Los ácidos húmicos de vermicompost protegen a plantas de arroz (Oryza sativa L.) contra un estrés hídrico posterior
The humic acids from vermicompost protect rice (Oryza sativa L.) plants against a posterior hidric stress
Fernando Guridi-Izquierdo,I Andrés Calderín-García,II Ricardo L. Louro-Berbara,II Dariellys Martínez-Balmori,I Mayelín Rosquete-BassóI
I Universidad Agraria de La Habana (UNAH). Autopista Nacional km 23 ½ y Carretera de Tapaste. San José de las Lajas. Mayabeque. Cuba.
II Universidade Federal Rural do Río de Janeiro (UFRRJ). BR 465 km 7. CEP 23890-000, Seropédica, RJ. Brasil.
RESUMEN
Los ácidos húmicos (AH) de dos diferentes vermicompost fueron extraídos, aislados, purificados y parcialmente caracterizados, para evaluar su posible efecto protector en plantas de arroz (Oryza sativa L.) ante un estrés hídrico. En los AH se encontraron diferencias en la composición elemental, en el valor del umbral de coagulación y en la relación E4/E6 de sus espectros UV-Vis. Dos concentraciones (40 y 60 mg L-1) de ambos AH se incluyeron en disoluciones nutritivas para el cultivo de plantas de arroz en condiciones controladas. Se verificó que el tratamiento previo con los AH durante seis días, estimuló la producción de biomasa radical. Después se excluyeron los AH y tanto en las plántulas inicialmente tratadas, como en un grupo de las utilizadas como control, se indujo un déficit hídrico adicionando polietilenglicol (PEG-6000) en la disolución nutritiva. Luego de 96 horas de establecida esa condición final se evaluaron la producción neta de biomasa radical, el contenido de pigmentos fotosintéticos foliares y la permeabilidad de la membrana de las raíces. En las plantas previamente tratadas con AH (a la concentración de 60 mg AH L-1), la permeabilidad de la membrana de las raíces, la producción neta de biomasa en este órgano, así como el contenido de clorofila “a” no manifestaron diferencias al compararlas con aquellas sin estrés. Se concluye que el tratamiento previo con los AH consiguió proteger a las plantas de arroz ante el estrés hídrico posterior que se indujo.
Palabras claves: biomasa radical, permeabilidad, pigmentos fotosintéticos, productividad biológica.
ABSTRACT
The humic acids (HA) from two different vermicompost were extracted, isolated, purified and partially characterized, to evaluate their possible protection in rice (Oryza sativa L.) plants against an hydric stress. Differences in elemental composition, as the coagulation threshold value and E4/E6 relation in their UV-Vis spectra were found. Two concentrations (40 and 60 mg L-1) of both HA were included in the nutritive solutions for rice plants in controlled conditions. It was verified that the previous treatment with the HA during six days stimulated the root biomass production. Later the HA were excluded and was an hydric deficit induced by adding polietilenglicol (PEG-6000) in the initially treated plants and in a group of those used as control. After 96 hours of this final condition the net radical biomass, the photosynthetic pigments content and the root membrane permeability were evaluated. In the plants previously treated with HA (at the concentration 60 mg HA L-1), the root membrane permeability, the net radical biomass production and the “a” chlorophyll content had no differences when compared with those without stress. It was concluded that the previous treatment with the HA protected the rice plants against a posterior hydric stress that was induced.
Key words: radical biomass, permeability, photosynthetic pigments, biological productivity.
INTRODUCCIÓN
Las sustancias húmicas constituyen la fracción donde es retenido mayoritariamente el carbono de la materia orgánica del suelo e intervienen en múltiples propiedades del sistema suelo-planta (1). Actualmente no se cuenta con una explicación integral que pueda justificar la posible relación entre la estructura de estas sustancias y los efectos directos que provocan en las plantas (2).
El compostaje y el vermicompostaje son procedimientos ampliamente utilizados en la obtención de materia orgánica renovable, para ser aplicada como mejoradora de las condiciones de los suelos degradados por la actividad agrícola y también representan fuentes muy útiles para la extracción de sustancias húmicas solubles. Además se ha verificado (3) que el sólido residual insoluble que se obtiene, después de la extracción de las sustancias húmicas solubles que contenía un vermicompost, presenta una considerable capacidad para retener cationes de metales pesados en medio acuoso.
Las características estructurales y las propiedades de las sustancias húmicas solubles que se obtienen de materiales compostados o vermicompostados, dependen de la fuente orgánica original, de las condiciones empleadas para su procesamiento (principalmente la temperatura, el tiempo y el agente biológico transformador), así como del procedimiento utilizado en la extracción (4–7).
Algunas investigaciones recientes están dirigiéndose al estudio de la influencia que las sustancias húmicas solubles (especialmente los ácidos húmicos) tienen en el estímulo para la adaptación de las plantas frente a estreses abióticos como la salinidad (8–11), la presencia de metales pesados en niveles tóxicos (12) y las deficiencias hídricas (13–15), siempre utilizándolas simultáneamente o después de la implantación del estrés, así como en la estimulación del crecimiento y el desarrollo en diferentes cultivos, para lo cual se han empleado distintas alternativas de aplicación (16–18).
El cultivo del arroz (Oryza sativa L.) exige un óptimo manejo del agua dados los considerables volúmenes que se consumen de este recurso, que puede no estar disponible siempre en las cantidades necesarias. Por ello es importante realizar estudios que permitan disponer de alternativas para atenuar los efectos desfavorables de las limitaciones de agua.
No existen suficientes informes en la literatura, referidos a la durabilidad del efecto protector que pudieran ejercer los ácidos húmicos ante el estrés hídrico cuando estos ya no se encuentran en el medio de cultivo.
En función de lo anterior el objetivo principal de esta investigación fue: evaluar los efectos de la aplicación previa de ácidos húmicos (AH) obtenidos de dos vermicompost diferentes, en la productividad biológica de plantas de arroz, así como su acción protectora al inducir un estrés hídrico posterior.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para dar cumplimiento al objetivo previsto se llevaron a cabo las actividades que se describen a continuación, que fueron ejecutadas en el Departamento de Suelos del Instituto de Agronomía de la Universidad Federal Rural de Río de Janeiro, Brasil, entre los meses de septiembre a noviembre de 2014.
Extracción, aislamiento, purificación y caracterización parcial de los AH
Los procedimientos para la extracción, aislamiento, purificación y caracterización parcial de los AH fueron ejecutados en el laboratorio de materia orgánica del Instituto de Agronomía de la Universidad Federal Rural de Río de Janeiro.
Como fuentes de los ácidos húmicos se utilizaron los vermicompost siguientes:
Vermicompost de estiércol bovino procesado por lombrices rojas africanas (Eudrilus eugeniae spp.), en pilas sobre el suelo, de acuerdo a los procedimientos fijados por el Manual Técnico para organopónicos de 2007, con un tiempo de maduración de 70 días. El estiércol fue suministrado por las vaquerías de la Finca “El Guayabal” (municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba) con coordenadas 22o 59´ 55,95´´ Latitud Norte y 82o 10´ 10,27´´ Longitud Oeste.
En ambos vermicompost fueron extraídos, aislados y purificados los AH de acuerdo a lo establecido por la Sociedad Internacional de Sustancias HúmicasA. Básicamente el procedimiento consiste en la utilización de una disolución de extracción de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 mol L-1 en atmósfera de dinitrógeno; seguido de centrifugación para separar la fracción insoluble y aislamiento de los AH del medio acuoso alcalino por coagulación mediante acidificación hasta pH < 2 con una disolución de ácido clorhídrico (HCl) 6 mol L-1. La recuperación de lo coagulado se logró por centrifugación y posteriormente se aplicaron lavados con agua destilada hasta ausencia de iones cloruros. La purificación se efectuó redisolviendo los AH obtenidos y se llevó a cabo la coagulación, la centrifugación y los lavados como se describió. Finalmente los AH se liofilizaron.
De aquí en adelante los AH obtenidos del vermicompost de Cuba se identificaron por AHC y los provenientes del vermicompost de Brasil como AHB.
Para la caracterización parcial de los AH se determinó en ambos la composición elemental, utilizando un aparato CHN Analyser 2400 Perkin Elmer (Inglaterra). Se calculó en cada uno la relación E4/E6 (relación entre las absorbancias a las longitudes de onda de 465 y 665 nm) en el espectro UV-Vis de una disolución
de 3 mg del AH en 10 mL de hidrógenocarbonato de sodio (NaHCO3) 0,05 mol L-1 de pH = 8, empleando un Espectrofotómetro Shimadsu UV-1800 (Japón) y se les determinó el umbral de coagulación mezclando un mismo volumen de disoluciones de 150 mg L-1 de los AH a pH = 6 con igual volumen de 15 concentraciones diferentes (desde 1,25 mmol L-1 hasta 18,75 mmol L-1) de cloruro de calcio (CaCl2) de calidad P.A., seguido de 24 horas de reposo para detectar visualmente la menor concentración del CaCl2 que provocó la coagulación.
Obtención de las plántulas de arroz y tratamientos con AHC y AHB
Se utilizaron semillas certificadas del cultivar “Piauí”, previamente desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2 % por 10 minutos y después lavadas con suficiente agua destilada, que se colocaron para germinar en contacto con una disolución de CaCl2 (calidad P.A.) de concentración 0,5 mmol L-1, manteniéndose en las condiciones de la cámara de crecimiento del Departamento de Suelos de la Universidad Federal Rural de Río de Janeiro, que fueron las siguientes: ciclo de luminosidad 12 horas de luz y 12 de oscuridad; flujo fotónico de 250 µmol m-2 s-1; humedad relativa de 70 %; temperatura diurna 28 oC y nocturna de 24 oC.
Después de la germinación se seleccionó un conjunto homogéneo de semillas germinadas con la misma longitud de la radícula (2 cm). En potes plásticos de 200 mL de capacidad, se añadió disolución de Hoagland (19) con ¼ de la fuerza iónica y se cubrieron con gasa estéril, sobre la cual se colocaron seis de las semillas escogidas en cada uno. A los tres días de adaptación a las condiciones experimentales de hidroponía y de la cámara de crecimiento, se cambió la disolución nutritiva por una con ½ de la fuerza iónica, manteniéndolas por otras 72 horas, al cabo de las cuales se realizó la aplicación de los tratamientos con los AH (seis potes por tratamiento) al renovar el medio de cultivo, que se mantuvo con igual composición. En otros seis potes no se incluyeron los AH para tomarlos como referencia (control).
Esas últimas condiciones permanecieron idénticas durante seis días, con un recambio de los tratamientos en el tercero.
Los tratamientos aplicados en esta etapa del estudio se resumen en la Tabla I.
Al concluir la etapa anterior (tratamiento previo con los AH) se retiraron dos plántulas de cada pote, conformando tres grupos (réplicas) de cuatro plántulas por tratamiento, para determinar la masa seca, tanto de la parte aérea como de las raíces, mediante desecación en estufa con circulación de aire (Venticell-707, China) a 60 oC hasta masa constante (balanza Sartorius, precisión ± 0,0001 g, Alemania), con el objetivo de calcular la relación entre ambas.
Aplicación del estrés hídrico
Después del período descrito se indujo un estrés hídrico durante 96 horas, incluyendo polietilenglicol (PEG-6000) al 15 % en las disoluciones nutritivas, excepto en la mitad de los potes de las plántulas donde no fueron aplicados los AH (control).
Para esta nueva etapa del estudio los tratamientos empleados (tres potes para cada tratamiento) aparecen resumidos en la Tabla II.
Al finalizar el período de estrés hídrico inducido se utilizaron dos plantas de cada pote para evaluar la permeabilidad de la membrana de las raíces, mediante medición de la conductividad eléctrica cada cinco minutos, después de ser lavadas con agua destilada y colocadas en 100 mL de agua ultrapura (mili-Q) con agitación permanente. Las lecturas fueron hechas con un pHmetro-conductímetro OrionStar A329 (Inglaterra).
En las cuatro plantas restantes de cada pote se determinaron las masas secas radicales y de la parte aérea y se cuantificó el contenido de pigmentos fotosintéticos foliares mediante una extracción con acetona al 80 % (20).
Todos los resultados obtenidos en las evaluaciones ejecutadas en las plantas en las dos etapas del experimento con un diseño completamente aleatorizado, fueron sometidas a análisis de varianza de clasificación simple y las medias se compararon con el test de Tukey para p<0,05 (21), utilizando el programa estadístico Statgraphic versión 5.1 (22).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En cuanto a la caracterización parcial de AHC y AHB los resultados obtenidos con respecto a sus respectivas composiciones elementales aparecen en la Tabla III.
Según lo anterior, ambos AH poseen una composición que se encuentra dentro de los rangos encontrados para ese tipo de sustancia húmica extraída de materiales compostados o vermicompostados (23) y las presentes en los suelos (24).
Se apreció que las principales diferencias entre AHC y AHB estuvieron en los contenidos de
C y de O, probablemente debido a las condiciones de obtención de los respectivos vermicompost (6). De lo anterior se infirió que el segundo es ligeramente más hidrofílico, teniendo en cuenta que en estas sustancias el oxígeno se encuentra mayoritariamente como hidróxilos (- OH) de grupos carboxílicos y fenólicos, los cuales poseen una elevada afinidad por el agua, por el establecimiento de puentes de hidrógeno (4). En función de esto último debe esperarse que el umbral de coagulación de AHB sea superior al de AHC, ya que se consumiría una mayor concentración de electrolitos para vencer la interacción con las moléculas de agua.
El cálculo de la relación E4/E6 así como la determinación del umbral de coagulación de los AH obtenidos se expone en la Tabla IV.
Los resultados para esta relación, tanto para AHC como para AHB, se encuentran dentro del intervalo general (entre 4 y 6) de los AH extraídos de diferentes fuentes naturales y cuyo valor depende de la masa molar, del tamaño molecular, así como del grado de condensación y de aromaticidad de la estructura (4). Esos valores indican que en AHC existe una mayor condensación estructural cuando se compara con
AHB (23) y confirman la superior hidrofilicidad de estos últimos, debido al contenido de oxígeno formando parte de grupos ionizables, en correspondencia con la composición elemental encontrada.
También es válido considerar lo informado por otros autores trabajando con el catión Cu2+ como coagulante de distintos AH a pH=5 (25), quienes plantearon que cuanto menor era el grado de aromaticidad (equivalente a un mayor valor de la relación E4/E6) se obtuvieron valores de umbral de coagulación superiores.
En la literatura científica está reconocida que la actividad biológica de los AH depende tanto de la estructura como de la composición elemental de estas sustancias (5, 23, 26), por lo cual las diferencias encontradas hasta aquí entre AHC y AHB pueden inducir efectos distintos en su interacción directa con las plantas.
La evaluación de la relación entre la masa seca de la parte aérea y la radical en las plántulas al final del tratamiento previo con los ácidos húmicos, se representa en la Figura 1.
Los resultados evidenciaron que todos los tratamientos previos, que incluyeron a los ácidos húmicos, en cualquiera de las concentraciones empleadas, provocaron una disminución de la Rel PA/R en comparación con el control (tratamiento T). Esto concuerda con la reconocida estimulación que estas sustancias húmicas ejercen directamente sobre el desarrollo del sistema radical en diversos cultivos en los primeros estadìos de crecimiento (27, 28).
Un mejor desarrollo del sistema radical contribuye a un aprovechamiento más eficiente del medio edáfico circundante, confiriéndole a la planta potencialidades de adaptabilidad a condiciones adversas, como limitaciones en la disponibilidad de agua o de elementos nutricionales esenciales, y ante situaciones de estrés metálico u oxidativo (29).
No se detectó diferencia estadística significativa entre los dos AH ni entre sus concentraciones, de lo cual se deriva que lo encontrado en la composición elemental no provocó variaciones en el efecto de los AH.
La determinación de los pigmentos fotosintéticos después del período de estrés hídrico inducido aparece en la Tabla V.
En cuanto a los contenidos individuales de los pigmentos fotosintéticos evaluados, resaltó la disminución que provocó el estrés en la “Clo a”, la cual fue atenuada por los tratamientos previos con ambos ácidos húmicos en las dos concentraciones, alcanzando valores equivalentes y hasta superiores a los de las plántulas (T SE) que no estuvieron sometidas al déficit hídrico inducido. También se observó que las plántulas tratadas previamente con las mayores concentraciones (60 mg L-1) tanto de AHC como de AHB, mantuvieron o hasta superaron a las del T SE en los contenidos de todos los pigmentos.
El efecto del estrés hídrico sobre los pigmentos fotosintéticos ha sido indicado como uno de los más generalizado en diversos cultivos, según lo señalado por estudios sobre la fotosíntesis en diversas plantas bajo condiciones de estrés (27).
Los resultados confirman lo que recoge la literatura en cuanto a que las sustancias húmicas tienen la posibilidad de influir directamente en el metabolismo de las plantas (2, 7, 26, 29), debido a la verificada actividad equivalente a las fitohormonas que poseen, así como al efecto estimulador de enzimas relacionadas con la fijación del dióxido de carbono. Además se ha demostrado que también pueden inducir modificaciones anatomorfológicas (incrementos del área foliar y radical) que repercuten en mayor eficiencia fotosintética.
El hecho de que la aplicación de los AH haya atenuado el efecto del estrés hídrico en cuanto a la dotación de pigmentos fotosintéticos, debe tener repercusión en la eficiencia fotosintética en esas plantas y consecuentemente en la producción de biomasa.
La producción neta de masa seca radical (diferencia de las masas secas antes y después del estrés) en el período de inducción del estrés, se representan en la Figura 2.
Se evidenció que las plantas que tuvieron los tratamientos previos con las mayores concentraciones de AHC y de AHB, consiguieron al menos igualar la producción de masa seca radical que se registró en aquellas que no fueron sometidas al estrés hídrico. En las plantas puestas en contacto anteriormente con la concentración de 40 mg L-1 de AHB hubo una respuesta favorable en comparación con las plántulas estresadas, pero sin conseguir la producción generada en las que no se expusieron al estrés.
Si se asocian los resultados en cuanto al contenido de los pigmentos al final del estrés hídrico inducido, con la producción neta de masa seca radical en ese período, es destacable que aquellas plantas tratadas previamente con AH (con lo que se consiguió mantener una adecuada composición de pigmentos), estuvieron en mejores condiciones para que la fotosíntesis aconteciera sin afectaciones significativas, que impidieran generar los metabolitos necesarios para garantizar la producción de biomasa.
Las mediciones de la conductividad eléctrica en el agua pura en contacto con las raíces íntegras en diferentes intervalos de tiempo, para la evaluación de la permeabilidad de la membrana se presentan en la Figura 3.
En general quedó demostrado la durabilidad del efecto protector de la aplicación previa de los AH sobre la permeabilidad de las membranas de las raíces. En el caso de las plantas provenientes de las dos concentraciones de AHC, los valores no tuvieron diferencias con las de las no estresadas (T SE) y muy inferiores a las de TE, en todas las evaluaciones a lo largo del tiempo. Esto significa que con dicho tratamiento fue perservada la permeabilidad de la membrana aun después de 96 horas de estrés.
En el caso de las plantas tratadas con AHB se consiguió un valor semejante al tratamiento T SE para la concentración de 60 mg L-1 en la útima evaluación, aunque siempre fueron inferiores a las registradas en las plántulas estresada que no tuvieron contacto previo con AH (tratamiento T E).
En las plantas del tratamiento AHB 40 E no se igualó en ningún momento la conductividad a las de T SE y solamente fueron inferiores a las de T E en el momento inicial y el final.
Lo encontrado en esta determinación confirma lo que han señalado otros autores en cuanto a que los efectos directos de los AH sobre la respuesta fisiológica de las plantas, dependen tanto de la concentración como de sus características estructurales (26, 28) y que lo hacen interfiriendo en diversos mecanismos fisiológicos (29, 30).
En relación con las características estructurales de los AH se puso de manifiesto que la composición elemental es una información insuficiente para explicar las diferencias en cuanto a su actividad biológica, por lo que se requiere una profundización mayor en este aspecto, como por ejemplo la distribución de tamaños moleculares y de grupos funcionales del carbono.
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados anteriores es posible plantear la siguiente conclusión general:
Los ácidos húmicos aislados de dos vermicompost obtenidos en condiciones distintas, manifestaron diferencias en las características estructurales y las propiedades evaluadas, pero en ambos casos, especialmente a la concentración de 60 mg L-1, ejercieron un efecto protector previo en plantas de arroz, que posteriormente fueron expuestas a un déficit hídrico por 96 horas, no estando ya presentes en el medio. Dicha protección se verificó en la producción neta de biomasa radical, los pigmentos fotosintéticos y la permeabilidad de la membrana de las raíces.
RECOMENDACIONES
Evaluar la posibilidad de emplear un extracto de las sustancias húmicas solubles contenidas en el vermicompost (sin aislar los ácidos húmicos) como un procedimiento práctico en el cultivo del arroz para lograr un uso más eficiente del recurso agua.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a CAPES por la aprobación del proyecto CAPES-MES 215/13, del EDITAL Nº 46/2013.
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Recibido: 11/05/2016
Aceptado: 07/11/2016
Fernando Guridi Izquierdo, Universidad Agraria de La Habana (UNAH). Autopista Nacional km 23 ½ y Carretera de Tapaste. San José de las Lajas. Mayabeque. Cuba. Email: fguridi@unah.edu.cu
