Se tomaron muestras de suelo rizosférico y raíces de plantas de caña de azúcar de la variedad LCP 85-384, pertenecientes a cañaverales ubicados en “Los Gómez” y “Las Talitas”, departamento Leales y Tafí Viejo, respectivamente.

Las bacterias del género Azospirillum se aislaron siguiendo la técnica descrita por Döbereiner et al. ⁷. Para el aislamiento de bacterias rizosféricas, de cada localidad se tomaron tres muestras de suelo rizosférico de 0-15 cm de profundidad. Cada muestra evaluada; a su vez, estaba constituida por cinco submuestras de aproximadamente 500 g cada una. A partir de estas muestras, se realizaron diluciones sucesivas en solución fisiológica estéril (NaCl 0,9 % m v^-1) y alícuotas de 100 μL se sembraron en el medio de cultivo semisólido malato libre de nitrógeno (NFb) (ácido málico 5 g L^-1; K₂HPO₄ 0,5 g L^-1; MgSO₄.7H₂O 0,2 g L^-1; NaCl 0,1 g L^-1; CaCl₂.2H₂O 0,02 g L^-1; KOH 4,5 g L^-1; agar 1,75 g L^-1; pH 6,8 ajustado con KOH). Para el aislamiento de bacterias endofíticas, de cada localidad se tomaron muestras de raíces de cinco plantas independientes, distanciadas por 3 m aproximadamente y escogidas al azar. De cada planta se tomaron cuidadosamente 10 raíces de 5 a 15 cm, que se desinfectaron de manera superficial con etanol 70 %, 1 min, hipoclorito de sodio al 2 % (v v^-1) y cinco lavados con agua destilada estéril. Las raíces desinfectadas se cortaron en fragmentos de 1 cm y se transfirieron al medio de cultivo NFb semisólido. Los frascos se incubaron durante cinco días a 30 °C. Los cultivos que presentaron crecimiento bacteriano en forma de una película blanca sub superficial, típica de Azospirillum, se repicaron en el medio de cultivo NFb sólido adicionado con extracto de levadura (5 g L^-1) y Rojo Congo (15 mL L^-1 de una solución acuosa 1:400 (p v^-1), para la identificación de colonias pequeñas, secas, color rojo escarlata ⁸.

La fijación biológica de nitrógeno se analizó según la capacidad de los aislados de crecer en el medio de cultivo NFb libre de nitrógeno y por amplificación mediante PCR de un fragmento de 710 pb del gen nifD de la nitrogenasa, enzima involucrada en el proceso de fijación de nitrógeno. Como cebadores se utilizaron nifDf y nifDr (Sigma-Aldrich, EE.UU) ⁹. La capacidad de los aislados para producir indoles, se evaluó siguiendo la técnica colorimétrica descrita por Glickmann y Dessaux ¹⁰. Para ello, una colonia aislada en el medio NFb sólido se sembró en el medio de cultivo líquido Luria Bertani (LB) (extracto de levadura 5 g L^-1; tripteína 10 g L^-1; NaCl 10 g L^-1). Los cultivos se incubaron a 30 °C con agitación (45 r.p.m). A las 24, 48, 72 y 96 h se tomaron muestras para evaluar el crecimiento bacteriano por determinación de la densidad óptica a 560 nm (DO_560nm). La concentración de índoles totales producidos y excretados al medio de cultivo se determinó a las 96 h de incubación, midiendo la DO_530nm y extrapolando los valores obtenidos en una curva de calibración en la que se utilizó ácido indol acético puro (AIA) como estándar. Como referencia se utilizó la cepa Az39 de A. brasilense.

Todos los ensayos correspondientes a la determinación de las características promotoras del crecimiento se realizaron por triplicado para cada cepa evaluada. Los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la Prueba de LSD Fisher, con el programa InfoStat (Software Estadístico, 2010) para Windows.

Los aislados de Azospirillum que mostraron diferencias en su huella genética luego de realizar la BOX-PCR, se seleccionaron y enviaron a una empresa productora de biofertilizantes para la formulación de diferentes bioproductos.

Se evaluó el efecto de cuatro bioproductos (Bio) formulados a partir de los aislados Ls1, 2 y 3 y de la cepa de referencia Az39 (BioLs1, BioLs2, BioLs3 y BioAz39, respectivamente) sobre la velocidad de brotación del cultivo de la caña de azúcar. Para ello, estacas uninodales extraídas a partir del tercio medio de tallos de caña semilla de la variedad LCP 85-384, se inocularon por riego con 5 mL de cada biofertilizante.

Considerando que la concentración óptima para la inoculación con biofertilizantes a base de Azospirillum corresponde a 1 x 10⁶ ufc mL ^{_{-1 (13)}} y que los bioproductos tenían una concentración promedio de 1 x 10⁹ ufc mL^-1 se realizaron las diluciones correspondientes (1:1000 v v^-1) de cada bioproducto antes de su aplicación. Por cada tratamiento evaluado, se sembraron 12 estacas uninodales en bandejas de plástico utilizando arena fina estéril como sustrato. Luego de la inoculación, las bandejas se conservaron en invernáculo a 25 °C. Las bandejas se colocaron en un diseño experimental de bloques completamente aleatorizados. Se trabajó con tres repeticiones por tratamiento y como control positivo se utilizó el biofertilizante a base de la cepa Az39 de A. brasilense (BioAz39).

Los resultados se expresaron como índice de velocidad de brotación (IVB) ¹⁴, calculados a partir de la siguiente fórmula:

$IVB= \left(B1/N1 + B2/N2 +\dots + Bn/Nn\right)$

donde B es el número de brotes y N los días después de la plantación.

Los datos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de la varianza (ANOVA) y la Prueba de LSD Fisher, con el programa InfoStat (Software Estadístico, 2010) para Windows.

Se obtuvieron tres aislados endofíticos con características típicas del género Azospirillum a partir de raíces de caña de azúcar del departamento “Leales”, que se denominaron Ls1, Ls2 y Ls3 y dos rizosféricos del departamento Tafí Viejo, los cuales se denominaron Tv1 y Tv2. La asociación de Azospirillum con las raíces de la caña de azúcar sólo puede ser exitosa si la bacteria es capaz de sobrevivir en el suelo y alcanzar poblaciones significativas en el sistema radicular, por lo que estos resultados confirman la capacidad que tiene este género bacteriano de colonizar naturalmente el cultivo de la caña de la azúcar ¹⁵.

Si bien las bacterias del género Azospirillum son generalmente consideradas como bacterias de la rizósfera, algunas cepas desarrollan diferencias específicas en la forma de colonizar las raíces. Predominantemente colonizan la superficie de la raíz y sólo unas pocas cepas son capaces de colonizar el interior de las raíces. Estas cepas endofíticas, al encontrarse en un ambiente protegido de las condiciones ambientales, tienen mecanismos específicos para comunicarse e interactuar con la planta de manera mucho más eficiente que las cepas rizosféricas.

Fijación biológica de nitrógeno (FBN)

Todos los aislados fueron capaces de crecer en medio NFb, formando una película blanca subsuperficial ⁷. Además, la presencia del gen nifD de la nitrogenasa proporciona evidencia de la capacidad potencial de dichos aislados de fijar nitrógeno atmosférico (Figura 1), en concordancia con lo informado por otros autores ⁹.

Figura 1

Amplificación por PCR del gen nifD (710 pb) de los aislados obtenidos

La amplificación corresponde a las cepas rizosféricas de Tafí del Valle Tv1 y Tv2 (líneas 1 y 2), cepa Az39 usada como referencia (línea 3), marcador de peso molecular 1Kb (Promega, EE.UU) (líneas 4 y 8), cepas endofíticas de Leales Ls1, Ls2 y Ls3 (líneas 5, 6 y 7)

Actualmente, la contribución de Azospirillum a los requerimientos de nitrógeno de la caña de azúcar por medio de la FBN, es un tema controversial. Algunos reportes de investigación afirman que el cultivo es capaz de obtener hasta un 70 % de sus requerimientos de nitrógeno a partir de la FBN y que éste constituye el principal mecanismo de promoción del crecimiento de las bacterias de este género ¹⁶, otros suponen que Azospirillum utiliza el nitrógeno de la FBN para su propio uso y la contribución de nitrógeno al cultivo está relacionada con la asimilación de nitratos ¹⁷.

Producción de indoles totales

En la Figura 2 se muestra la producción de indoles totales expresada en µg mL^-1 en función del crecimiento bacteriano, evaluado por medición de la densidad óptica a 560 nm.

Figura 2

Crecimiento (DO₅₆₀) (círculos) y producción de indoles totales (µg mL^-1l) (barras) de los distintos aislados a las 96 hs de incubación a 30 ºC

Letras iguales indican sin diferencias estadísticamente significativas (LSD, p ≤ 0,05)

Como se puede observar en la Figura 2, todos los aislados sintetizaron y excretaron al medio indoles totales, en cantidades similares a la cepa Az39 de A. brasilense. La producción de fitohormonas, es una de las características PGPB más importante del género Azospirillum¹⁸. Estas bacterias producen y liberan al medio de cultivo diferentes fitohormonas, durante la fase estacionaria de crecimiento, entre las cuales se han encontrado auxinas, giberelinas, ácido abscísico, etileno y ácido salicílico. Si bien estas fitohormonas afectan significativamente el crecimiento de la raíz, resultando en una mejor absorción de humedad y nutrientes, también se ha demostrado que participan en el incremento del crecimiento de los cultivos cuando Azospirillum se aplica de manera foliar ². Por esta razón, la producción de fitohormonas es importante, no sólo para la producción de inoculantes a nivel industrial, sino también para la acción de estas bacterias en la filósfera, en la rizósfera e incluso dentro de las plantas. Se ha observado que la inoculación con Azospirillum y con las fitohormonas producidas por estas rizobacterias, inducen una mayor respuesta de promoción de crecimiento en semillas y plántulas ². Los resultados obtenidos con los nuevos aislados, productores de indoles, son importantes para la selección y posterior formulación de posibles biofertilizantes ¹⁹.

Samples were taken of rhizospheric soil and roots of sugarcane plants of the LCP variety 85-384, belonging to reed beds located in “Los Gómez” and “Las Talitas”, department Leales and Tafí Viejo, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum were isolated following the technique described by Döbereiner et al., for the isolation of rhizospheric bacteria ⁷, three samples of rhizospheric soil 0-15 cm deep were taken from each location. Each sample evaluated, in turn, consisted of five subsamples of approximately 500 g each. From these samples, successive dilutions were made in sterile physiological solution (NaCl 0.9 % m v^-1) and aliquots of 100 μL were seeded in the semisolid culture medium free nitrogen malate (NFb) (malic acid 5 g L^-1; K2HPO4 0.5 g L^-1; MgSO₄.7H₂O 0.2 g L^-1; NaCl 0.1 g L^-1; CaCl₂.2H₂O 0.02 g L^-1; KOH 4.5 g L ^-1, 1.75 g L^-1 agar, pH 6.8 adjusted with KOH). For the isolation of endophytic bacteria, from each locality root samples were taken from five independent plants, spaced approximately 3 m apart and chosen at random. Ten roots of 5 to 15 cm were carefully taken from each plant, which were superficially disinfected with 70 % ethanol, 1 min, 2 % sodium hypochlorite (v v^-1) and five washes with sterile distilled water. The disinfected roots were cut into 1 cm fragments and transferred to the semi-solid NFb culture medium. The flasks were incubated for five days at 30 °C. The cultures that showed bacterial growth in the form of a sub-surface white film, typical of Azospirillum, were replic in solid NFb culture medium added with yeast extract (5 g L^-1) and Congo Red (15 mL L^-1 an aqueous solution 1: 400 (p v^-1), for the identification of small, dry colonies, scarlet red color ⁸.

Biological nitrogen fixation was analyzed according to the ability of the isolates to grow in the nitrogen-free NFb culture medium and by PCR amplification of a 710 bp fragment of the nifD gene of nitrogenase, an enzyme involved in the nitrogen fixation process. As primers, nifDf and nifDr (Sigma-Aldrich, USA) were used ⁹. The ability of the isolates to produce indoles was evaluated following the colorimetric technique described by Glickmann and Dessaux ¹⁰. For this, a colony isolated in the solid NFb medium was seeded in the liquid culture medium Luria Bertani (LB) (yeast extract 5 g L^-1, triptein 10 g L^-1, NaCl 10 g L^-1). The cultures were incubated at 30 °C with shaking (45 r.p.m.). At 24, 48, 72 and 96 h, samples were taken to evaluate the bacterial growth by determining the optical density at 560 nm (DO_560nm). The concentration of total indoles produced and excreted to the culture medium was determined at 96 h of incubation, measuring the DO_530nm and extrapolating the values obtained in a calibration curve in which pure indole acetic acid (IAA) was used as standard. The Az39 strain of A. brasilense was used as reference.

All the tests corresponding to the determination of the growth promoting characteristics were carried out in triplicate for each evaluated strain. The data were analyzed statistically by analysis of variance (ANOVA) and the Fisher LSD test, with the InfoStat program (Statistical Software, 2010) for Windows.

The isolates of Azospirillum that showed differences in their genetic fingerprint after carrying out the BOX-PCR, were selected and sent to a biofertilizer producing company for the formulation of different bioproducts.

The effect of four bioproducts (Bio) formulated from the isolates Ls1, 2 and 3 and from the reference strain Az39 (BioLs1, BioLs2, BioLs3 and BioAz39, respectively) was evaluated on the sprouting speed of the sugar cane culture. For this, uninodal stakes extracted from the middle third of stalks of seed cane of the LCP 85-384 variety were inoculated by irrigation with 5 mL of each biofertilizer. Considering that the optimum concentration for inoculation with biofertilizers based on Azospirillum corresponds to 1 x 106 cfu mL^{-1 (13}, and that the bioproducts had an average concentration of 1 x 109 cfu mL^-1 the corresponding dilutions were made (1 : 1000 v v^-1) of each bioproduct before its application. For each evaluated treatment, 12 uninodal stakes were planted in plastic trays using sterile fine sand as substrate. After the inoculation, the trays were kept in a hothouse at 25 °C. The trays were placed in an experimental design of completely randomized blocks. We worked with three repetitions per treatment, and as a positive control we used the biofertilizer based on the Az39 strain of A. brasilense (BioAz39). The results were expressed as sprouting velocity index (IVB) (14), calculated from the following formula:

$IVB= \left(B1/N1 + B2/N2 +\dots + Bn/Nn\right)$

Where: B is the number of shoots, and N the days after planting.

The data were analyzed statistically by the analysis of variance (ANOVA) and the Fisher LSD test, with the program InfoStat (Statistical Software, 2010) for Windows.

Three endophytic isolates with typical characteristics of the genus Azospirillum were obtained from sugarcane roots of the Leales department, which were denominated Ls1, Ls2 and Ls3, and two rhizospheres from the Tafí Viejo department, which were denominated Tv1 and Tv2. The association of Azospirillum with the roots of sugarcane can only be successful if the bacterium is able to survive in the soil and reach significant populations in the root system, so these results confirm the ability of this bacterial genus to colonize naturally the cultivation of sugar cane ¹⁵.

Although bacteria of the genus Azospirillum are generally considered rhizosphere bacteria, some strains develop specific differences in the way they colonize the roots. Predominantly they colonize the root surface and only a few strains are able to colonize the inside of the roots. These endophytic strains, being in an environment protected from environmental conditions, have specific mechanisms to communicate and interact with the plant much more efficiently than the rhizospheric strains.

Biological fixation of nitrogen (FBN)

All the isolates were able to grow in NFb medium, forming a white subsurface film ⁷. In addition, the presence of the nifD gene of nitrogenase provides evidence of the potential capacity of these isolates to fix atmospheric nitrogen (Figure 1), in agreement with that reported by other authors ⁹.

Figure 1

PCR amplification of the nifD gene (710 bp) of the isolates obtained

The amplification corresponds to the rhizospheric strains of Tafí del Valle Tv1 and Tv2 (lines 1 and 2), strain Az39 used as reference (line 3), molecular weight marker 1Kb (Promega, USA) (lines 4 and 8), endophytic strains of Loyalists Ls1, Ls2 and Ls3 (lines 5, 6 and 7)

Currently, the contribution of Azospirillum to nitrogen requirements of sugarcane through the FBN is a controversial issue. Some research reports claim that the crop is able to obtain up to 70 % of its nitrogen requirements from the FBN and that this is the main mechanism for promoting the growth of bacteria of this genus ¹⁶, others assume that Azospirillum it uses nitrogen from the FBN for its own use and the contribution of nitrogen to the crop is related to the assimilation of nitrates ¹⁷.

Producción de indoles totales

Figure 2 shows the production of total indoles expressed in μg mL^-1 as a function of bacterial growth, evaluated by measuring the optical density at 560 nm.

Figure 2

Growth (DO₅₆₀) (circles) and production of total indoles (μg mL^-1) (bars) of the different isolates at 96 hs incubation at 30 ºC

Equal letters indicate no statistically significant differences (LSD, p ≤ 0.05)

As can be seen in Figure 2, all the isolates synthesized and excreted total indoles, in amounts similar to the Az39 strain of A. brasilense. The production of phytohormones is one of the most important PGPB characteristics of the genus Azospirillum¹⁸. These bacteria produce and release to the culture medium different phytohormones, during the stationary phase of growth, among which auxins, gibberellins, abscisic acid, ethylene and salicylic acid have been found. Although these phytohormones significantly affect the growth of the root, resulting in a better absorption of moisture and nutrients, they have also been shown to participate in increasing the growth of the cultures when Azospirillum is applied in a foliar manner ². For this reason, the production of phytohormones is important not only for the production of inoculants at an industrial level, but also for the action of these bacteria in the phyllosphere, in the rhizosphere and even within plants. It has been observed that inoculation with Azospirillum and the phytohormones produced by these rhizobacteria induce a greater growth promotion response in seeds and seedlings ². The results obtained with the new isolates, producers of indoles, are important for the selection and subsequent formulation of possible biofertilizers ¹⁹.

The isolates Ls1, Ls2 and Ls3 were selected for being endophytes and for presenting differences in their genetic fingerprint with respect to strain Az39, for the formulation of bioproducts that were named BioLs1, BioLs2 and BioLs3. In addition, BioAz39 was used as a positive control for growth induction. The sprouting velocity index (IVB according its acronyms in Spanish) of the sugar cane stakes inoculated with the different biofertilizers is shown in Figure 5.

Among the evaluated bioproducts, BioLs1 was the one that showed the greatest capacity to increase the budding of uninodal stakes of sugarcane, after its application (Figure 5). BioLs1 presented statistically significant differences in comparison with BioLs3, BioAz39 and with the control without inoculation. On the other hand, BioLs1 and BioLs2 bioproducts significantly increased the IVB compared to the uninoculated control. The IVB was 2.30 for the control, while for BioLs1 and BioLs2 it was 5.02 and 4.01 respectively. It is important to point out that the BioLs1 bioproduct, formulated from the resident isolate A. brasilense Ls1, showed greater capacity to increase the IVB of sugarcane than BioAz39, which contains A. brasilense Az39, the most used strain in our region for the formulation of inoculants for sugar cane. The importance of the FBN during the initial growth of sugarcane, is due to the fact that the N absorption rate of the crop is highest in the first months after sprouting. In this period the crop absorbs more N than it uses for its growth and development, storing the excess as organic substances in its tissues (pods and leaf blades). Then, that N is remobilized to zones of active growth to satisfy, along with the N contributed from the ground, the high requirements of the phase of great growth. This behavior represents a strategy of biological administration of N, which guarantees that it does not compromise growth ²¹. For this reason, the use of bioproducts based on PGP bacteria capable of carrying out the FBN and of producing and excreting phytohormones allowing the rapid establishment of the plant in its initial stages of growth and development, is of fundamental importance considering that poor and prolonged emergencies affect the effective fulfillment of the following phenological phases of the crop, significantly reducing the production and yield of the sugarcane ²¹