Estrategia criogénica para el establecimiento de un banco de germoplasma de piña (Ananas comosus var. Comosus)

 

Cryogenic strategy for the establishment of a germplasm bank of pineapple (Ananas comosus var. Comosus)

 

 

Ariel Villalobos Olivera,I Roberto Méndez Pelegrín,I Justo González Olmedo,II Alitza Iglesias Alfonso,II Julia Martínez Rodríguez,II René Carlos Rodríguez Escriba,II Gustavo Yasser Lorente González,II Nicolás Quintana Bernabé,I Romelio Rodríguez Sánchez,II Fernanda Vidigal Duarte Souza,III Marcos Edel Martínez MonteroII

IUniversidad de Ciego de Ávila (UNICA), Cuba.
IICentro de Bioplantas, UNICA, Cuba.
IIIEMBRAPA Mandioca e Fruticultura, Brasil.

 

 

RESUMEN

En la piña se han utilizado protocolos de crioconservación basados en un procedimiento de vitrificación. Sin embargo, se desconoce aún la influencia de algunos factores técnicos para lograr una estrategia criogénica con una aplicación de rutina a un amplio número de genotipos. Además hasta la fecha, no se han realizado ningún análisis histológico para visualizar cambios estructurales durante un procedimiento de crioconservación. En la presente investigación se determinaron diferentes aspectos técnicos de una estrategia criogénica para aumentar los niveles de supervivencia de los ápices a la inmersión en nitrógeno líquido. Estos fueron: tipo de ápice, compuesto por 3-4 primordios foliares con un tamaño aproximado de 2,5-3mm; precultivo en 0,3 mol L-1 de sacarosa; aplicación de la solución de carga 0,4 mol L-1+2 0,4 mol L-1 glicerol; temperatura de aplicación de la solución vitrificadora PVS2 a 0 °C durante 420 min. El análisis de la visualización de los cambios estructurales ocurridos en los ápices crioconservados reveló que las células meristemática presentes en el domo apical y los primordios foliares en formación, sufrieron pocas alteraciones celulares y mantuvieron casi intacta sus características morfo-fisiológica en las mejores condiciones de supervivencia. Se aplicó de manera exitosa un procedimiento de vitrificación para nueve accesiones del banco de germoplasma in vitro del centro de Bioplantas. Lo anterior constituye una importante etapa para el establecimiento de un banco de germoplasma a larga plazo del cultivo de la piña.

Palabras clave: ápices, germoplasma, histología, vitrificación.

ABSTRACT

In pineapple have been used cryopreservation protocols based on a vitrification procedure. However, the influence of some technical factors is still unknown to achieve a strategy cryogenic routine application to a wide range of genotypes. Furthermore, there has been no histological analysis to display any structural changes during a process of cryopreservation. In the present investigation different technical aspects of a cryogenic strategy are determined to increase survival levels from the apexes to immersion in liquid nitrogen. These were: type of apex, consisting of 3-4 leaf primordia with an approximate size of 2,5-3mm; preculture 0,3 mol L-1 sucrose; application of the loading solution 0,4 mol L-1+2 0,4 mol L-1 mol glycerol; application temperature of the vitrification solution PVS2 at 0 °C for 420 min. The analysis of the display of structural changes in the cryopreserved apices revealed that the meristematic cells in the apical dome and leaf primordia in formation, suffered few cellular alterations and kept almost intact its morpho-physiological characteristics in the best conditions of survival. The method of vitrification was applied successfully for 9 accessions of the in vitro genebank of Bioplant center. This is an important step for the establishment of a gene bank for long-term cultivation of pineapple.

Key words: apices, germplasm, histology, vitrification.

 

 

INTRODUCCIÓN

La piña (Ananas comosus var. Comosus) es uno de los principales frutales del mundo, es cultivada con el fin de satisfacer necesidades alimenticias de la población y constituye un importante renglón para la producción de conservas y venta de fruta fresca (1). Esta fruta después del banano y el mango, es la fruta tropical más importante, con una producción mundial en el año 2012 que alcanzó 23 333 886 toneladas (2).

La piña para Cuba constituyó una de las principales plantaciones de la provincia de Ciego de Ávila, recayendo más del 80 % de la producción nacional en la variedad Española roja, de bajo potencial reproductivo, aunque en los últimos años se han introducido nuevos cultivares como el Cayena lisa y el ‘MD-2’, de buenos rendimiento, pero son más exigente a las condiciones ambientales (1, 2, 3).

En la actualidad, los recursos genéticos de la piña son conservados generalmente en colecciones de campo (4). Además se utilizan las técnicas de cultivo in vitro, como alternativa para responder a las necesidades de conservación de genes (5). Sin embargo, hasta la fecha, la opción más prometedora para el almacenamiento a largo plazo es la crioconservación mediante la creación de un banco genético básico donde los cultivos se almacenarían en espacio reducido, protegidos de las contaminaciones y con un mantenimiento limitado (6, 7, 8, 9). El material vegetal se transfiere a nitrógeno líquido, en el cual la temperatura es suficientemente baja (-196 °C), para que se suspenda el metabolismo y se eviten los procesos que reducen la estabilidad genética durante el almacenamiento (10, 11, 12).

En la crioconservación de especies que se propagan vegetativamente, los tejidos organizados tales como ápices o meristemos son de preferencia por su estabilidad genética (13, 14). Además, éstos se recomiendan como el explante por excelencia a almacenar germoplasma porque se pueden obtener plantas libres de virus (crioterapia) regeneradas directamente a partir de estos materiales crioconservados (15, 16).

En el caso de la piña se han utilizado protocolos basados en un procedimiento de vitrificación (17, 18). En los últimos años se ha implementado la técnica de micro-goteo/vitrificación en ápices de piña donde se ha logrado incrementar la supervivencia de los ápices (19, 20). Sin embargo, se desconoce aún la influencia de algunos factores técnicos para lograr una estrategia criogénica con una aplicación de rutina a un amplio número de genotipos de piña. Además se han realizado pocas investigaciones para visualizar los cambios estructurales a nivel celular durante las diferentes etapas de un procedimiento de crioconservación. Por lo que este trabajo tuvo como objetivo determinar diferentes aspectos técnicos de una estrategia criogénica que aumenten la supervivencia en nitrógeno líquido para ápices de vitroplantas de piña, visualizar los cambios estructurales por histología durante la crioconservación y aplicar el procedimiento de vitrificación para nueve accesiones del banco in vitro de germoplasma de piña.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en el laboratorio de Mejoramiento Genético del Centro de Bioplantas de la (Universidad de Ciego de Ávila), utilizando como material vegetal vitroplantas de piña (Ananas comosus var. Comosus) ‘MD-2’ provenientes de un Banco de germoplasma in vitro micropropagadas según el protocolo establecido (21).

Etapa I. Acondicionamiento de las vitroplantas donantes: Se utilizaron vitroplantas después de cuatro subcultivos. Multiplicadas en medio de cultivo líquido con sales MS+100 mg L-1mioinositol +2,1 mg L-1BA+ 0,3 mg L-1ANA +1,0 mg L-1Tiamin +30 g L-1 sacarosa (0,08 mol L-1), con un pH del medio justado a 5,67 según Skoog (22). Las plantas se subcultivaron cada 30 días y crecieron a 27±2°C y fotoperíodo de luz artificial de 18 h día-1, entre 1500 y 2000 lux de iluminación.

Etapa II. Pre-cultivo de ápices: Se utilizaron dos tipos de ápices: ápices tipo I (2,5-3 mm de longitud) con una pequeña base apical y tres a cuatro primordios foliares que lo cubrían; y ápices con la pequeña base apical con uno o dos primordios foliares (ápices tipo II) (0,8-1,3 mm de longitud), para luego determinar el tipo de ápice más adecuado antes y después de inmersión en nitrógeno líquido durante un tiempo de (0-30 min). La disección del explante se realizó bajo un estéreo microscopio (ACUS SCOPE) en un gabinete de flujo laminar a partir de vitroplantas. Los ápices se cultivaron durante dos días, cinco ápices por placa de Petri que contenían un medio de cultivo MS semisólido suplementado con 100 mg L-1 Mioinositol 1,0 mg L-1, Tiamina 30 g L-1 y 0,08 mol L-1 sacarosa. Luego se determinó los efectos del precultivo en sacarosa suplementando 0,1; 0,3; 0,5 y 0,7 mol L-1 de sacarosa, para mejora de la supervivencia de los ápices crioconservados. Después se determinó el efecto de la solución de carga, teniendo en consideración los mejores tratamientos del experimento anterior, donde los explantes precultivados en sacarosa se sometieron a 1mL de las soluciones de carga (0,4 mol L-1 sacarosa+ 2,0 mol L-1glicerol; 0,75 mol L-1 sacarosa+ 1,0 mol*L-1glicerol) en crioviales con capacidad total de 2 ml durante 25 min a 25 °C.

Etapa III. Deshidratación con la solución vitrificadora PVS2: A los dos días de precultivo los ápices pasaron a los crioviales (2mL de volumen total) que contenían 1,5 mL de solución de PVS2 a temperatura ambiente ±25 °C. El material vegetal se mantuvo durante un período de tiempo (0-30 min) a 25 °C, para determinar el tiempo de deshidratación en PVS2. Después se determinó el tiempo de deshidratación en PVS2 del material en un periodo de tiempo (0–180 min) a 25 °C de acuerdo vegetal según la aplicación de la solución de carga antes de la inmersión en nitrógeno líquido y posterior a la inmersión en nitrógeno líquido. Además, es necesario señalar que se realizó la evaluación del número total de grupos OH por la fórmula siguiente: Molaridad * NA * [OH] Donde, NA- Constante de Avogadro 6,022 x 10 23mol-1, [OH] grupos OH por molécula.

Después para mejorar la supervivencia de los ápices durante la crioconservación se evaluó el efecto de la temperatura teniendo en consideración los mejores tratamientos de los acápites anteriores con las siguientes modificaciones, donde el material vegetal se mantuvo durante un período de tiempo (0–540 min) a 25 °C y 0 °C.

Etapa IV. Inmersión en nitrógeno líquido: Posteriormente los crioviales se sumergieron en nitrógeno líquido y se mantuvieron por 2 h en estas condiciones.

Etapa V. Calentamiento: El calentamiento de los crioviales se realizó en un baño de agua a (+) 40 °C, durante 2-3 min.

Etapa VI. Destoxificación (solución de descarga): La solución vitrificadora PVS2 de los crioviales se reemplazó una vez por 1 mL de una solución de 1,2 mol L-1 de sacarosa y se mantuvo durante 30 min a 25 °C.

Etapa VII. Recuperación: Los ápices de los diferentes tratamientos se pasaron a papel de filtro que cubrió la superficie de placas de Petri que contenía el medio de micropropagación pero desprovistos de los reguladores del crecimiento.

Etapa VIII. Evaluación de supervivencia: A la semana, los ápices se transfirieron a placas de Petri que contenían medio de micropropagación con idénticas condiciones iniciales 27±2°C y fotoperíodo de luz artificial de 18 h día-1, entre 1500 y 2000 lux de iluminación, durante tres semanas. La evaluación de la supervivencia se realizó según lo establecido por Martinez- Montero (23), considerando la porcentaje de supervivencia, el número de ápices que mostró síntomas de recrecimiento a las cinco semanas de recuperación midiéndole su tamaño. Los porcentajes de supervivencia se expresaron con respecto al total de ápices usados por tratamiento.

Análisis histológico durante la crioconservación de ápices de piña

El análisis histológico se realizó a partir de muestras de ápices deshidratados y crioconservados del cultivar MD2 los cuales fueron sometidos durante 0, 180, 300, 420 y 540 min en la solución vitrificadora PVS3 a 0 °C.

Se siguió un procedimiento similar para todas las muestras. Estas se fijaron en solución F.A.A (formol - ácido acético - alcohol etílico) al 5-5-50 % (v/v), respectivamente. A continuación se lavaron en agua corriente durante 24 h para eliminar el exceso de fijador. Una vez concluido el lavado, el tejido fue deshidratado en concentraciones seriadas de alcohol etílico (30, 50, 70, 80 y 90 %) y tres veces por alcohol etílico absoluto, durante 2 h cada pase. Después del proceso de deshidratación las muestras se aclararon en alcohol- Bensol (50 % v/v), Luego se continuó la deshidratación en tres pases de Bensol durante 1 h y finalmente se embebieron en una serie de tres pases de parafina con un período de impregnación de 1 h por pase. Seguidamente se incluyeron en bloques de parafina a los que se le realizaron cortes seriados con un grosor de 20 µm, en un micrótomo manual de deslizamiento vertical. La técnica de tinción utilizada fue la tinción de Flemming (24). Para la observación de las muestras se utilizó un microscopio Carl Zeiss al cual se le acopló una cámara digital Canon Power Shot A620 con la que se tomaron todas las imágenes.

Después de realizado el procedimiento de vitrificación, fue validado en nueve accesiones del banco de germoplasma nacional piña, tomando en consideración los mejores tratamientos de los acápites anteriores (Tabla I). Además de la evaluación de la supervivencia, de los ápices deshidratados y crioconservados, respectivamente a las seis semanas de incubación.



 Tratamiento estadístico de los datos

Se realizaron experimentos monofactoriales con más de dos niveles, con cinco repeticiones y se aplicó un diseño completamente aleatorizado. En el procesamiento estadístico de los datos se empleó el utilitario SPSS para Windows (25). En todos los casos se comprobó la distribución normal de los datos mediante la prueba de homogeneidad de las varianzas a través de la prueba Levene. Se realizaron pruebas aramétricas (ANOVA y Tukey) p<0,05. En algunos casos se necesitó la transformación de datos según x’=2 arcosen ((x/100)0,5.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 1 se observó una mayor tolerancia con diferencias significativas para los ápices del tipo I (Figura 1A) con respecto a los ápices del tipo II (Figura 1B). Los ápices del tipo I soportaron los niveles de deshidratación al PVS2 tres veces más, hasta los 30 min de exposición.



Cuando se realizó una observación al microscopio óptico también se evidenciaron diferencias entre los tipos de ápices utilizados. La Figura 2 muestra la sección longitudinal de los dos tipos de ápices. El ápice tipo I (Figura 2A), consta de 3 a 4 primordios foliares, que garantizan cierto grado de protección al meristemo, y un ápice tipo II (Figura 2B) compuesto por uno o dos primordios foliares donde el meristemo queda prácticamente descubierto, los cuales resultaron ser más susceptibles a los tratamientos de deshidratación.



Generalmente, diversos autores aceptan, que para una crioconservación exitosa de los ápices, éstos deben consistir en un domo meristemático más uno o dos primordios foliares con un tamaño de 0,5-2 mm de longitud, dependiendo de las especies (26). Sin embargo, se recomienda, que es necesaria una selección apropiada del tamaño y el estado de desarrollo del material inicial como factor esencial para alcanzar altas tasas de recuperación después del calentamiento (27). Por lo anterior se seleccionaron los ápices de tipo I para continuar en la estrategia criogénica en los siguientes experimentos.

En contraste con los resultados de tolerancia obtenidos anteriormente solo se observó un 5,3 % de supervivencia para los ápices del tipo I cuando a los 25 min se deshidrataron por la solución vitrificadora PVS2, se enfriaron en nitrógeno líquido. Al realizar la evaluación de la coloración del tejido se observó que en la totalidad de los casos si éstos se mantenían de color verde intenso, podían recrecer a los 45 días de evaluación. Sin embargo, si cambiaban de coloración verde hacia amarilla-pálida no podían crecer, y por lo tanto morían.

Por otro lado, y para comparar el comportamiento de los ápices seleccionados en las Figuras 3 y 4 se muestra la histología realizada a ápices de tipo I sin tratamientos crioprotectores (tiempo 0) antes (Figura 3A y B) y después (Figura 4A y B) de la inmersión en nitrógeno líquido. Los explantes estuvieron formados por el domo meristemático o meristemo apical (Figura 3A y 4A) y una zona subapical de células parenquimáticas (Figura 3B y 4B).



La histología de los ápices sin tratamientos crioprotectores antes de la inmersión en nitrógeno líquido mostró que las células de la zona subapical o células parenquimáticas (Figura 4B), se presentan más grandes con paredes celulares más o menos engrosadas, vacuolas más grandes en comparación con la zona meristemática. No existe una clara definición en cuanto a la formación del meristemo en fila (rib meristem) como se observa claramente en plantas adultas desarrolladas ex vitro.

Por su parte, en la histología de los ápices sin tratamientos crioprotectores después de la inmersión en nitrógeno líquido, se observó que en la zona apical (Figura 4A) existió heterogeneidad celular, donde algunas células conservaron sus características meristemáticas, en el caso de los estratos celulares correspondiente a las células más jóvenes del domo meristemático, se observaron células necróticas, células meristemáticas con paredes celulares anormalmente engrosadas y con pequeñas vacuolas o espacios eriplamáticos, además las capas de la túnica se mostraron multiseriadas. Mientras que en la zona parenquimática subapical (Figura 4B), las células estuvieron más vacuoladas, algunas fueron dañadas, mostrando zonas de ruptura celular, con restos de paredes celulares y contenido núcleo plasmático disperso. Nótese la presencia de células parenquimáticas con paredes celulares muy engrosadas y núcleo adosado. Finalmente se observó que existió un número de células con el citoplasma contraído en la pared celular.

Semejantes observaciones fueron realizadas por (28) en meristemos de Musa spp, donde en los meristemático no enfriados las células mantenían forma más o menos regular y no se distinguían vacuolas en su citoplasma. Sin embargo, después de congelar las muestras por debajo de -30 °C, observaron que a medida que las células eran menos meristemáticas existía un incremento en número y tamaño de las vacuolas presentes en estas.

Como era esperado para una concentración de sacarosa de 0,3 mol L-1 se alcanzaron los mejores niveles de supervivencia para los ápices posterior a la inmersión en nitrógeno líquido y al calentamiento (Figura 5B). Por lo tanto, esta concentración de sacarosa se seleccionó para continuar la experimentación. Los resultados de diferentes grupos de investigación son variados en el sentido de estandarizar concentraciones apropiadas de sacarosa durante la crioprotección. Para cada material a crioconservar debe encontrarse la concentración adecuada ya que esta varía según la especie o explante (4, 13, 28).



Cuando se emplea sacarosa se debe determinar la concentración adecuada que toleran las células antes de iniciar el proceso de crioconservación, basado en dos aspectos fundamentales, la deshidratación osmótica y la toxicidad a las células (4). Los resultados más importantes de este experimento fue la seleccionó de la concentración de sacarosa de 0,3 mol*L-1 para continuar la experimentación.
En la Figura 6 se observó que los niveles de tolerancia a la deshidratación por la solución PVS2 se incrementaron notablemente al emplear los tratamientos de la solución de carga hasta 180 min (Figura 6A).



Por su parte, los niveles de supervivencia a la crioconservación también se elevaron hasta un 40 %, con diferencias significativas a los 150 min de deshidratación en PVS2 a favor de la mezcla crioprotectora de sacarosa 0,4 mol*L-1 y glicerol 2 mol*L-1 (Figura 6B), por lo que ésta última será la solución de carga que se empleará en los siguientes experimentos. Sin embargo, se evidenció que no fue posible obtener un incremento en la supervivencia de los ápices aunque se utilice un mayor tiempo de incubación.

Lo anterior coincide con los resultados publicados con respecto a la utilización del tiempo de pre-tratamiento en las concentraciones de glicerol y sacarosa mediante los procedimientos de vitrificación (9, 12). Lo que indica que es el tiempo adecuado para que se activen los mecanismos necesarios involucrados en la tolerancia de las células a los diferentes momentos estresantes en una estrategia de crioconservación.

Cuando se determinó el número total de grupos OH por moléculas de las mezclas utilizadas (sacarosa + glicerol) para comparar los resultados de supervivencia con diferencias estadísticas obtenidos en la Figura 6. Para el caso de la mezcla 0,4 mol*L-1 sacarosa + 2,0 mol*L-1 glicerol rinde 55,402 x 1023 grupos OH total por moléculas mientras que la mezcla 0,75 mol*L-1 sacarosa + 1,0 mol L-1 glicerol rinde 54,198 x 1023 grupos OH total por moléculas. De esta forma es evidente el porqué de las diferencias significativas. El reordenamiento de los grupos hidroxilo de las moléculas de diferentes azúcares y poli-alcoholes constituye un factor importante para una efectiva crioconservaciónA.

En la Figura 7 se muestran los resultados al disminuir la temperatura de aplicación del PVS2. Se observó un aumento en el tiempo de tolerancia hasta los 480 min (Figura 7A) y los máximos valores de supervivencia a la crioconservación se incrementaron hasta un 45 % a los 420 min de exposición al PVS2 (Figura 7B). Por lo tanto, en la continuación de la estrategia criogénica se disminuirá la temperatura hasta 0 °C para aplicar el PVS2.



Según Takagi (29) en la crioconservación de ápices de brotes de especies tropicales mejoro la supervivencia de Dioscorea alata a la crioconservación desde un 47 % hasta un 91 % disminuyendo la temperatura desde 25 °C hasta 0 °C durante la deshidratación por PVS2). En la actualidad existen evidencias de estudios de Calorimetría Diferencial de Barrido donde varios autores hipotetizan al respecto (15). Los autores plantean que el mecanismo de protección del PVS2 no solo está relacionado con la no formación de cristales de hielo, sino que además se basa en la restricción de la movilidad molecular y la desorganización de la estructura de los cristales de hielo.

En la Figura 8 se observó que existieron claras evidencias estadísticas donde la solución vitrificadora PVS2 (Figura 8 A) es menos efectiva que la PVS3 (Figura 8 B) para el caso de los ápices de piña empleados. Esto se manifiesta en los mayores valores de supervivencia a partir de los 180 min de aplicadas las soluciones vitrificadoras durante la deshidratación de los ápices. En el caso, de la supervivencia de los ápices crioconservados también los máximos niveles se alcanzan con la solución vitrificadora PVS3.



Lo anterior pudiera tener su explicación en que la solución PVS2 utiliza al compuesto químico dimetilsulfóxido que debe ser muy bien investigado su empleo porque tiene efectos fisiológicos y mutagénicos negativos para algunos materiales vegetales.

Los resultados negativos de tolerancia coinciden con lo informado para otros sistemas biológicos y está asociado al alto grado de toxicidad del dimetilsulfóxido (9) accesiones, se puede apreciar que el material vegetal mantuvo un porcentaje de supervivencia entre 6,3 -65 %.

Con relación a lo anterior, en la Tabla II se puede apreciar la aplicación de la estrategia criogénica a nueve accesiones del banco de germoplasma in vitro, donde se pudo comprobar la respuesta variada de los diferentes genotipos en la supervivencia después de la crioconservación. El material vegetal durante el proceso de crioconservación puede sufrir varios estreses entre los que se encuentran cambios de pH, cambios mecánicos, deshidratación (daños osmóticos), daños en la rehidratación, estrés oxidativo y estrés por bajas temperaturas (30). Los porcentajes de supervivencia alcanzados por los ápices de piña crioconservados pudrían estar influenciados por alguno de estos estreses.

 

CONCLUSIONES

 

Nota al Pie

AThinh, N. T. Cryopreservation of germplasm of vegetatively propagated tropical monocots by vitrification. Doctoral Paper, Kobe University, Faculty of Agriculture, Japan, 1997.

 

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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 28 de enero de 2016

 

 

Ariel Villalobos Olivera, Universidad de Ciego de Ávila (UNICA), Cuba. Email: ariel@unica.cu