Alberto-Casas, Pérez, Jerez, Fajardo-Molina, Morcillo-Blanco, and Fernández-Pascual: Respuesta de soya (Glycine max (L) Merr) a la inoculación con Azospirillum y Bradyrhizobium
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Respuesta de soya (Glycine max (L) Merr) a la inoculación con Azospirillum y Bradyrhizobium


RESUMEN

Azospirillum brasilense es una bacteria fijadora de nitrógeno y promotora del crecimiento vegetal con potencial como biofertilizante para plantas leguminosas y no leguminosas. Cultivos de importancia como la caña de azúcar han sido inoculados con A. brasilense produciendo incrementos en el crecimiento y el rendimiento de las cosechas en diferentes suelos y regiones climáticas. Experimentos en campo realizados en Cuba, de intercalamiento con caña de azúcar, inoculada con A. brasilense y soya, produjeron un incremento en la mayoría de los parámetros de crecimiento de la caña de azúcar, pero se desconocen los efectos de A. brasilense sobre soya. Este trabajo analiza las alteraciones en el desarrollo de planta y nódulos, actividad nitrogenasa y colonización por A. brasilense de raíces de soya inoculadas con A. brasilense 8-INICA y Bradyrhizobium japonicum USDA-110. A. brasilense no produjo modificaciones en la biomasa de la parte aérea de la planta ni en la actividad nitrogenasa en nódulos. Sin embargo, se produjeron incrementos en la biomasa de raíces y nódulos con su inoculación. A. brasilense coloniza la superficie de la raíz de soya mediante adhesión a la capa mucilaginosa y tiene la capacidad de proliferar y formar microcolonias en ella. La ruptura causada por la emergencia de raíces secundarias permitió a la bacteria entrar en los espacios intercelulares y las diferentes capas del parénquima radicular, produciéndose la colonización. Estos resultados sugieren que A. brasilense 8-INICA puede vivir como endófito en raíces de soya y podría ser un candidato a inoculante de leguminosas con fines agrícolas.


INTRODUCCIÓN

La importancia de aumentar los rendimientos de los cultivos en los sistemas de agricultura de subsistencia, caracterizados por un uso mínimo de fertilizantes minerales pasa por mejorar las interacciones de microorganismos beneficiosos-raíz-suelo que conducen a rendimientos más altos de los cultivos 1. El efecto en las leguminosas de coinoculación con simbióticos fijadores de nitrógeno y los géneros no simbióticos que promueven el crecimiento de plantas (PGPRs), están ganando cada vez más interés dentro de la fijación biológica de nitrógeno actual y se han propuesto como una nueva herramienta biotecnológica para mejorar el rendimiento y la sostenibilidad 2.

A. brasilense es una rizobacteria promotora del crecimiento de plantas fijadoras de nitrógeno (PGPR), con un potencial importante como biofertilizante para plantas leguminosas y no leguminosas. Cultivos de importancia agrícola, especialmente la caña de azúcar, se han inoculado a menudo con A. brasilense, lo que produce un aumento en los parámetros de crecimiento y rendimiento en diferentes suelos y regiones climáticas 3. Se han propuesto diferentes mecanismos de acción para explicar la mejora del crecimiento de las plantas, como la proliferación del sistema radical 4. La estimulación del crecimiento, generalmente se debe a la producción de fitohormonas como las auxinas, citoquininas, giberelinas 5,6. Además, se ha descrito la inducción de la tolerancia al estrés de las plantas y los genes de defensa 7.

La aplicación combinada de bacterias del género Rhizobium o Bradyrhizobium con Azospirillum, produjo un efecto positivo en las leguminosas 8. El efecto positivo da como resultado nodulación temprana, aumento en el número de nódulos, actividad de la nitrogenasa y la respiración de la raíz, así como una mejora general en la absorción de agua y nutrientes por parte de las raíces. Las características de PGPR de Azospirillum pueden ser la razón de su efecto sobre las coinoculaciones de leguminosas, que se relacionarían con la inducción de un mayor número de pelos radicales infectantes, diferenciados de las células epidérmicas y un aumento en la secreción de flavonoides que inducen genes nod9.

El intercalamiento de cultivos es un método sostenible que se utiliza para maximizar la utilización de los recursos disponibles y podría mejorar la biodiversidad de los suelos. En suelos tropicales se ha comprobado que el cultivo intercalado de gramíneas con leguminosas representa un conjunto de ventajas, entre las cuales podemos destacar, la contribución del nitrógeno al suelo y la obtención de producciones adicionales de fibra, grasa y alimentos 10. Además, el intercalamiento de cultivos mejora la resiliencia, la seguridad alimentaria 11 y la nutrición.

En experimentos de campo, en suelos cubanos de intercalamiento de caña de azúcar inoculada con A. brasilense y soya no inoculada10, se han observado aumentos en la mayoría de los parámetros de crecimiento de la caña de azúcar, pero no se conocen los efectos producidos por la inoculación de Azospirillum en la otra planta intercalada. El objetivo de este trabajo fue evaluar, bajo condiciones controladas, el efecto de A. brasilense 8-INICA y B. japonicum USDA-110 por separado y la coinoculación de los dos microorganismos sobre la altura de la planta, peso fresco de tallo y raíces, peso seco de nódulos, así como actividad nitrogenasa en nódulos de las raíces de soya (Glycine max (L) Merr), con énfasis en la colonización de la raíz de soya por Azospirillum.

MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas

A. brasilense cepa 8-INICA aislada de rizosfera de caña de azúcar cv. Ja 60-5 en la provincia de Ciego de Ávila, Cuba 12 cultivada en medio NFb a 28 ºC, 100 rpm y mantenida en caldo BMS 13 con glicerol al 20 % (v/v) a -80 ºC. B. japonicum cepa USDA-110 14 donada por el Centro de Investigación y Formación Agraria Las Torres-Tomejil (Sevilla, España), cultivada y mantenida en medio Vincent 15.

Crecimiento de las plantas y actividad nitrogenasa

Las semillas de soya (Glycine max cv. Williams) se esterilizaron superficialmente en HgCl2 al 0,1 % durante 5 min y luego se lavaron varias veces con agua destilada estéril. Las semillas se sembraron en frascos Leonard de 1 L pasados por autoclave llenos de vermiculita estéril y se inocularon con 1 mL de A. brasilense 8-INICA o B. japonicum USDA-110 en suspensiones con concentraciones del orden 108 unidades formadoras de colonias (UFC. mL-1). Los tratamientos fueron: plantas no inoculadas regadas con una solución de nitrato de potasio conteniendo 35 ppm de nitrógeno (tratamiento control); plantas inoculadas solo con A. brasilense 8-INICA; plantas inoculadas solo con B. japonicum USDA-110 y plantas inoculadas con los dos microorganismos. Los tratamientos de inoculación se regaron con una solución nutritiva libre de nitrógeno. Las soluciones nutritivas fueron reemplazadas tres veces por semana. Las condiciones de la cámara de crecimiento fueron: un fotoperíodo de 16 h de luz/8h de oscuridad, 25 ºC día/15 ºC de temperatura nocturna, 58 % de humedad relativa y un nivel de irradiación de 200 μm m-2 s-1. Se usaron tres réplicas para plantas inoculadas y no inoculadas. Después de cinco semanas, las plantas se recolectaron para determinaciones de parámetros de crecimiento de plantas y para microscopía. Se determinó la altura de la planta, el peso fresco de los tallos y las raíces, el peso seco de los nódulos y la actividad nitrogenasa en los nódulos. La actividad nitrogenasa se midió mediante el ensayo de reducción de acetileno (ARA) en raíces noduladas de plantas inoculadas con Bradyrhizobium y coinoculadas con Bradyrhizobium + Azospirillum respectivamente siguiendo el método descrito por otros autores 16.

Anticuerpos contra Azospirillum

Se obtuvieron anticuerpos contra Azospirillum para confirmar que la cepa de Azospirillum inoculada fue la misma que la que se encontró en las raíces de soya. La cepa A. brasilense 8-INICA se cultivó como se indicó anteriormente durante 24 h, en un volumen conocido de medio BMS. Se concentraron las células y se añadió formaldehído estéril al sedimento para lograr una concentración final de 5 por 1000 y se dejó durante la noche a 27 ºC. Posteriormente se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 min. El sedimento se lavó con solución salina tamponada con fosfato estéril pH 7,2 (PBS) y se suspendió en PBS estéril pH 7 hasta alcanzar 109 cel.mL-1, medida por densidad óptica a 680 nm. Los sedimentos finales se suspendieron en cantidades iguales de adyuvante completo de Freund. Se obtuvo antisuero en conejos blancos por vía de inmunización intravenosa, una inyección cada ocho días durante cinco semanas. La sangre se recogió ocho días después de la última inyección. El suero de purga final de cada conejo se recogió mediante centrifugación de la sangre coagulada a 2.000 g y se almacenó a -20 ºC. Se obtuvieron sueros de preinmunización de cada conejo.

Procesamiento de muestreo para microscopía

Solamente las plantas inoculadas con Azospirillum fueron procesadas para microscopía. Para probar la especificidad del antisuero, los cultivos in vitro de Azospirillum se incluyeron primero en agar 17. Las piezas de agar se procesaron como muestras de raíces para embeberse en resina LR-White 18. Se seleccionaron pequeños trozos de raíces frescas para una etapa de desarrollo comparable. Las muestras se tomaron en el momento de la cosecha, se cortaron con una cuchilla de afeitar, se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % (v/v) en 50 mM de cacodilato de Na, pH 7,4 y se infiltraron al vacío para mejorar la penetración del fijador. La deshidratación se realizó utilizando una serie de etanol y los nódulos se infiltraron y finalmente se incluyeron en LR-White Resin (London Resin Corporation) mediante polimerización por calor a 60 °C durante 24 h en cápsulas de gelatina 19. Se cortaron secciones semi-gruesas (1 μm) y ultrafinas (70 nm-espesor) en un ultramicrotomo Reichert Ultracut S para microscopía óptica y microscopía electrónica, respectivamente. Las secciones semi-gruesas se tiñeron con azul de toluidina al 1% (p/v) en borato de sodio acuoso (1 %) para examen directo utilizando un fotomicroscopio Zeiss Axiophot

Microscopía óptica y electrónica: inmunocitoquímica y silver enhancement

Para la inmunocitoquímica y el silver enhancement, se colocaron portaobjetos de vidrio con secciones de 1 µm de espesor a 37 ºC, durante la noche para asegurar la adhesión de las secciones. Las secciones se lavaron a fondo en PBS, pH 7,2, que contenía gelatina pura al 0,01 %, BSA al 0,1 % y azida sódica al 0,05 %. El bloqueo de los sitios de unión inespecíficos se logró mediante la incubación de secciones en la solución anterior que contenía 20 mg de albúmina de suero bovino (BSA) por mL, durante 20 minutos a temperatura ambiente. La incubación en anticuerpos primarios (anti-A. Brasilense 8-INICA) diluidos 1: 500 en el mismo tampón, se llevó a cabo durante 1 h en horno a 37 ºC. Las secciones se enjuagaron luego en PBS y el exceso de tampón se eliminó suavemente. La incubación con conjugado de oro anti-conejo de cabra (GAR 15 nm; BioCell, Cardiff, U.K.) diluido 1:40 en PBS se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se enjuagaron luego en PBS y agua destilada. El silver enhancement se llevó a cabo con el kit IntenSE M (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) y se permitió que progresara mientras se controlaba bajo el microscopio 19. Las secciones se enjuagaron luego enérgicamente con agua del grifo y agua destilada, se tiñeron con 0,05 % (w/v) de fucsina básica (Carlo Erba, Milano, Italia) en etanol acuoso al 5 % (v/v), se enjuagaron y se dejaron secar. Las secciones fueron montadas y fotografiadas bajo un fotomicroscopio Zeiss Axiophot. Para microscopía electrónica, se recogieron secciones (de 70 nm de espesor) en rejillas de níquel e inmunorotuladas 18. La contracción de las secciones se obtuvo con acetato de uranilo acuoso al 2 % (5 min) y citrato de plomo durante 2 min. Después de enjuagar y secar al aire, se examinaron las secciones utilizando un microscopio electrónico STEM LEO 910 a un voltaje de aceleración de 80 kV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La capacidad de A. brasilense para estimular el crecimiento de las plantas ha sido ampliamente demostrada 5,7. Informes anteriores han demostrado que la coinoculación de Rhizobium y Azospirillum mejoró la nodulación y el rendimiento de las plantas leguminosas 2. En nuestros resultados, la inoculación de A. brasilense 8-INICA no produjo cambios en la altura y la biomasa de las partes aéreas de la planta, ni en la actividad nitrogenasa (Tabla 1). Sin embargo, se observó un aumento del 61,8 % en el peso de la raíz, con respecto al control, en plantas inoculadas solamente con Azospirillum, mientras que se observó un aumento de solo el 6 % en plantas inoculadas sólo con Bradyrhizobium; no obstante, la coinoculación produjo un aumento del 11 % en este parámetro. Se observó un aumento en el peso de los nódulos del 78,9 % en plantas inoculadas, conjuntamente con plantas inoculadas solamente con Bradyrhizobium. Dado que el aumento en el peso de los nódulos no se tradujo en un aumento en la actividad nitrogenasa, este aumento no puede entenderse como un aumento en el número de bacteroides, sino en el tejido vegetal del nódulo. Las plantas tratadas sólo con nitrógeno o A. brasilense 8-INICA, respectivamente, no produjeron nódulos. El aumento en el peso de la raíz y los nódulos con la inoculación de Azospirillum fue consistente con otros resultados en Phaseolus vulgaris9) inoculado con Rhizobium tropici y R. etli y la misma especie de Azospirillum. El incremento del crecimiento de la raíz se puede producir mediante una mayor captación de minerales y agua 20, por lo que las inoculaciones de soya con Azospirillum podrían representar una ventaja en el rendimiento del cultivo.

Los tratamientos con Azospirillum y Bradyrhizobium se regaron con una solución nutritiva libre de nitrógeno y con una solución que contenía 35 ppm en el tratamiento con nitrógeno. Los datos son medias seguidas de error estándar de tres repeticiones. Las medias seguidas por la misma letra dentro de una columna no son significativamente diferentes. Los datos estadísticos fueron obtenidos por SPSS.

Colonización de raíces de soya por Azospirillum

El establecimiento de poblaciones bacterianas eficientes en la rizosfera es esencial para mejorar la colonización de las raíces y la productividad de las plantas 21. La colonización de la raíz de soya se estudió al final del cultivo de plantas, en plantas inoculadas sólo con Azospirillum, utilizando microscopía óptica y electrónica e inmunocitoquímica. A. brasilense 8-INICA colonizó la superficie de la raíz por adhesión al material mucilaginoso, producido por la planta donde proliferan las bacterias (Figura 1 y Figura 2A y B).

A, ápice radical B, área enmarcada de A. Azospirillum aislado (Az y flechas) o formando microcolonias (cabezas de flechas) dentro del material mucilaginoso Ep (epidermis), Is (intercelular) y Rh (pelo radical)

Además, se pueden observar los carbohidratos producidos por las bacterias. Los carbohidratos se detectaron mediante tinción con fucsina 19. (Figura 1C y Figura 2B y C).

Las flechas indican las bacterias de Azospirillum aisladas alrededor de los pelos radicales o formando microcolonias rodeadas por carbohidratos producidos por las bacterias (cabezas de flechas) Ep (epidermis), Is (intercelular), Rh (pelo radical) y Mm (material mucilaginoso)

Estos carbohidratos podrían conferir protección a la raíz contra condiciones externas y podrían favorecer la colonización de la bacteria en su hábitat natural 22. Los resultados muestran bacterias muy cerca de los pelos radicales cerca de la punta radical (Figura 1A y B). Se observan microcolonias en la superficie de la raíz embebidas en una matriz de polímero de carbohidratos de producción propia que fue consistente 23, como se muestra en las figuras 2B y C (puntas de flecha) y bajo protección del pelo radical (Figuras 2A y C). Esto da lugar a la biopelícula, que es un mecanismo que permite a las bacterias vivir en condiciones extremas o cambiantes y uno de los más utilizados en la colonización competitiva de raíces por bacterias eficientes. Después de la colonización de la raíz superficial, se produce la colonización parenquimática intercelular. Azospirillum pudo tomar la ruptura causada por la emergencia de una raíz secundaria (Figuras 3A y B) e ingresar en los espacios intercelulares del parénquima de la raíz de la planta (Figuras 3A y C) y entre las células epidermis radical, permitiendo la colonización. La morfología de la raíz cambió como consecuencia de esta colonización, produciendo una matriz entre dos capas de células del parénquima de la raíz (Figuras 3B y D).

Las flechas rojas indican el espacio donde la matriz parenquimática (B) comienza a formarse entre dos capas de células. Es (espacio intercelular), Pm (matriz parenquimática), Rp (parénquima de la raíz) y Sr (raíz secundaria)

Esta matriz parenquimática facilita el crecimiento bacteriano y las bajas presiones parciales de oxígeno para la expresión de la nitrogenasa y puede contribuir directamente al nitrógeno de la planta y asegura el intercambio de nutrientes entre las bacterias y la planta. Las bacterias del suelo y de la rizosfera pueden afectar la nutrición mineral de las plantas al cambiar las características de absorción de la raíz, debido a una modificación de la morfología de la raíz o la alteración de los mecanismos de absorción, la tasa de crecimiento relativa o la composición interna de las plantas 24. El hecho de sobrevivir dentro de la raíz y no producir ninguna lesión confirma este microorganismo como una bacteria endofítica 25. Los endófitos pueden ser útiles para proteger a la planta del estrés ambiental, así como para suministrar nitrógeno y otras sustancias que promueven el crecimiento 26.

Las bacterias pueden verse como cuerpos negros y cuerpos rodeados por un círculo negro en la ruptura producida por el surgimiento de una raíz secundaria (AC), en los espacios intercelulares, el parénquima de las raíces de soya y dentro de la matriz parenquimática (D, E y F), señaladas como flechas negras. G es la ampliación del espacio intercelular y la conexión de la matriz parenquimática. Es (espacio intercelular), Pm (matriz parenquimática), Rp (parénquima de la raíz) y Sr (raíz secundaria)

Las reacciones del anti-A brasilense 8-INICA con el microorganismo mostraron, en el microscopio óptico, las bacterias rodeadas de partículas de oro (Figura 4). La inmunolocalización y el silver enhancement demuestran que se logra la colonización por A. brasilense 8-INICA, conociendo que las bacterias están marcadas en la ruptura causada por la aparición de una raíz secundaria (Figura 4A-C), en los espacios intercelulares (Figura 4D) y en la matriz parenquimática producida por la colonización de Azospirillum del parénquima de la raíz (Figura 4D-F). Con el gran aumento en la microscopía óptica (Figura 4G) se puede observar que los espacios intercelulares y la matriz parenquimática están conectados, y Azospirillum identificado por el anticuerpo puede verse como cuerpos rodeados por un círculo negro. Estos resultados en experimentos de inoculación en soya muestran firmemente la colonización por Azospirillum, lo cual es consistente con informes similares sobre arroz 27, tabaco 28, tomate 29 y cebada 30. En el caso de la caña de azúcar, la controversia de si es solo una bacteria rizosférica o asociada a la raíz o un endófito, requiere estudios adicionales que permitan aclarar este aspecto, que podría verse influido por manifestación de quorum sensing3 y otros factores. La inmunolocalización en portaobjetos ultrafinos de células de Azospirillum, embebidas en agar con el anticuerpo anti-A. brasilense 8-INICA, muestra una enorme afinidad del anticuerpo al antígeno (Figura 5A). Hay un marcaje intenso de las bacterias con partículas de oro de 15 nm. El número de partículas de oro es elevado y marcó las diferentes capas de las envolturas celulares (Figura 5A, flechas).

La cantidad de partículas de oro disminuye considerablemente cuando el marcaje se realiza en los espacios intercelulares, como si las bacterias perdieran algunas de las capas con la colonización del parénquima de la raíz (Figura 5B), aunque también se puede observar el marcaje en diferentes capas (flechas). Dentro de la matriz parenquimática solo una capa aparece marcada (Figura 5C y D) y no se detectan partículas de oro en el interior de las bacterias. Se puede observar un marcaje inespecífico en las vesículas de la matriz parenquimática, probablemente formadas por la degradación de las membranas bacterianas (Figura 5C).

Note el intenso marcaje de las bacterias con partículas de oro de 15 nm (flechas)

B, note la gran disminución de partículas de oro cuando las bacterias están colonizando la raíz y llegan a la matriz parenquimática

(B-D), A. brasilense 8-INICA dentro de la matriz parenquimática

Cw (pared celular), Is (intercelular), Pm (matriz parenquimática)

Cuando la bacteria envejece, el citoplasma se retrae y las partículas de oro permanecen en la capa más externa de las envolturas de la bacteria (Figura 6A y B). Aunque no es normal, en algunas áreas aparecen partículas de oro en la pared celular (Figura 6C). Muy pocas partículas de oro aparecen en el citoplasma de las células adyacentes a la matriz. No hay localización de partículas de oro en orgánulos envejecidos (Figura 6D).

A y B note que cuando la bacteria envejece el citoplasma se retrae y el marcaje permanece en la capa más externa de la bacteria

C y D Matriz parenquimática y células adyacentes

Cw (pared celular), G (Golgi), Pm (matriz parenquimática)

Azospirillum generalmente se asocia con raíces de pastos como la caña de azúcar, el arroz y el maíz 4, lo que se traduce en beneficios para las plantas por su contribución a la nutrición. Las técnicas de microscopía e inmunolocalización permitieron confirmar en este trabajo que A. brasilense 8-INICA puede actuar como un endófito en las raíces de soya. Los endófitos pueden ser útiles para proteger a la planta del estrés ambiental, así como para suministrar nitrógeno y otras sustancias que promueven el crecimiento 26. Este trabajo enfatiza que Azospirillum no sólo es interesante para la inoculación en caña de azúcar, sino también en la soya y, por lo tanto, funcionaría muy bien en el intercalamiento de la soya y la caña de azúcar, con la ventaja de no tener que introducir cepas extrañas en los suelos cubanos.

CONCLUSIONES

  • brasilense 8-INICA es capaz de colonizar las raíces de la soja, no sólo de forma superficial, sino también intercelular, formando una matriz parenquimática que favorece el intercambio entre la bacteria y la planta, demostrando a A. brasilense 8-INICA como un endófito de las raíces de soya. Además de sus efectos mejorados sobre el peso de las raíces y los nódulos en comparación con especies nodulares como B. japonicum USDA-110, que confirman los informes de otros investigadores, este resultado de ser un endófito en las raíces de soya es importante para lograr la sostenibilidad en la agricultura, considerando que las inoculaciones de campo son amigables con el medio ambiente y una forma económica y viable de obtener buenas producciones mediante prácticas agrícolas orgánicas.

  • Se deben realizar estudios de campo adicionales en condiciones no controladas con esta cepa para explorar su potencial como biofertilizante en las prácticas de cultivo intercalado con esta leguminosa y caña de azúcar. Es importante destacar que A. brasilense 8-INICA está adaptado a las condiciones de los suelos cubanos, lo que evita que se introduzcan cepas extrañas en los ambientes de los suelos cubanos.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó gracias a los proyectos AECID, A / 8500/07 y A / 019119/08 y el Ministerio de Economía y Competitividad AGL2013-40758-R, desarrollado entre el ICA-CSIC (Madrid, España) y el INICA (La Habana), Cuba).

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Los autores de este trabajo declaran no presentar conflicto de intereses.

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Response of soybean (Glycine max (L) Merr) to inoculation with Azospirillum and Bradyrhizobium


ABSTRACT

Azospirillum brasilense is a nitrogen-fixing plant growth promoting rhizobacterium with potential as biofertiliser for leguminous and non-leguminous plants. Agriculturally important crops, especially sugar cane, have been often inoculated with A. brasilense producing increases in growth parameters and yield in different soils and climatic regions. Sugar cane inoculated with A. brasilense has been grown in intercropping with legumes like beans and soybean. In field experiments of intercropping of sugarcane inoculated with A. brasilense and soybean carried out in Cuban soils, an increase in most of the growth parameters of sugarcane have been observed, but it is not known the effects produced on the other intercropped plant. This work analyzes the alterations in plant and nodule development, nitrogenase activity and colonization of roots by Azospirillum, in soybean inoculated with A. brasilense 8-INICA and Bradyrhizobium japonicum USDA-110. A. brasilense inoculation did not produced changes in the height and biomass of aerial parts of the plant or in nitrogenase activity in nodules. However increases in root and nodule biomass were detected with its inoculation. A. brasilense colonized root surface by adhesion to mucilaginous material where bacteria proliferate and are able to form microcolonies inside. The break caused by the emergence of a secondary root allowed the bacterium to enter in the intercellular spaces of plant root parenchyma and between epidermal root cells, allowing soybean root colonization. These results suggested that A. brasilense 8-INICA can live as an endophyte in soybean roots and could be a suitable candidate like inoculant of leguminous with agricultural purposes.


INTRODUCTION

The importance of increasing crop yields in subsistence farming systems characterized by a minimal use of mineral fertilizers goes through improve beneficial microorganisms-root-soil interactions leading to higher crop yields 1.The effect on legumes of co-inoculation with nitrogen-fixing symbiotic bacteria and non-symbiotic plant growth promoting genera (PGPRs) is gaining increasing interest within the current biological nitrogen fixation and has been proposed like a new biotechnological tool to improve yield and sustainability 2.

A. brasilense is a nitrogen-fixing plant growth promoting rhizobacterium (PGPR) with a substantial potential as biofertilizer for leguminous and non-leguminous plants. Agriculturally important crops, especially sugar cane, have been often inoculated with A. brasilense producing increase in growth parameters and yield in different soils and climatic regions 3. Different mechanisms of action have been proposed to explain the enhancement of plant growth, like proliferation of the root system 4.The stimulation of growth is usually due to the production of phytohormones such as auxins, cytokinins, gibberellins 5,6. Furthermore induction of plant-stress tolerance and defense genes has been described 7.

The combined application of bacteria of the genus Rhizobium or Bradyrhizobium with Azospirillum, produced a positive effect on legumes 8. The positive effect results in early nodulation, increase in nodule numbers, nitrogenase activity and root respiration, as well as an overall improvement in the uptake of water and nutrients by the roots. Azospirillum PGPR characteristics may be the reason for its effect on legume co-inoculations, which would be related to the induction of a greater number of infective root hairs, differentiated from epidermal cells and an increase in the secretion of flavonoids inducing nod genes 9.

Intercropping is a sustainable method for crop production used to maximize utilization of available resources and could improve biodiversity of soils. In tropical soils it has been proven that the intercropping of grasses with legumes, represents a group of advantages among which we can point out the contribution of nitrogen to the soil and the obtaining of additional productions of fiber, fat and food 10. Furthermore, intercropping improves resilience, food security 11 and nutrition.

In field experiments of intercropping of sugarcane inoculated with A. brasilense and not-inoculated soybean, carried out in Cuban soils 10, increases in most of the growth parameters of sugarcane have been observed, but it is not known the effects produced by Azospirillum inoculation on the other intercropped plant. The aim of this work was to evaluate, under controlled conditions, the effect of A. brasilense 8-INICA and B. japonicum USDA-110 by separated and co-inoculation of the two microorganisms in plant height, shoot and root fresh weight, nodule dry weight and nitrogenase activity in nodules of soybean roots (Glycine max (L) Merr), emphasizing in soybean root colonization by Azospirillum.

MATERIALS AND METHODS
Strains

A. brasilense 8-INICA strain isolated from sugarcane cv. Ja 60-5 rhizosphere in Ciego de Ávila province, Cuba 12 cultured in NFb medium at 28 ºC, 100 rpm and maintained in BMS broth 13 containing 20 % (v/v) glycerol at -80 ºC. B. japonicum USDA-110 14 donned by Centro de Investigación y Formación Agraria Las Torres-Tomejil (Sevilla, Spain), grown and maintained in Vincent medium 15.

Plant growth and nitrogenase activity

Soybean (Glycine max cv. Williams) seeds were surface sterilized in 0.1 % HgCl2 for 5 min and then washed several times with sterile distilled water. Seeds were sown in 1 L autoclaved Leonard jars filled with sterile vermiculite and inoculated with 1 mL of A. brasilense 8-INICA or B. japonicum USDA-110 suspension containing 108 colony forming units (CFU mL-1). Treatments were: Nitrogen (control treatment) non-inoculated plants and watered with a solution containing 35 ppm of nitrogen in form of potassium nitrate, plants inoculated only with A. brasilense 8-INICA, plants inoculated only with B. japonicum USDA-110 and plants inoculated with the two microorganisms. The inoculations treatments were watered with a free nitrogen nutritive solution. Nutrive solutions were replaced three times per week. The conditions of the growth chamber were: a 16-h-light/8-h-dark photoperiod, 25 ºC day/15 ºC night temperature, 58 % relative humidity and an irradiance level of 200 μm m-2 s-1. Three replicates were used for inoculated and non-inoculated plants. After five weeks plants were harvested for plant growth parameter determinations and microscopy purposes. It was determined plant height, shoot and root fresh weight, nodule dry weight and nitrogenase activity in nodules. Nitrogenase activity was measured by the acetylene reduction assay (ARA) on nodulated roots from plants inoculated with Bradyrhizobium and co-inoculated with Bradyrhizobium + Azospirillum, following the method described by other authors 16.

Processing of sampling for microscopy

Antibodies against Azospirillum were obtained in order to confirm that the strain of Azospirillum inoculated was the same that those that was found in soy roots. A. brasilense 8-INICA strain was cultivated as indicated above for 24 h, in a known volume of BMS medium. Cells were harvested and sterile formaldehyde was added to the pellet to achieve a final concentration of 5 per 1000 and left overnight at 27 ºC. Cells were centrifuged at 5000 rpm for 5 min. The pellet was washed with sterile phosphate buffer saline pH 7.2 (PBS) and suspended in sterile PBS pH 7 until reaching109 cell mL-1, measured by optical density at 680 nm. The final pellets were suspended in equal quantities of Freund's complete adjuvant. Antiserum was obtained in white rabbits by intravenous immunization route, one injection every eight days for five weeks. Blood was collected eight days after the last injection. The final bleed-out serum from each rabbit was collected by centrifuging clotted blood at 2.000 g and stored at -20 ºC. Preimmunization sera were obtained from each rabbit.

Processing of sampling for microscopy

Only plants inoculated with Azospirillum were processed for microscopy. In order to prove the specificity of the antiserum, Azospirillumin in vitro cultures were embedded first in agar 17.The agar pieces were processed as root samples to be embedded in LR-White resin 18. Small pieces of fresh roots were selected for a comparable stage of development. Samples were taken at harvest time, cut with a razor blade, fixed in 2.5 % (v/v) glutaraldehyde in 50 mM Na-cacodylate, pH 7.4 and vacuum-infiltrated to enhance penetration of the fixative. Dehydration was performed using an ethanol series and nodules pieces were infiltrated and finally embedded in LR-White Resin (London Resin Corporation) by heat polymerization at 60 °C for 24 h in gelatin capsules 19. Semi-thick (1 μm) and ultrathin (70 nm-thick) sections were cut in a Reichert Ultracut S ultramicrotome for light microscopy, and electron microscopy, respectively. The semi-thick sections were stained with 1 % (w/v) toluidine blue in aqueous sodium borate (1 %) for direct examination using a Zeiss Axiophot photomicroscope.

Light and electron microscopy: immunocytochemistry and silver enhancement

For immunocytochemistry and silver enhancement, glass slides with 1 µm thick sections were placed at 37 ºC, overnight to ensure adhesion of sections. Sections were thoroughly washed in PBS, pH 7.2, containing 0.01 % pure gelatin, 0.1 % BSA, and 0.05 % sodium azide. Blocking of unspecific binding sites was achieved by incubation of sections in the above solution containing 20 mg of Bovine Serum Albumine (BSA) per mL, for 20 min at room temperature. Incubation in primary antibodies (anti-A. brasilense 8-INICA) diluted 1:500 in the same buffer, was carried out for 1 h in oven at 37 ºC. Sections were then rinsed in PBS and the excess of buffer gently removed. Incubation with goat anti-rabbit gold conjugate (GAR 15 nm; BioCell, Cardiff, U.K.) diluted 1:40 in PBS was performed for 1 h at room temperature. Sections were then rinsed in PBS and distilled water. Silver enhancement was carried out with IntenSE M Silver Enhancement Kit (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) and allowed to progress while monitored under the microscope 19. Sections were then energetically rinsed in tap and distilled water, counterstained with 0.05 % (w/v) basic fuchsine (Carlo Erba, Milano, Italy) in 5 % (v/v) aqueous ethanol, rinsed and let to dry. Sections were then mounted and photographed under a Zeiss Axiophot photomicroscope. For electron microscopy, sections (70 nm thick) were collected on nickel grids and immunolabelled 18. Counterstaining of sections was obtained with 2 % aqueous uranyl acetate (5 min) and lead citrate for 2 min. After rinsing and air-drying, sections were examined using a STEM LEO 910 electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV.

RESULTS AND DISCUSSION

The ability of A. brasilense to stimulate plant growth has been extensively demonstrated 5,7. Previous reports have shown that co-inoculation of Rhizobium and Azospirillum enhanced the nodulation and yield of leguminous plants 2. In our results, A. brasilense 8-INICA inoculation did not produced changes in the height and biomass of aerial parts of the plant nor in nitrogenase activity (Table 1). However an increase of 61.8 % in root weight with respect to control was observed in plants inoculated only with Azospirillum, while an increase of only 6 % was observed in plants inoculated only with Bradyrhizobium. Nevertheless co-inoculation produced an increase of 11 % in this parameter. An increase in nodule weight of 78.9 % was observed in co-inoculated plants with respect to plants inoculated only with Bradyrhizobium. Since the increase in the weight of the nodules did not translate into an increase in nitrogenase activity, this increase cannot be understood as an increase in the number of bacteroids, but rather in the vegetable tissue of the nodule. Plants treated only with nitrogen or A. brasilense 8-INICA respectively did not produce nodules. The increase in root and nodule weight with Azospirillum inoculation was consistent with others results in Phaseolus vulgaris9 inoculated with Rhizobium tropici and R. etli and the same species of Azospirillum. Improvement of root growth can be produced by enhanced uptake of minerals and water 20, thus, Azospirillum inoculations of soybean could represent an advantage in crop yield.

Azospirillum and Bradyrhizobium treatments were watered with a nitrogen free nutritive solution and with a solution containing 35 ppm in the nitrogen treatment. Data are means followed by standard error of three repetitions. Means followed by the same letter within a column are not significantly different. Statistical data were obtained by SPSS.

Soybean roots colonization by Azospirillum

The establishment of efficient bacterial populations in the rhizosphere is essential to improve root colonization and plant productivity 21. Soybean root colonization was studied at the end of plant culture in plants inoculated only with Azospirillum, using light and electron microscopy and immunocytochemistry. A. brasilense8-INICA colonized root surface by adhesion to mucilaginous material produced by the plant where bacteria proliferate (Figure 1 and Figure 2A and B).

A, root apice B, framed area of A. Azospirillum isolated (Az and arrows) or forming microcolonies (arrows heads) inside the mucilaginous material Ep (Epidermis), Is (intercellular) and Rh (root hair)

Furthermore, carbohydrates produced by the bacteria can be observed. Carbohydrates were detected by fuchsine staining 19. (Figure 1C and Figure 2B and C).

Arrows indicate Azospirillum bacteria isolated around the root hairs or forming microcolonies surrounded by carbohydrates produced by the bacteria (arrows heads) Ep (Epidermis), Is (Intercellular), Rh (Root hair) and Mm (Mucilaginous material)

These carbohydrates could be able to confer protection to the root against external conditions and may favor colonization of the bacterium in its natural habitat 22. Results show bacteria very close to root hairs near the radicular tip (Figure 1A and B). Microcolonies are observed on the root surface embedded in a self-produced carbohydrate polymer matrix which was consistent 23, as shown in figures 2B and C (arrowheads) and under protection of the root hair (Figures 2A and C). This gives rise to biofilm, which is a mechanism that allows bacteria to live in extreme or changing conditions and one of the most widespread used in competitive root colonization of efficient bacteria. After surface root colonization, the intercellular parenchymatic colonization is produced. Azospirillum was able to take the break caused by the emergence of asecondary root (Figures 3A and B) and enter in the intercellular spaces of plant root parenchyma (Figures 3A and C) and between epidermal root cells allowing the colonization. Root morphology changed as a consequence of this colonization, producing a matrix between two layers of parenchyma root cells (Figures 3B and D).

Red arrows indicate the gap where the parenchymatic matrix (B) starts to be formed between two layers of cells. Is (Intercellular space), Pm (Parenchymatic matrix), Rp (root parenchyma) and Sr (Secondary root)

This parenchymatic matrix facilitates bacterial growth and the low oxygen partial pressures for the expression of nitrogenase and can directly contribute to nitrogen to the plant and the exchange of nutrients between the bacteria and the plant is assured. Soil and rhizosphere bacteria can affect the mineral nutrition of plants by changing root-uptake characteristics, due to a modification of root morphology or alteration of uptake mechanisms, relative growth rate or internal composition of plants 24). The fact to survive inside the root and not producing any injuries confirm this microorganism as an endophytic bacterium 25. Endophytes can be helpful in protecting the plant from environmental stress as well as in supplying the plant with nitrogen and other growth promoting substances 26.

The bacteria can be seen as black bodies and bodies surrounded by a black circle in the rupture produced by the emergence of a secondary root (CA), in the intercellular spaces, the parenchyma of the roots of soybean and within the parenchyma matrix (D, E and F), marked as black arrows. G is the expansion of the intercellular space and the connection of the parenchymal matrix. It is (intercellular space), Pm (parenchymal matrix), Rp (parenchyma of the root) and Sr (secondary root)

Anti-A. brasilense 8-INICA reactions with the microorganism, showed, at light microscopy, the bacteria surrounded by gold particles (Figure 4). Immunolocalization and silver enhancement demonstrates that colonization by A. brasilense 8-INICA is achieved, knowing that the bacteria are labelled in the break caused by the emergence of a secondary root (Figure 4A-C), in the intercellular spaces (Figure 4D) and in the parenchyma matrix produced by Azospirillum colonization of plant root parenchyma (Figure 4D-F). With the high magnification at light microscopy (Figure 4G) it can be observed that the intercellular spaces and the parenchymatic matrix are connected, and Azospirillum identified by the antibody can be seen as bodies surrounded by a black circle. These results in inoculation experiments in soybean firmly show colonization by Azospirillum which is consistent with similar reports on rice 27, tobacco 28, tomato 29 and barley 30. In the case of sugarcane, the controversy of whether it is only a rhizospheric or a root associated bacterium or an endophyte requires further studies leading to clarify this aspect which could be influenced by quorum sensing3 and other factors. Immunolocalization in ultrathin slides of Azospirillum cells embedded in agar with the antibody anti-A. brasilense 8-INICA shows an enormous affinity of the antibody to the antigen (Figure 5A). There is intense labeling of the bacteria with 15 nm gold particles. The number of gold particles is elevated and marked the different layers of the cellular envelopes (Figure 5A, arrows).

The number of gold particles decreases considerably when the marking is done in the intercellular spaces, as if the bacteria would lose some of the layers with the colonization of the root parenchyma (Figure 5B), although still labeling in different layers can also be observed (arrows). Inside the parenchymatic matrix only one layer is labeled (Figure 5C and D) and no gold particles are detected inside the bacteria. Unspecific labeling can be observed in vesicles of the parenchymatic matrix, probably formed by bacterium membranes degradation (Figure 5C).

(A), cells embedded first in agar and in LR-White resin

Note the intense labeling of the bacteria with 15 nm gold particles (arrows)

B, note the big decrease of gold particles when the bacteria are colonizing the root and arrive to parenchymatic matrix

(B-D), A. brasilense 8-INICA inside the parenchymatic matrix

Cw (Cell wall), Is (Intercellular), Pm (Parenchymatic matrix)

When the bacterium ages, the cytoplasm is retracted and the gold particle remains on the outermost layer of the bacterium envelopes (Figure 6A and B). Although not normal, in some areas appear gold particles on the cell wall (Figure 6C). Very few gold particles appear in the cytoplasm of adjacent cells to the matrix. There is no localization of gold particles in aged organelles (Figure 6D).

A and B note that when the bacteria age, the cytoplasm retracts and the label remains on the outermost layer of the bacteria

C and D Parenchymatic matrix and adjacent cells. Cw (Cell wall), G (Golgi), Pm (Parenchymatic matrix)

Azospirillum is usually associated with roots of grasses such as sugar cane, rice and maize 4, translating benefits to the plants for its contribution to nutrition. Microscopy techniques and immunolocalization allowed to confirm in this work that A. brasilense 8-INICA can act as an endophyte in soybean roots. Endophytes can be helpful in protecting the plant from environmental stress as well as in supplying the plant with nitrogen and other growth promoting substances 26. This work emphasizes that Azospirillum is not only interesting for sugarcane inoculation, but also for soybean and therefore would work very well in intercropping of soybean and sugarcane, with the advantage of not having to introduce foreign strains in Cuban soils.

CONCLUSIONS

  • A. brasilense 8-INICA is able to colonize soybean roots, not only superficially but also intercellularly forming a parenchymatic matrix which favors the exchange between the bacterium and the plant, making A. brasilense 8-INICA an endophyte of soybean roots. Besides its enhanced effects on root and nodule weight in comparison with nodulating species like B. japonicum USDA-110, which confirm reports of other researchers, this result of being an endophyte in soybean roots is important in order to accomplish sustainability in agriculture, considering that field inoculations are environmental friendly and an economical feasible way to obtain good productions by means of organic agricultural practices.

  • Further field studies under non-controlled conditions must be carried out with this strain in order to explore its potential as a biofertilizer in intercropping practices with this leguminous and sugarcane. Is important to emphasize that A. brasilense 8-INICA is fit to Cuban soils conditions which avoids foreign strains to be introduced in Cuban soil environments.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was done thanks to the AECID projects, A / 8500/07 and A / 019119/08, and Ministerio de Economía y Competitividad AGL2013-40758-R, developed between ICA-CSIC (Madrid, Spain) and INICA (Havana, Cuba).

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