ctr Cultivos Tropicales cultrop 0258-5936 1819-4087 Ediciones INCA 00009 00009 Revisión Bibliográfica Nuevos desafíos en la producción de inoculantes a partir de hongos micorrízicos arbusculares en Cuba Mujica-Pérez Yonaisy 1 * Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) San José de las Lajas Mayabeque CP 32 700 Cuba Autor para correspondencia. ymujica@inca.edu.cu 01 03 2020 Jan-Mar 2020 41 1 e09 16 05 2019 16 12 2019 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) representan un grupo de microorganismos edáficos que establecen simbiosis con numerosas especies vegetales de interés agrícola. La producción de inoculantes micorrízicos experimentó un ascenso desde la pasada década, con el surgimiento de productos en varias formulaciones orientados a garantizar su inserción en las diversas tecnologías de cultivos. Sin embargo, las experiencias prácticas con el empleo de estas formulaciones han demostrado que no existe un portador universal y que la elección de los inoculantes depende de las características de los cultivos y las condiciones para su manejo. La experiencia cubana con el manejo de la simbiosis micorrízica, empleando formulaciones sólidas, ha aportado resultados significativos a lo largo de más de 20 años de investigaciones sostenidas y representa un modelo vigente a considerar en la implementación de nuevos estudios relacionados con la inclusión de estos simbiontes en las prácticas agrícolas actuales. El siglo XXI marcó una nueva etapa en el perfeccionamiento de inoculantes a base de estos hongos con la obtención de una formulación líquida con vistas a diversificar las formas de aplicación de estos simbiontes, a partir de su inclusión en los sistemas agrícolas a través del fertirriego. En la presente revisión se abordaran aspectos relacionados con las tecnologías para la reproducción de propágulos fúngicos, la obtención de inoculantes, así como las potencialidades de la inoculación de los HMA en soporte líquido.

Palabras clave: micorriza arbuscular inoculación diversificación agricultura
INTRODUCCIÓN

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) representan un grupo de microorganismos edáficos que establecen simbiosis con numerosas especies vegetales de interés agrícola 1. Dentro de los principales beneficios de esta interacción se destacan: los efectos directos en la nutrición mineral; especialmente en la absorción de macro y micronutrientes 2,3, la inducción de tolerancia frente a condiciones de estrés biótico (ej. fitopatógenos) 4 y abiótico (ej. sequía y salinidad) 5,6, su participación en los procesos de fitorremediación 7,8 y su contribución a la estabilidad de los agregados del suelo 9.

La inoculación de las plantas ha sido el mecanismo más generalizado para la inclusión de estos simbiontes en los procesos agrícolas 10, lo cual provocó un ascenso en la producción de inoculantes micorrízicos, a partir del surgimiento de nuevas empresas y cadenas de distribuidores que orientaron sus estrategias a la obtención de productos en varias formulaciones (sólidos y líquidos) 11,12. Sin embargo, las experiencias prácticas con el empleo de estas formulaciones demostraron que no existe un portador universal 10 y algunos reportes sugieren que la elección de los inoculantes depende de las características de los cultivos y las condiciones para su manejo 13.

Las investigaciones relacionadas con el manejo de la simbiosis micorrízica en Cuba, a partir de la inoculación de formulaciones sólidas (EcoMic®), establecieron los criterios para su aplicación en correspondencia con el ambiente edáfico, lo cual contribuyó a establecer un sistema de recomendación de cepas eficientes por tipo de suelo 14 y en condiciones de suministro de nutrientes subóptimo al requerido por las plantas no micorrizadas 15. No obstante, el éxito alcanzado en nuestro país con la formulación sólida tradicional, se hizo necesario la obtención de un nuevo inoculante, en formulación líquida, que permitiera la aplicación de los HMA a través de los sistemas de fertirriego, como una forma de diversificar el uso de estos microrganismos a tecnologías de producción más actuales y reducir los volúmenes de producto a manipular 16.

El fertirriego constituye una tecnología de avanzada que optimiza el consumo de agua y nutrientes en función de las etapas fenológicas del cultivo 17. Actualmente, se potencia su implementación en nuestro país, como parte de la política agroindustrial reflejada en los lineamientos del 156, 157 y 158 del Partido Comunista de Cuba 18.

Por tal motivo, en la presente revisión se abordarán algunos aspectos relacionados con las tecnologías para la reproducción de propágulos fúngicos implicadas en la obtención de inoculantes, así como los antecedentes relacionados con el manejo de los HMA en soporte líquido.

Los hongos micorrízicos arbusculares

Las micorrizas son asociaciones mutualistas que se establecen entre determinados hongos del suelo y las raíces de la mayoría de las plantas vasculares con variados patrones morfológicos 19, pero la más común es la simbiosis micorrízica arbuscular, representada en más del 74 % de las plantas terrestres, lo cual demuestra que los caracteres genéticos esenciales para su asociación son similares en una parte extensa del reino vegetal 20. Algunas evidencias fósiles demostraron la existencia de este tipo de asociación desde hace más 450 millones de años en los tejidos de las primeras plantas terrestres 21.

A partir de los caracteres morfológicos de las esporas, se han descrito unas 244 especies de HMA 22, no obstante, se estima que dicha diversidad fúngica puede oscilar de 341 a 1600 especies considerando la secuencia del ADN ribosomal 23,24. Recientemente se reclasificaron los hongos formadores de este tipo de micorrizas al Phylum Mucoromycota y a la clase Glomeromycotina25.

El carácter de simbiontes obligados de los HMA está dado porque no pueden completar su ciclo de vida en ausencia de una raíz hospedera 19. Dentro de los factores que explica esta condición se señala el metabolismo o la absorción de carbono en el estadio presimbiótico, pues las hifas extrarradicales son incapaces de absorber carbohidratos 26. El HMA recibe el carbono proveniente de la fotosíntesis de la planta hospedera y se promueve el crecimiento del micelio formando una extensa red de hifas en el suelo que transportan el agua y los nutrientes hacia los compartimentos internos de la planta 27. Algunos estudios han estimado que entre el 4 y 17 % del carbono fotosintético es consumido por el hongo para su metabolismo (28) .

Dentro de los principales beneficios que esta simbiosis le confiere a las plantas hospederas se destacan el aumento en la absorción de agua y nutrientes 10,29, lo cual favorece el establecimiento y la supervivencia de las plantas 30,31; la tolerancia de las especies vegetales frente a condiciones de estrés biótico (fitopatógenos) y abiótico (sequía y salinidad) 32; el incremento en la disponibilidad de nutrientes para las plantas 33, lo cual permite realizar un uso racional de los fertilizantes químicos 34; además de su contribución en la estabilidad de los agregados del suelo 35 y su efecto en la restauración ecológica 34.

Metodologías empleadas en la reproducción de propágulos fúngicos. Producción de inoculantes a base de HMA

El manejo de la simbiosis micorrízica vía inoculación ha sido el mecanismo más generalizado para la inclusión de los HMA en las prácticas agrícolas actuales, en correspondencia con las características de las tecnologías de los cultivos y exigencias de cada especie vegetal 36-38.

En tal sentido, la producción de inoculantes micorrízicos experimentó un ascenso (40 %) desde la pasada década en los continentes europeo (Reino Unido, República Checa, Alemania, Suiza, España y Francia), americano (Estados Unidos, Canadá, Chile, Perú, México, Colombia, Ecuador y Guatemala) y asiático (China y Japón) 10.

De igual manera, se destacó un aumento en el registro de patentes de inoculantes micorrízicos (15 %) y en la creación de nuevas empresas y cadenas de distribuidores 11 que identificaron sus oportunidades en sectores destinados a la producción en viveros, la horticultura y plantas ornamentales 39,40, así como en la fitorremediación en suelos con altos contenidos de metales pesados 41.

En otras investigaciones se indicó que la selección y reproducción de especies de HMA constituye una etapa decisiva en proceso de formulación de los inoculantes 41 y destacaron la participación directa de las colecciones internacionales [INVAM (http://invam.wvu.edu), IBG (http://www.kent.ac.uk/bio/beg) o GINCO (http://www.mycorrhiza.be/ginco-bel/)] en el aislamiento, caracterización y multiplicación de cepas, basados en criterios relacionados con su funcionamiento (capacidad de colonización y la tasa de germinación de las esporas) 22.

Recientemente, el empleo de nuevas técnicas en algunos países desarrollados (Canadá, China, Alemania y Bélgica) ha permitido incorporar los métodos moleculares, a partir de las secuencias de genes de ADN ribosomal (ADNr) y técnicas de PCR con cebadores específicos, como una herramienta que permiten caracterizar y evaluar el comportamiento de las especies de HMA inoculadas 42,43.

Los HMA requieren de un hospedante para completar su ciclo de vida, por lo que el sistema de cultivo a partir del empleo de plantas trampa se reconoce como un método clásico y el más extendido en su reproducción 19. Para este fin pueden emplearse diversos materiales (ejemplo: suelo, turba, perlita, vermiculita, arena, arcilla, arcilla calcinada) o combinaciones de algunos de ellos 10,11,44,45.

Algunos criterios señalan que mediante esta técnica se obtienen inoculantes que pueden aplicarse desde la siembra del cultivo y en la etapa de trasplante, pero tiene como desventaja que se requieren de la esterilización del sustrato a emplear, además de que suelen ser pesados y dificulta su transportación 1,46.

En otras técnicas como el sistema hidropónico, se emplean raicillas de las plantas previamente colonizadas que se ponen en contacto con una solución nutritiva en constante movimiento. Este método tiene como inconveniente que se debe realizar un control del pH de la solución y además requieren de la aplicación de soluciones nutritivas con cierta sistematicidad 11,40.

Dichos sistemas se han perfeccionado hasta llegar a tecnologías más complejas que involucran los métodos de cultivo in vitro para la reproducción de los HMA a partir del empleo de raíces transformadas que se colonizan y subcultivan en ambientes controlados 46. Mediante esta metodología se obtiene un material homogéneo y libre de fitopatógenos, pero resulta oportuno señalar que son técnicas altamente especializadas 1.

Por otra parte, algunos proyectos de investigación se han enfocado en perfeccionar los métodos de reproducción de los HMA hacia la búsqueda de nuevas alternativas que garanticen la liberación gradual de los microorganismos al suelo tras su inoculación 47,48. En tal sentido, la inmovilización de estructuras (esporas, pequeños segmentos de hifas o raíces colonizadas) empleando la técnica de la encapsulación, por medio de portadores gelificantes u otras sustancias similares, representa un paso de avance para el manejo de nuevas formulaciones con fines agrícolas 49,50.

Los métodos de reproducción de los HMA definen, en la mayoría de los casos, el tipo de portador a emplear en la formulación de los inoculantes micorrízicos 11. Algunas investigaciones apuntan a la no existencia de un portador universal y a su vez destacan que aquel que sea seleccionado para este fin debe 51:

Proporcionar un microambiente adecuado para el microorganismo.

Poseer propiedades físicas y químicas adecuadas que garanticen la supervivencia y la estabilidad de las estructuras fúngicas.

Garantizar su compatibilidad con las nuevas tecnologías agrícolas (maquinaria) 51.

Con respecto a la composición de los inoculantes, la experiencia práctica indica que en muchos de los experimentos, independientemente de las condiciones que se evalúen y los objetivos propuestos, se realiza la aplicación de una sola especie, destacándose Rhizoglomus irregulare y Funneliformis mosseae10,52. Aspectos relacionados con su habilidad para colonizar a diversos grupos de especies vegetales, su fácil y rápida multiplicación, su resistencia a largos períodos de conservación y su amplia distribución en varios ecosistemas, hacen de estas especies simbiontes idóneos para ser utilizadas en la formulación de los inoculantes 23.

Algunos reportes señalan que una de las estrategias adoptadas por algunas compañías para potenciar la comercialización de sus formulaciones en el mercado internacional, es la obtención de inoculantes mixtos (compuestos por varias especies de HMA) o por otros microorganismos (bacterias promotoras del crecimiento vegetal) 13,40.

Los inoculantes micorrízicos que en la actualidad se comercializan pueden estar compuestos por esporas, fragmentos de raíces colonizadas e hifas o por la combinación de estos propágulos (53) y se encuentran en soporte sólidos, líquido o geles 11,40,54).

Aspectos generales de los inoculantes líquidos

Los biofertilizantes en soporte líquido son suspensiones acuosas (pueden estar compuestas por caldo de cultivos, aceites minerales u orgánicos, o polímeros) 52 que han ganado popularidad en las últimas décadas por su fácil manejo y su sincronización con las nuevas tecnologías asociadas a las prácticas agrícolas actuales 41.

En la literatura se hace referencia a que algunas ventajas de estas formulaciones pueden estar relacionadas con: (I) la alta concentración (células o microrganismos) lo que permite optimizar sus aplicaciones 55, (II) la incorporación de aditivos (sacarosa o glicerol) que favorecen la supervivencia de los microorganismos y extienden su viabilidad 50) y (III) el ajuste con los sistemas agrícolas actuales (compatibilidad con los implementos agrícolas o sistemas por fertirriego) lo que facilita su aplicación en condiciones de producción 12.

Antecedentes relacionados con la aplicación de los HMA en soporte líquido. Experiencias prácticas

La experiencia cubana con el manejo de la simbiosis micorrízica, empleando formulaciones sólidas, ha aportado resultados significativos a lo largo de más de 20 años de investigaciones sostenidas y representa un modelo vigente a considerar en la implementación de nuevos estudios relacionados con la inclusión de estos simbiontes en las prácticas agrícolas actuales.

En tal sentido, con el inoculante comercial EcoMic®, obtenido en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), se condujeron de varios experimentos en diferentes cultivos de importancia agrícola [como la soya (Glycine max L.), sorgo (Sorghum bicolor L.), arroz (Oryza sativa L.), maíz (Zea mays L.), frijoles (Phaseolus vulgaris L.), girasol (Helianthus annuus L.), yuca (Manihot esculenta ‎Crantz), trigo (Triticum aestivum L.) y hortalizas, etc.], demostrando incrementos significativos en los rendimientos entre un 15 y 40 % en dependencia de la especie vegetal 56.

De igual manera, con estas investigaciones se establecieron algunos criterios para el manejo de la simbiosis micorrízica en correspondencia con el ambiente edáfico, partiendo de la recomendación de cepas eficientes por condición edáfica 57. Asimismo, otros aportes se centraron en la integración efectiva de la simbiosis micorrízica, vía inoculación de cepas eficientes, en presencia de sistemas de suministro de nutrientes 56 y otras tecnologías de producción como el manejo de posturas de cafeto 58, abonos verdes 59, pastizales 60 y vitroplantas de banano 61.

Pero el siglo XXI marcó una nueva etapa en el perfeccionamiento de inoculantes a base de estos hongos en Cuba con la obtención de una formulación líquida LicoMic®, cuyo objetivo principal fue diversificar las formas de aplicación de estos simbiontes a partir de su inclusión en los sistemas agrícolas a través del fertirriego 16.

Inicialmente se evaluó el efecto de la aplicación de Glomus fasciculatum en soporte sólido y líquido en los cultivos de lechuga (Lactuca sativa L.), pepino (Cucumis sativus L.) y tomate (Solanum lycopersicum L.) y se demostró que ambas formulaciones incrementaron eficiencia micorrízica (25 %), extracción de nutrientes minerales y el rendimientos de los cultivos en las condiciones experimentales estudiadas 62.

Posteriormente se evaluó la viabilidad y capacidad germinativa de esporas de dos especies de Glomus en soporte líquido y se obtuvo una estabilidad superior a los ochos meses en los propágulos fúngicos, con porcentajes de colonización (25 - 28 %) que demostraron el funcionamiento de ambas especies 63.

En otros estudios se comparó la eficiencia de diferentes inoculantes micorrizógenos (EcoMic® y LicoMic®) en plantas de tomate (S. lycopersicum L.) y a pesar de las variaciones en la colonización micorrízica marcadas por las etapas de desarrollo del cultivo, se incrementaron los valores fúngicos (50 %) en la etapa de fructificación en presencia de la inoculación líquida 64.

De igual forma se evaluó el efecto de la aplicación de dos inoculantes micorrízicos (líquido y sólido) en el cultivo de trigo duro (Triticum durum L.) en condiciones de campo y se demostró la acción positiva de ambas formulaciones en las variables relacionadas con el funcionameinto micorrízico, el estado nutricional y el rendimiento del cultivo 65.

En otras investigaciones se evaluó el efecto de la inoculación en soporte líquido de Glomus hoi en el crecimiento y producción de arroz (Oryza sativa L. 'INCA-LP5') en condiciones de salinidad y se demostró la efectividad de dicho inoculante al estimular el crecimiento, desarrollo y la producción del cultivo 66.

Posteriormente, se condujeron otros ensayos para estudiar el efecto protector de Glomus iranicum var tenuihypharum inoculado en soporte líquido en plantas de durillo (Viburnum tinus) tratadas con aguas residuales y se encontró una colonización eficiente en las raíces del cultivo con incrementos significativos en los niveles de glomalina y carbono en el suelo 67.

Otros autores comprobaron la viabilidad funcional de Glomus cubense en soporte líquido en condiciones controladas y demostraron que dicho inoculante conservó su estabilidad y favoreció los indicadores de crecimiento en plantas de sorgo (10 %) (S. bicolor L. Moench) 68.

Otras investigaciones se realizaron para conocer el efecto de diferentes dosis de un inoculante micorrizógeno en soporte líquido (75, 150 y 300 esporas por planta) en las variables del crecimiento, las relaciones hídricas y la eficiencia en el aprovechamiento de los nutrientes de plantas de tomate (S. lycopersicum L.). Los resultados mostraron, que con cualquiera de las dosis aplicadas se favoreció la simbiosis, con incrementos en las variables fúngicas, el contenido de biomasa seca, las relaciones hídricas y la mejor eficiencia en la utilización de los nutrientes en comparación con las plantas no micorrizadas 69.

CONCLUSIONES

Con los resultados anteriormente quedó demostrado que la inoculación de los HMA en formulación líquida indujo respuestas positivas en las plantas micorrizadas, sim embargo, resulta importante destacar que los estudios desarrollados hasta el momento con este inoculante no varían los criterios de selección de cepas ya establecidos con el inoculo sólido, con lo cual se favorece el manejo de la simbiosis para diferentes agroecosistemas.

Estos aspectos sugieren que el manejo de los HMA en formulación líquida puede ser efectivo tanto como el inoculante sólido y permite establecer nuevas vías para el manejo de estos simbiontes, con vistas a diversificar sus formas de aplicación a través de los sistemas de fertirriego y favorecer las producciones agrícolas.

Por lo tanto, el empleo de los HMA en formulación líquida puede convertirse en una práctica agrícola que enfrenta nuevos desafíos y enfoques en el manejo de estos simbiontes ante las diferentes tecnologías de cultivos vigentes en el modelo agrícola cubano.

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Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are an edaphic microorganisms group that establish symbiosis with numerous plant species of agricultural interest. Production of mycorrhizal inoculants has experienced an increase since the last decade, with the emergence of products in various formulations aimed at guaranteeing their insertion in the different crop technologies. However, practical experiences with the use of these formulations have shown that there is no universal carrier and that the choice of inoculants depends on the characteristics of the crops and the conditions for their management. Cuban’s experience with the mycorrhizal symbiosis’s management, using solid formulations, has provided significant results over more than 20 years of sustained research and represents a current model to be considered in the implementation of new studies related with the inclusion of these symbionts in current agricultural practices. The 21st century marked a new stage in the improvement of inoculants based on these fungi with the obtaining of a liquid formulation with a view to diversify the forms of application of these symbionts, from their inclusion in agricultural systems through fertigation. In the present review aspects related to the technologies for the reproduction of fungal propagules, the inoculants productions, as well as the potentialities of the AMF inoculation in liquid support will be addressed.

Key words: arbuscular mycorrhizae inoculation diversification agriculture
INTRODUCTION

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) represent a group of edaphic microorganisms that establish symbiosis with numerous plant species of agricultural interest 1. Among the main benefits of this interaction are: the direct effects on mineral nutrition; especially in the absorption of macro and micronutrients 2,3, the induction of tolerance against conditions of biotic (eg phytopathogenic) 4 and abiotic (eg drought and salinity) 5,6, their participation in phytoremediation processes 7,8 and their contribution to the stability of soil aggregates 9.

The inoculation of the plants has been the most generalized mechanism for the inclusion of these symbionts in the agricultural processes 10, which caused an increase in the production of mycorrhizal inoculants, from the emergence of new companies and chains of distributors that guided its strategies to obtain products in various formulations (solids and liquids) 11,12. However, practical experiences with the use of these formulations showed that there is no universal carrier 10 and some reports suggest that the choice of inoculants depends on the characteristics of the crops and the conditions for their management 13.

Research related to the management of mycorrhizal symbiosis in Cuba, based on the inoculation of solid formulations (EcoMic®), established the criteria for its application in correspondence with the edaphic environment, which contributed to establishing a strain recommendation system Efficient by soil type 14 and under suboptimal nutrient supply conditions to that required by non-mycorrhized plants 15. However, the success achieved in our country with the traditional solid formulation, it was necessary to obtain a new inoculant, in liquid formulation, that would allow the application of AMF through fertigation systems, as a way to diversify the use of these microorganisms to more current production technologies and reduce the volumes of product to be handled 16.

Fertigation is an advanced technology that optimizes the consumption of water and nutrients based on the phenological stages of the crop 17. Currently, its implementation in our country is enhanced, as part of the agroindustrial policy reflected in the guidelines of 156, 157 and 158 of the Communist Party of Cuba 18.

For this reason, in this review some aspects related to the technologies for the reproduction of fungal propagules involved in obtaining inoculants will be addressed, as well as the background related to the management of AMF in liquid support.

Arbuscular mycorrhizal fungi

Mycorrhizae are mutualistic associations that are established between certain soil fungi and the roots of most vascular plants with varied morphological patterns 19, but the most common is arbuscular mycorrhizal symbiosis, represented in more than 74 % of plants terrestrial, which demonstrates that the essential genetic characters for their association are similar in a large part of the plant kingdom 20. Some fossil evidence demonstrated the existence of this type of association for more than 450 million years in the tissues of the first land plants 21.

From the morphological characters of the spores, about 244 species of AMF have been described 22, however, it is estimated that this fungal diversity can range from 341 to 1600 species considering the sequence of the ribosomal DNA 23,24. Recently the fungi forming this type of mycorrhizae were reclassified to the Phylum Mucoromycota and the Glomeromycotina class 25.

The character of obligated symbionts of HMAs is given because they cannot complete their life cycle in the absence of a host root 19. Among the factors that explain this condition, the metabolism or the absorption of carbon in the presimbiotic stage is indicated, since extra-radical hyphae are unable to absorb carbohydrates 26. HMA receives carbon from the photosynthesis of the host plant and mycelium growth is promoted by forming an extensive network of hyphae in the soil that transport water and nutrients to the internal compartments of the plant 27. Some studies have estimated that between 4 and 17 % of photosynthetic carbon is consumed by the fungus for its metabolism 28.

Among the main benefits that this symbiosis confers on the host plants are the increase in the absorption of water and nutrients 10,29, which favors the establishment and survival of the plants 30,31; the tolerance of plant species against conditions of biotic (phytopathogenic) and abiotic (drought and salinity) stress 32; the increase in nutrient availability for plants 33, which allows a rational use of chemical fertilizers 34; In addition to its contribution to the stability of soil aggregates 35 and its effect on ecological restoration 34.

Methodologies used in the reproduction of fungal propagules. Production of inoculants based on HMA

The management of mycorrhizal symbiosis via inoculation has been the most widespread mechanism for the inclusion of AMF in current agricultural practices, corresponding to the characteristics of crop technologies and requirements of each plant species 36-38.

In this sense, the production of mycorrhizal inoculants experienced a rise (40 %) since the last decade in the European continents (United Kingdom, Czech Republic, Germany, Switzerland, Spain and France), American (United States, Canada, Chile, Peru, Mexico, Colombia, Ecuador and Guatemala) and Asian (China and Japan) 10.

Similarly, an increase in the registration of mycorrhizal inoculants (15 %) and in the creation of new companies and distributor chains 11 that identified their opportunities in sectors for nursery production, horticulture and ornamental plants 39,40, as well as in phytoremediation in soils with high heavy metal contents 41.

Other research indicated that the selection and reproduction of HMA species constitutes a decisive stage in the process of formulating the inoculants 41 and highlighted the direct participation of international collections [INVAM (http://invam.wvu.edu) , IBG (http://www.kent.ac.uk/bio/beg) or GINCO (http://www.mycorrhiza.be/ginco-bel/)] in the isolation, characterization and multiplication of strains, based on criteria related to their functioning (colonization capacity and spore germination rate) 22.

Recently, the use of new techniques in some developed countries (Canada, China, Germany and Belgium) has allowed the incorporation of molecular methods, based on ribosomal DNA gene sequences (rDNA) and PCR techniques with specific primers, such as tool that allows characterizing and evaluating the behavior of inoculated AMF species 42,43.

HMAs require a host to complete their life cycle, so that the cultivation system from the use of trap plants is recognized as a classic method and the most widespread in its reproduction 19. Various materials can be used for this purpose (example: soil, peat, perlite, vermiculite, sand, clay, calcined clay) or combinations of some of them 10,11,44,45.

Some criteria indicate that through this technique inoculants are obtained that can be applied from the sowing of the crop and at the stage of transplantation, but it has a disadvantage that they require sterilization of the substrate to be used, in addition to being usually heavy and difficult to transport (1.46).

In other techniques such as the hydroponic system, rootlets of previously colonized plants are used that come into contact with a nutrient solution in constant motion. This method has the disadvantage that a pH control of the solution must be carried out and they also require the application of nutritive solutions with a certain systematicity 11,40.

These systems have been refined to reach more complex technologies that involve in vitro culture methods for the reproduction of AMF from the use of transformed roots that are colonized and subcultured in controlled environments 46. Through this methodology, a homogeneous material free of phytopathogens is obtained, but it is appropriate to point out that they are highly specialized techniques 1.

On the other hand, some research projects have focused on improving the methods of reproduction of AMF towards the search for new alternatives that guarantee the gradual release of microorganisms to the soil after inoculation 47,48. In this sense, the immobilization of structures (spores, small segments of hyphae or colonized roots) using the encapsulation technique, by means of gelling carriers or other similar substances, represents a step forward for the management of new formulations for agricultural purposes 49,50.

HMA reproduction methods define, in most cases, the type of carrier to be used in the formulation of mycorrhizal inoculants 11. Some research points to the non-existence of a universal carrier and, in turn, highlights that the one selected for this purpose must 51:

Provide a suitable microenvironment for the microorganism.

To possess adequate physical and chemical properties that guarantee the survival and stability of fungal structures.

Ensure its compatibility with new agricultural technologies (machinery) 51.

With regard to the composition of the inoculants, practical experience indicates that in many of the experiments, regardless of the conditions being evaluated and the proposed objectives, the application of a single species is carried out, highlighting Rhizoglomus irregularulare and Funneliformis mosseae10,52. Aspects related to their ability to colonize various groups of plant species, their easy and rapid multiplication, their resistance to long conservation periods and their wide distribution in various ecosystems, make these species suitable symbionts to be used in the formulation of inoculants 2,3.

Some reports indicate that one of the strategies adopted by some companies to enhance the commercialization of their formulations in the international market, is to obtain mixed inoculants (composed of several species of AMF) or by other microorganisms (plant growth promoting bacteria) ( 13,40).

The mycorrhizal inoculants that are currently marketed can be composed of spores, colonized root fragments and hyphae or by the combination of these propagules 53 and are found in solid, liquid or gels support 11,40,54.

General aspects of liquid inoculants

Biofertilizers in liquid support are aqueous suspensions (they can be composed of crop broth, mineral or organic oils, or polymers) 52 that have gained popularity in recent decades for their easy handling and their synchronization with the new technologies associated with current agricultural practices 41.

Reference is made in the literature that some advantages of these formulations may be related to: (I) the high concentration (cells or microorganisms) which allows optimizing their applications 55, (II) the incorporation of additives (sucrose or glycerol ) that favor the survival of microorganisms and extend their viability 50 and (III) the adjustment with current agricultural systems (compatibility with agricultural implements or fertigation systems) which facilitates their application under production conditions 12.

Background related to the application of AMF in liquid support. Practical experiences

The Cuban experience with the management of mycorrhizal symbiosis, using solid formulations, has provided significant results over more than 20 years of sustained research and represents a current model to consider in the implementation of new studies related to the inclusion of these symbionts in current agricultural practices.

In this sense, with the commercial inoculant EcoMic®, obtained at the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), several experiments were conducted on different crops of agricultural importance [such as soybeans (Glycine max L.), sorghum (Sorghum bicolor L .), rice (Oryza sativa L.), corn (Zea mays L.), beans (Phaseolus vulgaris L.), sunflower (Helianthus annuus L.), cassava (Manihot esculenta Crantz), wheat (Triticum aestivum L.) and vegetables, etc.], demonstrating significant increases in yields between 15 and 40 % depending on the plant species 56.

Similarly, with these investigations some criteria were established for the management of mycorrhizal symbiosis in correspondence with the edaphic environment, based on the recommendation of efficient strains by edaphic condition 57. Likewise, other contributions focused on the effective integration of mycorrhizal symbiosis, via inoculation of efficient strains, in the presence of nutrient supply systems 56 and other production technologies such as coffee tree posture management 58, green manures 59, grassland 60 and banana in vitro plants 61.

But the 21st century marked a new stage in the improvement of inoculants based on these fungi in Cuba with the obtaining of a liquid formulation LicoMic®, whose main objective was to diversify the ways of application of these symbionts from their inclusion in the systems agricultural through fertigation 16.

Initially, the effect of Glomus fasciculatum application on solid and liquid support on lettuce (Lactuca sativa L.), cucumber (Cucumis sativus L.) and tomato (Solanum lycopersicum L.) crops was evaluated and both formulations increased mycorrhizal efficiency (25 %), extraction of mineral nutrients and crop yields under the experimental conditions studied 62.

Subsequently, the viability and germinative capacity of spores of two Glomus species in liquid support was evaluated and stability was obtained greater than eight months in fungal propagules, with colonization percentages (25-28 %) that demonstrated the functioning of both species 63.

In other studies, the efficiency of different mycorrhizal inoculants (EcoMic® and LicoMic®) in tomato plants (S. lycopersicum L.) was compared and despite the variations in mycorrhizal colonization marked by the stages of crop development, the fungal values (50 %) in the fruiting stage in the presence of liquid inoculation 64.

Similarly, the effect of the application of two mycorrhizal inoculants (liquid and solid) in the cultivation of durum wheat (Triticum durum L.) under field conditions was evaluated and the positive action of both formulations on the variables related to Mycorrhizal function, nutritional status and crop yield 65.

In other investigations, the effect of Glomus hoi liquid support inoculation on the growth and production of rice (Oryza sativa L. 'INCA-LP5') under salinity conditions was evaluated and the effectiveness of said inoculant in stimulating growth was demonstrated, development and crop production 66.

Subsequently, other trials were conducted to study the protective effect of Glomus iranicum var tenuihypharum inoculated in liquid support in durillo plants (Viburnum tinus) treated with wastewater and an efficient colonization was found in the roots of the crop with significant increases in the levels of Glomalin and carbon in the soil 67.

Other authors verified the functional viability of Glomus cubense in liquid support under controlled conditions and demonstrated that said inoculant retained its stability and favored growth indicators in sorghum plants (10 %) (S. bicolor L. Moench) 68.

Other investigations were carried out to know the effect of different doses of a mycorrhizal inoculant in liquid support (75, 150 and 300 spores per plant) in the variables of growth, water relations and efficiency in the use of nutrients from tomato plants (S. lycopersicum L.). The results showed that symbiosis was favored with any of the applied doses, with increases in fungal variables, dry biomass content, water relations and better efficiency in nutrient utilization compared to non-mycorrhized plants 69.

CONCLUSIONS

With the results previously, it was shown that the inoculation of AMF in liquid formulation induced positive responses in mycorrhized plants, however, it is important to highlight that the studies developed so far with this inoculant do not vary the criteria for selection of established strains with solid inoculum, which favors the management of symbiosis for different agroecosystems.

These aspects suggest that the management of AMF in liquid formulation can be effective as well as the solid inoculant and allows establishing new avenues for the management of these symbionts, with a view to diversifying their forms of application through fertigation systems and favoring Agricultural productions

Therefore, the use of AMF in liquid formulation can become an agricultural practice that faces new challenges and approaches in the management of these symbionts in the face of the different crop technologies in force in the Cuban agricultural model.

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