A. brasilense cepa 8-INICA aislada de rizosfera de caña de azúcar cv. Ja 60-5 en la provincia de Ciego de Ávila, Cuba ¹² cultivada en medio NFb a 28 ºC, 100 rpm y mantenida en caldo BMS ¹³ con glicerol al 20 % (v/v) a -80 ºC. B. japonicum cepa USDA-110 ¹⁴ donada por el Centro de Investigación y Formación Agraria Las Torres-Tomejil (Sevilla, España), cultivada y mantenida en medio Vincent ¹⁵.

Las semillas de soya (Glycine max cv. Williams) se esterilizaron superficialmente en HgCl₂ al 0,1 % durante 5 min y luego se lavaron varias veces con agua destilada estéril. Las semillas se sembraron en frascos Leonard de 1 L pasados por autoclave llenos de vermiculita estéril y se inocularon con 1 mL de A. brasilense 8-INICA o B. japonicum USDA-110 en suspensiones con concentraciones del orden 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC. mL^-1). Los tratamientos fueron: plantas no inoculadas regadas con una solución de nitrato de potasio conteniendo 35 ppm de nitrógeno (tratamiento control); plantas inoculadas solo con A. brasilense 8-INICA; plantas inoculadas solo con B. japonicum USDA-110 y plantas inoculadas con los dos microorganismos. Los tratamientos de inoculación se regaron con una solución nutritiva libre de nitrógeno. Las soluciones nutritivas fueron reemplazadas tres veces por semana. Las condiciones de la cámara de crecimiento fueron: un fotoperíodo de 16 h de luz/8h de oscuridad, 25 ºC día/15 ºC de temperatura nocturna, 58 % de humedad relativa y un nivel de irradiación de 200 μm m^-2 s^-1. Se usaron tres réplicas para plantas inoculadas y no inoculadas. Después de cinco semanas, las plantas se recolectaron para determinaciones de parámetros de crecimiento de plantas y para microscopía. Se determinó la altura de la planta, el peso fresco de los tallos y las raíces, el peso seco de los nódulos y la actividad nitrogenasa en los nódulos. La actividad nitrogenasa se midió mediante el ensayo de reducción de acetileno (ARA) en raíces noduladas de plantas inoculadas con Bradyrhizobium y coinoculadas con Bradyrhizobium + Azospirillum respectivamente siguiendo el método descrito por otros autores ¹⁶.

Se obtuvieron anticuerpos contra Azospirillum para confirmar que la cepa de Azospirillum inoculada fue la misma que la que se encontró en las raíces de soya. La cepa A. brasilense 8-INICA se cultivó como se indicó anteriormente durante 24 h, en un volumen conocido de medio BMS. Se concentraron las células y se añadió formaldehído estéril al sedimento para lograr una concentración final de 5 por 1000 y se dejó durante la noche a 27 ºC. Posteriormente se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 min. El sedimento se lavó con solución salina tamponada con fosfato estéril pH 7,2 (PBS) y se suspendió en PBS estéril pH 7 hasta alcanzar 10⁹ cel.mL^-1, medida por densidad óptica a 680 nm. Los sedimentos finales se suspendieron en cantidades iguales de adyuvante completo de Freund. Se obtuvo antisuero en conejos blancos por vía de inmunización intravenosa, una inyección cada ocho días durante cinco semanas. La sangre se recogió ocho días después de la última inyección. El suero de purga final de cada conejo se recogió mediante centrifugación de la sangre coagulada a 2.000 g y se almacenó a -20 ºC. Se obtuvieron sueros de preinmunización de cada conejo.

Solamente las plantas inoculadas con Azospirillum fueron procesadas para microscopía. Para probar la especificidad del antisuero, los cultivos in vitro de Azospirillum se incluyeron primero en agar ¹⁷. Las piezas de agar se procesaron como muestras de raíces para embeberse en resina LR-White ¹⁸. Se seleccionaron pequeños trozos de raíces frescas para una etapa de desarrollo comparable. Las muestras se tomaron en el momento de la cosecha, se cortaron con una cuchilla de afeitar, se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % (v/v) en 50 mM de cacodilato de Na, pH 7,4 y se infiltraron al vacío para mejorar la penetración del fijador. La deshidratación se realizó utilizando una serie de etanol y los nódulos se infiltraron y finalmente se incluyeron en LR-White Resin (London Resin Corporation) mediante polimerización por calor a 60 °C durante 24 h en cápsulas de gelatina ¹⁹. Se cortaron secciones semi-gruesas (1 μm) y ultrafinas (70 nm-espesor) en un ultramicrotomo Reichert Ultracut S para microscopía óptica y microscopía electrónica, respectivamente. Las secciones semi-gruesas se tiñeron con azul de toluidina al 1% (p/v) en borato de sodio acuoso (1 %) para examen directo utilizando un fotomicroscopio Zeiss Axiophot

Para la inmunocitoquímica y el silver enhancement, se colocaron portaobjetos de vidrio con secciones de 1 µm de espesor a 37 ºC, durante la noche para asegurar la adhesión de las secciones. Las secciones se lavaron a fondo en PBS, pH 7,2, que contenía gelatina pura al 0,01 %, BSA al 0,1 % y azida sódica al 0,05 %. El bloqueo de los sitios de unión inespecíficos se logró mediante la incubación de secciones en la solución anterior que contenía 20 mg de albúmina de suero bovino (BSA) por mL, durante 20 minutos a temperatura ambiente. La incubación en anticuerpos primarios (anti-A. Brasilense 8-INICA) diluidos 1: 500 en el mismo tampón, se llevó a cabo durante 1 h en horno a 37 ºC. Las secciones se enjuagaron luego en PBS y el exceso de tampón se eliminó suavemente. La incubación con conjugado de oro anti-conejo de cabra (GAR 15 nm; BioCell, Cardiff, U.K.) diluido 1:40 en PBS se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se enjuagaron luego en PBS y agua destilada. El silver enhancement se llevó a cabo con el kit IntenSE M (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) y se permitió que progresara mientras se controlaba bajo el microscopio ¹⁹. Las secciones se enjuagaron luego enérgicamente con agua del grifo y agua destilada, se tiñeron con 0,05 % (w/v) de fucsina básica (Carlo Erba, Milano, Italia) en etanol acuoso al 5 % (v/v), se enjuagaron y se dejaron secar. Las secciones fueron montadas y fotografiadas bajo un fotomicroscopio Zeiss Axiophot. Para microscopía electrónica, se recogieron secciones (de 70 nm de espesor) en rejillas de níquel e inmunorotuladas ¹⁸. La contracción de las secciones se obtuvo con acetato de uranilo acuoso al 2 % (5 min) y citrato de plomo durante 2 min. Después de enjuagar y secar al aire, se examinaron las secciones utilizando un microscopio electrónico STEM LEO 910 a un voltaje de aceleración de 80 kV.

El establecimiento de poblaciones bacterianas eficientes en la rizosfera es esencial para mejorar la colonización de las raíces y la productividad de las plantas ²¹. La colonización de la raíz de soya se estudió al final del cultivo de plantas, en plantas inoculadas sólo con Azospirillum, utilizando microscopía óptica y electrónica e inmunocitoquímica. A. brasilense 8-INICA colonizó la superficie de la raíz por adhesión al material mucilaginoso, producido por la planta donde proliferan las bacterias (Figura 1 y Figura 2A y B).

Además, se pueden observar los carbohidratos producidos por las bacterias. Los carbohidratos se detectaron mediante tinción con fucsina ¹⁹. (Figura 1C y Figura 2B y C).

Estos carbohidratos podrían conferir protección a la raíz contra condiciones externas y podrían favorecer la colonización de la bacteria en su hábitat natural ²². Los resultados muestran bacterias muy cerca de los pelos radicales cerca de la punta radical (Figura 1A y B). Se observan microcolonias en la superficie de la raíz embebidas en una matriz de polímero de carbohidratos de producción propia que fue consistente ²³, como se muestra en las figuras 2B y C (puntas de flecha) y bajo protección del pelo radical (Figuras 2A y C). Esto da lugar a la biopelícula, que es un mecanismo que permite a las bacterias vivir en condiciones extremas o cambiantes y uno de los más utilizados en la colonización competitiva de raíces por bacterias eficientes. Después de la colonización de la raíz superficial, se produce la colonización parenquimática intercelular. Azospirillum pudo tomar la ruptura causada por la emergencia de una raíz secundaria (Figuras 3A y B) e ingresar en los espacios intercelulares del parénquima de la raíz de la planta (Figuras 3A y C) y entre las células epidermis radical, permitiendo la colonización. La morfología de la raíz cambió como consecuencia de esta colonización, produciendo una matriz entre dos capas de células del parénquima de la raíz (Figuras 3B y D).

Esta matriz parenquimática facilita el crecimiento bacteriano y las bajas presiones parciales de oxígeno para la expresión de la nitrogenasa y puede contribuir directamente al nitrógeno de la planta y asegura el intercambio de nutrientes entre las bacterias y la planta. Las bacterias del suelo y de la rizosfera pueden afectar la nutrición mineral de las plantas al cambiar las características de absorción de la raíz, debido a una modificación de la morfología de la raíz o la alteración de los mecanismos de absorción, la tasa de crecimiento relativa o la composición interna de las plantas ²⁴. El hecho de sobrevivir dentro de la raíz y no producir ninguna lesión confirma este microorganismo como una bacteria endofítica ²⁵. Los endófitos pueden ser útiles para proteger a la planta del estrés ambiental, así como para suministrar nitrógeno y otras sustancias que promueven el crecimiento ²⁶.

Las reacciones del anti-A brasilense 8-INICA con el microorganismo mostraron, en el microscopio óptico, las bacterias rodeadas de partículas de oro (Figura 4). La inmunolocalización y el silver enhancement demuestran que se logra la colonización por A. brasilense 8-INICA, conociendo que las bacterias están marcadas en la ruptura causada por la aparición de una raíz secundaria (Figura 4A-C), en los espacios intercelulares (Figura 4D) y en la matriz parenquimática producida por la colonización de Azospirillum del parénquima de la raíz (Figura 4D-F). Con el gran aumento en la microscopía óptica (Figura 4G) se puede observar que los espacios intercelulares y la matriz parenquimática están conectados, y Azospirillum identificado por el anticuerpo puede verse como cuerpos rodeados por un círculo negro. Estos resultados en experimentos de inoculación en soya muestran firmemente la colonización por Azospirillum, lo cual es consistente con informes similares sobre arroz ²⁷, tabaco ²⁸, tomate ²⁹ y cebada ³⁰. En el caso de la caña de azúcar, la controversia de si es solo una bacteria rizosférica o asociada a la raíz o un endófito, requiere estudios adicionales que permitan aclarar este aspecto, que podría verse influido por manifestación de quorum sensing³ y otros factores. La inmunolocalización en portaobjetos ultrafinos de células de Azospirillum, embebidas en agar con el anticuerpo anti-A. brasilense 8-INICA, muestra una enorme afinidad del anticuerpo al antígeno (Figura 5A). Hay un marcaje intenso de las bacterias con partículas de oro de 15 nm. El número de partículas de oro es elevado y marcó las diferentes capas de las envolturas celulares (Figura 5A, flechas).

La cantidad de partículas de oro disminuye considerablemente cuando el marcaje se realiza en los espacios intercelulares, como si las bacterias perdieran algunas de las capas con la colonización del parénquima de la raíz (Figura 5B), aunque también se puede observar el marcaje en diferentes capas (flechas). Dentro de la matriz parenquimática solo una capa aparece marcada (Figura 5C y D) y no se detectan partículas de oro en el interior de las bacterias. Se puede observar un marcaje inespecífico en las vesículas de la matriz parenquimática, probablemente formadas por la degradación de las membranas bacterianas (Figura 5C).

Cuando la bacteria envejece, el citoplasma se retrae y las partículas de oro permanecen en la capa más externa de las envolturas de la bacteria (Figura 6A y B). Aunque no es normal, en algunas áreas aparecen partículas de oro en la pared celular (Figura 6C). Muy pocas partículas de oro aparecen en el citoplasma de las células adyacentes a la matriz. No hay localización de partículas de oro en orgánulos envejecidos (Figura 6D).

Azospirillum generalmente se asocia con raíces de pastos como la caña de azúcar, el arroz y el maíz ⁴, lo que se traduce en beneficios para las plantas por su contribución a la nutrición. Las técnicas de microscopía e inmunolocalización permitieron confirmar en este trabajo que A. brasilense 8-INICA puede actuar como un endófito en las raíces de soya. Los endófitos pueden ser útiles para proteger a la planta del estrés ambiental, así como para suministrar nitrógeno y otras sustancias que promueven el crecimiento ²⁶. Este trabajo enfatiza que Azospirillum no sólo es interesante para la inoculación en caña de azúcar, sino también en la soya y, por lo tanto, funcionaría muy bien en el intercalamiento de la soya y la caña de azúcar, con la ventaja de no tener que introducir cepas extrañas en los suelos cubanos.

A. brasilense 8-INICA strain isolated from sugarcane cv. Ja 60-5 rhizosphere in Ciego de Ávila province, Cuba ¹² cultured in NFb medium at 28 ºC, 100 rpm and maintained in BMS broth ¹³ containing 20 % (v/v) glycerol at -80 ºC. B. japonicum USDA-110 ¹⁴ donned by Centro de Investigación y Formación Agraria Las Torres-Tomejil (Sevilla, Spain), grown and maintained in Vincent medium ¹⁵.

Soybean (Glycine max cv. Williams) seeds were surface sterilized in 0.1 % HgCl₂ for 5 min and then washed several times with sterile distilled water. Seeds were sown in 1 L autoclaved Leonard jars filled with sterile vermiculite and inoculated with 1 mL of A. brasilense 8-INICA or B. japonicum USDA-110 suspension containing 10⁸ colony forming units (CFU mL^-1). Treatments were: Nitrogen (control treatment) non-inoculated plants and watered with a solution containing 35 ppm of nitrogen in form of potassium nitrate, plants inoculated only with A. brasilense 8-INICA, plants inoculated only with B. japonicum USDA-110 and plants inoculated with the two microorganisms. The inoculations treatments were watered with a free nitrogen nutritive solution. Nutrive solutions were replaced three times per week. The conditions of the growth chamber were: a 16-h-light/8-h-dark photoperiod, 25 ºC day/15 ºC night temperature, 58 % relative humidity and an irradiance level of 200 μm m^-2 s^-1. Three replicates were used for inoculated and non-inoculated plants. After five weeks plants were harvested for plant growth parameter determinations and microscopy purposes. It was determined plant height, shoot and root fresh weight, nodule dry weight and nitrogenase activity in nodules. Nitrogenase activity was measured by the acetylene reduction assay (ARA) on nodulated roots from plants inoculated with Bradyrhizobium and co-inoculated with Bradyrhizobium + Azospirillum, following the method described by other authors ¹⁶.

Antibodies against Azospirillum were obtained in order to confirm that the strain of Azospirillum inoculated was the same that those that was found in soy roots. A. brasilense 8-INICA strain was cultivated as indicated above for 24 h, in a known volume of BMS medium. Cells were harvested and sterile formaldehyde was added to the pellet to achieve a final concentration of 5 per 1000 and left overnight at 27 ºC. Cells were centrifuged at 5000 rpm for 5 min. The pellet was washed with sterile phosphate buffer saline pH 7.2 (PBS) and suspended in sterile PBS pH 7 until reaching10⁹ cell mL^-1, measured by optical density at 680 nm. The final pellets were suspended in equal quantities of Freund's complete adjuvant. Antiserum was obtained in white rabbits by intravenous immunization route, one injection every eight days for five weeks. Blood was collected eight days after the last injection. The final bleed-out serum from each rabbit was collected by centrifuging clotted blood at 2.000 g and stored at -20 ºC. Preimmunization sera were obtained from each rabbit.

Only plants inoculated with Azospirillum were processed for microscopy. In order to prove the specificity of the antiserum, Azospirillumin in vitro cultures were embedded first in agar ¹⁷.The agar pieces were processed as root samples to be embedded in LR-White resin ¹⁸. Small pieces of fresh roots were selected for a comparable stage of development. Samples were taken at harvest time, cut with a razor blade, fixed in 2.5 % (v/v) glutaraldehyde in 50 mM Na-cacodylate, pH 7.4 and vacuum-infiltrated to enhance penetration of the fixative. Dehydration was performed using an ethanol series and nodules pieces were infiltrated and finally embedded in LR-White Resin (London Resin Corporation) by heat polymerization at 60 °C for 24 h in gelatin capsules ¹⁹. Semi-thick (1 μm) and ultrathin (70 nm-thick) sections were cut in a Reichert Ultracut S ultramicrotome for light microscopy, and electron microscopy, respectively. The semi-thick sections were stained with 1 % (w/v) toluidine blue in aqueous sodium borate (1 %) for direct examination using a Zeiss Axiophot photomicroscope.

For immunocytochemistry and silver enhancement, glass slides with 1 µm thick sections were placed at 37 ºC, overnight to ensure adhesion of sections. Sections were thoroughly washed in PBS, pH 7.2, containing 0.01 % pure gelatin, 0.1 % BSA, and 0.05 % sodium azide. Blocking of unspecific binding sites was achieved by incubation of sections in the above solution containing 20 mg of Bovine Serum Albumine (BSA) per mL, for 20 min at room temperature. Incubation in primary antibodies (anti-A. brasilense 8-INICA) diluted 1:500 in the same buffer, was carried out for 1 h in oven at 37 ºC. Sections were then rinsed in PBS and the excess of buffer gently removed. Incubation with goat anti-rabbit gold conjugate (GAR 15 nm; BioCell, Cardiff, U.K.) diluted 1:40 in PBS was performed for 1 h at room temperature. Sections were then rinsed in PBS and distilled water. Silver enhancement was carried out with IntenSE M Silver Enhancement Kit (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) and allowed to progress while monitored under the microscope ¹⁹. Sections were then energetically rinsed in tap and distilled water, counterstained with 0.05 % (w/v) basic fuchsine (Carlo Erba, Milano, Italy) in 5 % (v/v) aqueous ethanol, rinsed and let to dry. Sections were then mounted and photographed under a Zeiss Axiophot photomicroscope. For electron microscopy, sections (70 nm thick) were collected on nickel grids and immunolabelled ¹⁸. Counterstaining of sections was obtained with 2 % aqueous uranyl acetate (5 min) and lead citrate for 2 min. After rinsing and air-drying, sections were examined using a STEM LEO 910 electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV.

The establishment of efficient bacterial populations in the rhizosphere is essential to improve root colonization and plant productivity ²¹. Soybean root colonization was studied at the end of plant culture in plants inoculated only with Azospirillum, using light and electron microscopy and immunocytochemistry. A. brasilense8-INICA colonized root surface by adhesion to mucilaginous material produced by the plant where bacteria proliferate (Figure 1 and Figure 2A and B).

Furthermore, carbohydrates produced by the bacteria can be observed. Carbohydrates were detected by fuchsine staining ¹⁹. (Figure 1C and Figure 2B and C).

These carbohydrates could be able to confer protection to the root against external conditions and may favor colonization of the bacterium in its natural habitat ²². Results show bacteria very close to root hairs near the radicular tip (Figure 1A and B). Microcolonies are observed on the root surface embedded in a self-produced carbohydrate polymer matrix which was consistent ²³, as shown in figures 2B and C (arrowheads) and under protection of the root hair (Figures 2A and C). This gives rise to biofilm, which is a mechanism that allows bacteria to live in extreme or changing conditions and one of the most widespread used in competitive root colonization of efficient bacteria. After surface root colonization, the intercellular parenchymatic colonization is produced. Azospirillum was able to take the break caused by the emergence of asecondary root (Figures 3A and B) and enter in the intercellular spaces of plant root parenchyma (Figures 3A and C) and between epidermal root cells allowing the colonization. Root morphology changed as a consequence of this colonization, producing a matrix between two layers of parenchyma root cells (Figures 3B and D).

This parenchymatic matrix facilitates bacterial growth and the low oxygen partial pressures for the expression of nitrogenase and can directly contribute to nitrogen to the plant and the exchange of nutrients between the bacteria and the plant is assured. Soil and rhizosphere bacteria can affect the mineral nutrition of plants by changing root-uptake characteristics, due to a modification of root morphology or alteration of uptake mechanisms, relative growth rate or internal composition of plants ^_24). The fact to survive inside the root and not producing any injuries confirm this microorganism as an endophytic bacterium ²⁵. Endophytes can be helpful in protecting the plant from environmental stress as well as in supplying the plant with nitrogen and other growth promoting substances ²⁶.

Anti-A. brasilense 8-INICA reactions with the microorganism, showed, at light microscopy, the bacteria surrounded by gold particles (Figure 4). Immunolocalization and silver enhancement demonstrates that colonization by A. brasilense 8-INICA is achieved, knowing that the bacteria are labelled in the break caused by the emergence of a secondary root (Figure 4A-C), in the intercellular spaces (Figure 4D) and in the parenchyma matrix produced by Azospirillum colonization of plant root parenchyma (Figure 4D-F). With the high magnification at light microscopy (Figure 4G) it can be observed that the intercellular spaces and the parenchymatic matrix are connected, and Azospirillum identified by the antibody can be seen as bodies surrounded by a black circle. These results in inoculation experiments in soybean firmly show colonization by Azospirillum which is consistent with similar reports on rice ²⁷, tobacco ²⁸, tomato ²⁹ and barley ³⁰. In the case of sugarcane, the controversy of whether it is only a rhizospheric or a root associated bacterium or an endophyte requires further studies leading to clarify this aspect which could be influenced by quorum sensing³ and other factors. Immunolocalization in ultrathin slides of Azospirillum cells embedded in agar with the antibody anti-A. brasilense 8-INICA shows an enormous affinity of the antibody to the antigen (Figure 5A). There is intense labeling of the bacteria with 15 nm gold particles. The number of gold particles is elevated and marked the different layers of the cellular envelopes (Figure 5A, arrows).

The number of gold particles decreases considerably when the marking is done in the intercellular spaces, as if the bacteria would lose some of the layers with the colonization of the root parenchyma (Figure 5B), although still labeling in different layers can also be observed (arrows). Inside the parenchymatic matrix only one layer is labeled (Figure 5C and D) and no gold particles are detected inside the bacteria. Unspecific labeling can be observed in vesicles of the parenchymatic matrix, probably formed by bacterium membranes degradation (Figure 5C).

When the bacterium ages, the cytoplasm is retracted and the gold particle remains on the outermost layer of the bacterium envelopes (Figure 6A and B). Although not normal, in some areas appear gold particles on the cell wall (Figure 6C). Very few gold particles appear in the cytoplasm of adjacent cells to the matrix. There is no localization of gold particles in aged organelles (Figure 6D).

Azospirillum is usually associated with roots of grasses such as sugar cane, rice and maize ⁴, translating benefits to the plants for its contribution to nutrition. Microscopy techniques and immunolocalization allowed to confirm in this work that A. brasilense 8-INICA can act as an endophyte in soybean roots. Endophytes can be helpful in protecting the plant from environmental stress as well as in supplying the plant with nitrogen and other growth promoting substances ²⁶. This work emphasizes that Azospirillum is not only interesting for sugarcane inoculation, but also for soybean and therefore would work very well in intercropping of soybean and sugarcane, with the advantage of not having to introduce foreign strains in Cuban soils.