http://dx.doi.org/10.13140/RG.2.2.29052.13446
Actividad antifúngica del extracto en acetona asistido por ultrasonido y fracciones enriquecidas en alquilresorcinoles de Hordeum vulgare L. Contra Fusarium oxysporum
Antifungal activity of ultrasound-assisted acetone extract and alkylresorcinol-enriched fractions from Hordeum vulgare L. against Fusarium oxysporum
Oscar D. Plazas-Jiménez, Ericsson Coy-Barrera
Laboratorio de Química Bioorgánica, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada.
RESUMEN
Los lípidos fenólicos son una serie de compuestos de origen natural que son producidos, entre otros, por especies de la familia Poaceae, como es el caso de la cebada (Hordeum vulgare L.). Tales compuestos se han descrito en algunos trabajos con propiedades antimicrobianas importantes. Por tanto, como parte de un programa de búsqueda de compuestos anti fúngicos, se realizó la evaluación de la actividad in-vitro contra Furarium oxysporum del extracto en acetona y de tres fracciones depuradas, obtenidas a partir de la harina de granos de la variedad andina de cebada. En comparación con trabajos previos, el extracto en acetona presentó contenidos más altos de alquilresorcinoles, cuyo perfil cromatográfico permitió identificar al menos ocho alquilresorcinoles mayoritarios. La depuración del extracto bajo monitoreo con revelador específico, llevó a la obtención de tres fracciones enriquecidas en alquilresorcinoles. Tanto el extracto crudo como las fracciones depuradas mostraron actividad anti fúngica a diferentes niveles, con respuesta dependiente de la dosis. Así, los valores de ED50 de tales tratamientos estuvieron entre 3,3-24,0 μg mL-1. Las fracciones enriquecidas mostraron mayor actividad, indicando que el efecto directo de los alquilresorcinoles sobre el fitopatógeno es representativo para inhibir su crecimiento. Todo lo anterior sugiere a estos compuestos como buenos candidatos para ser estudiados en trabajos futuros en el control de este fitopatógeno.
Palabras clave: Poaceae, propiedades antimicosicas, compuestos fenólicos, lípidos.
ABSTRACT
Phenolic lipids are a series of natural origin compounds which are produced, among others, by species of the family Poaceae, such as barley (Hordeum vulgare L.). Such compounds have been described with significant antimicrobial properties. Therefore, as part of a program for the search for antifungal compounds, an acetone extract and depurated fractions were obtained from grain flour of barley (andina variety) and tested in-vitro against Furarium oxysporum. The acetone extract showed high alkylrecorcinols content compared to previous works, whose chromatographic profile led to identify at least eight major alkylresorcinols. The purification of the extract (monitored with specific revealer) led to obtain three alkylrecorcinol-enriched fractions. Both the crude extract and the purified fractions showed antifungal activity at different levels, with a dose-dependent response. Thus the treatments showed ED50 values were between 3,3-24,0 μg mL-1. However, enriched fractions showed greater activity to that of crude extract, indicating that the direct effect of alkylresorcinols on the phytopathogen is representative to inhibit their growth. All of the above mentioned facts suggest these compounds as good candidates for controlling this phytopathogen.
Key words: Poaceae, antifungal properties, phenolic compounds, lipids.
INTRODUCCIÓN
Los alquilresorcinoles se definen químicamente como lípidos fenólicos no isoprenoides. Su estructura consiste de un anillo de benceno con dos grupos hidroxilo en posiciones 1,3 y generalmente una cadena alifática en la posición 5, que puede variar desde C1 hasta C29 y estar saturada e insaturada. Son moléculas anfipáticas, lo cual depende del largo de la cadena alifática, la saturación y los grupos funcionales presentes (1).
Algunos autores notifican la presencia de alquilresorcinoles en 11 familias de plantas, dos familias de algas, tres géneros de musgos, dos familias de hongos, tres familias de bacterias y una especie de esponja marina (2). En el caso de las plantas, los alquilresorcinoles se acumulan en la cutícula de las hojas, botones florares, frutos y semillas.
Dentro de las especies vegetales más reconocidas, por sus altos contenidos de alquilresorcinoles, se destaca a la familia Poaceae, cuyos ejemplares más representativos son la cebada (Hordeum vulgare L.), trigo (Triticum aestivum L.), centeno (Secale cereale L.), triticale (×Triticum secale), arroz (Oryza sativa L.), maíz (Zea mays L.), mijo (Pennisetum americanum L.) y avena (Avena sativa L.) (3).
La cebada es cultivada en Colombia, en zonas con alturas entre 1800-3200 metros sobre el nivel del mar y temperaturas de 18-11 °C, con un área de 6,372 ha. No obstante, la cebada no es un producto principal de cultivo.
Actualmente se hacen grandes esfuerzos para mejorar su oferta y demanda, ya sea para el consumo humano o animal, como para la industria cervecera. Sumado a esto se encuentra el hecho de que sean buenas fuentes de alquilresorcinoles, ya que en varios casos se ha descrito que una de las razones químicas para que las semillas de cebada sean resistentes a hongos, es la presencia de alquilresorcinoles (4). Esto abre la posibilidad de considerar estos compuestos como posibles entidades químicas para el control de hongos, entre los que se encuentra Fusarium oxysporum Schlecht., un hongo causante de enfermedades en plantas de interés comercial en Colombia y otros países (5).
Varios trabajos coinciden en explicar que la bioactividad de los alquilresorcinoles está determinada por su naturaleza anfipática, la cual les permite interactuar con un amplio número de moléculas, células y estructuras tisulares (1, 2). Por tanto, algunos estudios han sido enfocados a la evaluación de la capacidad de los alquilresorcinoles para inhibir el crecimiento in-vitro de microorganismos.
En esos estudios se destaca la actividad antifúngica contra Aspergillus niger Tiegh., A. parasticus Speare, A. versicolor (Vuill.) Tirab., Penicillium chrysogenum Thom, P. roqueforti Thom, Fusarium culmorum (W.G. Sm.) Sacc., Rhizoctonia solani J.G. Kühn, R. cerealis E.P. Hoeven, Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Cladosporium cucumerinum Ellis & Arthur, Trichophyton mentagrophytes (C.P. Robin) R. Blanch. y Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen (2, 6).
Otros autores concluyen que los alquilresorcinoles son importantes y eficientes entidades químicas con propiedades antimicrobianas, los cuales podrían estar jugando un papel conveniente en la protección contra patógenos durante la formación de semillas y la biocenosis de plántulas (6, 7). Por consiguiente, con el propósito de aportar información relacionada con la actividad antifúngica de alquilresorcinoles de fuentes conocidas, en el presente trabajo se estableció un diseño experimental dirigido a la evaluación in-vitro contra F. oxysporum del producto obtenido a partir de la harina de cebada, mediante la extracción con acetona, asistido por ultrasonido, y de tres fracciones enriquecidas en alquilresorcinoles.
Este trabajo se constituye en el primer estudio sobre la composición en términos de alquilresorcinoles de cebada cultivada en Colombia y de la actividad de alquilresorcinoles contra F. oxysporum.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIAL BIOLÓGICO
El material vegetal de cebada –H. vulgare L., genotipo Andino, caracterizado por espigas de seis carreras, grano cubierto y masa de 100 granos=4,83±0,35 g (8)– fue cultivado bajo fertilización orgánica y sin productos agrícolas sintéticos, en bloques completamente al azar con tres repeticiones, en el predio de cultivo experimental del Campus Nueva Granada (suelo arcilloso (pH 8,0), 16 °C, 2600 m s. n. m.). El cultivo se estableció conforme a lo notificado en un trabajo previo (8).
Las muestras de grano entero (ca. 2000 granos con pericarpio y endospermo), se recogieron de plantas adultas por triplicado. Las muestras colectadas fueron liofilizadas, y una vez secas, se molieron en un triturador de cuchillas (Marca Waring, Modelo 2.5 Qt) hasta harina, luego se mantuvieron a -20 °C hasta su posterior análisis.
El fitopatógeno (F. oxysporum) se mantuvo crioconservado en caldo nutritivo:glicerol 70:30 a -20 °C y fue reactivado en placas contentivas de agar nutritivo a 25 °C, durante 48 h cuando se requirió su uso.
EXTRACCIÓN
Para la extracción con acetona de la harina de cebada se siguió la metodología descrita en el trabajo desarrollado por Magnucka, et al. (1). La mencionada extracción consistió en tomar una muestra de la harina (80 g) y someterla a extracción asistida por ultrasonido con acetona (120 mL). La extracción consistió de tres ciclos de sonicación de 15 min en un equipo Elmasonic S30H. El extracto obtenido se filtró a través de papel filtro (Papel Whatman No 4) y posteriormente se concentró a sequedad, a presión reducida (40°C) en un rotaevaporador IKA Digital 10.
OBTENCIÓN DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN ALQUILRESORCINOLES
Una cantidad (5,0 g) del extracto en acetona se fraccionó por cromatografía en columna (CC), sobre gel de sílice (SiO2), eluyendo con una mezcla de cloroformo:acetona:metanol 90:10:1 v/v/v a un flujo de 0,5 mL min-1). Las fracciones se colectaron en viales de vidrio y fueron monitoreadas por cromatografía en capa delgada (CCD) (eluídas con cloroformo: acetona:metanol 82:15:3 v/v/v y reveladas con Fast Blue RR® al 0,5 %). Luego de la elución, se reunieron las fracciones con perfil en CCD similar, a partir de la evidencia de la presencia de alquilresorcinoles.
CUANTIFICACIÓN COLORIMÉTRICA DE ALQUILRESORCINOLES EN ESTRACTOS Y FRACCIONES
Para la cuantificación colorimétrica de alquilresorcinoles en los extractos y fracciones de harina de cebada, se tomó por separado 1 mL de una disolución de 1 mg mL-1 del extracto o fracción en metanol, se agregaron 100 µL de Na2CO3 al 10 %; luego se adicionaron 3 mL de una disolución de FBRR al 0,01 % y 20 minutos después se midió la absorbancia a 480 nm (9). Cada medida se realizó por triplicado. Las medidas de absorbancia obtenidas se transformaron a valores de concentración en una curva de calibración previamente construida, utilizando olivetol (en μg mL-1) como patrón de referencia (y=0,1601x; R2=0,9997). Los resultados se expresaron como μg equivalentes de olivetol/g de material seco (MS) (± intervalo de confianza a 95 %).
ANÁLISIS POR HPLC-ESI-MS
La disolución del extracto y las fracciones (100 μg mL-1) se analizaron en un cromatógrafo Shimadzu UFLC con una bomba LC20AD y un detector UV SPD20A acoplado con interface ESI en modo positivo a un espectrómetro de masas de alta resolución marca Bruker, modelo Micro ToF-QII. La corrida cromatográfica para todos los extractos se realizó en una columna marca Phenomenex® modelo Luna C18 de 5 μm de tamaño de partícula y de dimensiones 250X100 mm.
La fase móvil utilizada para el análisis fue una mezcla de metanol (fase A) y 0,05 % de ácido trifluoracético (TFA) en agua (fase B), en gradiente de elución (fase B: 50 % de 0-2 min; 50-100 % de 2-20 min; 100 % de 20-24 min; 100-50 % de 24-26 min; 50 % de 26-30 min).
La identificación tentativa se llevó a cabo mediante el análisis de los espectros de masas, recuperados del TIC, el análisis de la fórmula condensada a través de las medidas de masa exacta y por comparación con datos encontrados en literatura.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIUFÚNGICA
La actividad antifúngica in-vitro se evaluó contra F. oxysporum. El medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) se suplementó a diferentes concentraciones (100,0-0,01 µg mL-1) de los extractos y las fracciones obtenidas de H. vulgare.
Lo anterior se realizó por una mezcla directa entre el medio (PDA antes de solidificar) y el tratamiento (el extracto en acetona o las fracciones F1-F3), adicionando la cantidad requerida de medio y de tratamiento, para conseguir la concentración a evaluar. Esta mezcla se agitó fuertemente hasta obtener una dispersión homogénea antes de solidificar.
Los medios suplementados se adicionaron en cajas Petri de 6 cm de diámetro y luego se colocó un disco de 2 mm, obtenido a partir de una colonia del fitopatógeno en el centro de la caja (10). Cada ensayo consistió de un diseño aleatorizado con tres repeticiones (cada una con tres réplicas) comparado contra un testigo (PDA sin tratamiento). Como control positivo se usó prochloraz®.
Los ensayos se dieron por terminados, una vez que el crecimiento micelial del testigo alcanzó el borde de la caja. Al finalizar la prueba se realizó el análisis de datos calculando el porcentaje de inhibición (InC).
%InC = [(área crecimiento micelial testigo – área crecimiento micelial tratamiento)/
área crecimiento micelial testigo]*100
Al finalizar el ensayo se registró también el número de conidios (en cámara de Neubauer) en los distintos tratamientos evaluados, para calcular el porcentaje de inhibición de producción de conidios:
(InE) (%InE= [(conidios/cm-2del testigo–conidios/cm-2 tratamiento) / (conidios/cm2 testigo)]*100)
donde:
Esporas/cm2 = # conidios
* área de crecimiento del hongo para cada tratamiento o testigo.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Con el fin de determinar si había diferencias (p<0,05) entre las variables respuesta evaluadas, los resultados de contenido total de alquilresorcinoles (CTA) y actividad antifúngica se compararon con sus réplicas, utilizando las pruebas de ANOVA y TUKEY (11). Para este fin se utilizó el software estadístico R versión 3.2.5 (12). Adicionalmente, con los datos de inhibición se determinó la dosis efectiva media (ED50) mediante una regresión no lineal con el programa Graph Pad Prism 5.0 (13).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ALQUILRESORCINOLES EN CEBADA ANDINA
La extracción con acetona proporcionó un rendimiento de 9,1 mg extracto por g de material seco. En la Figura 1 se observa que el CTA para H. vulgare, genotipo Andino cultivado en Colombia, posee un valor de 77,8 ± 1,4 μg g-1 de material seco. Este resultado es comparable con lo encontrado en otros estudios previos, donde se describe que el valor CTA para cebada puede encontrarse entre 41-210 µg g-1 base seca (4). No obstante, el resultado encontrado fue mayor que los contenidos determinados en accesiones de origen polaco (14), pero menor a los encontrados en otras gramíneas como el trigo (1).
A partir del análisis por HPLC-ESI-HRMS se obtuvo el cromatograma de iones totales (TIC) mostrado en la Figura 2a. En este TIC se observan 22 señales cromatográficas. No obstante, se encontró que no todos los compuestos detectados corresponden a alquilresorcinoles, entre los que se consideran algunos fenólicos y triglicéridos (datos no mostrados).
Bajo un análisis detallado de los espectros de masas y la fórmula condesada, deducida por la determinación de su masa exacta, se identificaron ocho compuestos de tipo alquilresorcinol, indicados por números resaltados en el perfil cromatográfico del extracto (Figura 2a).
En la Tabla I se muestran los ocho alquilresorcinoles identificados, con los valores de masa exacta, fórmula molecular deducida y el nombre del alquilresorcinol identificado.
En trabajos previos se analizaron los alquilresorcinoles presentes en cebada por cromatografía de gases, acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Este tipo de análisis requiere una previa derivatización para obtener los productos trimetilsilados de los alquilresorcinoles para que puedan ser analizados por GC. En tales trabajos se encontraron series homólogas de cadena saturada de C15:0 a C25:0, siendo mayoritarios los compuestos C21:0 y C25:0 (14). No obstante, en el ESA de la variedad andina se encontraron tres alquilresorcinoles conocidos, pero no identificados antes en muestras de cebada: el C12:1 (1), C14:1 (2) y el C18:0 (5). Esto puede deberse al uso de la sonicación como ayuda en la extracción, permitiendo remover tales compuestos de la matriz vegetal.
De todos los compuestos detectados en el ESA, aquellos con mayor área correspondieron a C15:0 (3), C17:0 (4), C19:0 (6) y C21:0 (7), los cuáles podrían ser considerados como mayoritarios.
OBTENCIÓN DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN ALQUILRESORCINOLES
A partir de la cromatografía en columna se obtuvieron tres fracciones enriquecidas en alquilresorcinoles (F1-F3), con valores de Rf en CCD de 0,81, 0,62 y 0,44, respectivamente.
La cuantificación del CTA mostró que la F3 posee el mayor contenido (38,8 μg eq olivetol g-1 de MS) en comparación con las otras fracciones (Figura 1), indicando que el ESA es abundante en compuestos saturados de cadena larga. Así mismo, estas tres fracciones también se analizaron por HPLC-ESI-HRMS cuyos TIC se muestran en la Figura 2b-d, respectivamente. En estos perfiles se aprecia la buena separación alcanzada en las fracciones, obteniendo para cada fracción tres grupos de alquilresorcinoles, lo cual es un indicativo de la depuración de los extractos.
La fracción 3, por su complejidad, agrupó el mayor número de compuestos, entre los que se encuentran los alquilresorcinoles 5-8 en mezcla con algunos triglicéridos. Las fracciones 2 y 3 consistieron en mezclas de dos alquilresorcinoles equivalentes a 1-2 y 3-4, respectivamente.
Otras señales presentes en el TIC del ESA no se presentan en las fracciones dado que la depuración del extracto se basó en el monitoreo con el revelador específico para alquilresorcinoles.
ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA
En la Figura 3 se muestran los resultados del por ciento InC para cada uno de los tratamientos. En ella se observa que el ESA presenta un comportamiento dependiente de la dosis empleada, con valores entre 0,5-34,0% de inhibición a dosis entre 0,01 y 10,0 μg mL-1, y significativamente diferentes (p<0,05) entre sí. Estos resultados concuerdan con lo encontrado por otros autores (7), quienes evaluaron una mezcla de alquilresorcinoles saturados de C13 a C27 contra tres fitopatógenos (F. culmorum, R. solani, R. cerealis) y encontraron que la mezcla ejercía inhibición a diferentes niveles.
En ese estudio, los fitopatógenos presentaron inhibición a partir de 10-20 μg mL-1, siendo F. culmorun el más resistente a los tratamientos. Sin embargo, al compararlos con los presentes resultados, el extracto crudo soluble en acetona (ESA) de cebada resultó ser más activo, pues a 90 μg mL-1 inhibió el crecimiento completamente (datos no mostrados), mientras que en otro trabajo se observó que la inhibición completa se logró a partir de 160 μg mL-1 (7).
Las fracciones F1-F3 por su parte, presentaron mejor actividad que el ESA, con porcentajes de inhibición mayores y significativamente diferentes (p<0,05) al extracto crudo. Entre ellas, la Fracción 1 presentó los mejores valores de inhibición (77 % a 10 μg mL-1), la cual contiene los alquilresorcinoles insaturados y de cadena de C12 y C14. Las otras dos fracciones (F1 y F2) también fueron más activas que ESA, las cuáles contienen alquilresorcinoles saturados (C15-C23), pero menos activos en comparación con la Fracción 1 (e.g., a la máxima dosis mostrada, 10 μg mL-1).
Por otro lado, los resultados de DE50 se muestran en la Tabla II. Se puede apreciar que el ESA es el menos activo (24,1±1,3 μg mL-1) y que la Fracción 1 presenta la mayor actividad (dos-cuatro veces) en términos de inhibición de crecimiento micelial de F. oxysporum (3,31±0,54 μg mL-1) y casi comparables con el control positivo utilizado (prochloraz®, ED50=1,68±0,37 μg mL-1).
Para el caso de la inhibición en la producción de conidios (%InE), tanto el extracto como las fracciones mostraron reducción significativa en la esporulación, y con una distribución similar (Figura 4).
Nuevamente la Fracción 1 evidenció los valores más altos de %InE, aunque fueron comparables y sin diferencia significativa con las Fracciones 1 y 2. Sin embargo, las fracciones presentaron valores ligeramente más altos que el ESA.
Los alquilresorcinoles, así como los lípidos fenólicos en general, se describen como compuestos con diferentes actividades biológicas (15), sobre todo aquellos obtenidos a partir de cereales (16). No obstante, la actividad antifúngica contra algunos fitopatógenos no se ha estudiado ampliamente, encontrándose estudios de actividad contra fitopatógenos de alquilresorcinoles obtenidos de centeno (7, 17–19), trigo duro (6), y de la cáscara de mango (20, 21).
Para alquilresorcinoles obtenidos de H. vulgare solo se encontró el estudio realizado con extractos obtenidos del grano de diferentes cultivares de cebada de origen uruguayo contra A. niger y P. crysogenum (5), pero no hay resultados previos que evalúan la actividad de alquilresorcinoles contra F. oxysporum, lo cual también constituye una de las principales novedades del presente trabajo.
Los resultados permiten concluir que los alquilresorcinoles poseen actividad antifúngica, lo cual está acorde con lo establecido por Zarnowski en su estudio (7).
Lo anterior indica también que los alquilresorcinoles podrían ser objeto de estudio en procesos avanzados de evaluación (in-vivo y en campo) en el camino para ser utilizados como una alternativa de control de F. oxysporum.
Teniendo en cuenta las características químicas de los alquilresorcinoles presentes en las fracciones, los lípidos fenólicos con cadenas más pequeñas o insaturadas, poseen mayor actividad antifúngica que aquellos con cadenas saturadas y más largas. Esto está de acuerdo con un estudio previo donde se encontró que los alquilresorcinoles saturados y de cadena más larga posiblemente no retenían la actividad antifúngica por más tiempo, dado que algunos hongos fitopatógenos tienen la capacidad de metabolizar los alquilresorcinoles de cadena relativamente más grande, transformándolos en compuestos menos tóxicos (17).
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Universidad Militar Nueva Granada por la financiación. Producto derivado del proyecto INV-CIAS-1471, financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones de la UMNG-Vigencia 2014.
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Recibido: 09/04/2015
Aceptado: 29/02/2016
Oscar D. Plazas-Jiménez, Laboratorio de Química Bioorgánica, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada. Email: ericsson.coy@unimilitar.edu.co
