COMUNICACIÓN CORTA

 

La kinetina ribósido como estimulador de la germinación In Vitro de esporas de Glomus clarum

 

The kinetin riboside as In Vitro stimulator of Glomus clarum spores germination

 

 

Dra.C. Kalyanne Fernández Suárez, Dr.C. Eduardo Pérez Ortega, Laura R. Medina García

Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32700.

 

 

RESUMEN

La micorrización de plantas in vitro constituye hoy en día un reto de la biotecnología agrícola y depende en gran medida del potencial germinativo de los propágulos de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) utilizados, en especial las esporas, sus habilidades colonizativas y de los sistemas y medios de cultivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos concentraciones (0,05 mg L-1 y 0,07 mg L-1) de la auxina AIA y la citoquinina kinetina ribósido en la germinación y el crecimiento del tubo germinativo in vitro de esporas de G. clarum en medio de cultivo E (MS modificado). Se utilizó además el medio E y el SRM como controles. Todos los medios de cultivo influyeron sobre el comportamiento de ambas variables. La concentración de kinetina ribósido de 0,07 mg L-1 tuvo un efecto positivo sobre el porcentaje de germinación, alcanzándose valores en este medio cercanos al 100 %, transcurridos 10 días de incubación. Estos valores fueron estadísticamente similares a los encontrados en el medio SRM. Sin embargo, los mayores valores de crecimiento del tubo germinativo se obtuvieron en el medio SRM y superaron en un 45 % aproximadamente a los alcanzados en medio E combinado con la concentración de kinetina ribósido de 0,07 mg L-1. Las concentraciones de AIA utilizadas tuvieron un efecto inhibitorio sobre la germinación e igualmente sobre el crecimiento de los tubos germinativos.

Palabras clave: mycorrhizae, sustancias de crecimiento vegetal, germinación de esporas, micelio.

ABSTRACT

Nowadays the in vitro mycorrhization of plants is a challenge in agricultural biotechnology and it depends of the germination potential of arbuscular mycorrhizal fungal (AMF) propagules, specially the spores, their colonization abilities and the media and systems of culture. The aim of this work was to evaluate the effect of two concentrations (0,05 mg L-1 y 0,07 mg L-1) of the auxin AIA and the cytochinin kinetin riboside on in vitro germination and germinative tube length of G. clarum spores in E medium (modified MS). E and MSR media were used as controls. All culture media had influence on both variables performance. The concentration of kinetin riboside of 0,07 mg L-1 had a positive effect on germination percentage, reaching values of 100 % in that medium after 10 days of incubation. Those values were statistically similar to those founded in MSR medium. However, the highest values of germinative tube length were obtained in MSR medium and they were 45 % higher to those measured in E medium combined with kinetin riboside (0,07 mg L-1). The AIA concentrations used had an inhibitory effect on spore germination and also on the germinative tubes growth.

Key words: mycorrhizae, plant growth substances, spores germination, mycelium.

 

 

INTRODUCCIÓN

La capacidad de los Hongos Micorrízicos Arbusculares (HMA) de aumentar el crecimiento y la sobrevivencia de las plantas ha despertado el interés de los científicos en todo el mundo. En la actualidad se ha potenciado el uso de estos microorganismos como sustitutos de fertilizantes químicos y plaguicidas, en armonía con el desarrollo de prácticas de producción agrícola sostenibles (1).

La micorrización de plantas in vitro constituye hoy en día un reto de la biotecnología agrícola y depende en gran medida del potencial germinativo de los propágulos de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) utilizados, en especial las esporas, de sus habilidades colonizativas y de los sistemas y medios de cultivo. El perfeccionamiento metodológico continuo de los sistemas de cultivo (composición de los medios de cultivo y las condiciones ambientales de crecimiento) contribuirá al desarrollo de sistemas que garanticen la producción masiva de plantas micorrizadas in vitro (2).

El medio de cultivo E (3) fue diseñado para sustituir el medio SRM (Strullu y Romand modificado), comúnmente utilizado para el cultivo in vitro de los HMA, ya que este no garantiza los requerimientos nutricionales de las plantas de papa in vitro. Este medio se obtuvo a partir de modificaciones realizadas al medio MS (Murashige & Skoog), para garantizar la micorrrización de plantas de papa (Solanum tuberosum L. cv. Desiré) con el HMA G. clarum (Nicolson & Schenck), en sistemas de cultivo parcialmente in vitro (3). Sin embargo, en sistemas totalmente in vitro, también estudiados por el mismo autor, en los que usualmente se producen las plantas en estas condiciones, no se logró la germinación de las esporas en el medio EA, o no ocurrió con la rapidez necesaria. La causa probable de la ausencia o retardo en la germinación fue la presencia de etileno en los envases (2), conocido regulador del crecimiento vegetal que puede influir negativamente en la germinación de esporas de HMA (4, 5) y es producido por las plantas de papa cuando se cultivan en envases cerrados (6).

La germinación de esporas es uno de los procesos más importantes durante el ciclo de vida de estos hongos, de la cual va a depender, en gran medida, el éxito del establecimiento de la simbiosis (7), tanto en condiciones naturales como in vitro. Aunque las esporas, por lo general, no necesitan de factores externos para germinar (8), este es un proceso complejo que está influido por dormancia y almacenamiento, pH, temperatura, humedad, luz, aireación (oxígeno, CO2), iones inorgánicos, microorganismos, agentes oxidantes, antibióticos y pesticidas. Otras investigaciones más recientes reconocen también a factores radicales liberados por el hospedero conocidos como proteínas, CO2, flujo de protones extracelulares y estrigolactonas (9) como estimuladores de la germinación de esporas (10) y el crecimiento y la ramificación hifal presimbióticos (11, 12).

Otros reguladores del crecimiento como auxinas o citoquininas podrían tener determinada influencia sobre la germinación de esporas de HMA, ya que se conoce que las plantas micorrizadas varían los niveles de estas hormonas en relación con las plantas no micorrizadas (13), modifican su potencial colonizativo y se discute la posibilidad de que estos hongos produzcan alguna de ellas (13).

Por todo lo expuesto anteriormente, el propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de la auxina AIA y la citoquinina kinetina ribósido en la germinación y el crecimiento del tubo germinativo de esporas de G. clarum en medio de cultivo E.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Para dar cumplimiento al objetivo propuesto se realizó un experimento con dos repeticiones en el tiempo, en condiciones controladas de laboratorio, en el cual se evaluó el efecto de dos reguladores del crecimiento sobre la germinación y el largo del tubo germinativo in vitro de esporas del HMA G. clarum - MUCL 46238, aislado de un ecosistema cubano.

Las esporas de G. clarum utilizadas, de cuatro meses de cultivo, se adquirieron en GINCO (Colección in vitro de Glomeromycota, BCCM/MUCL, Unidad de Microbiología, Universidad católica de Lovaina, Lovaina la Nueva, Bélgica, http://www.mbla.ucl.ac.be/ginco-bel) y fueron suministradas en placas Petri de 90 mm de diámetro, en asociación con raíces transformadas (Ri T-DNA) de zanahoria (Daucus carota L.) en medio SRM (Strullu y Romand modificado) (14), solidificado con 3 g L-1 de Gel Gro®.

Las esporas se extrajeron del cultivo después de solubilizar el medio SRM con una solución de ácido cítrico (1,92 g 100 mL-1) y citrato de sodio (2,94 g 100 m L-1) (15) y mantenidas en agua desionizada estéril hasta su utilización. Posteriormente, se inocularon en medio E (MS modificado) (3) sin azúcar y sin vitaminas combinado con dos concentraciones (0,05 mg L-1 y 0,07 mg L-1) de kinetina ribósido (Duchefa Biochemie) y ácido indol acético (AIA - Sigma) y se utilizaron los medios E y SRM como controles.

Se inocularon cinco esporas por placa Petri de 90 mm de diámetro con ayuda de una micropipeta Eppendorf (20 µL) y se utilizaron 10 placas para cada medio de cultivo. Posteriormente, se sellaron las placas con Parafilm (Pechiney, PlasticPackaging, Chicago, IL 60631) y se incubaron a 27 oC hasta finalizar los estudios.

Evaluaciones

Se determinó el porcentaje de germinación (%) y la longitud del tubo germinativo (mm) de las esporas. La germinación se monitoreó cada dos días después de la incubación y hasta los 16 días. Se consideró una espora germinada cuando se apreció crecimiento del tubo germinativo a partir del esporóforo o del extremo de la hifa de sostenimiento, en el caso de que la espora tuviese. La longitud del tubo germinativo se evaluó al finalizar el experimento (16 días) empleando un micrómetro. Las evaluaciones se realizaron utilizando un microscopio de disección (10-40X, Olympus SZ40, Olympus Optical GmbH, Alemania).

Análisis estadístico

Después de comprobada la normalidad y la homogeneidad de varianza (Test de Brown-Forsythe), utilizando el paquete estadístico Statistica, los datos fueron sometidos a Análisis de Varianza de clasificación simple y posterior Test de Tuckey, con el fin de identificar las diferencias significativas entre los tratamientos a p<0,05. Los valores de porcentaje de germinación fueron transformados, según la expresión arcsen√/100 y comprobada su distribución normal. Con los valores de ambas variables se calcularon los intervalos de confianza de la media al 95 % de probabilidad, atendiendo al número de repeticiones y la reproducibilidad de los datos.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al evaluar el efecto de las dos concentraciones de kinetina ribósido y AIA en medio E sobre el porcentaje de germinación de esporas de G. clarum (Figura 1), se obtuvo un efecto diferenciado de los medios de cultivo sobre la variable, apreciable desde los primeros cuatro días de incubación.



Los porcentajes de germinación de las esporas comenzaron a aumentar gradualmente a medida que transcurrieron los días, alcanzando un valor máximo para cada medio de cultivo en el día 10. A partir de este momento los valores de la variable se mantuvieron constantes hasta el día 16 en que finalizó el experimento, siendo mayores en las esporas que se encontraban en los medios E-kinetina 2 (0,07 mg L-1) y el medio SRM, sin diferencias significativas entre ellos. A los 16 días, prácticamente el 100 % de las esporas se encontraban germinadas en estos dos medios.

Los tubos germinativos observados mostraban un crecimiento típico de G. clarum con gran cantidad de contenido citoplasmático (Figura 2) y se extendían rectos dentro de los medios de cultivo, sin apreciarse efecto de la composición de los medios sobre su comportamiento, aunque sí sobre la longitud de los mismos.



En la Figura 3 puede observarse el efecto de la composición de los medios sobre el crecimiento de los tubos germinativos de esporas de G. clarum. A diferencia del porcentaje de germinación, los mayores valores de esta variable se obtuvieron en el medio SRM, utilizado comúnmente para el cultivo in vitro de HMA en raíces transformadas, seguido por el medio E combinado con 0,07 mg L-1 de kinetina ribósido, que en este caso mostró valores 45 % menores que los encontrados en medio SRM.



En ambos medios los valores de crecimiento de los tubos germinativos superaron estadísticamente a los observados en el resto de los medios de cultivo. Los menores valores de esta variable se obtuvieron en los medios que contenían AIA.

Las plantas micorrizadas incrementan la acumulación de citoquininas tanto en raíces como en tallos, por lo que es obvio que existe una estrecha relación entre el establecimiento micorrízico y la evolución de esta fitohormona en las diferentes partes del vegetal (12).

Si bien no existen informes en la literatura consultada que destaquen un efecto directo de las citoquininas sobre los eventos previos al proceso colonizativo de los hongos micorrízicos, no caben dudas que en el caso de este experimento existe evidencia directa de que la kinetina ribósido, a la concentración de 0,07 mg L-1 en el medio E, estimula significativamente la germinación de esporas de G. clarum y el crecimiento de los tubos germinativos.

No obstante, en el caso de los hongos ectomicorrízicos, sí existen evidencias de que las citoquininas producidas por las plantas estimulan las ramificaciones del micelio (13). Si esto se confirmara, sería evidente que las hifas de los hongos micorrízicos tienen receptores, al menos, para algunas fitohormonas y estas podrían jugar un rol en la fase asimbiótica de su ciclo de vida.

Determinados metabolitos secundarios radicales como los flavonoides o terpenoides, dependiendo de la especie de planta, aunque no son esenciales en la simbiosis micorrízica arbuscular, pueden afectar la germinación de las esporas, la producción de ramificaciones hifales y la colonización radical (10, 11, 12). Los isoflavonoides tienen estructuras similares a estrógenos y en R. intraradices se ha demostrado que existen sitios de unión similares a los que utilizan los estrógenos, que al parecer juegan un papel en la regulación del crecimiento de la hifa (16).

Por otra parte, ha sido clonado un cDNA de R. intraradices (Ginmyc1) con una secuencia similar a una proteína receptora de hormona esteroide y los productos del gen han sido detectados solo en las hifas externas, lo cual sugiere que puedan jugar un papel en el estadio de precolonización (17).

En el medio E combinado con cualquiera de las dos concentraciones de AIA se obtuvieron valores de germinación menores significativamente que en las esporas incubadas en los otros medios de cultivo. Estos valores no superaron el 50 % de germinación, manifestando un efecto inhibitorio de esta hormona, a la concentración utilizada, sobre el comportamiento de la variable.

Es probable que las concentraciones de AIA empleadas hayan tenido un efecto negativo sobre la germinación y el crecimiento de los tubos germinativos, teniendo en cuenta los estudios realizados por Cecep et al. (7), al inocular, conjuntamente con las esporas, bacterias aisladas del exterior de esporas de G. sp., en condiciones in vitro. Según estos autores los efectos encontrados en el comportamiento de ambas variables estuvieron relacionados con la producción de AIA por parte de las cepas bacterianas empleadas. Si la concentración de AIA se encontraba en valores nanomolares pues se estimulaba la germinación de las esporas y por el contrario, si los valores de AIA producidos eran del orden de los micromolares, como los empleados en este experimento, pues se inhibía la germinación.

En un estudio similar, se refirió que las fitohormonas como el AIA pueden estimular la germinación de esporas y el crecimiento hifal de Gigaspora margarita y G. fistulosum a concentraciones nanomolares e inhibirlos a altas (micromolares) (17).

CONCLUSIONES

• La aplicación de kinetina ribósido de 0,07 mg L-1 al medio E estimula la germinación de esporas de G. clarum, alcanzándose valores de germinación del 100 %, similares a los obtenidos en medio SRM. Sin embargo, las concentraciones de AIA utilizadas (0,05 mg L-1 y 0,07 mg L-1) en el mismo medio (E), tuvieron un efecto inhibitorio, tanto sobre la germinación como sobre el crecimiento de los tubos germinativos de las esporas. Los mayores valores de longitud de los tubos germinativos se obtuvieron en el medio SRM, comúnmente utilizado para el cultivo in vitro de los HMA.

• Aunque en la literatura no abundan trabajos relacionados con el efecto de las citoquininas sobre la germinación de esporas, es preciso tener en cuenta los resultados de este estudio, no solo para complementar los avances alcanzados en la temática de micorrización de plantas in vitro en nuestro país, sino también porque constituyen resultados valiosos a considerar en los intentos por cultivar in vitro especies de HMA consideradas “recalcitrantes” que se resisten al cultivo en estas condiciones.

• La ausencia de descripciones sobre el papel de las fitohormonas en la biología de los hongos en general, podría simplemente ser el reflejo de que in vivo la acción de las hormonas está regulada por gradientes de concentración que son difíciles de reproducir experimentalmente.

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Recibido: 12 de septiembre de 2014
Aceptado: 5 de febrero de 2015

 

 

Dra.C. Kalyanne Fernández Suárez, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32700. Email: kalyanne@inca.edu.cu