Evaluación cualitativa de monoterpenos en Rosmarinus officinalis cultivados con agua tratada magnéticamente

Qualitative evaluation of monoterpenes in Rosmarinus officinalis cultivated with magnetically treatment water

Yilan Fung Boix,^I Jorge Molina Torres,^II Enrique Ramírez Chávez,^II Liliana Gómez Luna,^I Janet Quiñones-Galvez,^III Albys Ferrer Dubois,^I Elizabeth Isaac Alemán,^I Ann Cuypers^IV

^ICentro Nacional de Electromagnetismo Aplicado, CNEA. Universidad de Oriente, ave Las Ameritas s/n. Santiago de Cuba, Cuba, CP 90400.
^IICINVESTAV, Unidad Irapuato. km 9.6 libramiento norte, CP 36821. Irapuato, Guanajuato. México.
^IIICentro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón, km 9. Ciego de Ávila. CP 69450, Cuba.
^IVCentro de Ciencias Ambientales. Universidad de Hasselt. Bélgica.

RESUMEN

La familia Lamiaceae (labiatae labiadas), está formada por numerosas especies entre ellas el Rosmarinus officinalis L. La misma constituye una de las especies con mayor poder antioxidante por la presencia de sus aceites esenciales, monoterpenos y compuestos fenólicos. Su propagación vegetativa en Cuba es una de sus dificultades y en estos momentos se encuentra retirada del Formulario Nacional de Fitofármacos, debido a la disponibilidad en el país. El agua tratada magnéticamente ha sido muy utilizada en el riego ya que estimula el crecimiento y desarrollo de las plantas, mostrando que su aplicación puede activar el metabolismo de las células; sin embargo, los estudios han sido muy limitados en estos aspectos. El objetivo del trabajo fue evaluar los compuestos bioactivos monoterpenos presentes en la especie Rosmarinus officinalis L., cultivadas con agua tratada magnéticamente en Santiago de Cuba. Los extractos n-hexano fueron analizados a través del método de cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC), en sílica gel (placas Fluka, alufoils analítica espesor 0,2 mm), con sistema de solvente de tolueno y acetato de etilo, soluciones estándares de monoterpenos: cineol, borneol, geraniol, linalol, citral, eucaliptol, citronelal y dos tipos de reveladores la vainillina en etanol al 10 % y una solución de ácido sulfúrico en etanol, la observación fueron con luz blanca. Se obtuvo como resultado que los extractos de las plantas tratadas con 120 mT y las plantas control, se identificaron la presencia de monoterpenos con un factor de retención (R_f) entre 0,08-0,93.

Palabras clave: cromatografía, campo magnético, lamiaceae, plantas medicinales.

ABSTRACT

Lamiaceae (labiatae labiadas) family have many species for example Rosmarinus officinalis L., it is one of the species with the highest antioxidant power by the presence of essential oils, monoterpenes and phenolic compounds. Its vegetative propagation in Cuba is one of its difficulties and in recent years, this species has been removed from the National Formulary of Phytopharmaceuticals because of its availability. The magnetically treated water has been used for irrigation because it stimulates the growth and development of plants, showing that its application can activate metabolism of cells; however, studies have been very limited in these respects. The aim of this work was to evaluate monoterpen bioactive compounds present in the species Rosmarinus officinalis L., cultivated with magnetically treated water in Santiago de Cuba. N-hexane extracts were analysed by the method of thin layer chromatography of high-resolution (HPTLC) silica gel (fluka plates, foils analytical Alu thickness 0, 2 mm) with a solvent system of toluene and ethyl acetate. Monoterpen standard solutions as cineol, borneol, geraniol, linalool, citral, eucalyptol, citronellal were used and two types of developers vanillin in 10 % ethanol and a solution of sulphuric acid in ethanol, the observation was with white light. The results showed that hexane extracts from treated plants with 120 mT and control plants had the presence of monoterpens, and it was identified with retention factor (R_f) between 0,08 to 0,93.

Key words: chromatography, magnetic field, lamiaceae, medicinal plants.

INTRODUCCIÓN

Rosmarinus officinal L.es una de las plantas utilizadas en la medicina tradicional, debido a la presencia de diferentes compuestos entre los que se encuentran los compuestos fenólicos, ácido rosmarinico, flavonoides, monoterpenos, ac. carnosico, carnosol y rosmanol (1). Debido a su alto contenido de estos metabolitos presenta elevada actividad antioxidante y sus extractos constituyen excelente secuestradores de radicales libres (estrés oxidativo) (2), o moléculas que al reaccionar con las proteínas, grasas y ácidos nucleicos, pueden causar cambios que originan enfermedades cardíacas, cáncer, Alzheimer y envejecimiento prematuro.

Las condiciones ecológicas en diferentes países pueden influir en los compuestos fitoquímicos de las plantas, ya que pueden ser acumulados particularmente debido a las respuestas de las condiciones ambientales (3). Por lo que dependiendo del lugar geográfico donde crezcan las plantas bajo condiciones de clima, suelo, humedad, altura sobre el nivel del mar generan diferentes cambios en cantidad y tipos de moléculas bioactivas presentes; por ejemplo, las variedades de romero originarias de Portugal se caracterizan por poseer altas cantidades de mirceno, mientras que en Francia es el alcanfor y en Marruecos el cineol los que se encuentran en mayor concentración (4, 5).

En Cuba esta planta crece de manera espontánea y sus cultivos se encuentra en jardines privados. Es una especie que florece esporádicamente y cuando lo hace, sus semillas presentan poca viabilidad. Del mismo modo, su propagación vegetativa en la mayoría de las ocasiones presenta dificultades en el enraizamiento de las estacas y cuando logran generar raíces su crecimiento es muy lento (6). Actualmente se encuentra retirada del formulario nacional de fitofármacos y apifármacos por disponibilidad del cultivo^A; y en los últimos años esta especie forma parte del listado de plantas priorizadas para el desarrollo de la medicina natural y tradicional en nuestro país.

Recientemente, el uso de los campos magnéticos para la estimulación del crecimiento vegetal es cada vez más utilizada debido a la menor influencia perjudicial sobre el medio ambiente. Entre los métodos empleados se destaca el agua tratada con campo magnético estático en sistemas de riego, reportándose los efectos beneficiosos en la producción y rendimiento de las plantas.aunque estos estudios son todavía muy limitados se plantea que los efectos biológicos del campo magnético dependen de los niveles de inducción magnética, tiempo de exposición, contenido de iones, calidad, volumen y flujo del agua, así como la temperatura (7).

El agua tratada magnéticamente ha sido utilizada en la agricultura y su aplicación en el riego mejora el crecimiento, desarrollo y productividad en las plantas (8). Estudios realizados hasta la actualidad han demostrado el papel significativo del riego con agua tratada magnéticamente sobre las plantas, siendo recomendada para el ahorro del agua en el riego (9, 10).

Otros estudios del tema han mostrado que la aplicación de campos magnéticos en el agua de riego puede activar el metabolismo celular. Investigaciones en plantas de frijol regadas con agua tratada magnéticamente obtuvieron un incremento en el crecimiento, concentración de giberelinas (GA3), kinetina, pigmentos fotosintéticos (clorofila a, b y carotenoides), en comparación con plantas que fueron regadas con agua sin tratamiento magnético (8). Otros estudios en la irrigación con agua tratada magnéticamente en plantas de garbanzo indujo un efecto positivo en el porcentaje de germinación y rendimientos de dichas plantas (11, 12). Otros autores utilizaron 125 mT en la germinación de Glyxine max, obteniendo un incremento de la rubisco (13). En la especie Raphanus sativus se obtuvieron estimulación en la síntesis de lípidos en cloroplastos, mitocondrias y membrana celular cuando fue aplicado el campo magnético con una densidad de flujo de 500 μT (14). También fueron encontrados aumentos positivos en el rendimiento de las semillas, y estimulación en la síntesis de los lípidos en rábano (14, 15).

El objetivo del trabajo fue evaluar la presencia de los compuestos bioactivos monoterpenos presentes en la especie Rosmarinus officinalis L. cultivadas con agua tratada magnéticamente en Santiago de Cuba, a través de las técnicas de cromatografía de capa fina de alta resolución (TLC/HPTLC).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las plantas fueron cultivadas en la parcela experimental (CNEA) en Santiago de Cuba, mediante la metodología planteada (16). La especie fue depositada en el herbario del Centro de Biodiversidad y Ecosistemas (BIOECO) en la misma provincia con registro No. 21324.

Material vegetal

Como material inicial se emplearon hojas de plantas adultas de la especie Rosmarinus officinalis L. de 50 cm de longitud, cultivadas en los canteros de la parcela experimental del CNEA, las mismas tenían seis meses de edad.

Se tomaron los datos meteorológicos existentes en el período durante el cual se desarrolló la investigación, la temperatura osciló entre 30 ºC+2; un valor promedio de humedad relativa entre 60 y 70 %; precipitaciones entre 55 y 60 mm3. El sustrato estaba formado por materia orgánica y tierra (1:2), así como los diferentes tipos de minerales.

En las propiedades físicas del suelo se encuentran:

Materia orgánica > 4,3 %

Conductividad eléctrica: 271 μs cm^-1

pH: 6,8

El riego se realizó dos veces al día a través de un sistema de microjet por goteo, durante 30 minutos, el cual tiene entre sus accesorios una bomba itur y un sistema distribuidor, controlado por válvulas que garantizan que el riego se realice por secciones.

Las características del agua de riego utilizada fueron:

Velocidad del agua: 1,4 – 1,6 m/s

Caudal de la bomba: 2,54 – 2,91 m³h^-1

Conductividad eléctrica: 208 μscm^-1

Ph: 7,50

Se realizó el análisis químico al suelo y agua de riego, obteniéndose los siguientes valores promedios (Tabla I).

Tratamiento magnético

Para cada tratamiento magnético se utilizó un magnetizador exterior de imanes permanentes, diseñado, construido y calibrado en el centro nacional de electromagnetismo aplicado (CNEA). Se utilizó un magnetizador exterior de imanes permanentes con una longitud de 10 cm y una inducción magnética de 120 mT, la inducción magnética fue medida con un Microweberímetro 192041, de error relativo de las mediciones menores del 5 %. El tamaño de muestra fue de 40 plantas por cada tratamiento.

Los tratamientos estudiados fueron:

Tratamiento 1 (T1): plantas testigo, que no fueron regadas con agua tratada magnéticamente.

Tratamiento 2 (T2): plantas regadas con agua tratada magnéticamente a una inducción magnética de 120 mT.

Obtención de los extractos con solvente hexano a partir de hojas de R. officinalis L.

Las hojas fueron colectadas y sometidas a un proceso de secado en una estufa a 40 ºC hasta peso constante. Se emplearon tres gramos de hojas como peso inicial de cada tratamiento en 100 ml del solvente. Se realizaron extracciones sucesivas con hexano como solvente, con la finalidad de lograr un mayor agotamiento del material vegetal seco triturado. La extracción se realizó con el equipo Soxhlet durante cuatro horas de reflujo continuo. Lo extraído se filtró y concentró en un equipo Rotoevaporador Buchi modelo 461 a temperatura de 40 0C, hasta reducirlo a un volumen de 10 ml, para luego ser almacenado para su posterior análisis.

Análisis bioquímico

La determinación de los pigmentos fotosintéticos de R. officinalis l. se realizó según metodología (17). Para ello se pesaron 100 mg de hojas frescas, se colocaron en un mortero con acetona al 80 %, en el que se maceraron y pasaron a un papel de filtro Whatman (GF/A, 110 mm), se obtuvo como volumen final 20 ml de la solución.

Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro UV-1602, a longitudes de onda de 663, 646 y 470 nm, y como blanco acetona al 80 %.

Los cálculos se realizaron a través de las fórmulas:

Chl a (μg ml^-1extracto) =12,21 * A₆₆₃-2,81*A₆₄₆

Chl b (μg ml^-1extracto) =20,13 * A₆₄₆–5,03*A₆₆₃

Carotenoides (μg ml^-1extracto)=1000*A₄₇₀–3,27*Chla- 104*Chl b-L

La evaluación cualitativa se realizó a través de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC), en sílica gel (placas Fluka, Alufoils analítica thickness 0,2 mm). Se aplicaron en la cromatoplaca 2 microlitros de las soluciones estándares de monoterpenos: cineol, borneol, geraniol, linalol, citral, eucaliptol y citronelal, además de los dos extractos preparados previamente. El sistema de solventes fue: tolueno y acetato de etilo (93:7), una vez desarrollada la placa fue revelada con dos tipos de soluciones: vainillina en etanol y la segunda solución etanol con ácido sulfúrico, luego fue calentada la placa a 110 0C durante cinco minutos, observada a la luz blanca (18).

Los datos experimentales obtenidos de la concentración de pigmentos fotosintéticos, se procesaron estadísticamente mediante un análisis de varianza de clasificación simple para un 95 % de confianza, y una prueba de t-Student. Los resultados se expresaron en valores medios±error estándar.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN

Para la variable concentración de pigmentos fotosintético aunque no existieron diferencias estadísticamente significativas, desde el punto de vista biológico los mayores valores de clorofila_a (1,70±0,04 mg L^-1), clorofilab (0,60±0,04 mg L^-1) y carotenos (0,52±0,04mg L^-1) fueron en las plantas tratadas siendo el testigo los menores valores de clorofila a (1,40±0,06mg L^-1), clorofilab (0,33±0,03mg L^-1) y carotenos (0,40±0,03 mg L^-1 )(Tabla II).

En la figura se muestra la evaluación cualitativa de los monoterpenos presentes en extractos hexano de R. officinalis L:,cultivados con agua tratada magnéticamente y con agua sin tratamiento magnético. Se presentan los estándares de monoterpenos cineol, borneol, geraniol, linalol, citral, eucaliptol y citronelal, además de los extractos.

El estudio de los compuestos bioactivos en los extractos procedentes de las plantas regadas sin y con agua tratada magnéticamente, mostraron la presencia de algunos de los compuestos estándares en su composición, existiendo coincidencia de la estándares linalol (0,38), citral (0,25) y citronelal (0,50) para los extractos procedentes de plantas regadas sin y con agua tratada magnéticamente como se observa en la (Tabla III).

En los resultados algunos de los compuestos presentes en nuestros extractos están relacionados con la composición química de los aceites esenciales en la especie Rosmarinus officinalis cultivado en Pakistán, los cuales fueron determinados por métodos de cromatografía gaseosa y espectrometría de masa. En donde aparecen los grupos de monoterpenos oxigenados con un 67 % y los hidrogenados en un 27 % (3).

Debido a la importancia de los antioxidantes naturales existen estudios sobre los diferentes tipos de obtención y propiedades, pero la escasa difusión de los mismos y las diferentes condiciones de experimentación, hacen que se necesite de ajustes de ciertos parámetros de extracción como solventes y dosificación para que puedan más utilizados.

En la familia de las Lamiaceae, el aceite esencial se produce en las hojas por estructuras secretoras como los tricomas glandulares, peltados y capitados. En este aspecto el R. officinalis se han reportado diversos compuestos químicos, los cuales han sido agrupados de manera general por diversos autores, y se han identificado presencia de a-pineno, ß-pineno, canfeno, ésteres terpénicos como el 1,8-cineol, alcanfor, linalol, verbinol, carnosol, rosmanol, isorosmanol, 3-octanona, isobanil-acetato y ß-cariofileno; los ácidos vanílico, caféico, clorogénico, oleanólico, rosmarínico, carnósico, ursólico, butilínico, betulínico, betulina, a-amirina, ß-amirina, borneol, terpineol, linalol, citronelal y acetato de bornilo (19, 20).

Estudios realizados en Melissa officinalis perteneciente a la misma familia del R. officinalis reportaron en sus aceites esenciales compuestos similares como linalol, citronelal, metilcitronelal, siendo los monoterpenos los mayoritarios en la composición fitoquímica (21).

Los resultados obtenidos demuestran que las plantas regadas con agua tratada magnéticamente a una inducción de 120 mT, se obtuvieron mejores valores en la concentración de pigmentos fotosintéticos, en comparación con las plantas testigo. Al igual que se comprobaron la presencia de los monoterpenos linalol, citronelal y citral en los extractos obtenidos de plantas regadas con agua tratada magnéticamente y plantas control. Demostrándose que el campo magnético no varió ningún compuesto en ambos extractos; la ausencia de los demás estándares en la placa, pudo ser debido al método de extracción utilizado.

Este estudio contribuyó al conocimiento de la aplicación del agua tratada con campo magnético estático y su influencia en el riego del romero. Al mismo tiempo se utilizó el método de HPTLC como una herramienta rápida y económica para el análisis de drogas secas y extractos naturales. Todo ello permite la obtención de una materia prima desde el campo con mejor calidad, y que pueda ser utilizada en la elaboración de extractos antioxidantes naturales.

CONSLUSIONES

El trabajo se obtuvo mayores valores de clorofila a, b y carotenos con respecto a las plantas testigo. Se demuestra que el Rosmarinus officinalis cultivado con agua tratada magnéticamente presenta los mismos compuestos que las plantas sin tratamiento magnético. A través de las técnicas de Cromatografía de Capa Fina o Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución (TLC/HPTLC) se puede autenticar de forma preliminar y rápida, sustancias presentes en extractos naturales que son utilizados como medicamentos naturales o Fitofármacos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores ofrecen las gracias a la colaboración internacional de la Secretaría de Relaciones Exteriores (SRE)/CINVESTAV. Irapuato (México). Proyecto VLIR/UO, Universidad de Hasselt (Bélgica)/ Universidad de Oriente/CNEA (Cuba).

Notas al pie

^A Buró nacional de farmacia MINSAP. Formulario nacional fitofármacos y apifármacos. Edit. Ciencias médicas, la Habana, 2010.

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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 29 de enero de 2016

Yilan Fung Boix, Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado, CNEA. Universidad de Oriente, ave Las Ameritas s/n. Santiago de Cuba, Cuba, CP 90400. Email: yilan@uo.edu.cu