COMUNICACIÓN CORTA

Características metrológicas en la determinación de ácidos urónicos para el control de la calidad en mezclas de oligogalacturónidos

Metrological characteristics in uronic acid determination for quality control of oligogalacturonide mixtures

M.Cs. Yuliem Mederos Torres,^I Dra.C. Inés M. Reynaldo Escobar,^I Dra.C. Josefa Hormaza Monte-Negro^II

^IInstituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32 700.
^IIInstituto Cubano de Investigaciones Azucareras (ICINAZ), carretera al central Manuel Martínez Prieto km 2½, Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN

La determinación del contenido de ácidos urónicos en el control de la calidad de los oligogalacturónidos es sumamente importante, teniendo en cuenta que ellos están directamente relacionados con la actividad biológica que estos presentan. El objetivo de este trabajo fue realizar el análisis de las características metrológicas de la técnica espectrofotométrica de Blumenkrantz y Asboe-Hansen, en la determinación de ácidos urónicos en mezclas de oligogalacturónidos, empleando como cromóforo el m-hidroxidifenilo. Dentro de las características metrológicas analizadas se encontraron la linealidad, la precisión y los límites de detección y cuantificación. Como resultado el método de Blumenkrantz y Asboe-Hansen se ajustó a un modelo lineal en el rango de concentración de 10-80 µg mL^-1. Para el modelo ajustado, el valor del coeficiente de correlación es r= 0,996 y el coeficiente de determinación es R²= 0,992, lo cual indicó muy buena correlación entre la concentración de ácidos urónicos y su absorbancia. La precisión del método se determinó por dos procedimientos, los cuales no sobrepasaron el valor establecido como límite de variabilidad del 5 %. Los límites de detección y cuantificación estuvieron en el orden de 1,6 ± 0,4 µg mL^-1 y 5 ± 1 µg mL^-1, respectivamente. La concentración de ácidos urónicos se encontró en el orden de los 890 µg mL^-1.

Palabras clave: ácido péctico, ácidos urónicos, control de la calidad, oligogalacturónidos.

ABSTRACT

Uronic acid content determination for the quality control of oligogalacturonides is extremely important, considering that they are directly related to their biological activity. The aim of this research was to analyze the metrological characteristics of Blumenkrantz and Asboe-Hansen spectrophotometric method, for uronic acid determination in oligogalacturonide mixtures, by using m-hydroxydiphenyl as chromophore. Linearity, precision and limits of detection and quantification were among the metrological characteristics analyzed. Blumenkrantz and Asboe-Hansen method resulted to be adjusted to a linear model within a concentration range of 10-80 µg mL^-1. Regarding such model, the correlation coefficient value is r= 0,996 whereas the determination coefficient is R²= 0,992, indicating a very good correlation between uronic acid concentration and its absorbance. The precision of this method was determined through two procedures, which did not surpass the established value as a variability limit of 5 %. Detection and quantitation limits were in the order of 1,6 ± 0,4 µg mL^-1 and 5 ± 1 µg mL^-1, respectively. Uronic acid concentration was recorded in the order of 890 µg mL^-1.

Key words: pectic acid, uronic acids, quality control, oligogalacturonides.

INTRODUCCIÓN

Los oligogalacturónidos están compuestos por oligómeros lineales de ácido D-galacturónico unidos por enlaces del tipo a (1- 4), que pueden ser obtenidos por hidrólisis ácida o enzimática de los ácidos pécticos (1). Los oligogalacturónidos han demostrado tener una variada actividad biológica en las plantas, dentro de las cuales se encuentran la promoción de procesos morfogenéticos en especies vegetales (2) y la estimulación del crecimiento vegetal (3), entre otras. Dicha actividad biológica está determinada por su grado de polimerización, la especie de planta y la concentración a la cual son aplicados. También ha sido estudiado su empleo en el secuestro de metales pesados (4). En este sentido, se ha estudiado el uso de los oligogalacturónidos en la disminución de la toxicidad del ión Cu²⁺ en plántulas de tomate, produciendo cambios en el patrón de absorción de este metal (5).

El Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), cuenta con una tecnología patentada a nivel nacional para la obtención de mezclas de oligogalacturónidos. El control de la calidad de estas mezclas incluye la determinación del contenido de ácidos urónicos, azúcares neutros y azúcares reductores presentes en este. Dentro de estas características nombradas, el contenido de ácidos urónicos es uno de los más importantes, pues está estrechamente relacionado con la actividad biológica que estos oligosacáridos presentan en las plantas. Dicha actividad biológica puede estar basada en la capacidad de los oligogalacturónidos de formar un enrejado molecular con los iones Ca²⁺ nombrado caja de huevo (6). Esta conformación es posible, debido a las múltiples cargas negativas que presentan los oligogalacturónidos, desde el punto de vista estructural y que depende de su grado de polimerización.

La evaluación del contenido de ácidos urónicos, en forma de ácido galacturónico, puede ser realizada mediante la evaluación espectrofotométrica. Para ello, los métodos espectrofotométricos más conocidos en esta determinación son aquellos que emplean como cromóforos al m-hidroxidifenilo (7, 8, 9, 10), el 3,5-dimetilfenol (11, 12) y el carbazol (13, 14). Más recientemente se ha empleado la cromatografía líquida de alta resolución (15, 16) y la electroforesis capilar zonal, como método de cuantificación de ácido galacturónico con detección por UV (17).

De manera general, el procedimiento que emplea el m-hidroxidifenilo como cromóforo (7) es el más citado de todos y se caracteriza por ser cuantitativo, sensible y específico, razones por las cuales se seleccionó como técnica de control de la calidad de las mezclas de oligogalacturónidos. Este método se basa en la aparición de un cromógeno de color rosado cuando el ácido urónico es calentado a 100 ^oC en una mezcla de ácido sulfúrico/tetraborato de sodio y posteriormente tratado con m-hidroxidifenilo (Figura 1).

El objetivo de este trabajo fue la evaluación de algunas características metrológicas en la técnica de determinación de ácidos urónicos, empleando como cromóforo el m-hidroxidifenilo y de esta forma contribuir a su validación posterior.

MATERIALES Y MÉTODOS

La mezcla de oligogalacturónidos se obtuvo por hidrólisis enzimática (18), con el empleo de ácido poligalacturónico (SIGMA) y el preparado pectinolítico Pectinase obtenido a partir del hongo Aspergillus aculeatus de la corporación Novozyme A/S. La determinación del contenido de ácidos urónicos se realizó de acuerdo al método propuesto por Blumenkrantz y Asboe-Hansen (7), empleando como patrón ácido galacturónico en el rango de concentraciones de 10, 20, 40, 60 y 80 µg mL^-1. Las lecturas se realizaron a 520 nm en un espectrofotómetro UV visible Genesys 6 de la corporación Thermo Electron. Las características metrológicas analizadas fueron la linealidad, la precisión y los límites de detección y cuantificación del método (19, 20). La linealidad (n= 3) se determinó por el método de los mínimos cuadrados, con la evaluación de la pendiente, el intercepto, los coeficientes de correlación y determinación, así como la existencia de falta de ajuste, el análisis del gráfico de residuos y el coeficiente de variación del factor respuesta (CVf); este último se determinó a partir de la siguiente secuencia de ecuaciones.

donde:

f es el factor respuesta, yi y xi son la absorbancia y la concentración del ácido galacturónico, respectivamente, SD_f es la desviación estándar del factor respuesta, CVf es el coeficiente de variación del factor respuesta y n el número de réplicas.

La precisión se determinó en términos de repetibilidad, manteniendo el mismo procedimiento de medición, el mismo operador y sistema de medición, así como iguales condiciones de operación, con igualdad de réplicas, en un corto período de tiempo (21). La precisión se expresó mediante el CV y se determinó como el cociente entre la desviación estándar y el valor medio del factor respuesta, expresado en porciento. La precisión se evaluó por dos vías, mediante la determinación del CV (a partir del análisis de tres niveles de concentración de ácido galacturónico 10, 40 y 80 µg mL^-1) y mediante el análisis de seis muestras de oligogalacturónidos en condiciones de repetibilidad. Para el análisis de la mezcla de oligogalacturónidos se realizaron diluciones de estas a 1000 µg mL^-1 en agua desionizada. Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se determinaron mediante las fórmulas de Long and Winefordner (22).

donde:

K= 3 para LOD y 10 para LOQ

SD_B= desviación estándar de la absorbancia del blanco

m es la media de la pendiente de las curvas de calibración

t_a= distribución t Student para a= 0,01

SD_m= desviación estándar de las pendientes de las curvas de calibración

Los límites se calcularon a partir del análisis de siete blancos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis de la linealidad de la técnica de determinación de los ácidos urónicos se realizó a través de su curva de calibración en el rango de concentración de 10-80 µg mL^-1 (Figura 2). El análisis de la regresión mostró que se ajustó a un modelo lineal descrito por la ecuación de primer grado y= 0,09 + 8,8.10^-3x para el rango de concentraciones especificado. Para el modelo ajustado, el valor del coeficiente de correlación es r= 0,996172, mientras que el coeficiente de determinación es R²= 0,992, lo cual indica una excelente correlación entre la concentración y la absorbancia. El análisis de significación de la pendiente mostró que la probabilidad de error es menor que 0,05 (P= 0,0000), lo cual indicó que esta es significativamente diferente de cero. Por otra parte, el análisis de significación del intercepto mostró que la probabilidad de cometer error, determinado a partir de la prueba t de Student es menor que 0,05 (P= 0,0000), lo cual indica que el intercepto (0,09) debe ser tenido en cuenta al realizar los análisis. El coeficiente de variación del factor respuesta (CVf) en el rango de concentraciones analizado fue de 3,3 %, el cual es menor que 5 %, valor conocido como límite de variabilidad, por lo cual se considera adecuado (23).

La prueba de falta de ajuste verifica si el modelo seleccionado (modelo lineal) es adecuado para describir los datos observados o si debe ser utilizado un modelo más complejo. La probabilidad (P= 0,0012) asociada al valor de F de la falta de ajuste resultó menor que 0,05, por lo que hay una falta de ajuste al modelo lineal estadísticamente significativo para un nivel de confianza del 95 % (Tabla).

Aun cuando es conocido que el análisis de la linealidad en un método de determinación espectrofotométrico se realiza a partir de la búsqueda de la ecuación lineal que lo describa en un rango de concentraciones especificado, el empleo del programa estadístico STATGRAPHICS PLUS 5.1 (24) permite verificar, a partir de modelos curvilíneos alternativos, qué modelo matemático describe mejor el sistema.

El modelo ajustado que mejor describió al sistema fue raíz cuadrada con un R²= 99,41 %; sin embargo, el modelo lineal solo difirió de este en un 0,17 %, lo que concuerda con la falta de ajuste encontrada en el análisis de varianza. Por otra parte, el gráfico de residuos mostró que los resultados presentan una distribución aleatoria, lo cual confirma que el modelo escogido es el adecuado (Figura 3).

La evaluación de la linealidad en un método espectrofotométrico se basa en la propiedad de las sustancias de absorber la luz y debe cumplir con la Ley de Lambert-Beer, que plantea que la luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de la sustancia (25). Por tanto, se puede decir que esta relación quedó descrita a partir de la ecuación lineal de primer grado, y= 0,09 + 8,8.10^-3x, cuyos coeficientes de correlación y determinación demostraron la proporcionalidad existente entre la concentración y absorbancia, cumpliendo así con la Ley de Lambert-Beer.

La precisión del método se evaluó en términos de repetibilidad. La determinación del coeficiente de variación a tres niveles de concentración diferentes mostró que este oscila entre el 1,64 y 2,76 %, el cual se encuentra por debajo del valor establecido como límite de variabilidad (5 %), por lo que el método se considera adecuado (Tabla).

La determinación del límite de detección y cuantificación en la curva de calibración (Tabla) mostró que el nivel más bajo de ácidos urónicos que puede ser detectado mediante esta técnica es de 1,6 ± 0,4 µg mL^-1. A su vez, la concentración más baja que puede ser determinada con precisión es 5 ± 1 µg mL^-1.

Los valores de limites de detección y cuantificación calculados indican que el método de determinación de ácidos urónicos es adecuado, teniendo en cuenta que la concentración de ácidos urónicos presente en muestras de mezclas de oligogalacturónidos está en el orden de los 890 µg mL^-1, siendo estos los componentes mayoritarios, representando aproximadamente el 89 % de las muestras. Dicha concentración está en el orden de los valores indicados en la literatura en la caracterización de ácido péctico comercial (SIGMA) de origen cítrico (26), donde la concentración de ácidos urónicos representó el 87 % de la muestra analizada.

La determinación del límite de detección permitió referir que la respuesta lineal del método comprendió el rango de 1,6 a 80 µg mL^-1. Este resultado se encontró en el orden de lo informado por otros autores (27), al realizar la determinación espectrofotométrica de los ácidos urónicos en muestras de té verde, donde la respuesta lineal del método oscila entre 1 y 100 µg mL^-1.

CONCLUSIONES

De manera general y a modo de conclusión, teniendo en cuenta todas las características metrológicas analizadas anteriormente, se puede decir que la técnica de determinación de ácidos urónicos, de acuerdo al método propuesto por Blumenkrantz y Asboe-Hansen (7), puede ser empleado como técnica de control de la calidad en mezclas de oligogalacturónidos, puesto que cumple con el criterio de linealidad, precisión y límites de detección y cuantificación adecuados para este fin.

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Recibido: 17 de diciembre de 2014
Aceptado: 28 de julio de 2015

M.Sc. Yuliem Mederos Torres, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32 700. Email: yuliem@inca.edu.cu