Propagación in vitro de cultivares de Moringa oleifera Lam.
In vitro propagation of Moringa oleifera Lam. cultivars
Arturo Matos Ruiz, Iris Capote Betancourt, Aurora Pérez Martínez, Yarianne Lezcano Más, Carlos E. Aragón Abreu, Danilo Pina Morgado, Karel Vives Hernández, Marcos Daquinta Gradaille, Maritza Escalona Morgado
Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos del Centro Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila (UNICA), carretera a Morón km 9, Cuba, CP 69450.
RESUMEN
La Moringa posee hojas, flores y frutos con un alto contenido de vitaminas, minerales y proteínas de interés para las industrias alimenticias y médicas. Su reproducción es por semillas y estacas, métodos insuficientes si se desean introducir nuevos cultivares. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer un protocolo para la propagación in vitro de Moringa oleifera Lam. La desinfección de las estructuras embrión-endospermo con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) se realizó a los cinco, siete y nueve minutos. La multiplicación in vitro se realizó por: sistemas convencionales (medio de cultivo semi-sólido) y biorreactores de inmersión temporal. En el enraizamiento in vitro se evaluó la concentración del ácido naftalen acético y el ácido indol butírico (0; 2,5; 5,0 y 7,5 µmol L-1) y el tipo de explante. Se evaluó la supervivencia de los brotes en la aclimatización teniendo en cuenta la procedencia de la fase de enraizamiento. Se determinó el efecto del genotipo en el establecimiento y la multiplicación in vitro. La desinfección del cultivar Supergenius fue mejor a los siete minutos, con un porcentaje de germinación del 54 %. Los biorreactores de inmersión temporal incrementaron la calidad morfológica de los brotes y el coeficiente de multiplicación aumentó de 6,2 a 16,1 para el cultivar Supergenius. El enraizamiento se logró sin auxinas y la supervivencia en aclimatización fue de un 85 % a los 35 días para los brotes que se enraizaron sin reguladores del crecimiento, independientemente del explante de procedencia. Se demostró que el genotipo influyó en el establecimiento y multiplicación de los mismos.
Palabras clave: cultivares, protocolo, reguladores del crecimiento vegetal.
ABSTRACT
Moringa has leaves, flowers and fruit with a high level of vitamins, minerals and proteins of interest for the food and medical industries. This species can be propagated by seeds or cuttings, methods that not suitable to introduce new cultivars. The aim of this research was to establish an in vitro propagation protocol of different cultivars of Moringa oleifera Lam. To disinfect seeds three different disinfection times were evaluated five, seven and nine minutes in 10 gL-1 sodium hipoclorite. Two methods for in vitro micropropagation were used: conventional system (semi-solid culture medium) and temporary immersion bioreactor. In the in vitro rooting phase, four concentrations of the naphthalene acetic acid and Indole butyric acid auxins (0; 2,5; 5,0 and 7,5 µmol L-1) were evaluated and also the kind of explant. The survival rates of the sprout during the acclimatization phase was evaluated in relation to their origin in the rooting phase. Besides the effect of the genotype on in vitro establishment and multiplication was determined. The disinfection of the Supergenius cultivar was better at seven minutes of treatment with sodium hipoclorite, with 54 % of germination. The Temporary Immersion Bioreactor increased the sprouts morphological quality and multiplication coefficient from 6,2 until 16,1 of the Supergenius cultivar. Rooting was successful without auxin and acclimatization survival was around 85 % at 35 days for shoots rooted without growth regulators, regardless of explant origin. It was shown that the genotype influenced the establishment and multiplication of explants.
Key words: cultivars, protocol, plant growth regulators.
INTRODUCCIÓN
Moringa oleifera
Lam es un árbol de la familia Moringaceae (1). Esta especie
es nativa de la zona de la India, Afganistán, Pakistán (2). Por
su alta resistencia a condiciones de estrés, en la actualidad se encuentra
extendida en gran parte del mundo, incluyendo América (3).
Esta planta es un recurso natural que posee gran utilidad como complemento alimenticio
rico en vitaminas, antioxidantes, aceites, microelementos y proteínas
(2). Además del beneficio para la industria alimenticia, en la medicina
tradicional se utiliza para prevenir patologías asociadas a la carencia
de elementos esenciales de la dieta, como la ceguera infantil (4).
Igualmente se le atribuyen usos en la purificación de agua (5) y en la
obtención de biodiesel (6). Algunos autores le adjudican, también,
actividad bio-estimulante para el crecimiento de algunos cultivosA.
Recientemente se ha informado en la literatura la obtención de compuestos
naturales a partir de esta planta para su uso a nivel agrícola y médico
(5, 7).
Debido a estas propiedades, el cultivo de esta especie se ha incrementado en
los últimos años (5). Los métodos tradicionales como la
siembra de semillas y estacas han sido los más utilizados para satisfacer
la relación consumo/demanda (8). Sin embargo, las inversiones de tiempo
y dinero en podas, preparación de terreno, siembra y cosecha, son grandes
y en ocasiones limitan las potencialidades de uso.
En los últimos años, las técnicas de cultivo in vitro
se han utilizado en aras de obtener mayor cantidad de plantas de esta especie
y ahorrar recursos materialesB;
sin embargo, son escasos los informes que lo referencian. Esto crea la necesidad
de profundizar en las investigaciones concernientes a este árbol de gran
importancia en la seguridad alimentaria, salud y agriculturaB.
Los Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT®) se han
utilizado con éxito para la propagación in vitro de plantas
(9, 10). Estos sistemas semi-automatizados con el empleo del medio líquido
favorecen la nutrición in vitro, así como la renovación
de gases dentro del frasco de cultivo, lo que incrementa el crecimiento y el
desarrollo de los brotes (9, 11). Además, se obtienen mejoras significativas
en los indicadores morfo-fisiológicos de los brotes que garantizan mayor
supervivencia y crecimiento de los mismos en condiciones ex vitro (12).
El presente trabajo tuvo como objetivo establecer un protocolo para la propagación
in vitro de Moringa oleifera Lam.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material
vegetal
Se colectaron frutos de siete cultivares de Moringa oleifera
Lam (Supergenius, Criolla Ciego de Ávila, PKM-2, Paraguay, Guatemala,
Plain y Criolla Holguín), en diferentes áreas del territorio nacional.
Para la obtención de las semillas, se secaron los frutos a temperatura
ambiente durante una semana. A las semillas se les quitó el tegumento,
se trabajó con las estructuras embrión-endospermo y se seleccionaron
las que poseían entre 0,8 mm y 1 cm de diámetro; se lavaron con
detergente comercial durante cinco minutos y se enjuagaron tres veces con abundante
agua corriente.
Efecto del tiempo de desinfección de las semillas de Moringa
oleifera Lam cv Supergenius
La desinfección de los explantes (estructuras embrión-endospermo)
se realizó con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) en agitación durante
cinco, siete y nueve minutos. Posteriormente se colocaron individualmente en
un tubo de ensayo con 10 mL de medio de cultivo que estuvo compuesto por el
100 % de las sales MS (14), suplementado con 20 g L-1 de sacarosa,
1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol y sin
reguladores del crecimiento. El pH se ajustó a 5,7. Las condiciones de
cultivo fueron de un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho horas de
oscuridad` y un flujo de fotones fotosintéticamente activos de 37 µmol
m-2s-1 (Luxómetro digital FAITHFUL modelo FT-710)
a temperatura de 26±1 °C.
Se utilizaron 48 explantes por tratamiento. Después de siete días
de cultivo se determinó el número de explantes contaminados. A
los 21 días se evaluó el número de estructuras embrión-endospermo
germinado y no germinado. Los resultados se expresaron en porcentaje.
Multiplicación in vitro de brotes de Moringa oleifera
Lam cv Supergenius
A partir de las estructuras embrión-endospermo germinadas se obtuvieron
dos tipos de explantes: ápices (segmento de tallo de 3 cm aproximadamente
con un par de hojas) y segmentos nodales (segmento de tallo de 3 cm aproximadamente
con dos nudos y dos hojas). Todos los explantes se colocaron en un medio de
cultivo semi-sólido que contenía el 100 % de las sales MS (13),
suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 1 mg L-1 de
tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol y sin reguladores del crecimiento.
El pH se ajustó a 5,7. La densidad de inóculo fue de siete explantes
por frasco y el volumen de medio de cultivo fue de 25 mL. Las condiciones de
cultivo se mantuvieron igual que en el experimento anterior. Los explantes se
subcultivaron tres veces cada 21 días, manteniendo la misma composición
del medio de cultivo.
Posteriormente se tomaron diez segmentos de tallos de aproximadamente 3 cm de
longitud con dos nudos y dos hojas provenientes de la multiplicación
convencional y se colocaron en Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT®)
(14) que contenían 800 mL de medio de cultivo líquido con igual
composición que el anterior. Se realizaron tres inmersiones por día
y el tiempo de inmersión fue de cuatro minutos. Se utilizaron tres
BIT y cada explante constituyó una unidad experimental. Las condiciones
de cultivo se mantuvieron igual que en el experimento anterior. Después
de 21 días de cultivo se evaluaron los indicadores número de brotes
por explante, longitud del brote, número de entrenudos, número
de raíces, grosor del tallo, presencia de brotes hiperhídricos
y además se calculó el coeficiente de multiplicación como
el cociente entre el número de brotes finales y el número de explantes
inicial.
Enraizamiento in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv
Supergenius Para el enraizamiento in vitro, se utilizó un medio
de cultivo semi-sólido que estuvo compuesto por las sales MS (13), suplementado
con 40 g L-1 de sacarosa, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg
L-1 de mio-inositol y los reguladores del crecimiento ácido
naftalen acético (ANA) y ácido indol butírico (AIB) en
varias concentraciones (0; 2,5; 5,0; y 7,5 µmol L-1). El pH
se ajustó a 5,7. Se utilizaron dos tipos de explantes, el de las bases
de tallos de 3 cm de longitud aproximadamente con dos nudos y dos hojas y el
segmento de tallo de 3 cm de longitud aproximadamente, con dos nudos y dos hojas.
La densidad de inóculo fue de siete explantes por frasco y el volumen
de medio de cultivo fue de 25 mL. Se mantuvieron las condiciones de cultivo
descritas anteriormente. Se utilizaron 30 explantes por tratamiento. Cada explante
constituyó una unidad experimental.
A los 21 días de cultivo, se evaluaron los indicadores altura de los
brotes, número de entrenudos, número de raíces, longitud
y grosor de la raíz más extensa.
Aclimatización de las plantas de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
Los brotes de aproximadamente 5 cm de longitud, con cuatro hojas y presencia
de raíces provenientes de los diferentes tratamientos de enraizamiento
in vitro, se colocaron en comprimidos de turba (jiffys). Las condiciones
de cultivo fueron de 80±3 % de humedad relativa y 25±2 °C
de temperatura (Termo Higrómetro digital TECPEL® modelo
DTM- 303), fotoperíodo correspondiente al ciclo del día (16 horas
luz/8 horas oscuridad) con un flujo de fotones fotosintéticamente activos
de 608 µmol m-2s-1 y condiciones atmosféricas
de concentración de CO2 entre 375 y 400 µmol mol-1
a las 12:00 pm. El riego se realizó con regadera una vez por día
en el horario comprendido entre las 9?30 am y 11?00 am. Se utilizaron 30 plantas
por tratamiento. Cada planta constituyó una unidad experimental.
A los 7, 14, 21, 28 y 35 días de cultivo se calculó el porcentaje
de supervivencia de acuerdo con la fórmula:
% de supervivencia= (número de plantas vivas/total de plantas) x100
Efecto del genotipo en la germinación de semillas de Moringa
oleifera Lam
A las semillas de los siete cultivares de Moringa oleifera Lam (Supergenius,
Criolla Ciego Ávila, PKM-2, Paraguay, Guatemala, Plain y Criolla Holguín)
se les realizó la desinfección de las estructuras embrión-endospermo
con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) en agitación durante siete minutos.
Se mantuvieron las condiciones de cultivo descritas para la germinación
del cultivar Supergenius.
Se utilizaron 48 estructuras embrión-endospermo por cultivar. Después
de siete días de cultivo se determinó el número de explantes
contaminados. A los 21 días se evaluó el número de estructuras
embrión-endospermo germinado y no germinado. Los resultados se expresaron
en porcentaje.
Efecto del genotipo en la multiplicación de Moringa oleifera
Lam
Para evaluar el efecto del genotipo en la multiplicación se procedió
de igual manera que con el cultivar Supergenius descrito previamente. Después
de 21 días de cultivo en BIT se evaluaron los indicadores número
de brotes por explante, longitud del brote, número de entrenudos, presencia
raíces, grosor del tallo y presencia de brotes hiperhídricos.
Además, se calculó el coeficiente de multiplicación como
el cociente entre número de brotes final y número de explantes
inicial.
Análisis estadístico
En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario
SPSS (15), el análisis de varianza simple, bifactorial y trifactorial
(ANOVA) con diferentes niveles. Las medias de los tratamientos se compararon
utilizando la prueba de rangos múltiple de Tukey (p<0,05). En algunos
casos fue necesaria la transformación de los datos para lograr los supuestos
de las pruebas paramétricas realizadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto
del tiempo de desinfección de las semillas de Moringa oleifera
Lam cv Supergenius
En la Tabla I se muestra el efecto del tiempo de desinfección
con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) sobre el porcentaje de estructuras embrión-endospermo
contaminadas, germinadas y no germinadas durante el establecimiento in vitro.
El menor porcentaje de contaminación se obtuvo cuando la desinfección
se realizó durante nueve minutos, con diferencias significativas del
resto de los tratamientos. Por su parte, el mayor porcentaje de germinación
le correspondió al tratamiento donde se utilizó el hipoclorito
de sodio 1 % (V:V) durante siete minutos, el cual difirió significativamente
de los tratamientos de cinco y nueve minutos. También se pudo observar
que con el aumento del tiempo de desinfección aumentó el porcentaje
de semillas no germinadas a pesar de que el porcentaje de contaminación
fue menor. Este comportamiento pudiera estar relacionado con un efecto fitotóxico
del hipoclorito de sodio (16). A partir de estos resultados se seleccionó
el tiempo de siete minutos como el adecuado para la desinfección de las
semillas de moringa.
Multiplicación
in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
En la multiplicación de M. oleifera Lam. cv Supergenius en el
sistema convencional se obtuvo un elevado coeficiente de multiplicación
(6,2) a pesar de no utilizar reguladores del crecimiento en el medio de cultivo.
Esto pudiera asociarse fundamentalmente a la juvenilidad del material vegetal
y a la ruptura de la dominancia apical que favoreció la activación
de la brotación axilar así como, a un elevado contenido endógeno
de fitohormonas como la zeatinaA
(17), lo que pudo favorecer la formación de brotes axilares.
El uso de los BIT incrementó el coeficiente de multiplicación
hasta 16,1 (Tabla II), demostrando el efecto positivo de este
sistema de cultivo en la multiplicación de la M. oleifera Lam.
cv Supergenius. Además, los indicadores morfológicos evaluados
mostraron resultados favorables. El uso del medio de cultivo líquido
y la renovación de la atmosfera gaseosa interna del recipiente de cultivo
favorecieron la incorporación y asimilación de los nutrientes,
incrementando el crecimiento y la acumulación de biomasa (14, 18).
Enraizamiento
in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
El efecto de la concentración de dos auxinas (ANA y AIB) y el tipo de
explante sobre indicadores morfológicos en la fase de enraizamiento in
vitro de brotes de Moringa oleifera Lam. cv. Supergenius se muestran
en la Tabla III. El número de raíces fue mayor
cuando se utilizó como explante segmentos de tallos con 5,0 µmolL-1
de ANA y 7,5 µmolL-1 de AIB, sin diferencias significativas
entre sí.
La longitud de
la raíz más extensa fue mayor en el control, independientemente
del tipo de explante, sin diferencias significativas con el tratamiento en que
se utilizaron bases de tallo con 2,5 µmol L-1 de ANA.
Este tratamiento también mostró el mejor resultado en cuanto al
grosor de la raíz más extensa y la altura del brote, con diferencias
significativas del resto de los tratamientos. El número de entrenudos
fue superior para los segmentos de tallos del tratamiento control, con diferencias
significativas con el resto de los tratamientos.
En los explantes proveniente de la base del tallo se favoreció la formación
de callo en la región basal, lo que afectó la formación
de raíces. Esto pudiera estar relacionado con el incremento endógeno
de la concentración de auxina, ya que se reconoce que la Moringa posee
un elevado contenido de AIA y la adición exógena de ANA y AIB
pudo provocar la división celular descontrolada dando lugar a la masa
callosa (19). Esta condición en los explantes es no deseada ya que las
raíces que se forman a partir de esta estructura son de baja calidad
(20).
Aclimatización de brotes de Moringa oleifera Lam cv
Supergenius
La Tabla IV muestra el efecto de la aplicación de auxinas
(ANA y AIB) durante el enraizamiento in vitro sobre en el porcentaje
de supervivencia de los brotes en la fase de aclimatización. El uso de
auxinas en la fase de enraizamiento in vitro, independientemente del
tipo y concentración, afectó notablemente la supervivencia de
los brotes durante el transcurso del tiempo. El tratamiento control, donde no
se utilizaron auxinas para el enraizamiento, mostró los mejores valores
de supervivencia en todos los momentos evaluados, independientemente del tipo
de explante utilizado. Luego de 35 días de cultivo la supervivencia fue
de superior al 85 % para el tratamiento control. Para los tratamientos donde
se utilizaron auxinas los valores de supervivencia al final de esta fase fueron
muy bajos oscilando entre 0 y 6,6 %.
El comportamiento
observado pudiera estar asociado a que las raíces formadas in vitro
son poco funcionales y con escasos pelos adsorbentes, lo que no garantiza la
nutrición de los brotes en la etapa inicial de la aclimatización
(21). Además, en algunas plantas, las raíces in vitro
se pierden durante el trasplante al sustrato, por lo que durante este proceso
donde las plantas tienen que adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo y
enfrentar las condiciones de estrés a las que son expuestas durante el
tránsito in vitro-ex vitro podría afectar el
porcentaje de supervivencia.
La aplicación de auxinas promovió el enraizamiento de los brotes;
sin embargo, en el tratamiento control las raíces que se formaron son
más funcionales, lo que garantizó la supervivencia durante la
aclimatización. Esto pudiera estar asociado a que el suplemento de auxinas
favorece la formación de callos en la base de los brotes que impide la
funcionabilidad de las raíces en condiciones ex vitro afectando
la supervivencia de las plantas.
Efecto del genotipo en la germinación de semillas de Moringa
oleifera Lam
En la Tabla V se muestra el efecto de la desinfección
durante siete minutos con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) sobre el porcentaje
de estructuras embrión-endospermo contaminadas, germinadas y no germinadas
durante el establecimiento in vitro de M. oleifera Lam cv
Paraguay, Plain, PKM-2, Guatemala, Criolla Ciego Ávila, Criolla Holguín.
Para los cultivares evaluados el porcentaje de contaminación fue inferior
al del cultivar Supergenius, con excepción del cultivar Criolla Holguín
que mostró un porcentaje de contaminación de 95,80 %. El mayor
porcentaje de germinación se logró en los cultivares Criolla Ciego
Ávila y Plain, sin diferencias significativas entre sí. Estos
valores de germinación fueron superiores al obtenido con el cultivar
Supergenius. La germinación del resto de los cultivares fue baja. El
cultivar Criolla Holguín se vio severamente afectado por la contaminación
y la no germinación de las estructura embrión-endospermo, por
lo que no se pudo continuar con la experimentación con este cultivar.
Efecto
del genotipo en la multiplicación de Moringa oleifera Lam
Los valores de coeficiente de multiplicación en sistema convencional
de los cultivares de M. oleifera Lam (Paraguay, Plain, PKM-2, Guatemala
y Criolla Ciego Ávila), se muestra en la Tabla VI.
Los mejores resultados se obtuvieron con los cultivares Supergenius, Plain y
Paraguay, sin diferencias estadísticas significativas entre sí.
Los resultados más bajos se obtuvieron con el cultivar Criolla Ciego
Ávila a pesar de ser la que mejores resultados mostró en cuanto
a germinación de las estructuras embrión-endospermo con el 91,60
%.
Los valores de los indicadores morfológicos evaluados luego de la multiplicación
en BIT de M. oleifera Lam se muestran en la Tabla VII. Para el indicador
longitud del brote, los mejores resultados se obtuvieron para los cultivares
Supergenius, Paraguay y Plain, sin diferencias estadísticas entre sí.
Por su parte, el número de entrenudos fue superior en los cultivares
Supergenius, Paraguay y PKM-2, sin diferencias estadísticas entre sí.
La formación de raíces se evidenció en todos los cultivares,
excepto en Paraguay y Criolla Ciego Ávila, presentándose el mayor
número de raíces en los cultivares Supergenius y PKM-2, sin diferencias
significativas entre sí. El indicador grosor del tallo no mostró
diferencias significativas entre los cultivares evaluados. Tampoco, se presentaron
brotes hiperhídricos en ninguno de los cultivares. En cuanto al coeficiente
de multiplicación, el mejor resultado le correspondió al cultivar
Supergenius, seguido por el cultivar Paraguay. Para estos cultivares, el BIT
incrementó en más de dos veces el coeficiente de multiplicación,
mientras que para el resto de los cultivares este indicador no tuvo un incremento
significativo con respecto al sistema convencional.
Los resultados demostraron el efecto del genotipo sobre la germinación
de las estructuras embrión-endospermo y la multiplicación in
vitro. Las diferencias observadas entre los cultivares pudieran estar relacionadas
con el estado fisiológico y sanitario de la planta madre y de las semillas,
así como el tamaño, edad y momento de toma de los explantes. Además,
se conoce que la respuesta genotípica depende de la expresión
génica de cada individuo, la cual depende del medio ambiente donde se
desarrolla el individuo (22).
CONCLUSIONES
Se logró
un protocolo para la propagación in vitro de cultivares de Moringa
oleifera Lam, el cual se caracterizó por su efectividad en el número
y calidad de los brotes. El mismo se caracterizó por la ausencia de reguladores
del crecimiento durante el establecimiento, la multiplicación y el enraizamiento
de los brotes lo cual incidió positivamente en los altos porcentajes
de supervivencia logrados durante la aclimatización.
Con el empleo de la técnica de inmersión temporal se alcanzó
duplicar la tasa de multiplicación en algunos cultivares demostrando
la efectividad de este método en la propagación de esta planta.
Es evidente que los contenidos endógenos de auxinas y citoquininas en
esta planta favorecieron la propagación in vitro, por lo que
la obtención de extractos naturales y su evaluación en la morfogénesis
in vitro de otras plantas son de gran interés y constituyen
aspectos a abordar en futuras investigaciones.
Nota al pie
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Recibido: 15 de
mayo de 2015
Aceptado: 29 de enero de 2016
Arturo Matos Ruiz, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos del Centro Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila (UNICA), carretera a Morón km 9, Cuba, CP 69450. Email: aruiz@bioplantas.cu
