El material vegetal de piña (Ananas comosus var. comosus) ‘MD-2’ lo suministró el Laboratorio de Escalado y Transferencia Tecnológica del Centro de Bioplantas. Se utilizaron plantas que provenían de la fase de enraizamiento in vitro (30 días) y se encontraban en un medio de cultivo que contenía: sales MS ¹⁷, 100 mg L^-1 de mioinositol, sacarosa al 30 g L^-1, 0,1 mg L^-1 de tiamina-HCl y 2,69 µmol L^-1 de ácido naftalen acético (ANA).

Para obtener el extracto acuoso se utilizaron las hojas de Moringa oleifera Lam. cv. Supergenius provenientes de plantas adultas de tres años, crecidas en la Estación Experimental “Juan Tomás Roig”, Centro de Bioplantas, que poseían los componentes fitoquímicos que se muestran en la Tabla 1.

Para la obtención del extracto acuoso se molieron 400 g de masa fresca de hojas de moringa con nitrógeno líquido en batidora comercial. La proporción de material vegetal y agua fue de 1:2.5 (m:v). La extracción se realizó durante una hora con agitación y posteriormente se filtró con gasa para eliminar el material vegetal. A continuación, se centrifugó la muestra durante 20 minutos a 15 000 x g y se colectó el sobrenadante. Al extracto acuoso se le determinó la concentración de proteínas ¹⁸, la concentración de carbohidratos ¹⁹ y la concentración de compuestos fenólicos solubles ²⁰ (Tabla 2).

Se seleccionaron plantas homogéneas enraizadas in vitro para su aclimatización, las cuales poseían entre 0,8-1,62 g de masa fresca, 8-10 cm de longitud, 4-6 hojas y 3-4 raíces, como establece el instructivo técnico para la propagación de la piña del Centro de Bioplantas ²¹. Se prepararon dos disoluciones del extracto acuoso de moringa: extracto diluido cuatro veces (1:4) y extracto diluido ocho veces (1:8). Las raíces de las plantas se sumergieron durante: 0, 24, 48 y 72 horas en las disoluciones. Se utilizaron 7,5 mL de las diluciones del extracto acuoso/planta.

Las mismas se colocaron el tiempo que duró la inmersión en cámaras de cultivo (KOXKA; mod. EC -1200F) con condiciones ambientales controladas. La temperatura (25±1 °C), flujo de fotones fotosintéticos (FFF=80 µmol m^-2s^-1) y humedad relativa (HR=70 %) se fijaron durante todo el experimento para favorecer el desarrollo del cultivo, el fotoperiodo fue de 16 horas luz y ocho horas de oscuridad.

Las plantas fueron sembradas en envases plásticos con un volumen de 222,59 cm³ con mezcla del sustrato tamizado de suelo Ferralítico Rojo y cachaza (derivado de la caña de azúcar) a una proporción de 1:1 (v/v). Las mismas fueron aclimatizadas en una casa de cultivo bajo condiciones de 80±3 % de humedad relativa, 30±2 °C de temperatura, luz natural con flujo de fotones fotosintéticos de 400±25 µmol m^-2s^-1 y condiciones atmosféricas de concentración de CO₂ y fotoperiodo natural. Estas se asperjaron cada 10 días con una mezcla de fertilizante foliar que contenía 16,0 g de N-P-K cristalino y 1,0 g de Multimicro Combi (Haifa Chemicals Ltd., Haifa Bay 26120).

A los 42 días se determinó la supervivencia (%) de las plantas como el cociente del número de plantas vivas al finalizar esta etapa entre el número inicial de plantas (30 plantas). Además, se evaluaron los indicadores morfológicos: masa fresca (g), masa seca (g), longitud de la planta (cm), número de hojas, longitud de la raíz más larga (cm) y número de raíces por planta.

Se diseñaron cuatro tratamientos: raíces sumergidas en agua destilada durante 72 horas (control), raíces sumergidas en extracto de moringa diluido ocho veces (1:8) durante 72 horas, raíces sumergidas en Previcur^® Energy LS 84 (Bayer CropScience, 1.0 ml·L^-1) durante tres minutos y una combinación de inmersión de las raíces en extracto de moringa diluido ocho veces (1:8) durante 72 horas y luego en Previcur Energy^® durante tres minutos ²².

Las plantas fueron sembradas y cultivadas en las mismas condiciones que en el experimento anterior. A los 42 días se evaluaron los mismos indicadores descritos en el experimento anterior.

En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario SPSS Version 21 para Windows, SPSS Inc. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) simple y bifactorial (tiempo de inmersión y la dilución del extracto acuoso). Las medias de los tratamientos se compararon utilizando la prueba de rangos múltiple de Tukey (p<0,05) previa comprobación de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. En los indicadores supervivencia, número de hojas y número de raíces fue necesaria la transformación de los datos para lograr los supuestos de las pruebas paramétricas realizadas. En ambos experimentos se utilizaron 30 plantas por tratamiento con un diseño experimental completamente aleatorizado. Los experimentos se repitieron tres veces. El porcentaje de supervivencia representa el promedio de las tres repeticiones (n=3). Para el resto de los indicadores evaluados cada planta fue considerada como una unidad experimental y representa el promedio de todas las mediciones individuales (n=90).

La Figura 1 muestra la supervivencia de plantas de piña luego de 42 días en aclimatización, posterior a la inmersión de las plantas en extracto de Moringa oleifera Lam diluido cuatro (1:4) y ocho veces (1:8) durante 24, 48 y 72 horas. Los mejores resultados se obtuvieron con la inmersión de las raíces de las plantas de piña por 24 y 48 horas en el extracto acuoso diluido 1:4, sin diferencias significativas con la dilución 1:8 por 72 horas. En estos tratamientos se logró el 100 % de supervivencia de las plantas. Por otra parte, las plantas cuyas raíces fueron sumergidas en extracto acuoso de moringa (1:4) por 72 horas, disminuyeron significativamente su porcentaje de supervivencia. Sin embargo, la dilución (1:8) necesitó 72 horas de inmersión para proporcionar un 100 % de supervivencia.

En las plantas que murieron durante el experimento se observó flacidez en las hojas con síntomas de pudrición y coloración parda-negruzca hacia la base de las hojas. Esto pudiera estar asociado a la presencia de Phytophthora parasitica Dastur que es el principal patógeno que afecta al cultivo de la piña ‘MD-2’ durante la aclimatización ¹⁶. No obstante, es necesaria la realización de análisis de laboratorio que permitan identificar si los daños se deben a la presencia de este patógeno.

La Tabla 3 muestra los valores de los indicadores morfológicos de las plantas de piña como respuesta a diferentes tiempos de inmersión en diluciones del extracto acuoso de hojas de moringa. El número de hojas y la masa fresca fueron significativamente superior cuando las plantas se sumergieron por 72 horas en extracto diluido 1:8, sin diferencias estadísticas con el resto de los tratamientos donde se utilizó el extracto acuoso de hojas de moringa, independientemente de la dilución y el tiempo de inmersión. La longitud de la planta alcanzó los mayores valores cuando se utilizó el extracto diluido 1:4 por 48 horas y el extracto diluido 1:8 por 72 horas, sin diferencias estadísticas con los tratamientos donde se utilizó el extracto acuoso de hojas de moringa independientemente del tiempo de inmersión. La longitud de la raíz más larga fue mayor cuando la inmersión en el extracto acuoso de hojas de moringa se realizó por 48 y 72 horas, independientemente de la dilución. La masa seca no mostró diferencias significativas entre las diluciones utilizadas, excepto cuando la inmersión se realizó en la dilución 1:4 por 72 horas. El número de raíces no mostró diferencia entre los tratamientos.

El hecho de que la inmersión en la mayor dilución del extracto acuoso de moringa (1:8) a las 72 horas mostrara los mejores resultados, en cuanto a la supervivencia y los indicadores morfológicos, pudiera estar relacionada con que la viscosidad de esta disolución es menor, lo que favorece la entrada del agua y la penetración de iones minerales y otros nutrientes que benefician el crecimiento. Por esta razón, se seleccionó este tratamiento para continuar la experimentación debido a que la supervivencia y los indicadores morfológicos evaluados en las plantas mostraron una calidad superior.

Luego de 42 días de cultivo, la supervivencia de las plantas tratadas con Previcur^®Energy LS 84, extracto acuoso diluido ocho veces (1:8) y la combinación de ambos fue de 100 %; mientras que la del tratamiento control de 81 % (datos no mostrados).

En la Tabla 4 se muestran los valores de los indicadores morfológicos de las plantas de piña como respuesta a la inmersión, previo a la aclimatización en el extracto acuoso de hojas de Moringa oleifera Lam. y en el Previcur^® Energy LS 84. La longitud de la planta y la longitud de la raíz más larga fueron superiores en las plantas tratadas con Previcur^®Energy LS 84, sin diferencias significativas con el extracto acuoso diluido 1:8. La masa fresca mostró los mejores resultados en los tratamientos con Previcur^®Energy LS 84 y el extracto acuoso diluido 1:8, sin diferencias significativas con el control. Los indicadores número de hojas, número de raíces y la masa seca no mostraron diferencias para los tratamientos evaluados.

Los indicadores morfológicos de las plantas que se trataron con la inmersión durante 72 horas en extracto acuoso diluido 1:8 seguido de tres minutos en Previcur^®Energy LS 84 se vieron afectados. Es posible que los compuestos fenólicos y los aminoácidos aromáticos de las proteínas presentes en el extracto crudo de hojas de moringa interactuaran con el ingrediente activo del Previcur^®Energy LS 84 (propamocarb fosetilato) generando compuestos químicos del tipo de los fenilcarbamatos. Estos compuestos son reconocidos por tener actividad herbicida y pueden actuar como inhibidores de la mitosis o del transporte de electrones en los cloroplastos afectando del crecimiento de las plantas ²³.

Los resultados de esta investigación demostraron el efecto beneficioso del extracto acuoso de hojas de moringa sobre los indicadores morfológicos en la aclimatización de la piña ‘MD-2’. El contacto directo del extracto acuoso de hojas de moringa por 72 horas con las estructuras absorbentes de las raíces de las plantas de piña ‘MD-2’ pudo haber favorecido la entrada de minerales y compuestos orgánicos presentes en el extracto. Algunos autores reconocen el efecto estimulador del crecimiento de los extractos crudos acuosos de hojas de Moringa oleifera Lam., asociado a la presencia de aminoácidos, iones minerales como K⁺ y Ca²⁺, ácido ascórbico y compuestos fenólicos ²⁴.

Además, cuando se aplicó el extracto acuoso diluido 1:8, el Previcur^®Energy LS 84 y la combinación de ambos tratamientos no se notaron síntomas visibles de enfermedades fungosas que aparecen en esta etapa crucial de la aclimatización, donde se reconoce que la mayor mortalidad de las plantas está asociada a Phytophthora parasitica Dastur ¹⁶. Este comportamiento observado con el extracto acuoso pudiera estar asociado a la presencia de compuestos fenólicos (Tabla 1), los que poseen reconocida actividad antimicrobiana ²⁵.

The plant material of pineapple (Ananas comosus var. Comosus) 'MD-2' was supplied by the Technological Scaling and Transfer Laboratory of the Bioplant Center. Plants that came from the in vitro rooting stage (30 days) and were in a culture medium containing: MS salts ¹⁷, 100 mg L^-1 of myo-inositol, sucrose at 30 g L^-1, were used. , 1 mg L^-1 of thiamin-HCl and 2.69 μmol L^-1 of naphthalene acetic acid (ANA).

To obtain the aqueous extract, the leaves of Moringa oleifera Lam were used. cv. Supergenius from adult plants of three years grown in the “Juan Tomás Roig” Experimental Station, Center of Bioplants that possessed the phytochemical components shown in Table 1.

To obtain the aqueous extract, 400 g of fresh mass of moringa leaves were milled with liquid nitrogen in a commercial blender. The proportion of plant material and water was 1:2.5 (m:v). The extraction was carried out for one hour with agitation and then filtered with gauze to eliminate the plant material. Next, the sample was centrifuged for 20 minutes at 15,000 x g and the supernatant was collected. The concentration of proteins ¹⁸, the concentration of carbohydrates ¹⁹ and the concentration of soluble phenolic compounds ²⁰ were determined to the aqueous extract and are shown in Table 2.

Homogeneous plants rooted in vitro were selected for acclimatization, which had between 0.8-1.62 g of fresh mass, 8-10 cm in length, 4-6 leaves and 3-4 roots, as established in the technical instructions for the propagation of the pineapple of the Bioplants Center ²¹. Two solutions of the aqueous extract of moringa were prepared: extract diluted four times (1: 4) and extract diluted eight times (1: 8). The roots of the plants were submerged during: 0, 24, 48 and 72 hours in the solutions. 7.5 mL of the dilutions of the aqueous extract/plant were used.

They were placed for the duration of the immersion in culture chambers (KOXKA, mod EC-1200F) with controlled environmental conditions. Temperature (25±1 °C), photosynthetic photon flux (PPF = 80 mol m^-2s^-1) and relative humidity (RH = 70 %) were fixed throughout the experiment to promote crop growth, photoperiod it was of 16 light hours and eight hours of darkness.

The plants were planted in plastic containers with a volume of 222.59 cm³ with a mixture of the sifted substrate of Ferralitic Red soil and filter cake (derived from sugarcane) at a ratio of 1: 1 (v/v). They were acclimatized in a house of culture under conditions of 80 ± 3 % relative humidity, 30 ± 2 °C temperature, natural light with photosynthetic photon flux of 400 ± 25 umol m^-2s^-1 and atmospheric conditions of concentration of CO₂ and natural photoperiod. These were sprayed every 10 days with a foliar fertilizer mixture containing 16.0 g of crystalline N-P-K and 1.0 g of Multimicro Combi (Haifa Chemicals Ltd., Haifa Bay 26120).

At 42 days the survival (%) of the plants was determined as the quotient of the number of live plants at the end of this stage between the initial numbers of plants (30 plants). In addition, the morphological indicators were evaluated: fresh mass (g), dry mass (g), length of the plant (cm), number of leaves, length of the longest root (cm) and number of roots per plant.

Four treatments were designed: roots submerged in distilled water for 72 hours (control), roots submerged in moringa extract diluted eight times (1: 8) for 72 hours, roots submerged in Previcur^® Energy LS 84 (Bayer CropScience, 1.0 ml) L^-1) for three minutes and a combination of immersion of the roots in moringa extract diluted eight times (1:8) for 72 hours and then in Previcur Energy^® for three minutes ²².

The plants were sown and cultivated under the same conditions as in the previous experiment. At 42 days, the same indicators described in the previous experiment were evaluated.

In the statistical processing of the data, the utility SPSS Version 21 for Windows, SPSS Inc. was used. The analysis of variance (ANOVA) simple and bifactorial (immersion time and dilution of the aqueous extract) was used. The means of the treatments were compared using Tukey's multiple range test (p <0.05) after checking the assumptions of normality and homogeneity of variances. In the indicators survival, number of leaves and number of roots it was necessary to transform the data to achieve the assumptions of the parametric tests carried out. In both experiments, 30 plants were used per treatment with a completely randomized experimental design. The experiments were repeated three times. The percentage of survival represents the average of the three repetitions (n=3). For the rest of the indicators evaluated, each plant was considered as an experimental unit and represents the average of all the individual measurements (n=90).

The Figure 1 shows the survival of pineapple plants after 42 days in acclimatization, after immersion of the plants in extract of Moringa oleifera Lam diluted four (1:4) and eight times (1:8) during 24, 48 and 72 hours. The best results were obtained with the immersion of the roots of the pineapple plants for 24 and 48 hours in the aqueous extract diluted 1: 4, without significant differences with the dilution 1: 8 for 72 hours. In these treatments 100 % survival of the plants was achieved. On the other hand, the plants whose roots were submerged in aqueous extract of moringa (1: 4) for 72 hours, significantly decreased their percentage of survival. However, the dilution (1:8) required 72 hours of immersion to provide 100 % survival.

Plants that died during the experiment showed flaccidity in the leaves with symptoms of rot and brownish-black coloration towards the base of the leaves. This could be associated with the presence of Phytophthora parasitica Dastur, which is the main pathogen that affects the cultivation of the 'MD-2' pineapple during acclimatization ¹⁶. However, it is necessary to perform laboratory analyzes to identify if the damage is due to the presence of this pathogen.

Table 3 shows the values of the morphological indicators of the pineapple plants in response to different immersion times in dilutions of the aqueous extract of moringa leaves. The number of leaves and the fresh mass were significantly higher when the plants were submerged for 72 hours in a diluted 1: 8 extract, without statistical differences with the rest of the treatments where the aqueous extract of moringa leaves was used, regardless of the dilution and the time of immersion. The length of the plant reached the highest values when the diluted extract was used 1: 4 for 48 hours and the extract diluted 1:8 for 72 hours, without statistical differences with the treatments where the aqueous extract of moringa leaves was used regardless of Immersion time. The length of the longest root was greater when the immersion in the aqueous extract of moringa leaves was carried out for 48 and 72 hours, independently of the dilution. The dry mass did not show significant differences between the dilutions used, except when the immersion was performed in the 1: 4 dilution for 72 hours. The number of roots showed no difference between the treatments.

The fact that the immersion in the highest dilution of the aqueous moringa extract (1:8) at 72 hours showed the best results in terms of survival and the morphological indicators could be related to the lower viscosity of this solution, which favors the entry of water and the penetration of mineral ions and other nutrients that benefit growth. For this reason, this treatment was selected to continue the experimentation because the survival and the morphological indicators evaluated in the plants showed a superior quality.

After 42 days of culture, the survival of the plants treated with Previcur^® Energy LS 84, aqueous extract diluted eight times (1:8) and the combination of both was 100 %; while that of the control treatment of 81 % (data not shown).

Table 4 shows the values of the morphological indicators of pineapple plants as a response to immersion prior to acclimatization in the aqueous extract of Moringa oleifera Lam. leaves and in the Previcur^® Energy LS 84. The length of the plant and the length of the longest root were higher in the plants treated with Previcur^® Energy LS 84, without significant differences with the aqueous extract diluted 1: 8. The fresh mass showed the best results in the treatments with Previcur^® Energy LS 84 and the aqueous extract diluted 1:8, without significant differences with the control. The indicators number of leaves, number of roots and dry mass did not show differences for the treatments evaluated.

The morphological indicators of the plants that were treated with immersion for 72 hours in aqueous extract diluted 1: 8 followed by three minutes in Previcur^® Energy LS 84 were affected. It is possible that the phenolic compounds and the aromatic amino acids of the proteins present in the raw extract of moringa leaves interacted with the active ingredient of Previcur^® Energy LS 84 (propamocarb fosetilate) generating chemical compounds of the phenylcarbamate type. These compounds are known to have herbicidal activity and can act as inhibitors of mitosis or electron transport in chloroplasts affecting the growth of plants ²³.

The results of this investigation showed the beneficial effect of the aqueous extract of moringa leaves on the morphological indicators in the acclimatization of the 'MD-2' pineapple. The direct contact of the aqueous extract of moringa leaves for 72 hours with the absorbent structures of the roots of the pineapple plants 'MD-2' could have favored the entry of minerals and organic compounds present in the extract. Some authors recognize the stimulatory effect of the growth of aqueous extracts of leaves of Moringa oleifera Lam., associated with the presence of amino acids, mineral ions such as K⁺ and Ca^{2 +}, ascorbic acid and phenolic compounds ²⁴.

In addition, when the aqueous extract diluted 1: 8 was applied, the Previcur^® Energy LS 84 and the combination of both treatments showed no visible symptoms of fungal diseases that appear at this crucial stage of acclimatization, where it is recognized that the highest mortality of plants is associated with Phytophthora parasitica Dastur ¹⁶. This behavior observed with the aqueous extract could be associated with the presence of phenolic compounds (Table 1), which have recognized antimicrobial activity ²⁵.