La enfermedad conocida como “pata prieta” provocada por el oomycetes Phytophthora nicotianae Breda de Haan, produce cuantiosas pérdidas anuales a la producción de tabaco en Cuba y el resto del mundo ^1,2. El control de esta enfermedad se realiza a través de un manejo integrado que comprende: la rotación de cultivos, el uso de productos químicos y las variedades resistentes, siendo esta última la estrategia más económica y duradera ^3,4.

La obtención de cultivares resistentes a la enfermedad en Cuba, a través de los programas de mejoramiento genético actuales, resulta en un largo período de unos 10 o 12 años. Las diferentes razas de este patógeno son capaces de evolucionar de manera acelerada en cortos periodos de tiempo, desarrollándose aislados mucho más agresivos ⁵; por esta razón, el patógeno logra vencer la resistencia de las nuevas variedades que se liberan a la producción en solo unos pocos años. A esto se suma la posible consanguinidad presente en los cultivares debido al uso recurrente y continuo de los mismos progenitores, que provoca una baja variabilidad genética a la cual le resulta fácil adaptarse el patógeno.

Hasta el momento se encuentran bien identificadas cuatro fuentes de resistencia monogénica y multigénica a P. nicotianae. La resistencia parcial, controlada por múltiples genes y raza no específica, que proviene del cultivar 'Florida 301', es una de las más difundidas pero se asocia a bajos rendimientos y a una reducción de la calidad de la hoja curada en tabaco Virginia ⁶.

El cultivar de tabaco negro 'Beinhart-1000' posee una fuerte resistencia a las Razas 0 y 1 del patógeno, pero se emplea poco en programas de mejora por la presencia de compuestos no deseados en la hoja curada ^1,7. La región genómica conocida como Wz proveniente de la especie silvestre Nicotiana rustica ha sido introgresada en algunos cultivares de tabaco Virginia en Estados Unidos de América y Zimbabwe a través de una línea estable designada como 'Wz'. Líneas de tabaco, en las cuales ha sido introgresada la región Wz, contienen un gen o genes que confieren un alto nivel de resistencia a la Raza 0 y afectan la resistencia a la Raza 1 de P. nicotianae⁷.

Por último, tenemos la transferencia de los genes Php y Phl a cultivares comerciales de tabaco a partir de las especies silvestres Nicotiana plumbaginifolia Viv. y Nicotiana longiflora Cav., respectivamente. Ambos genes poseen efectos similares, con un carácter monogénico dominante que aporta resistencia completa solo a la Raza 0 de P. nicotianae^8-12.

En Cuba sólo se informa la presencia de la Raza 0 de P. nicotianae y los cultivares cubanos muestran niveles de resistencia variables, desde susceptibles hasta altamente resistentes, en el momento de su liberación a la producción. ⁵

Existe ambigüedad entre los productores y fitomejoradores sobre el origen de la resistencia a P. nicotianae en los cultivares de tabaco cubano, por lo que se hace difícil determinar si el gen Php se introdujo en los cultivares comerciales como parte del programa de mejoramiento genético en la década de los 60 y 70 del siglo anterior. Esto impide saber si este gen de resistencia se ha desplegado en el genofondo del tabaco en Cuba a lo largo de más de 40 años de mejoramiento genético.

Una búsqueda intensa y rigurosa en el pedigree de los cultivares comerciales de tabaco cubanos, muestra que probablemente solo se introdujo en Cuba la resistencia a la “pata prieta” que proviene de 'Florida 301', a través de cultivares que se emplearon como progenitores en los programas de mejora. Cultivares como 'K326' y el propio 'Florida 301', se utilizaron en la mejora de cultivares de tabaco cubano tipo Virginia unos años atrás ¹³. No tenemos evidencia de la presencia del gen Php como fuente de resistencia en el tabaco cubano, un conocimiento fundamental que se necesita para los programas de mejora y para el establecimiento de una adecuada política varietal de tabaco en nuestro país.

Tomando en cuenta lo anterior el objetivo de esta investigación fue identificar la presencia del gen Php en cultivares actuales comerciales de tabaco, cultivares que en su momento fueron comerciales y cultivares que se han empleado y emplean en los programas de mejora del tabaco en Cuba como parentales desde hace más de 40 años.

Todos los cultivares de esta investigación se utilizaron o utilizan en los programas de mejora genética del tabaco en Cuba. Se plantaron semillas de 29 cultivares de tabaco (Nicotiana tabacum L.) y semillas de la especie silvestre Nicotiana plumbaginifolia Viv. (fuente natural del gen Php) en bandejas de poliestireno expandido, con 264 alveolos, que contenían sustrato orgánico con la siguiente composición: 70 % de turba negra, 15 % de cáscara de arroz y 15 % de zeolita ¹⁴, basado en la tecnología de bandejas flotantes, según García y Andino ¹⁵. Las bandejas se colocaron en condiciones de cultivo protegido o túneles.

En todos los cultivares testados está ausente el gen Php, excepto en N. plumbaginifolia que es la fuente natural (Tabla 1 y Figura 1). Los resultados aportan nueva información que sugiere que estos cultivares, que se utilizaron como progenitores en los programas de mejora del tabaco en Cuba a lo largo de más de 40 años, no contienen el gen Php. Este tipo de resistencia puede introducirse y explotarse en los actuales y futuros programas de mejora en nuestro país. La evidencia científica sobre la ausencia de Php en el tabaco comercial cubano entra en contradicción con lo citado por Espino y citado por Valdés, que afirma que los cultivares cubanos de tabaco tipo Virginia poseen la fuente de resistencia a la enfermedad “pata prieta” que proviene de N. plumbaginifolia^17,18. En ninguno de los 10 cultivares de tabaco Virginia que se analizaron se encuentra el gen Php.

Sobre la base de esta nueva evidencia es posible desarrollar programas de mejora que utilicen como parentales un cultivar foráneo que tenga el gen Php y un cultivar cubano con buen desempeño agrícola y elevado rendimiento, para así obtener líneas y/o cultivares mejorados en cuanto a la resistencia a la “pata prieta” que posean el típico fenotipo comercial de tabaco cubano muy deseado por los consumidores de Europa. Debido a la baja durabilidad de los mecanismos de resistencia monogénica en tabaco ¹⁹, los programas deben estar enfocados a combinar la resistencia monogénica del gen Php con niveles medios o altos de resistencia poligénica que resulta más duradera en el tiempo.

Por esa razón es importante el diseño de esquemas de piramidación génica, que permitan obtener líneas élites de tabaco en cortos períodos de tiempo (tres a cinco años), que posean un amplio espectro de respuesta a las diferentes razas patogénicas de P. nicotianae, como resultado de la combinación de los tipos de resistencias monogénica y poligénica, sin afectar significativamente el rendimiento en la producción.

La existencia de marcadores AFLP, SSR y SCAR para la región genómica Wz, el componente de la resistencia en Beinhart-1000 y el gen Php, respectivamente ^1,20, permiten aplicar métodos de mejora que permitan una selección más confiable, rápida y segura de las líneas genéticas resistentes. Uno de estos métodos es el retrocruce asistido por marcadores moleculares, que hace posible la combinación del gen Php en estado homocigótico o heterocigótico con otras fuentes de resistencia poligénica, como el fragmento genómico Wz en líneas isogénicas cercanas e híbridos isogénicos cercanos.

Se ha demostrado que Php y Wz se segregan de forma independiente y que la combinación de genotipos Wz/-Php/- exhiben niveles de resistencia a la “pata prieta”, que fueron significativamente mayores que los exhibidos por cultivares comerciales de EUA heterocigóticos para el gen Php, como NC 196 y NC 71 ⁷. En tabaco, la introgresión de genes de resistencia, a partir de especies silvestres en estado heterocigótico, típicamente exhibe mayor desempeño agrícola y rendimiento en comparación con materiales en estado homocigótico ¹⁹.

En Cuba solo se informa la presencia de la Raza 0 de P. nicotianae y existe un debate sobre la presencia real de la Raza 1 ²¹. El gen Php confiere inmunidad solo a la Raza 0, pero hay que tener cuidado con las líneas que se deriven de estos programas y que contengan este gen en estado homocigótico o heterocigótico. Es necesario cumplir los esquemas de rotación con cultivares que no posean el gen o que posean una fuente de resistencia diferente para evitar un cambio hacia la Raza 1 y la predominancia final de razas alternativas ^11,22.

Todas las fuentes de resistencia ejercen presión de selección sobre el patógeno, lo que puede resultar en la selección y establecimiento de nuevas razas y/o poblaciones de patógenos con una mayor agresividad en genotipos de huéspedes resistentes ²³.

En el tabaco, las poblaciones de P. nicotianae pueden exhibir mayor agresividad a las plantas con altos niveles de resistencia parcial, después de unas pocas generaciones de hospederos ²².

Cuando la resistencia completa se distribuye ampliamente en un área geográfica grande, conduce a una selección direccional en la población de patógenos. Esta selección da como resultado un aumento en los mutantes virulentos y la ruptura del gen de resistencia ^22,23. Por lo tanto, la resistencia completa generalmente no es duradera y, a menudo, da como resultado ciclos de auge y caída en los que el huésped se ve favorecido durante un tiempo, seguido de un cambio a favor del patógeno ²³.

En otro orden, es importante evaluar la calidad química de las nuevas líneas en términos de porcentaje de alcaloides totales y porcentaje de azúcares reductores y que estos valores estén dentro del margen comercial aceptable para el tabaco cubano en el mercado internacional. Las fuentes de resistencia a la “pata prieta” conocidas, se asocian regularmente con una reducción de los rendimientos y/o de la calidad de la hoja curada, lo que hace difícil el desarrollo de cultivares altamente resistentes, que a la vez produzcan altos rendimientos de hoja curada con características químicas de calidad adecuada ⁷.

The disease known as “black shank” caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae Breda de Haan, produces large annual losses to tobacco production in Cuba and the rest of the world ^1,2. The control of this disease is carried out through an integrated management that includes: the rotation of crops, the use of chemical products and resistant varieties, the latter being the most economical and lasting strategy ^3,4.

Obtaining cultivars resistant to the disease in Cuba, through current breeding programs results in a long period of about 10 or 12 years. The different races of this pathogen are able to evolve in an accelerated way in short periods of time developing much more aggressive isolates ⁵, for this reason the pathogen manages to overcome the resistance of the new varieties that are released to production in only a few years. To this is added the possible consanguinity present in the cultivars due to the recurrent and continuous use of the same parents that causes a low genetic variability to which it is easy to adapt the pathogen.

So far, four sources of monogenic and multigenic resistance to P. nicotianae are well identified. The partial resistance, controlled by multiple genes and non-specific race that comes from the cultivar 'Florida 301' is one of the most widespread but is associated with low yields and a reduction in the quality of the leaf cured in Virginia tobacco ⁶.

The cultivar of black tobacco 'Beinhart-1000' has a strong resistance to races 0 and 1 of the pathogen, but it is little used in improvement programs due to the presence of unwanted compounds in the cured leaf ^1,7). The genomic region known as Wz from the wild species Nicotiana rustica has been introgressed in some cultivars of tobacco Virginia in the United States of America and Zimbabwe through a stable line designated as' Wz'. Tobacco lines in which it has been introgressed the Wz region contains a gene or genes that confer a high level of resistance to Race 0 and affect the resistance to Race 1 of P. nicotianae⁷.

Finally we have the transfer of Php and Phl genes to commercial tobacco cultivars from the wild species Nicotiana plumbaginifolia Viv. and Nicotiana longiflora Cav., Respectively. Both genes have similar effects, with a dominant monogenic character that provides complete resistance only to Race 0 of P. nicotianae^8-12.

In Cuba, only the presence of Race 0 of P. nicotianae is reported and Cuban cultivars show resistance levels varying from susceptible to highly resistant at the time of release to production. ⁵

There is ambiguity among producers and plant breeders about the origin of resistance to P. nicotianae in Cuban tobacco cultivars. So it is difficult to determine if the Php gene was introduced into commercial cultivars as part of the breeding program in the 60s and 70s of the previous century. This makes it impossible to know if this resistance gene has been deployed in the set, properly preserved, of the variety of genes of tobacco in Cuba over more than 40 years of genetic improvement.

An intense and rigorous search in the pedigree of Cuban commercial tobacco cultivars shows that probably only resistance to the "brown leg" that comes from "Florida 301" was introduced in Cuba through cultivars that were used as progenitors in the programs of improvement. Cultivars such as 'K326' and 'Florida 301' itself, were used in the improvement of Cuban tobacco cultivars type Virginia a few years ago ¹³. We have no evidence of the presence of the Php gene as a source of resistance in Cuban tobacco, a fundamental knowledge that is needed for improvement programs and for the establishment of an adequate tobacco policy in our country.

Taking into account the above, the objective of this research was to identify the presence of the Php gene in current commercial tobacco cultivars, cultivars that were commercial at the time and cultivars that have been used and used in tobacco improvement programs in Cuba as parents for more than 40 years.

All the cultivars of this research were used or used in tobacco breeding programs in Cuba. Seeds of 29 tobacco cultivars (Nicotiana tabacum L.) and seeds of the wild species Nicotiana plumbaginifolia Viv. (Natural source of the Php gene) were planted in expanded polystyrene trays with 264 alveoli containing organic substrate with the following composition: 70 % of black peat, 15 % of rice husk and 15 % of zeolite ¹⁴, based on the floating tray technology according to García and Andino ¹⁵. The trays were placed in protected culture conditions or tunnels.

In all the cultivars tested, the Php gene is absent except for N. plumbaginifolia, which is the natural source (Table 1 and Figure 1). The results provide new information that suggests that these cultivars that were used as progenitors in tobacco improvement programs in Cuba over more than 40 years do not contain the Php gene. This type of resistance can be introduced and exploited in current and future improvement programs in our country. The scientific evidence on the absence of Php in Cuban commercial tobacco is in contradiction with the cited by Espino and cited by Valdés, who states that Cuban cultivars of Virginia-type tobacco possess the source of resistance to the disease “black shank” that comes from of N. plumbaginifolia^17,18. In none of the 10 Virginia tobacco cultivars that were analyzed was the Php gene.

On the basis of this new evidence it is possible to develop improvement programs that use as a parent a foreign cultivar that has the Php gene and a Cuban cultivar with good agricultural performance and high yield to obtain lines and cultivars improved in terms of resistance to the "black shank" that possess the typical commercial phenotype of Cuban tobacco very much desired by consumers in Europe. Due to the low durability of the mechanisms of monogenic resistance in tobacco ¹⁹, programs should focus on combining the monogenic resistance of the Php gene with medium or high levels of polygenic resistance that is more durable over time.

For this reason, it is important to design genetic pyramid schemes that allow obtaining elite lines of tobacco in short periods of time (three to five years), that have a broad spectrum of response to the different pathogenic races of P. nicotianae, as a result of the combination of monogenic and polygenic types of resistances, without significantly affecting production performance.

The existence of AFLP, SSR and SCAR markers for the Wz genomic region, the resistance component in Beinhart-1000 and the Php gene, respectively ^(1.20), allow the application of improvement methods that allow a more reliable, quick and safe selection of the resistant genetic lines. One of these methods is the backcross assisted by molecular markers that makes it possible to combine the Php gene in a homozygous or heterozygous state with other sources of polygenic resistance such as the Wz genomic fragment in nearby isogenic lines and nearby isogenic hybrids.

It has been shown that Php and Wz are segregated independently and that the combination of Wz/-Php/ - genotypes exhibit levels of resistance to the "black shank" that were significantly higher than those exhibited by commercial cultivars of the USA heterozygous for the gene Php, as NC 196 and NC 71 ⁷. In tobacco, the introgression of resistance genes from heterozygous wild species typically exhibits higher agricultural performance and yield compared to materials in the homozygous state ¹⁹.

In Cuba, only the presence of Race 0 of P. nicotianae is reported and there is a debate about the real presence of Race 1 ²¹. The Php gene confers immunity only to Race 0, but care must be taken with the lines that are derived from these programs and that contain this gene in a homozygous or heterozygous state. It is necessary to comply with rotation schemes with cultivars that do not have the gene or that have a different source of resistance to avoid a change to Race 1 and the final predominance of alternative races ^11,22.

All sources of resistance exert selection pressure on the pathogen, which may result in the selection and establishment of new races and populations of pathogens with greater aggressiveness in genotypes of resistant hosts ²³.

In tobacco, populations of P. nicotianae may exhibit greater aggressiveness to plants with high levels of partial resistance after a few generations of hosts ²².

When complete resistance is widely distributed over a large geographic area, it leads to a directional selection in the pathogen population. This selection results in an increase in virulent mutants and breakdown of the resistance gene ^22,23. Therefore, complete resistance is generally not durable and often results in boom and bust cycles in which the host is favored for a time followed by a change in favor of the pathogen ²³.

In another aspect, it is important to evaluate the chemical quality of the new lines in terms of percentage of total alkaloids and percentage of reducing sugars and that these values are within the acceptable commercial margin for Cuban tobacco in the international market. Known sources of resistance to the "black shank" are regularly associated with a reduction in the yields and the quality of the cured leaf, which makes it difficult to develop highly resistant cultivars that also produce high yields cured leaf with chemical characteristics of adequate quality ⁷.