ctr Cultivos Tropicales cultrop 0258-5936 1819-4087 Ediciones INCA 00004 00004 Artículo original Conservación in vitro de cafeto (Coffea arabica L.) mediante la disminución de sales minerales en el medio de cultivo Castilla-Valdés Yanelis 1 * González-Vega María Esther 1 Espinosa-Torres Llayma 1 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) San José de las Lajas Mayabeque CP 32 700 Cuba Autor para correspondencia. yanelis@inca.edu.cu 01 03 2020 Jan-Mar 2020 41 1 e04 29 11 2018 13 11 2019 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

La conservación de recursos fitogenéticos reviste gran importancia en tiempos en que se agudizan las consecuencias del cambio climático global. El género cafeto (Coffea spp) no está exento de estos riesgos, por lo que se buscan alternativas para su conservación ex situ. Específicamente, los métodos de conservación in vitro conocidos como de ‘crecimiento mínimo’, permiten la preservación a mediano plazo del material vegetal, mediante la disminución del ritmo de crecimiento y de la frecuencia entre subcultivos. Son necesarios estudios acerca del efecto independiente de variaciones en la concentración de macro y microelementos esenciales, en la conservación a mediano plazo de cafeto. El objetivo del trabajo fue determinar el efecto de la disminución del contenido mineral del medio de cultivo en la respuesta de plantas de cafeto (Coffea arabica L.) conservadas in vitro por un período entre dos y seis meses. Las plantas, previamente obtenidas in vitro, fueron sembradas en medio MS modificado, con tres tratamientos consistentes en la reducción al 75, 50 y 25 % de sus macro y microelementos. La supervivencia, el número de pares de hojas, la abscisión foliar y el porcentaje de plantas con raíces fueron evaluados a los dos, cuatro y seis meses. En el tratamiento de MS al 50 %, los porcentajes de supervivencia variaron entre el 85 y 100 %, se obtuvieron valores intermedios de pares de hojas y de abscisión foliar, con respecto al resto de los tratamientos. Además, las plantas desarrollaron raíces que les permitieron sobrevivir a pesar de la carencia de nutrientes. Con este tratamiento, que representa un ahorro de la mitad de los componentes minerales del medio de cultivo, se considera factible conservar por un período de hasta seis meses las plantas in vitro de cafeto.

Palabras clave: brotes cultivo in vitro nutrientes minerales plántulas in vitro recursos genéticos vegetales
INTRODUCCIÓN

El cafeto (Coffea spp.) juega una importante función en la economía a nivel mundial, ya que representa una fuente mayoritaria de ingresos foráneos en aproximadamente 80 países productores 1. Se estima que el 80 % del volumen exportado de cafeto actualmente es producido en países latinoamericanos como Brasil, Colombia y Costa Rica 2. En Cuba, el cafeto es una prioridad en el sector de la agricultura, ya que a partir de él se obtiene una bebida de consumo habitual por la población, y también constituye un rubro exportable 3.

Aunque la vía más común para producir plántulas de cafeto es la utilización de la semilla botánica, la pérdida de su germinación durante el almacenamiento resulta un problema para la propagación y conservación de sus recursos genéticos 4. A partir de esta realidad, el método de conservación más ampliamente utilizado para las colecciones de especies de cafeto, son los bancos de germoplasma en condiciones de campo. Sin embargo, las amenazas a los recursos fitogenéticos del cafeto son numerosas y su pérdida pudiera ocasionar una erosión genética significativa al germoplasma. Una de las grandes dificultades de las colecciones ex situ en campo de cafeto es que frecuentemente se encuentran localizadas en condiciones ecológicas como la altitud, el sombreado, la humedad relativa, que no resultan adecuadas para la supervivencia de todo el material vegetal. La pérdida de plantas como resultado del envejecimiento, métodos de cultivo inapropiados, así como las plagas y enfermedades, pueden causar erosión genética y el peligro del cambio climático incrementa la urgencia de conservar 1.

Por ello, se estudian otros métodos de conservación ex situ de cafeto que permitan superar estas barreras, por ejemplo, mediante la conservación in vitro, que constituye una de las aplicaciones del cultivo in vitro. Esta resulta una valiosa alternativa para la preservación de germoplasma de especies de semilla botánica de corta viabilidad como el cafeto. También reviste importancia para especies de propagación vegetativa o de materiales que necesitan ser propagados vegetativamente para mantener algún genotipo en particular. La conservación in vitrose puede efectuar a través de los métodos de crecimiento mínimo y crioconservación 5.

Los métodos de crecimiento mínimo consisten en reducir la velocidad de crecimiento de las plantas, basados en la disminución de la división celular y el metabolismo, lo cual se logra mediante la alteración de las condiciones óptimas de cultivo. Se puede variar la composición del medio de cultivo, o bien modificar el ambiente de crecimiento (temperatura, intensidad luminosa, disponibilidad de oxígeno) 6, de esta manera, es posible conservar las plantas a corto o mediano plazos, lo que permite una reducción en la frecuencia de los subcultivos e incrementar la longevidad in vitro de los cultivos; así como minimizar el riesgo de cambios genéticos 5,7.

Los nutrientes minerales se encuentran entre los componentes principales de los medios de cultivo de tejidos vegetales 8, de aquí que en el cultivo del cafeto han sido realizadas diferentes investigaciones referentes a la interacción entre su concentración, la adición de reguladores del crecimiento y reguladores osmóticos y/o la temperatura 9-11. Sin embargo, se carece de estudios acerca del efecto independiente de variaciones en la concentración de estos elementos esenciales, en la conservación a mediano plazo de cafeto.

Por todo ello, en el presente trabajo se propone como objetivo determinar el efecto de la disminución del contenido mineral del medio de cultivo en la respuesta de plantas de cafeto (Coffea arabica L.) conservadas in vitro durante un período comprendido entre dos y seis meses.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología del Departamento de Genética y Mejoramiento de Plantas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), ubicado en el municipio San José de Las Lajas, provincia Mayabeque.

Para obtener las plantas in vitro de cafeto (C. arabica), previamente se realizó la desinfección de semillas mediante su inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (2,4 % de cloro activo) por 90 min. Las semillas fueron lavadas tres veces con agua destilada estéril y sumergidas en una solución de ácido bórico al 0,5 %, con agitación en zaranda orbital a 150 r.p.m. durante 72 h. Los embriones cigóticos fueron extraídos en las condiciones estériles del flujo laminar y sembrados en medio de cultivo Murashige-Skoog (MS) 12) con sacarosa 30 g L-1, cisteína 25 mg L-1y agar 5 g L-1. Al germinar los embriones, cuando las plántulas contaban con el primer par de hojas verdaderas, fueron subcultivadas a medio de cultivo MS con tiamina 5 mg L-1, inositol 100 mg L-1, sacarosa 30 g L-1, 6-bencil-amino-purina (BAP) 0,5 mg L-1, ácido naftal en-acético (ANA) 0,3 mg L-1, ácido giberélico (AG3) 1 mg L-1 y agar 5 g L-1. Una vez que las plantas tuvieron cuatro pares de hojas, se tomaron como donantes de los brotes apicales dedos pares de hojas, utilizados en el estudio de conservación.

El subcultivo para la conservación in vitro, se realizó en diferentes variantes de medio de cultivo MS 12 suplementado con tiamina 5 mgL-1, inositol 100 mg L-1, cisteína 25 mgL-1, sacarosa 30 g L-1 y agar 5 g L-1. Para retardar el crecimiento de las plantas in vitro de cafeto, las variantes del medio de cultivo consistieron en la disminución de la concentración de las sales de MS, de manera tal que T1 (control) estaba constituido por el 100 % de los macro y microelementos de MS; T2 por el 75 %; T3 por el 50 % y T4 por el 25 %. Para cada variante se sembraron 20 brotes apicales y se realizaron 3 repeticiones por tratamiento. Como recipientes para la siembra, se utilizaron tubos de cultivo (25/100 mm) con 20 mL de medio. Los mismos fueron colocados en el cuarto de crecimiento a una temperatura de 23 ± 2 ºC, bajo iluminación artificial con un fotoperiodo de 16 horas luz e intensidad luminosa de 18,75 µmol m-2 s-1 y humedad relativa del 85 %.

A partir de los dos meses de la siembra y con esta frecuencia hasta los seis meses, se realizaron las evaluaciones del porcentaje de supervivencia, el número de pares de hojas, la abscisión foliar (número de hojas escindidas por planta) y el porcentaje de plantas con formación de raíces. A las variables expresadas en porcentaje se les realizó una prueba de comparación de proporciones utilizando el programa Statgraphics Plus 5.1, y al resto de las variables se les realizó un análisis de varianza de clasificación simple, previa comprobación del cumplimiento de sus premisas, y en caso de diferencias entre las medias se realizó una prueba de comparación de medias (Duncan) utilizando el programa SPSS 10.0 para Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A los dos meses se alcanzó el 100 % de supervivencia de las plantas, en todos los tratamientos. De manera semejante, a los cuatro meses la supervivencia de las plantas de los tratamientos con las mayores concentraciones de MS mantuvo este valor, sin embargo, a partir de esta etapa comenzó un descenso en la supervivencia de las plantas de los tratamientos T3 y T4, los que contaban con las menores concentraciones de los elementos de MS, obteniéndose diferencias significativas entre ambos y entre estos y los tratamientos T1 (control) y T2, como se observa en la Figura 1.

Al analizar la tercera evaluación, a los seis meses, la supervivencia de las plantas del tratamiento T3 disminuyó al 85 %, valor que se considera elevado para las condiciones de cultivo. En esta etapa, la supervivencia de las plantas del tratamiento T4 disminuyó al 53,33 %, encontrándose diferencias significativas con el resto de los tratamientos (Figura 1). Estos resultados coinciden con los informados por otros autores 13) al realizar la conservación in vitro de clavel español (Dianthus caryophyllus L.), que encontraron diferencias significativas en la supervivencia de las plantas cultivadas en medio con reducción al 25 % de las sales de MS con respecto al resto de los tratamientos, a los tres meses de cultivo.

Porcentaje de supervivencia de las plantas de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) subcultivadas en medio de cultivo de conservación, con diferentes concentraciones de los macro y microelementos de MS Leyenda: Tto. 1 (control): 100 %; Tto. 2: 75 %; Tto 3: 50 %; Tto. 4: 25 %. Para la misma evaluación, letras comunes no difieren significativamente (Duncan p˂0,05)

A los dos meses, las medias para el número de pares de hojas de las plantas de los tratamientos T1 (control), T2 y T4, no difirieron estadísticamente, sin embargo, las plantas obtenidas en el tratamiento T3 alcanzaron un número de pares de hojas mayoral resto de los tratamientos (Figura 2). A los cuatro meses fue el tratamiento T4 el que difirió del resto, con una media de 2,67 pares de hojas por planta, mientras que en los demás tratamientos la media varió entre 4,60 y 4,87 pares de hojas (tratamientos T3 y T2, respectivamente).

A los seis meses, continuó la tendencia a disminuir el número de pares de hojas de las plantas del tratamiento T4, lo cual se relaciona con un aumento en el número de hojas escindidas. En el resto de los tratamientos, en esta etapa la tendencia fue a un incremento en el número de pares de hojas. No obstante, es de destacar que, aunque el tratamiento T3 (50 % de la concentración de MS) no difirió estadísticamente de los tratamientos con las mayores concentraciones de MS, en este caso el valor de la media fue menor y muy cercano al obtenido en la segunda evaluación, evidenciando una disminución en su ritmo de crecimiento (Figura 2).

Número de pares de hojas, de las plantas de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) subcultivadas en medio de cultivo de conservación, con diferentes concentraciones de los macro y microelementos de MS Leyenda: Tto. 1 (control): 100 %; Tto. 2: 75 %; Tto 3: 50 %; Tto. 4: 25 %. Para la misma evaluación, letras comunes no difieren significativamente (Duncan p˂0,05)

Resultados similares han sido obtenidos al realizar la conservación in vitro de segmentos nodales de cuatro genotipos de boniato (Ipomoea batatas (L.) Lam). En este caso, al evaluar la altura de los brotes sembrados en medio de cultivo con concentraciones de MS al 100 %, 75 % y 50 % y sacarosa 30 g L-1, no se obtuvieron diferencias estadísticas entre estos tratamientos. Teniendo en cuenta los porcentajes de supervivencia, resultó factible la conservación de dos de los genotipos de boniato por un período de seis meses en el tratamiento del 50 % de las sales de MS, mientras el resto fue posible conservarlo en este mismo tratamiento por un período de hasta nueve meses 14. Según algunos autores, en la conservación in vitro bajo condiciones de mínimo crecimiento, no es deseable la elongación excesiva de los explantes porque además de reducir el espacio disponible en el recipiente de cultivo, también causa el agotamiento de los nutrientes del medio y puede provocar la muerte del material vegetal 15.

Con respecto a la abscisión de las hojas, esta variable comenzó a tener incidencia a partir de los cuatro meses, cuando las plantas del tratamiento T4 fueron las más afectadas, perdiendo un promedio de 3,40 hojas, que resultó significativo con las plantas del tratamiento T3, que a su vez perdieron una media de 1,13 hojas (Figura 3). Los menores valores de abscisión foliar fueron obtenidos en las plantas de los tratamientos T1 (control) y T2, en los cuales se utilizaron las mayores concentraciones de los elementos de MS. A los seis meses se incrementó el número de hojas caídas en las plantas de todos los tratamientos, pero se mantuvieron los mismos grupos de significación. De esta forma, se evidencia que la disminución del contenido mineral en los medios de cultivo favorece el retardo en el crecimiento, debido a variaciones que ocurren en el metabolismo celular. El incremento en los valores de abscisión foliar indica que a medida que se disminuyó la concentración de sales minerales en el medio de cultivo, aumentó significativamente el deterioro y necrosis del tejido foliar 13.

Número de hojas escindidas, de las plantas de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) subcultivadas en medio de cultivo de conservación, con diferentes concentraciones de los macro y microelementos de MS Leyenda: Tto. 1 (control): 100 %; Tto. 2: 75 %; Tto 3: 50 %; Tto. 4: 25 %. Para la misma evaluación, letras comunes no difieren significativamente (Duncan p˂0,05)

Desde los cuatro meses, en las plantas de los tratamientos T3 y T4 se observó la formación de raíces (Figura 4), posiblemente como resultado de la escasez de nutrientes que influyó en que las plantas emitieran raíces que facilitaran la obtención de sustancias que se agotaron primeramente en el entorno más cercano al explante. Los porcentajes de formación de raíces fueron del 26 % en el tratamiento T3 y del 21 % en el tratamiento T4 en la segunda evaluación, y del 36 % y 23 % respectivamente, en la tercera evaluación.

En una investigación con el objetivo de preservar germoplasma de C. arabica mediante el cultivo de brotes obtenidos a partir de meristemos apicales de plantas in vitro, se ha realizado la modificación del medio de cultivo mediante la adición de los reguladores del crecimiento 6-benciladenina y zeatina a diferentes concentraciones. Cuando los meristemos del cafeto fueron cultivados en medio Murashige- Skoog (MS) suplementado con 6-benciladenina (BA) o zeatina a las concentraciones de 5 o 10 μM, se obtuvieron múltiples brotes, mientras que a menores niveles de estas hormonas (0,1 o 1 μM), se obtuvieron brotes únicos. La regeneración de las raíces solo fue posible al cultivar los brotes diferenciados en un medio MS al 50 %, libre de sacarosa y suplementado con ácido indol-butírico (AIB) 1μM, lo cual facilitó la preservación de las plantas 9.

Resulta interesante destacar que en el presente estudio, utilizando un único subcultivo en medio al 50 % de los macro y microelementos de MS y en ausencia de reguladores del crecimiento, fue posible lograr tanto el retardo del crecimiento de las plantas de cafeto, como su emisión de raíces, lo cual simplifica la composición y elaboración del medio de cultivo, así como el proceso de conservación.

Porcentaje de plantas de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) que formaron raíces al ser subcultivadas en medio de cultivo de conservación, con diferentes concentraciones de los macro y microelementos de MS Leyenda: Tto. 1 (control): 100 %; Tto. 2: 75 %; Tto 3: 50 %; Tto. 4: 25 %. Para la misma evaluación, letras comunes no difieren significativamente (Duncan p˂0,05)

A pesar de la respuesta de la emisión de raíces, las plantas del tratamiento T4, que fue el consistente en la menor concentración de los nutrientes de MS, no presentaron elevados porcentajes de supervivencia a los seis meses, ya que al parecer la carencia de macro y microelementos superó los requerimientos nutricionales de las mismas. Además, para dicha etapa, este tratamiento fue en el que se obtuvieron mayores medias de abscisión foliar y menores medias de formación de hojas (Figura 5). Sin embargo, a los dos meses estas plantas conservan valores aceptables para todas las variables evaluadas, por lo que se considera que por este período resulta factible utilizar el tratamiento del 25 % de los macro y microelementos de MS, teniendo en cuenta también que este resulta el tratamiento que permite un mayor ahorro de componentes del medio de cultivo.

Plantas <italic>in vitro</italic> de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) subcultivadas por seis meses en medio de cultivo de conservación, con la disminución al 25 % de los macro y microelementos de MS (tratamiento T4). Se observa la marchitez foliar, como indicio que generalmente precede a su abscisión

Por otra parte, a los seis meses las plantas del tratamiento T3 lograron sobrevivir en un elevado porcentaje (85 %) y tuvieron menores valores de formación de hojas que los tratamientos T1 (control) y T2 y valores de pérdida de hojas intermedios entre estos dos tratamientos y T4. Adicionalmente, un número significativo de estas plantas formaron raíces, las que posiblemente les brinden mayores posibilidades de supervivencia, debido a una mayor eficiencia ante la absorción de los nutrientes, así como un mejor sostén en el medio de cultivo.

De esta manera, se considera que el tratamiento de la reducción de macro y microelementos de MS al 50 %, resulta el más adecuado para realizar la conservación de las plantas in vitro de cafeto por seis meses (Figura 6). Lo observado con esta concentración de elementos de MS, coincide con la realizada por otros autores 10) al realizar la conservación de germoplasma de cafeto (C. arabica) mediante la encapsulación de yemas apicales. En este caso, se realizó la encapsulación de los explantes en alginato de sodio al 5 % y se les preservó a tres temperaturas en diferentes variantes de medios de cultivo. El que permitió disminuir el crecimiento por un mayor período de tiempo (12 meses), fue el medio de cultivo que contenía las sales de MS al 50 %, con sacarosa 1 % y ácido abscícico (ABA) 10 mgL-1, a una temperatura de 20 ºC.

Plantas <italic>in vitro</italic> de cafeto (<italic>C. arabica</italic>) subcultivadas por seis meses en medio de cultivo de conservación con la disminución al 50 % de los macro y microelementos de MS (tratamiento T3)

La reducción de los niveles de macro y microelementos de MS en el medio de cultivo, constituye una de las estrategias más habituales para la conservación in vitro de plantas 14. La conservación de brotes de cafeto mediante este método, resulta una forma simple y accesible a los laboratorios de recursos limitados, que puede facilitar la preservación a corto y mediano plazo de germoplasma e incluso permitir el ahorro de reactivos durante la elaboración de medio de cultivo, así como de tiempo debido a la disminución de la frecuencia de los subcultivos.

CONCLUSIONES

Resulta factible realizar la conservación de las plantas in vitro de cafeto por un período de dos y hasta seis meses, con los tratamientos de reducción de los macro y microelementos de MS al 25 % y al 50 %, respectivamente.

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The importance of the conservation of plant genetic resources is becoming higher at times when the consequences of global climate change are more acute. The coffee genus (Coffea spp) is not exempt from these risks, so it is researched some alternatives for its ex situ conservation. Specifically, the in vitro conservation methods known as 'slow growth' allow the medium-term preservation of plant material, by decreasing the growth rate and the frequency between subcultures. Studies are needed on the independent effect of variations in the concentration of essential macro and microelements in the medium-term preservation of coffee. The objective of the work was to determine the effect of the decrease of the mineral content of the culture medium in the response of in vitro coffee plants (Coffea arabica L.) preserved by a period between two and six months. The plants, previously obtained in vitro, were cultured in modified MS medium, with three treatments consisting in the reduction to 75, 50 and 25 % of their macro and microelements. The survival, the number of leaf pairs, the leaf abscission and the percentage of rooted plants were evaluated at two, four and six months. In the treatment of 50 % MS, the survival percentages varied between 85 and 100 %, and were obtained intermediate values of leaf pairs and leaf abscission, with respect to the rest of the treatments. In addition, the plants developed roots that allowed them to survive despite the lack of nutrients. With this treatment, which represents a saving of the half of the mineral components of the culture medium, it is considered feasible to preserve the coffee plants for a period up to six months.

Key words: in vitro culture in vitro plantlets mineral nutrients plant genetic resources shoots
INTRODUCTION

Coffee (Coffea spp.) plays an important role in the economy worldwide, as it represents a major source of foreign income in approximately 80 producing countries 1. It is estimated that 80% of the exported volume of coffee is currently produced in Latin American countries such as Brazil, Colombia and Costa Rica 2. In Cuba, coffee is a priority in the agriculture sector, since from it a drink of habitual consumption is obtained by the population, and also constitutes an exportable item 3.

Although the most common way to produce coffee seedlings is the use of botanical seed, the loss of their germination during storage is a problem for the propagation and conservation of their genetic resources 4. From this reality, the most widely used conservation method for coffee tree species collections are germplasm banks in field conditions. However, the threats to coffee plant genetic resources are numerous and their loss could cause significant genetic erosion to germplasm. One of the great difficulties of the ex situ collections in coffee fields is that they are often located in ecological conditions such as altitude, shading, relative humidity, which are not suitable for the survival of all plant material. Loss of plants as a result of aging, inappropriate cultivation methods, as well as pests and diseases, can cause genetic erosion, and the danger of climate change increases the urgency of conserving 1.

Therefore, other methods of ex situ conservation of coffee are studied that allow these barriers to be overcome, for example, by in vitro conservation, which constitutes one of the applications of in vitro culture. This is a valuable alternative for the germplasm preservation of botanical seed species of short viability such as coffee. It is also important for species of vegetative propagation or materials that need to be in a vegetative way propagated to maintain a particular genotype. In vitro conservation can be carried out through the methods of minimum growth and cryopreservation 5.

The minimum growth methods consist in reducing the growth rate of the plants, based on the decrease in cell division and metabolism, which is achieved by altering the optimal culture conditions. The composition of the culture medium can be varied, or the growth environment can be modified (temperature, light intensity, oxygen availability) 6. In this way, it is possible to conserve the plants in the short or medium term, which allows reduction in the frequency of subcultures and increase in vitro longevity of crops; as well as minimizing the risk of genetic changes 5,7.

Mineral nutrients are among the main components of plant tissue culture media 8, hence the cultivation of coffee has been carried out in different studies regarding the interaction between its concentration, the addition of growth regulators and osmotic regulators and temperature 9-11. However, studies on the independent effect of variations in the concentration of these essential elements on the medium-term preservation of coffee are lacking.

For all these reasons, this paper aims to determine the effect of the decrease in the mineral content of the culture medium on the response of coffee plants (Coffea arabica L.) preserved in vitro for a period between two and six months.

MATERIALS AND METHODS

The work was carried out in the Biotechnology Laboratory of the Department of Genetics and Plant Improvement of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), located in San José de Las Lajas municipality, Mayabeque province.

In order to obtain in vitro coffee plants (C. arabica) seed disinfection was previously carried out by immersion in a solution of sodium hypochlorite (2.4% active chlorine) for 90 min. The seeds were washed three times with sterile distilled water and immersed in a 0.5% boric acid solution, with stirring in orbital strainer at 150 r.p.m. for 72 h. Zygotic embryos were extracted under sterile laminar flow conditions and seeded in Murashige-Skoog (MS) culture medium 12 with 30 g L-1 sucrose, 25 mg L-1 cysteine and 5 g L-1 agar. When the embryos germinated, when the seedlings had the first pair of true leaves, they were subcultured to MS culture medium with thiamine 5 mg L-1, inositol 100 mg L-1, sucrose 30 g L-1, 6-benzyl- amino-purine (BAP) 0.5 mg L-1, acid-acetaphthalene-acetic acid (ANA) 0.3 mg L-1, gibberellic acid (AG3) 1 mg L-1 and agar 5 g L-1. Once the plants had four pairs of leaves, finger pairs of leaves, used in the conservation study were taken as donors of the apical sprouts.

The subculture for in vitro preservation was performed in different variants of MS 12 culture medium supplemented with thiamine 5 mgL-1, inositol 100 mg L-1, cysteine 25 mgL-1, sucrose 30 g L-1 and agar 5 g L-1. In order to retard the growth of in vitro coffee plants, the variants of the culture medium consisted of a decrease in the concentration of the MS salts, so that T1 (control) was constituted by 100 % of the macro and microelements of MS; T2 for 75 %; T3 for 50 % and T4 for 25 %. For each variant, 20 apical shoots were sown and 3 repetitions were performed per treatment. As sowing containers, culture tubes (25/100 mm) with 20 mL of medium were used. They were placed in the growth room at a temperature of 23 ± 2 °C, under artificial lighting with a photoperiod of 16 light hours and light intensity of 18.75 µmol m-2 s-1 and relative humidity of 85 %.

From the two months of sowing and with this frequency until the six months, the evaluations of the survival percentage, the number of pairs of leaves, the foliar abscission (number of leaves cleaved per plant) and the percentage of plants were carried out With root formation. The variables expressed as a percentage were tested for proportions using the Statgraphics Plus 5.1 program, and the rest of the variables had a simple classification variance analysis, after checking compliance with their premises, and in case of differences between the means, a means comparison test (Duncan) was performed using the SPSS 10.0 program for Windows.

RESULTS AND DISCUSSION

After two months, 100 % plant survival was achieved in all treatments. Similarly, at four months the survival of the treatment plants with the highest concentrations of DM maintained this value, however, from this stage a decrease in the survival of the T3 and T4 treatment plants began, those with the lowest concentrations of the MS elements, obtaining significant differences between them and between them and the treatments T1 (control) and T2, as seen in Figure 1.

When analyzing the third evaluation, at six months, the survival of the T3 treatment plants decreased to 85 %, which is considered high for the growing conditions. At this stage, the survival of the T4 treatment plants decreased to 53.33 %, finding significant differences with the rest of the treatments (Figure 1). These results coincide with those reported by other authors 13 when performing in vitro conservation of Spanish carnation (Dianthus caryophyllus L.), which found significant differences in the survival of plants grown in medium with 25 % reduction of the salts of MS with respect to the rest of the treatments, after three months of cultivation.

Survival percentage of coffee plants (<italic>C</italic>. <italic>arabica</italic>) subcultured in conservation culture medium, with different concentrations of MS macro and microelements Tt. 1 (control): 100 %; Tt. 2: 75 %; Tt 3: 50 %; Tt. 4: 25 %. For the same evaluation, common letters do not differ significantly (Duncan p˂0.05)

At two months, the means for the number of leaf pairs of the T1 (control), T2 and T4 treatment plants did not differ statistically, however, the plants obtained in the T3 treatment reached a number of leaf pairs mayoral rest of the treatments (Figure 2). At four months it was the T4 treatment that differed from the rest, with an average of 2.67 pairs of leaves per plant, while in the other treatments the average varied between 4.60 and 4.87 pairs of leaves (T3 treatments and T2, respectively).

At six months, the tendency to decrease the number of leaf pairs of the T4 treatment plants continued, which is related to an increase in the number of cleaved leaves. In the rest of the treatments, at this stage the tendency was to an increase in the number of pairs of leaves. However, it is noteworthy that although the T3 treatment (50 % of the DM concentration) did not differ statistically from the treatments with the highest DM concentrations, in this case the value of the mean was lower and very close to that obtained in the second evaluation, showing a decrease in its growth rate (Figure 2).

Number of leaf pairs, of coffee plants (<italic>C</italic>. <italic>arabica</italic>) subcultured in conservation culture medium, with different concentrations of MS macro and microelements Tt. 1 (control): 100 %; Tt. 2: 75 %; Tt 3: 50 %; Tt. 4: 25 %. For the same evaluation, common letters do not differ significantly (Duncan p˂0.05)

Similar results have been obtained by performing in vitro conservation of nodal segments of four sweet potato genotypes (Ipomoea batatas (L.) Lam). In this case, when evaluating the height of the shoots sown in culture medium with concentrations of 100, 75 and 50 % DM and sucrose 30 g L-1, no statistical differences were obtained between these treatments. Taking into account the survival percentages, it was feasible to preserve two of the sweet potato genotypes for a period of six months in the treatment of 50 % of the DM salts, while the rest was possible to keep it in this same treatment for a period up to nine months 14. According to some authors, in in vitro conservation under conditions of minimum growth, excessive elongation of explants is not desirable because in addition to reducing the available space in the culture vessel, it also causes the depletion of nutrients from the medium and can cause death of plant material 15.

With respect to the abscission of the leaves, this variable began to have an impact after four months, when the T4 treatment plants were the most affected, losing an average of 3.40 leaves, which was significant with the T3 treatment plants. , which in turn lost an average of 1.13 leaves (Figure 3). The lowest values of foliar abscission were obtained in the T1 (control) and T2 treatment plants, in which the highest concentrations of the MS elements were used. At six months the number of fallen leaves on the plants of all treatments was increased, but the same significance groups were maintained. In this way, it is evident that the decrease of the mineral content in the culture media favors the retardation in the growth, due to variations that occur in the cellular metabolism. The increase in foliar abscission values indicates that as the concentration of mineral salts in the culture medium decreased, the deterioration and necrosis of the foliar tissue significantly increased 13.

Number of cleaved leaves of coffee plants (<italic>C. arabica</italic>) subcultured in conservation culture medium, with different concentrations of MS macro and microelements Tt. 1 (control): 100 %; Tt. 2: 75 %; Tt 3: 50 % and Tt. 4: 25 %. For the same evaluation, common letters do not differ significantly (Duncan p˂0.05)

From the four months, in the plants of the treatments T3 and T4 the formation of roots was observed (Figure 4), possibly as a result of the shortage of nutrients that influenced the plants to emit roots that facilitated the obtaining of substances that were they sold out first in the environment closest to the explant. Root formation percentages were 26 % in the T3 treatment and 21 % in the T4 treatment in the second evaluation, and 36 and 23 % respectively, in the third evaluation.

In an investigation with the objective of preserving germplasm of C. arabica by cultivating shoots obtained from apical meristems of plants in vitro, the modification of the culture medium has been carried out by adding the 6-benzyldenine growth regulators and Zeatin at different concentrations. When coffee meristems were grown in Murashige-Skoog (MS) medium supplemented with 6-benzyladenine (BA) or zeatin at concentrations of 5 or 10 μM, multiple outbreaks were obtained, while at lower levels of these hormones (0.1 or 1 μM), single shoots were obtained. Root regeneration was only possible by growing differentiated shoots in a 50 % MS medium, free of sucrose and supplemented with 1μM indole-butyric acid (AIB), which facilitated the preservation of plants 9.

It is interesting to note that in the present study, using a single subculture in the middle of 50 % of the macro and microelements of MS and in the absence of growth regulators, it was possible to achieve both the growth retardation of coffee plants, and their emission of roots, which simplifies the composition and elaboration of the culture medium, as well as the conservation process.

Percentage of coffee plants (<italic>C. arabica</italic>) that formed roots when subcultured in conservation culture medium, with different concentrations of the macro and microelements of MS Tt. 1 (control): 100 %; Tt. 2: 75 %; Tt 3: 50 %; Tt. 4: 25 %. For the same evaluation, common letters do not differ significantly (Duncan p˂0.05)

In spite of the response of the emission of roots, the plants of the T4 treatment, which was the one consisting of the lowest concentration of the nutrients of DM, did not present high percentages of survival at six months, since apparently the lack of macro and microelements exceeded their nutritional requirements. In addition, for this stage, this treatment was in which greater means of foliar abscission and lower means of leaf formation were obtained (Figure 5). However, at two months these plants retain acceptable values for all the variables evaluated, so it is considered that for this period it is feasible to use the treatment of 25 % of the macro and microelements of MS, also taking into account that this results the treatment that allows greater savings of components of the culture medium.

<italic>In vitro</italic> coffee plants (<italic>C. arabica</italic>) subcultured for six months in conservation culture medium, with a 25 % decrease in the macro and microelements of MS (T4 treatment). Foliar wilt is observed, as evidence that generally precedes its abscission

On the other hand, at six months the T3 treatment plants managed to survive in a high percentage (85 %) and had lower leaf formation values than the T1 (control) and T2 treatments and intermediate leaf loss values between these two treatments and T4. Additionally, a significant number of these plants formed roots, which possibly give them greater chances of survival, due to greater efficiency in the absorption of nutrients, as well as a better support in the culture medium.

In this way, it is considered that the treatment of the macro and microelements reduction of MS to 50 %, is the most suitable for the conservation of in vitro coffee plants for six months (Figure 6). The observed with this concentration of MS elements, coincides with that carried out by other authors 10 when carrying out the conservation of coffee germplasm (C. arabica) by encapsulating apical buds. In this case, the explants were encapsulated in 5 % sodium alginate and preserved at three temperatures in different variants of culture media. The one that allowed the growth to be reduced for a longer period of time (12 months), was the culture medium containing the 50 % DM salts, with 1 % sucrose and 10 mgL-1 abscic acid (ABA), at a temperature of 20 °C.

<italic>In vitro</italic> coffee plants (<italic>C. arabica</italic>) subcultured for six months in conservation culture medium with a 50 % decrease in the macro and microelements of MS (T3 treatment)

The reduction of the levels of macro and microelements of MS in the culture medium is one of the most common strategies for the in vitro conservation of plants 14. The conservation of coffee sprouts by this method is a simple and accessible to laboratories with limited resources, which can facilitate the short and medium term preservation of germplasm and even allow reagent savings during the development of culture medium, as well as time due to the decrease in the frequency of subcultures.

CONCLUSIONS

It is feasible to carry out the conservation of coffee plants in vitro for a period of two and up to six months, with the macro and microelement reduction treatments of MS at 25 and 50 %, respectively.

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