Pérez-Pérez, Oudot, Hernández, Nápoles, Pérez-Martínez, and Castillo: Aislamiento y caracterización de Stenotrophomonas asociada a rizosfera de maíz (Zea Mays L.)
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Aislamiento y caracterización de Stenotrophomonas asociada a rizosfera de maíz (Zea Mays L.)


RESUMEN

La inoculación de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal en cultivos de interés agrícola como el maíz, constituye una alternativa económica y ambientalmente amigable a la fertilización química. Stenotrophomonas es un género bacteriano común en muchos tipos de suelos y rizosferas de diferentes cultivos y presenta mecanismos de promoción del crecimiento como la fijación biológica del nitrógeno, solubilización de minerales y producción de fitohormonas. En consecuencia, el presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar e identificar molecularmente cepas de Stenotrophomonas provenientes de la rizosfera de maíz. Para ello se realizó un aislamiento a partir de suelo rizosférico y rizoplano y se seleccionaron colonias con características culturales semejantes a las descritas para este género. También se tuvieron en cuenta las características microscópicas y la capacidad para realizar la fijación biológica de nitrógeno, solubilizar diferentes fuentes de fosfato y potasio y la actividad antagónica frente a Fusarium oxysporum. La identificación molecular se realizó por secuenciación del ADNr 16S. Se obtuvieron un total de 20 aislados con características culturales, morfológicas y fisiológicas coincidentes con el género en cuestión. De estos 15 solubilizaron al menos una de las fuentes de fosfato utilizadas, dos solubilizaron las fuentes de potasio y seis mostraron antagonismo frente al patógeno. Siete aislados fueron identificados como Stenotrophomonas y el resto se incluyó en tres géneros, pertenecientes también al filo Proteobacteria. El aislado más integral en cuanto a los atributos positivos evaluados, fue INCA-FRr1 identificado como Stenotrophomonas. Este podría constituir un inoculante promisorio para el maíz y otros cultivos.


INTRODUCCIÓN

El maíz es un componente importante en la alimentación humana y animal. Es cultivado en las más diversas condiciones edáficas y ecológicas dada su alta plasticidad y su producción y consumo a nivel mundial, alcanzan las más elevadas cifras en comparación con otros cultivos 1. Sin embargo, la disponibilidad de ciertos nutrientes, propiciada generalmente por la fertilización mineral, fundamentalmente nitrógeno, potasio y fósforo, es esencial para obtener rendimientos aceptables. Si bien la aplicación de estos insumos permite obtener rendimientos representativos, también constituyen un alto costo para el proceso productivo e impacta de forma negativa sobre el agroecosistema 2.

La utilización de biofertilizantes a base de Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR por sus siglas en inglés) resulta una alternativa viable para disminuir la carga de fertilizante mineral que se aplica cada año en la agricultura. Estos biopreparados resultan inocuos al ambiente, aumentan los rendimientos de los cultivos y disminuyen los costos de producción 3.

El género Stenotrophomonas se ha descrito como microbiota rizosférica de diferentes cultivos, incluido el maíz 4-7 y se considera una PGPR por los diferentes mecanismos de promoción del crecimiento vegetal que presenta. Estos incluyen la Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN), solubilización de sales de fosfato, producción de índoles 6 y síntesis de ACC desaminasa 8.

En Cuba no existen estudios relacionados con la interacción Stenotrophomonas-maíz, ni con el uso del género para la explotación agrícola, por lo que el presente trabajo se propone aislar, identificar y caracterizar Stenotrophomonas de la rizosfera de maíz, así como determinar el efecto de su inoculación en condiciones controladas.

MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo

El muestreo se realizó en la finca El Mulato en el municipio San José de las Lajas, Mayabeque. El maíz estaba cultivado en suelo Ferralítico Rojo Lixiviado Típico eútrico 9 con Phaseolus vulgaris L. como cultivo precedente. Se establecieron cinco puntos de muestreo aleatorios y de cada uno de ellos se tomaron dos plantas, para un total de 10. La extracción se realizó tomando un volumen de suelo de 20 cm3 aproximadamente. Las muestras se colocaron en bolsas de polietileno, por separado, y antes de las dos horas se conservaron en el laboratorio a 4 ºC hasta su uso.

Aislamiento de Stenotrophomonas de la rizosfera de maíz

El aislamiento se realizó a partir de suelo rizosférico y rizoplano de plantas de maíz, siguiendo la metodología propuesta por Granada 5. Para el aislamiento del suelo rizosférico, se pesaron muestras de 1 g y se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-6 en agua destilada estéril. Se tomaron 100 μL de las suspensiones (10-4 - 10-6) y se sembraron por diseminación en medio LB con tres réplicas cada una. Las placas se incubaron a 28 ºC durante 48 h.

Para el aislamiento del rizoplano, se cortaron las raíces en porciones de 1 cm de largo y se colocaron en frascos Erlenmeyers con 10 mL de agua destilada estéril. Estos se mantuvieron en agitación durante 1 h a 150 rpm y se les aplicó la misma metodología del suelo rizosférico.

Las raíces cortadas se colocaron en placas con medio LB y se incubaron a 28 ºC durante 48 h. Posteriormente, se tomaron asadas del crecimiento bacteriano que se visualizó alrededor y sobre las raíces y se aislaron en el mismo medio con iguales condiciones.

Caracterización de Stenotrophomonas aislada de la rizosfera de maíz
Caracterización cultural y morfológica

Para la caracterización cultural se tuvo en cuenta la coloración, la mucosidad y la morfología de la colonia. Las que presentaron coloración traslúcida, mucosidad ligera, bordes lisos y elevación plana 5, fueron purificadas mediante pases sucesivos por estría en medio LB. Luego se realizó la tinción de Gram y se seleccionaron los aislados gramnegativos, con morfología bacilar o cocobacilar y no esporulados, que posteriormente se sembraron por punción en los medios carentes de nitrógeno, Rennie y JMV. Los aislados que crecieron en estos medios se clasificaron como nitrofijadores.

Caracterización como PGPR

En este ensayo se evaluó la capacidad de los aislados para solubilizar fósforo y potasio, además se determinó la actividad antagónica frente a Fusarium oxysporum.

La solubilización de fosfato se determinó en medio NBRIP utilizando el indicador púrpura de bromocresol; además se probaron tres fuentes de fósforo inorgánico diferentes: fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2), fosfato de aluminio (AlPO4) y fosfato de hierro (FePO4). Las bacterias se sembraron por puntos de alrededor de 0,5 cm de diámetro a razón de cinco aislados por placa y se establecieron tres réplicas por cada uno. Las placas se incubaron a 28 ºC durante 48 h. Se tomaron como resultados positivos aquellos aislados que presentaron un halo amarillo alrededor del crecimiento, indicando la solubilización de las sales de fosfato.

Siguiendo el mismo procedimiento, se determinó la capacidad de solubilización de potasio en el medio Alexandrov, utilizando como fuentes de potasio el hidrógeno fosfato dipotásico (K2HPO4) y el óxido de potasio (K2O). Las placas se incubaron a 28 ºC durante 48 h y se tomaron como resultados positivos los aislados que presentaron halo de solubilización alrededor de las colonias.

Para determinar la actividad antagónica frente a la cepa Fusarium oxysporum EC20-E-GM (perteneciente al cepario del laboratorio de fitopatología del Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador), se procedió al corte del micelio con bisturí estéril. Este fue colocado en tubo Falcon con 20 mL de agua destilada estéril y posteriormente se añadieron balines de acero esterilizados, de 4 mm de diámetro. Se agitó vigorosamente el frasco de forma manual durante 5 min y se filtró el contenido con un tamiz de 40 μm montado sobre un tubo Falcón estéril. Se sembraron por diseminación 200 μl de la solución tamizada en Agar Papa Dextrosa y sobre esto se sembraron los aislados bacterianos en forma de punto a razón de cuatro aislados por placa. La incubación fue a 28 ºC durante siete días. Se tomaron como resultados positivos a la actividad antagónica los aislados que presentaron halo de inhibición del crecimiento fúngico con un radio mayor de 0,5 mm.

Identificación por secuenciación del gen ADNr 16S
Extracción del ADN genómico

La extracción del material genético se realizó por lisis alcalina. Se tomó una colonia del cultivo axénico y se colocó en Eppendorf con 40 μl de NaOH a 0,20 M. Posteriormente se calentó en microondas a 10 % de potencia de 700 W por un minuto e inmediatamente se enfrió en hielo durante 5 min. Las células lisadas se centrifugaron durante 10 min a 10,000 gravedades. Se tomó el sobrenadante y se realizó la cuantificación de ácidos nucleicos por espectrofotometría, utilizando el NanoDropTM 2000 a 260 nm y se calculó la razón 260/280 y 260/230 en búsqueda de determinar la concentración y calidad del ADN, respectivamente.

Amplificación y secuenciación del ADNr 16S

Para la amplificación se utilizaron 25 μl de la mezcla de PCR que contenía 1 μl del extracto crudo conteniendo ADN, 1 μl (10 μM) de los cebadores universales 27F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘) y 1492R (5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3‘) 10, que permiten obtener amplicones de alrededor de 1500 pb, y GoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, USA). La amplificación se realizó en un termociclador MS mini (Major Science, USA) bajo los siguientes parámetros: desnaturalización inicial 95 °C por 10 minutos y desnaturalización adicional de1 minuto a 92 °C, 35 ciclos de 72 °C cada uno, durante 2 minutos. Los productos de la amplificación se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % (1 g de agarosa en 150 mL de buffer TAE 1X) a 80 V durante 45 min. La secuenciación se realizó por el método de Sanger en la compañía Macrogen®.

Edición de secuencias e identificación

Se realizó un análisis de calidad de las secuencias obtenidas mediante el programa FinchTV (ver. 1.4.0) (Geospiza Inc.) usando como criterio de aceptación un valor de calidad (Q) igual o superior a 20 por base. Posteriormente se analizaron usando el programa BLASTn 11. El valor de corte utilizado fue de 1 x 10-5, con una cobertura mínima de aproximadamente el 80 %. La depuración y el alineamiento de las secuencias obtenidas se realizaron usando la herramienta de alineación de secuencias múltiples ClustalW 12 en el programa MEGA-X (ver. 10.0.4) 13.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de Stenotrophomonas de la rizosfera de maíz

Se obtuvieron 59 aislados totales, de los cuales el 72,9 % provino del rizoplano y el 27,1 % del suelo rizosférico de las plantas de maíz. La riqueza nutricional que representa el rizoplano lo convierte en una zona atractiva para el establecimiento de poblaciones microbianas. Los exudados radicales, cuyas concentraciones son máximas a nivel de rizoplano, constituyen importantes fuentes de carbono para muchos microorganismos edáficos 14.

Caracterización de Stenotrophomonas aislada de la rizosfera de maíz
Caracterización cultural y morfológica

Los 59 aislados obtenidos presentaron colonias planas, traslúcidas, ligeramente mucosas y con bordes lisos, características semejantes a las descritas por Granada 5. De estos, el 86,4 % (51 aislados) resultaron gramnegativas y, a su vez, el 94,1 % (48 aislados) coincidió con las especificaciones morfológicas propuestas para el género Stenotrophomonas: bacilos o cocobacilos gramnegativos, no esporulados. En el suelo se desarrollan muchos géneros bacterianos; sin embargo, en números absolutos, existe un predominio de bacterias gramnegativas sobre las grampositivas 15. En el caso particular de la rizosfera, las raíces tienen una influencia directa en la composición y densidad de la microbiota del suelo. La liberación de sustancias orgánicas vegetales favorece el establecimiento de poblaciones microbianas heterótrofas que, en su mayoría, comprenden bacilos gramnegativos y actinomicetos 15.

El género Stenotrophomonas presenta la capacidad de realizar la FBN, por lo que se utilizaron los medios Rennie y JMV para descartar aquellos aislados que no realizan esta función y el 41,7 % (20 aislados) crecieron en los medios. Los suelos Ferralíticos Rojos son los más comunes en la llanura Habana-Matanzas, zona que contempla el área muestreada. Por lo general, la productividad de estos suelos es alta debido a la profundidad y características de sus horizontes; sin embargo, son pobres en materia orgánica y presentan una baja fertilidad 9, lo cual puede traducirse en pobres concentraciones de nitrógeno. Estas características podrían favorecer la proliferación y actividad de microorganismos diazotróficos como Stenotrophomonas. La FBN ocurre en función de la concentración del elemento en el medio, respondiendo al principio de economía celular. La presencia de altas concentraciones de compuestos nitrogenados inhibe la síntesis de la nitrogenasa, enzima responsable del proceso, mediante la represión de la expresión de los genes nif que la codifican. De esta manera, el microorganismo utiliza preferentemente estos elementos como fuente de nitrógeno, en lugar de realizar un proceso que implica un alto consumo energético, como lo es la FBN. Por otro lado se plantea que cualquier deficiencia en los compuestos nitrogenados orgánicos e inorgánicos, estimula la fijación microbiana de N216,17.

Los medios utilizados en el aislamiento de bacterias nitrofijadoras carecían totalmente de fuentes de nitrógeno e incluían en su composición, la sal molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4.2H2O) como fuente de molibdeno, componente estructural de la enzima nitrogenasa 17. Ambos aspectos favorecieron la síntesis y actividad de la enzima y, por lo tanto, permitieron el crecimiento microbiano en estas condiciones.

Caracterización como PGPR

Los 20 aislados que mostraron la capacidad de realizar la FBN, crecieron en el medio NBRIP. La fuente de carbono presente en dicho medio es la glucosa, que constituye el azúcar más utilizado como fuente de carbono en los medios de cultivo y son pocos los microorganismos con la incapacidad de metabolizarla 17.

El 75 % (15 aislados) de estos aislados desarrollaron halo de solubilización frente a las diferentes fuentes de fósforo utilizadas (Tabla 1).

El fosfato de aluminio fue la fuente menos consumida, con nueve aislados; mientras que el fosfato tricálcico y el fosfato de hierro fueron más exitosos con 13 y 15 aislados, respectivamente. El contenido de hierro en los suelos Ferralíticos Rojos es elevado 9, por lo que es más probable que el fosfato establezca uniones con los iones férricos en comparación con otros iones y, a su vez, los microorganismos presentes en estos suelos estén más familiarizados con estos compuestos.

La formación de los halos de solubilización se produce como consecuencia del intercambio catiónico que realizan ácidos orgánicos secretados por las bacterias. Estos compuestos convierten el fosfato insoluble a formas solubles de la sal 18.

Por otro lado, la presencia o no del halo alrededor de la colonia no es criterio suficiente para clasificar a los microorganismos como solubilizadores de fósforo 19. La solubilización de sales de fósforo pudiera ocurrir por la unión de un agente quelante a los cationes, desplazando a los grupos fosfatos. Estas reacciones, aunque permiten la solubilización del fosfato no producen halo en el medio de cultivo; por lo que si bien no se puede descartar la posibilidad de que algunos de los aislados aquí estudiados no tengan la capacidad de solubilizar alguna de las sales de fosfato empleadas, sí pudieran existir aislados con potencialidades solubilizadoras y por la metodología empleada no se han podido determinar 20.

En cuanto a la solubilización de potasio, el 60 % (12 aislados) crecieron en el medio Aleksandrov y de estos el 16,6 % (2 aislados) desarrollaron halo de solubilización. Este medio tiene como fuente de carbono y componente mayoritario la sacarosa, disacárido que no constituye la fuente de carbono más atractiva para la mayoría de los microorganismos.

Algunos autores asocian la solubilización de potasio con la producción de ácidos de origen microbiano 21 . Éste pudiera haber sido el mecanismo empleado para formar el halo de solubilización. Sin embargo, al igual que en la solubilización de fosfato, hay estudios que indican que esta ocurre sin la liberación de ácidos al medio y, por consiguiente, sin la disminución del pH 22.

La actividad antagónica frente a Fusarium oxysporum fue positiva en el 30 % (6 aislados). El maíz en los ambientes tropicales es atacado por un gran número de patógenos que causan importantes daños económicos a su producción. Entre estos destacan especies del género Fusarium23 causantes de pudriciones de mazorca, que además de reducir el rendimiento son causa del deterioro y mala calidad de los granos y debido a la capacidad de producir micotoxinas, también están relacionadas con enfermedades en sus comensales 24.

Identificación por secuenciación del gen ADNr 16S

Se identificaron cuatro géneros bacterianos pertenecientes al Phylum Proteobacteria, grupo especialmente abundante en la rizosfera durante los diferentes estadíos fenológicos del maíz 25,26. Estos incluyeron a Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium y Stenotrophomonas con un porciento de identidad mayor o igual a 97 en el 95 % de los casos (Tabla 2).

Los géneros más representativos fueron Stenotrophomonas y Pseudomonas, para un 35 % del total en cada caso (7 aislados). Resultados similares fueron obtenidos por otros autores 6 en rizosfera de Daucus carota L. En menor medida se identificaron los géneros Rhizobium y Enterobacter con un 25 % (5 aislados) y 5 % (1 aislado) de aparición, respectivamente.

Es común encontrar reportes de patogenicidad asociado a los géneros Stenotrophomonas, Pseudomonas y Enterobacter, en humanos, en animales e incluso en plantas 27-30. Sin embargo, en muchas ocasiones, la presencia de factores de virulencia y la patogenicidad de los microorganismos se restringen a especies, e incluso a cepas específicas dentro de un género 17. El carácter patogénico que pudieran presentar algunos de estos géneros, no resta mérito a las potencialidades bioestimulantes que desarrollan en plantas; aunque no quedan eximidos de los exámenes eco-toxicológicos establecidos para la explotación agrícola de microorganismos.

El género Pseudomonas se ha reportado ampliamente como PGPR de diversas plantas incluyendo las gramíneas 5,6,15,31. Es frecuente que las poblaciones de Pseudomonas sobresalgan por encima de otros géneros diazotróficos, debido a su corto período de latencia, rápida tasa de crecimiento y versatilidad metabólica 32. Por otro lado, Enterobacter se ha descrito como microorganismo rizosférico y sobre todo, como endófito de diferentes especies vegetales; destacando por sus características como promotores del crecimiento 33,34.

En el caso del género Rhizobium, se han realizado aislamientos como endófitos de maíz 35 y en menor medida, de la rizosfera 36, fundamentalmente en suelos donde se aplica el sistema de rotación de cultivo con alguna especie leguminosa. El uso de Phaseolus vulgaris L. como cultivo de rotación en este estudio, pudo haber favorecido el establecimiento de poblaciones de rizobios, puesto que esta leguminosa presenta mayor susceptibilidad a la colonización y establecimiento de la simbiosis con especies del género Rhizobium, con respecto a otros géneros de rizobios 37.

Stenotrophomonas se ha aislado de diversos ambientes, desde diferentes tipos de suelos hasta tractos intestinales de animales 38, lo cual resalta el carácter ubicuo de esta bacteria. La especie Stenotrophomonas pavanii se utiliza en procesos de biorremediación a nivel industrial 39 y agrícola 40, mientras que Stenotrophomonas maltophilia tiene un comportamiento contrastante en los diferentes hábitats que ocupa.

Esta especie es común en ambientes intrahospitalarios y algunas cepas están descritas como potentes agentes nosocomiales; sin embargo, se describe como parte de la microbiota edáfica normal y se asocia a muchos cultivos de interés agrícola sin ocasionar daños a los mismos 41. De igual forma ocurre con Stenotrophomonas rhizophila, que muestra un gran potencial para promover el crecimiento de las plantas como la soya 42, algodón, tomate y pimiento entre otros; y es considerada microbiota planctónica de ambientes marinos 43.

En este estudio el aislado más integral en cuanto a los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal evaluados, fue INCA-FRr1, identificado como Stenotrophomonas rhizophila. La capacidad de solubilizar diferentes fuentes de fósforo y potasio, de realizar la FBN y la actividad antagónica frente a fitopatógenos, además de otras características positivas que no se demostraron en este estudio pero que son conocidas 6; representan ventajas claras con respecto a otros géneros bacterianos rizosféricos 43; por el contrario, utilizan una cepa de Stenotrophomonas rhizophila que no presenta la capacidad de realizar la FBN y aun así obtienen resultados importantes en cuanto a desarrollo de variables como: altura, longitud de tallo y raíz, biomasa seca área y foliar en plantas de albahaca.

Esto podría sugerir la presencia de otros mecanismos de promoción del crecimiento vegetal. En ensayos de co-inoculación de Stenotrophomonas rhizophila con Hongos Micorrízicos Arbusculares (HMA), en comparación con las inoculaciones simples, se percibe un aumento en el crecimiento de las plantas y en el contenido de clorofilas 44; por consiguiente, la bacteria también es calificada como potenciadora de la micorrización (termino conocido como Mycorrhiza Helper Bacteria, MHB) 45,46.

El éxito de la utilización de bioproductos radica, entre otros aspectos, en la obtención de cepas compatibles al cultivo en cuestión 47 y eficientes para la lograr los rendimientos deseados. De esta forma, la utilización de PGPR nativas como inoculantes, promueve el manejo ecológico-sostenible de los agroecosistemas y podría mejorar la producción de maíz. La capacidad de las cepas nativas para interactuar positivamente con la microbiota edáfica residente y su adaptabilidad a las condiciones climáticas y agroecológicas locales, a menudo potencia su rendimiento en comparación con cepas alóctonas.

CONCLUSIONES

  • En la rizosfera de maíz cultivado en suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico-eútrico, de la provincia de Mayabeque, coexisten poblaciones bacterianas diazotróficas correspondientes a los géneros Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium y Enterobacter. De manera integral, el aislado INCA-FRr1 correspondiente al género Stenotrophomonas, sobresale por sus características promotoras del crecimiento vegetal y podría constituir un inoculante promisorio para cultivos de interés agrícola y para el propio cultivo del maíz.

  • El estudio de la rizosfera y el conocimiento de su composición microbiana, es clave para la concepción de productos biológicos eficientes y compatibles dentro de una agricultura sostenible.

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Los autores de este trabajo declaran no presentar conflicto de intereses.

Este artículo se encuentra bajo licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional (CC BY-NC 4.0)

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Isolation and characterization of Stenotrophomonas asociated to maize (Zea Mays L.) rhizosphere


ABSTRACT

The inoculation of plant growth-promoting rhizobacteria in agricultural interest crops such as maize constitutes an economically and environmentally friendly alternative to chemical fertilization. Stenotrophomonas is a common bacterial genus in many soil types and rhizospheres of different crops, and presents mechanisms for growth promotion such as biological nitrogen fixation, mineral solubilization and phytohormones production. Consequently, the present work aimed to characterize and molecularly identify Stenotrophomonas strains from the maize rhizosphere. For this, an isolation was performed from rhizospheric and rhizoplane soil and colonies with cultural characteristics similar to those described for this genus were selected. The microscopic characteristics and the ability to perform the biological nitrogen fixation solubilize different phosphate and potassium sources and the antagonistic activity against Fusarium oxysporum were also taken into account. Molecular identification was performed by 16S rDNA sequencing. Twenty isolates with cultural, morphological and physiological characteristics coinciding with the genus in question were obtained. From these 15 solubilized at least one of the phosphate sources used, two solubilized the potassium sources and six showed antagonism against the pathogen. Seven isolates were identified as Stenotrophomonas and the rest were included in three genera, also belonging to the Proteobacteria phylum. The integral isolate in terms of positive attributes evaluated was INCA-FRr1 identified as Stenotrophomonas. This could be a promising inoculant for maize and other crops.


INTRODUCTION

Corn is an important component in human and animal nutrition. It is cultivated in the most diverse edaphic and ecological conditions given its high plasticity; and its production and consumption worldwide, reach the highest figures compared to other crops 1. However, the availability of certain nutrients, generally caused by mineral fertilization, mainly nitrogen, potassium and phosphorous, is essential to obtain acceptable yields. Although the application of these inputs makes it possible to obtain representative yields, they also constitute a high cost for the production process and negatively influence the agroecosystem 2.

The use of biofertilizers based on Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) is a viable alternative to decrease the load of mineral fertilizer applied every year in agriculture. These biopreparations are harmless to the environment, increase crop yields and decrease production costs 3.

The Stenotrophomonas genus has been as a rhizospheric microbiota of different crops described, including corn 4-7, and it is considered a PGPR due to the different mechanisms of promotion of plant growth it presents. These include Biological Nitrogen Fixation (FBN), solubilization of phosphate salts, production of indoles 6) and synthesis of ACC deaminase 8.

In Cuba, there are no studies related to the Stenotrophomonas-corn interaction, nor with the use of the genus for agricultural exploitation, therefore, the present work intends to isolate, identify and characterize Stenotrophomonas from the corn rhizosphere, as well as to determine the effect of their inoculation under controlled conditions.

MATERIALS AND METHODS
Sampling

The sampling was carried out at the El Mulato farm in San José de las Lajas municipality, Mayabeque. The corn was cultivated in Ferralitic Red Leachate Typical eutric 9) with Phaseolus vulgaris L. as the preceding crop. Five random sampling points were established and two plants were from each of them taken, for 10. The extraction was carried out taking a volume of soil of approximately 20 cm3. The samples were placed in separate polyethylene bags, and before two hours were stored in the laboratory at 4 ºC until use.

Isolation of Stenotrophomonas from the Corn Rhizosphere

Isolation was made from rhizospheric soil and rhizoplane from corn plants following the methodology proposed by Granada 5. For rhizospheric soil isolation, 1 g samples were weighed and serial dilutions of 10-1 to 10-6 were made in sterile distilled water. The 100 µl of the suspensions (10-4-10-6) were by dissemination in LB medium, taken and sown with three replicates each. The plates were at 28 °C for 48 hours incubated.

For rhizoplane isolation, roots were into 1 cm long portions cut and placed in Erlenmeyers bottles with 10 mL of sterile distilled water. These were kept in agitation for 1h at 150 rpm and the same rhizospheric soil methodology was applied to them.

The cut roots were with LB medium plated and incubated at 28 °C for 48 h. Subsequently, roasts were taken from the bacterial growth that was visualized around and on the roots and isolated in the same medium with the same conditions.

Characterization of Stenotrophomonas isolated from the corn rhizosphere
Cultural and morphological characterization

For the cultural characterization, the coloration, mucus and morphology of the colony were taken into account. Successive striating in LB medium purified those with translucent coloration, light mucus, smooth edges and flat elevation 5. Then Gram staining was performed and gram-negative isolates with bacillary or cocobacillary morphology and non-sporulated were selected, which were subsequently punctured in the nitrogen-free media, Rennie and JMV. The isolates that grew in these media were as nitrofixers classified.

Characterization as PGPR

In the test, the capacity of the isolates to solubilize phosphorus and potassium was evaluated, in addition the antagonistic activity against Fusarium oxysporum was determined.

Phosphate solubilization was determined in NBRIP medium using the bromocresol purple indicator, In addition, three different sources of inorganic phosphorus were tested: tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2), aluminum phosphate (AlPO4) and iron phosphate (FePO4). The bacteria were by spots around 0.5 cm in diameter seeded, at the rate of five isolates per plate, and three replicates were for each one established. The plates were at 28 °C for 48 hours incubated. Those isolates that showed a yellow halo around the growth were taken as positive results, indicating the solubilization of the phosphate salts.

Following the same procedure, the solubilization capacity of potassium in the Alexandrov medium was determined using dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) and potassium oxide (K2O) as potassium sources. The plates were at 28 °C incubated for 48 h and the isolates that had a solubilization halo around the colonies were as positive results taken.

To determine the antagonistic activity against the Fusarium oxysporum EC20-E-GM strain (belonging to the strain of the plant pathology laboratory of the Center for Biotechnological Research of Ecuador), the mycelium was cut with a sterile scalpel. This was in a Falcon tube placed with 20 ml of sterile distilled water and subsequently sterilized steel pellets, 4 mm in diameter were added. The bottle was shaken vigorous and manually for 5 min and the contents were filtered with a 40-µm sieve mounted on a sterile Falcon tube. The 200 µl of the sieved solution were seeded in Potato Dextrose Agar, and the bacterial isolates were spotted on this point at the rate of four isolates per plate. Incubation was at 28 °C for 7 days. The isolates that showed a fungal growth inhibition halo with a radius greater than 0.5 mm were as positive results for the antagonistic activity taken.

Identification by sequencing of the 16S rDNA gene
Genomic DNA extraction

The extraction of the genetic material was carried out by alkaline lysis. A colony was from the axenic culture taken and placed in Eppendorf with 40 μl of NaOH at 0.20 M. It was then at 10 %, power of 700 W for one minute microwaved and immediately cooled on ice for 5 min. The lysed cells were for 10 min at 10,000 gravities spun. The supernatant was taken and the nucleic acid quantification was performed by spectrophotometry using the NanoDropTM 2000 at 260 nm, and the ratio 260/280 and 260/230 were calculated in search of determining the concentration and quality of the DNA, respectively.

Amplification and sequencing of 16S rDNA

For the amplification, 25 µl of the PCR mixture containing 1 µl of the crude extract containing DNA, 1 µl (10 µM) of the universal primers 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') and 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-) were used. 3') (10), which allow obtaining amplicons of around 1500 bp, and GoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, USA). Amplification was performed in an MS mini thermocycler (Major Science, USA) under the following parameters: initial denaturation 95 °C for 10 minutes and additional denaturation for 1 minute at 92 °C, 35 cycles of 72 °C each, for 2 minutes. Amplification products were verified by 1 % agarose gel electrophoresis (1 g agarose in 150 mL of 1X TAE buffer) at 80 V for 45 min. The reaction products were purified using the prior to sequencing, was performed by the Sanger method at the Macrogen® Company (Republic of Korea)

Editing sequences and identification

A quality analysis was performed of the sequences obtained using the FinchTV program (ver. 1.4.0) (Geospiza Inc.) using as a criterion of acceptance a quality value (Q) equal to or greater than 20 per base. They were subsequently analyzed using the BLASTn program 11. The cutoff value used was 1 x 10-5, with a minimum coverage of approximately 80 %. The debugging and alignment of the obtained sequences were performed using the ClustalW multiple sequence alignment tool 12 in the MEGA-X program (ver. 10.0.4) 13.

RESULTS AND DISCUSSION
Isolation of Stenotrophomonas from the corn rhizosphere

The 59 total isolates were obtained, of which 72.9 % came from the rhizoplane and 27.1 % from the rhizospheric soil of corn plants. The nutritional wealth that the rhizoplane represents makes it an attractive area for the establishment of microbial populations. Radical exudates, whose concentrations are highest at the rhizoplane level, constitute important sources of carbon for many edaphic microorganisms 14.

Characterization of isolated Stenotrophomonas from the corn rhizosphere
Cultural and morphological characterization

The 59 isolates obtained presented flat, translucent, mucous colonies with smooth edges, characteristics similar to those described by other author 5. From these, 86.4 % (51 isolates) were gram-negative and, in turn, 94.1 % (48 isolates) coincided with the proposed morphological specifications for the genus Stenotrophomonas: gram-negative bacilli or cocobacilli not sporulated. Many bacterial genera develop in the soil, however, in absolute numbers; there is a predominance of gram-negative bacteria over gram-positive bacteria 15. In the particular case of the rhizosphere, the roots have a direct influence on the composition and density of the soil microbiota. The release of organic plant substances favors the establishment of heterotrophic microbial populations that, for the most part, comprise gram-negative bacilli and actinomycetes 15.

The genus Stenotrophomonas presents the ability to perform the FBN, so the Rennie and JMV media were used to rule out those isolates that do not perform this function; and 41.7 % (20 isolates) grew in the media. Red Ferralitic soils are the most common in the Habana-Matanzas plain, an area that includes the sampled area. In general, the productivity of these soils is high due to the depth and characteristics of their horizons; however, they are poor in organic matter and have low fertility 9, which can translate into poor nitrogen concentrations. These characteristics could favor the proliferation and activity of diazotrophic microorganisms such as Stenotrophomonas. FBN occurs as a function of the concentration of the element in the medium, responding to the principle of cellular economy. The presence of high concentrations of nitrogenous compounds inhibits the synthesis of nitrogenase, the enzyme responsible for the process, by repressing the expression of the nif genes that encode it. In this way, the microorganism preferably uses these elements as a nitrogen source, instead of carrying out a process that involves high-energy consumption, such as FBN. On the other hand, it is argued that any deficiency in organic and inorganic nitrogenous compounds stimulates N2 microbial fixation (16, 17).

The means used in the isolation of nitrofixing bacteria were completely devoid of nitrogen sources and included in its composition, sodium molybdate salt dihydrate (Na2MoO4.2H2O) as a source of molybdenum, a structural component of the enzyme nitrogenase 17. Both aspects favored the synthesis and activity of the enzyme, and therefore allowed microbial growth under these conditions.

Characterization as PGPR

The 20 isolates that showed the ability to perform the FBN, grew in the NBRIP medium. The carbon source present in said medium is glucose, which constitutes the sugar most used as a carbon source in culture media; and there are few microorganisms with the inability to metabolize it 17.

The 75 % (15 isolates) of these isolates developed a solubilization halo against the different phosphorus sources used (Table 1).

Aluminum phosphate was the least consumed source, with nine isolates; while tricalcium phosphate and iron phosphate were more successful with 13 and 15 isolates respectively. The iron content in Red Ferralitic soils is high 9, making it more likely that phosphate will establish bonds with ferric ions compared to other ions, and in turn, the microorganisms present in these soils are more familiar with these compounds.

The formation of the solubilization halos occurs because of the cation exchange carried out by organic acids secreted by the bacteria. These compounds convert insoluble phosphate to soluble forms of the salt 18.

On the other hand, the presence or not of the halo around the colony is not a sufficient criterion to classify the microorganisms as phosphorus solubilizers 19. The solubilization of phosphorous salts could occur by the binding of a chelating agent to the cations, displacing the phosphate groups. These reactions, although they allow the phosphate to be solubilized, do not produce halo in the culture medium. Therefore, although the possibility that some of the isolates studied here may not have the ability to solubilize any of the phosphate salts used, it cannot be ruled out that there may be isolates with solubilizing potentialities and, due to the methodology used, it has not been possible to determine 20.

Regarding the solubilization of potassium, 60 % (12 isolates) of the isolates grew in Aleksandrov's medium and of these, 16.6 % (2 isolates) developed a halo of solubilization. This medium has as its carbon source and the main component sucrose. Disaccharide that not constitute the most attractive carbon source for most microorganisms.

Some authors associate the solubilization of potassium with the production of acids of microbial origin 21. This could have been the mechanism used to form the solubilization halo. However, as in the phosphate solubilization, there are studies that indicate that this occurs without the release of acids into the medium, and therefore without the decrease in pH 22.

The antagonistic activity against Fusarium oxysporum was positive in 30 % (6 isolates) of the isolates. A large number of pathogens that cause significant economic damage to its production attacks corn in tropical environments. These include species of the genus Fusarium23 that cause ear rot, which, in addition to reducing yield, cause deterioration and poor quality of grains, and due to the ability to produce mycotoxins, they are also to diseases in their diners related 24.

Identification by sequencing of the 16S rDNA gene

Four bacterial genera belonging to the Phylum Proteobacteria were identified, a group especially abundant in the rhizosphere during the different phenological stages of maize 25,26. These included Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium and Stenotrophomonas with a percentage of identity greater than or equal to 97 in 95 % of cases (Table 2).

The most representative genera were Stenotrophomonas and Pseudomonas for 35 % of the total in each case (7 isolates). Similar results were obtained in the Daucus carota L. rhizosphere 6. To a lesser extent, the genera Rhizobium and Enterobacter were identified with 25 % (5 isolates) and 5 % (1 isolate) of appearance respectively.

It is common to find reports of pathogenicity associated with the genera Stenotrophomonas, Pseudomonas and Enterobacter, in humans, animals and even plants 27-30. However, on many occasions, the presence of virulence factors and the pathogenicity of microorganisms are restricted to species, and even to specific strains within a genus 17. The pathogenic character that some of these genera may present does not detract from the biostimulant potentialities that they develop in plants; although they are not exempt from the eco-toxicological tests established for the agricultural exploitation of microorganisms.

The genus Pseudomonas have been widely reported as PGPR of various plants including grasses 5,6,15,31. Populations of Pseudomonas frequently stand out above other diazotrophic genera due to their short latency period, rapid growth rate, and metabolic versatility 32. On the other hand, Enterobacter has been described as a rhizospheric microorganism and, above all, as an endophyte of different plant species; standing out for its growth promoting characteristics 33,34. In the case of the Rhizobium genus, isolations have been made as endophytes of corn 35 and to a lesser extent of the rhizosphere 36; mainly in soils where the crop rotation system is applied with some legume species. The use of Phaseolus vulgaris L. as a rotation culture in this study, may have favored the establishment of rhizobia populations, since this legume presents greater susceptibility to colonization and symbiosis with species of the Rhizobium genus with respect to other genera rhizobia 37.

Stenotrophomonas has been isolated from various environments, from different soil types to animal intestinal tracts 38, which highlights the ubiquitous character of this bacterium. The Stenotrophomonas pavanii species is in bioremediation processes at industrial 39 and agricultural 40 levels used, while Stenotrophomonas maltophilia has a contrasting behavior in the different habitats it occupies. This species is common in hospital settings and some strains are as powerful nosocomial agents described; however, it is described as part of the normal edaphic microbiota and is associated with many crops of agricultural interest without causing damage to them 41. Likewise, it occurs with Stenotrophomonas rhizophila, which shows great potential to promote the growth of plants such as soybeans 42, cotton, tomato and pepper, among others; and it is considered a planktonic microbiota of marine environments 43.

In this study, the most comprehensive isolate in terms of the plant growth promotion mechanisms evaluated was INCA-FRr1, identified as Stenotrophomonas rhizophila. The ability to solubilize different sources of phosphorus and potassium, to perform FBN and antagonistic activity against phytopathogens, in addition to other positive characteristics that were not in this study demonstrated but are known 6; they represent clear advantages over other rhizospheric bacterial genera 43. On the contrary, they use a strain of Stenotrophomonas rhizophila that does not present the ability to perform the FBN and still obtain important results in terms of development of variables such as height, stem and root length, dry area and leaf biomass in basil plants. This could suggest the presence of other mechanisms for promoting plant growth. In co-inoculation tests of Stenotrophomonas rhizophila with Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF), compared to simple inoculations, an increase in plant growth and chlorophyll content is observed 44; consequently, the bacterium is also classified as a mycorrhizal enhancer (term known as Mycorrhiza Helper Bacteria, MHB) (45, 46).

The success of bioproduct use lies, among other aspects, in obtaining strains compatible with the crop in question 47 and efficient for achieving the desired yields. In this way, the use of native PGPRs as inoculants promotes ecological-sustainable management of agroecosystems as well as, could improve corn production. The ability of native strains to interact positively with the resident soil microbiota and their adaptability to local climatic and agro-ecological conditions often enhances their performance compared to non-native strains.

CONCLUSIONS

  • Diazotrophic bacterial populations coexist in the genus Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium and Enterobacter. In an integral way, the INCA-FRr1 isolate corresponding to the genus Stenotrophomonas, stands out for its characteristics that promote plant growth and could constitute a promising inoculant for crops of agricultural interest and for the cultivation of corn itself.

  • The study of the rhizosphere and the knowledge of its microbial composition is key to the conception of efficient and compatible biological products within a sustainable agriculture

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