El pimiento es una de las especies hortícolas más importante para Cuba y el mundo, pertenece al género Capsicum, familia Solanaceae. El género Capsicum contiene alrededor de 25 especies silvestres y cinco cultivadas, que son: Capsicum annuum L., Capsicum frutenscens L., Capsicum chínense Jacq., Capsicum bacatum L. y Capsicum pubescens R y P ¹. Se desarrolla desde cerca del nivel del mar hasta los 2500 m s.n.m, abarcando diferentes regiones de México y otros lugares del mundo, razón por la cual se pudiera encontrar este cultivo en el mercado todo el año, por lo que su consumo es muy generalizado en fresco e industrializado en diversas modalidades ^2,3.

De las especies cultivadas Capsicum annuum L. es la de mayor importancia económica, ya que es ampliamente consumida por la población mundial como condimento; además, sus frutos tienen propiedades medicinales, debido a que contienen aceites volátiles, capsaisicinoides, carotenoides, vitaminas, proteínas, fibras, antioxidantes y elementos minerales ^4-6. Existen cultivares que se diferencian en forma, tamaño, color, sabor y usos culinarios ⁷.

Por otra parte, se ha visto que el uso de explantes para la regeneración de meristemos apicales ⁸, hojas, hipocotilos, cotiledones, raíces y embrionesinducen la embriogénesis somática ^9-11. Sin embargo, no todos los cultivares responden de igual manera a estas técnicas ni a la desinfección previa de los explantes, por lo que se necesitan ajustes y conocimientos básicos de los mecanismos fisiológicos que intervienen en las diferentes etapas de la micropropagación de un cultivo ¹².

’YAMIL’, es un cultivar de polinización abierta, de un ciclo de 130 días, presenta buena adaptación climática, se recomienda para época de invierno (15 de septiembre hasta 15 de febrero); posee buena cobertura de follaje que permite proteger a los frutos de los golpes de sol y de los depredadores; comienza a florecer a los 29 días después del trasplante (ddt), su floración masiva ocurre a los 34 ddt; los frutos son verde que pasan a rojo en su madurez fisiológica; tiene9,94 cm de largo y 9,35 cm de ancho, así como un grosor de 6,62 mm, la masa media del fruto oscila entre 200-230 g y tiene entre seis a siete frutos por planta; el rendimiento es de 30 tha^-1; la acidez (0,16 %), °Brix (4,5), pH (5,5-5,6) y entre 170-175 mg en 100g de contenido de vitamina C; es resistente a Potuvirus; este genotipo está inscrito en el registro oficial de variedades del Ministerio de la Agricultura de Cuba ¹³.

En la actualidad se trabaja en el mejoramiento genético del cultivar ‘YAMIL’ para las altas temperaturas; por una parte, ya que es un genotipo para campo abierto y para mejorar la calidad de los frutos; por otra parte, en cuanto al contenido de licopeno. Por lo que obtener plántulas de este cultivar en un menor tiempo resulta imprescindible y se debe acudir a las técnicas biotecnológicas, por lo que se deben iniciar las investigaciones por la desinfección de las semillas para su implantación in vitro y disminuir el tiempo de mejoramiento con respecto a los métodos tradicionales.

Existe una amplia gama de agentes químicos que se emplean en la desinfección de los explantes antes de su inoculación in vitro, por lo que es imprescindible establecer el tipo de desinfectante a utilizar, el tiempo de los tratamientos y las concentraciones, ya que de la misma forma que estos actúan sobre los microorganismos, lo hacen sobre el material tratado y pueden ocasionarle daños irreparables ¹⁴.

La desinfección de las semillas de diferentes genotipos de Capsicum spp. se realizó con hipoclorito de sodio al 5 % durante 10 minutos ¹⁵. Por otra parte, Matos et al.¹⁶, informaronque la desinfección adecuada de los explantes (estructuras embrión-endospermo) de semillas de moringa (Moringa oleifera Lam.), se realizó con hipoclorito de sodio 1 % (v:v) en agitación durante siete minutos. También se utiliza el hipoclorito de calcio a concentraciones y tiempos de desinfección diferentes, en dependencia de la especie y el cultivar. Asimismo, se emplea también el cloruro de mercurio II (HgCl₂) en la desinfección de los explantes para iniciar el cultivo in vitro en diferentes especies de plantas, pero este agente desinfectante es muy tóxico, por lo que se debe emplear con mucha precaución.

Teniendo en cuenta lo antes expuesto, este trabajo se realizó con el objetivo de determinar el mejor tratamiento de hipoclorito de sodio y tiempo de desinfección de las semillas de pimiento (Capsicum annuum L.) cultivar ‘YAMIL’para su implantación in vitro.

El experimento se realizó en el Departamento de Genética y Mejoramiento de las Plantas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), Cuba.

Material vegetal

Se emplearon semillas certificadas de pimiento (Capsicum annuumL.) del cultivar ‘YAMIL’ de la campaña 2016-2017.

Medio de cultivo

Se empleó como medio de cultivo basal las sales de Murashige y Skoog ¹⁷ [MS]. Las combinaciones de medios de cultivo fueron las siguientes:

El pH se ajustó a 5,8(0, 2 antes de realizar la esterilización del mismo en autoclave a 1,5 atmósferas de presión y 121 ⁰C de temperatura durante 20 minutos.

En todos los casos se emplearán 10 mL de medio de cultivo por frasco.

Condiciones de cultivo

Todos los frascos con los explantes se colocaron en una cámara de crecimiento a una temperatura de 24±2 ⁰C, a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos entre 220-250 µmolm^-2s^-1, con un foto período de 16 horas luz y ocho de oscuridad y humedad relativa entre 70-75 %.

Los tratamientos fueron los siguientes:

Evaluaciones

Se realizaron a los 7, 14 y 21 días, pero en el trabajo se presentarán los resultados de la última evaluación. Las variables evaluadas fueron las siguientes:

Diseño experimental y análisis de los datos

Se empleó un diseño completamente aleatorizado con 15 frascos por tratamiento con dos semillas (explantes) por frasco y el mismo se repitió dos veces en el tiempo. Los datos se procesaron mediante Análisis de Varianza de Clasificación Simple (ANOVA), con el programa SPSS 11,5 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL) y la comparación entre las medias se realizó de acuerdo a la prueba de Tukey (p(0,05).

Los resultados relacionados con el porcentaje de desinfección y germinación de las semillas (explantes) de pimiento se reflejan en la Figura 1. Como se puede observar hubo diferencias significativas en cuanto al porcentaje de desinfección de las semillas; el 100 % de las semillas de los tratamientos 6 y 8 se desinfectaron y no hubo diferencias entre las semillas de estos tratamientos, pero si se diferenciaron de las de los tratamientos 1 y 2. Es importante aclarar, que la contaminación de las semillas (explantes) en los diferentes tratamientos fue fundamentalmente con bacterias. Con respecto al porcentaje de germinación de las semillas, solo las del tratamiento 8 alcanzaron el 100 % de germinación y se diferenciaron estadísticamente del resto de los tratamientos.

El 100 % de las semillas de pimiento del cultivar ‘Jalapeño M’, se desinfectaron con 100 y 50 % de Clorox; sin embargo, el porcentaje de germinación fue superior con la concentración más elevada (92,6 %) y la más baja afectó la misma (64,2 %) ¹⁹.

Explantes obtenidos a partir de semillas de diferentes genotipos de Capsicum spp., se desinfectaron con agua que contenía Tween 20, etanol al 70 % y NaOCl al 5 % durante 10 minutos y obtuvieron un elevado porcentaje de germinación de las semillas ¹⁵. Por otra parte, Stanislava y Velichka ²⁰ también obtuvieron buenos resultados con respecto a la germinación de las semillas de los cultivares de pimiento 'Yasen F₁' y 'Kurtovskakapia 1619',cuando las mismas se desinfectaron con una solución de hipoclorito de calcio al 5 % durante una hora.

Si bien el hipoclorito de calcio, es un buen agente desinfectante, es posible que en los resultados anteriores, se haya afectado un poco el porcentaje de germinación de las semillas en ambos cultivares de pimiento, ya que estas semillas estuvieron expuestas mucho tiempo al agente químico.

En otros cultivos como Aloe vera (L.) Burm. f., Lavanya y Thayamini ²¹, se informó que los brotesque extrajeron de la planta madre se lavaron con agua del grifo durante aproximadamente 40 minutos y después se desinfectaron con etanol al 70 % durante 30 segundos y posteriormente estos explantes se colocaron en Clorox al 20 % (5,25 % de NaOCl) con dos gotas de Tween 20 durante 30 minutos. Según otros autores ²², cuando se realizó la desinfección durante un minuto en alcohol 96° y 20 minutos en NaOCl al 2 % (5,6 gL^-1 de cloro activo), con dos gotas de Tween 20, el porcentaje de contaminación in vitro de semillas de Schinus fasciculata (Griseb) J.M. Johnstvar. fasciculata (molle), implantada en agar, -agua fue de 16 %. Estos autores, informaron además, que el porcentaje de germinación fisiológica a los tres días de la inoculación en el medio de cultivo fue de 40 % y a los siete días alcanzaron el 84 %.

Otros autores desinfectaron semillas albahaca (Ocimum basilicum L.) con NaOCl al 10 % durante cinco minutos y etanol al 70 % durante 20 segundos ²³. En otras investigaciones se emplearon tres métodos para la desinfección de las semillas de Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz ²⁴, la primera desinfección la realizaron en una solución que contenía Mancozeby Benomilo (2 gL^-1 de Mancozeb; 0,6 gL^-1 de Benomil, más unas gotas de Tween 20) por 20 minutos y se colocaron en un agitador magnético; la segunda desinfección fue con una solución de alcohol 75° por cinco segundos y, por último, las semillas se sumergieron en NaOCl al 1 % por 10 minutos.

Los fertilizantes químicos, como el Benomilo y el Mancozeb, son muy agresivos para emplearlos en la desinfección de explantes in vitro, con independencia de los resultados que se obtengan, ya que pueden ser tóxicos y de difícil remoción del explante in vitro, que posteriormente se convertirá en una planta, que consumen las personas y los animales y, además, afectan el medio ambiente.

La desinfección de los cultivares de berenjena (Solanum melongena L.) 'Mattu Gulla' y 'Perampalli Gulla', la realizaron introduciendo sus semillas en una solución jabonosa (dos o tres gotas de Tween 20) durante cinco minutos, seguido de un tratamiento con etanol al 70 % durante un minuto y posteriormente colocaron las semillas en cloruro de mercurio (II) (HgCl₂) 0,1 % (w/v) durante cinco minutos ²⁵. La germinación de las semillas de Stenocereus queretaroensis (F. A. C. Weber) F. Buxb. (una cactácea arborescente, endémica de México), tratadas conhipoclorito de sodio al 10 % durante cinco minutos, fue superior a las que no se trataron ²⁶.

El hipoclorito de sodio y calcio, así como el cloruro de mercurio (II) causan la muerte de los microorganismos infecciosos como bacterias y hongos exógenos, que permiten que haya un mayor índice de establecimiento en el material vegetal. Sin embargo, los dos primeros deben usarse a ciertas concentraciones y tiempos de desinfección, ya que son muy potentes y en el último caso, no debe emplearse en la desinfección de los explantes, ya que es muy tóxico para los mismos cuando se cultivan in vitro y muy difícil de remover de los mismos.

En la Tabla 1, se muestra la altura de las plántulas, el número y la longitud de las raíces, así como el vigor de las plántulas y hubo diferencias significativas entre los tratamientos en todas las variables que se evaluaron. Con respecto a la altura de las plántulas, el mejor tratamiento fue en el que se colocaron las semilla en NaOCl 5 % durante un minuto y las mismas se implantaron en el medio de cultivo MS suplementado con 30 g L^-1 de sacarosa, con 5,84 cm de altura de la plántula, que se diferenció estadísticamente de los tratamientos controles 1 (medio de cultivo MS suplementado con 15 g L^-1 sacarosa) y 2 (medio de cultivo MS suplementado con 30 g L^-1 sacarosa), que las plántulas alcanzaron 4,61 y 4,94 cm, respectivamente. Las plántulas del tratamiento 8, también se diferenciaron estadísticamente de las del resto de los tratamientos.

En relación con el número de raíces, las plántulas del tratamiento 8, fueron estadísticamente superiores a las del resto de los tratamientos, incluyendo a las de los tratamientos controles (1 y 2). Sin embargo, con respecto a la longitud de las raíces, las plántulas de los tratamientos 3 y 6, con 4,08 y 3,94 cm, respectivamente alcanzaron los mejores resultados (Tabla 1).

Finalmente, las plántulas más vigorosas fueron las del tratamiento 8, que alcanzaron un vigor de 3 y superaron a las de los tratamientos controles 1 y 2, con un vigor de 2 en ambos casos (Tabla 1).

Las plántulas del cultivar 'Jalapeño M', con aplicaciones de Clorox 50 % alcanzaron mayor altura y longitud de las hojas cotiledonares a diferencia de las plántulas en las que se empleó Clorox al 100 %. Sin embargo, no informaron diferencias significativas estadísticas con respecto al ancho de las hojas cotiledonares ni en la longitud de las raíces ¹⁹.

Otros autores ²⁷ en estudios realizados con Escobaria cubensis (Britton y Rose) Hunts, comúnmente denominado “cactus enano de Holguín”, informaron que el tratamiento de las semillas con 2 % de NaOCl y doble desinfección, fueron las que tuvieron mayores niveles de supervivencia de las plántulas; las mamilas respondieron mejor en cuanto a la supervivencia a las combinaciones mayores de concentración de NaOCl y el tipo de desinfección.

La obtención de diferentes tipos de explantes primarios de tres cultivares de piña (Ananas comosus (L.) Merr.: yemas de la corona y el meristemo de los hijuelos, a partir de tallos, que se lavaron previamente con detergente y, posteriormente, se transfirieron a una solución diluida de cloro comercial al 20 % (v/v) durante 10 minutos, observaron que a las cuatro semanas de cultivo, hubo brote de una yema apical en todos los cultivares, con una longitud de 3 a 4 mm, aproximadamente; después de cuatro semanas adicionales en el mismo medio de cultivo, hubo alargamiento de las hojas y del vástago (1 a 3 cm) y el alargamiento se incrementó con el tiempo, sin que se observara brotación lateral ²⁸. En sentido general, en este trabajo, las plántulas del tratamiento 8 (NaOClal 5 % durante un minuto e inoculación de las semillas en el medio de cultivo basal MS suplementado con sacarosa (30 g L^-1), mostraron un desarrollo homogéneo, dada la alta sincronización que se observó en la germinación de las mismas. Además, este material constituyó una fuente adecuada de explantes de calidad para los experimentos posteriores.

A partir de estos resultado se propone una metodología de desinfección de las semillas de pimiento, cultivar ‘YAMIL’ para su implantación in vitro.

Pasos de la metodología:

The pepper is one of the most important horticultural species for Cuba and the world, belongs to the genus Capsicum, family Solanaceae. The genus Capsicum contains about 25 wild and five cultivated species, which are: Capsicum annuum L., Capsicum frutenscens L., Capsicum chínense Jacq, Capsicum bacatum L. and Capsicum pubescens R and P ¹. It develops from near sea level to 2500 m a.s.l, covering different regions of Mexico and other parts of the world, which is why this crop could be found in the market all year round, so its consumption is very widespread in fresh and industrialized in various modalities ^2,3.

From the cultivated species, Capsicum annuum L. is the one of greater economic importance, since it is widely consumed by the world population as a condiment. In addition, its fruits have medicinal properties, because they contain volatile oils, capsaisicinoids, carotenoids, vitamins, proteins, fibers, antioxidants and mineral elements ^4-6. There are cultivars that differ in shape, size, color, flavor and culinary uses ⁷.

On the other hand, it has been seen that the use of explants for the regeneration of apical meristems ⁸, leaves, hypocotyls, cotyledons, roots and embryos induce somatic embryogenesis ^9-11. However, not all cultivars respond equally to these techniques or to prior disinfection of explants, so adjustments and basic knowledge of the physiological mechanisms involved in the different stages of the micropropagation of a crop are needed ¹².

‘YAMIL’, is a cultivar of open pollination, of a cycle of 130 days, presents good climatic adaptation, it is recommended for wintertime (September 15 to February 15). It has good foliage cover that allows the fruits to be protected from sunburn and predators. It begins to bloom at 29 days after transplantation (dat), its massive flowering occurs at 34 dat; the fruits are green that turn red at their physiological maturity, it is 9.94 cm long and 9.35 cm wide, as well as a thickness of 6.62 mm. The average mass of the fruit ranges between 200-230 g and has between six to seven fruits per plant. The yield is 30 t ha_-1; acidity (0.16 %), °Brix (4.5), pH (5.5-5.6) and between 170-175 mg in 100 g of vitamin C content; it is resistant to Potyvirus. This genotype is registered in the official variety registry of the Ministry of Agriculture of Cuba ¹³.

Currently working on the genetic improvement of cultivating ‘YAMIL’ for high temperatures; on the one hand, since it is a genotype for open field and to improve the quality of the fruits; on the other hand, in terms of lycopene content. Therefore, obtaining seedlings of this crop in a shorter time is essential and biotechnological techniques must be used, so research should be initiated on the disinfection of seeds for in vitro implantation and decrease the improvement time with respect to traditional methods.

There is a wide range of chemical agents that are used in the disinfection of explants before in vitro inoculation, so it is essential to establish the type of disinfectant to be used, the time of treatments and concentrations, since the same way these act on the microorganisms, they do on the treated material and can cause irreparable damage ^14).

The disinfection of the seeds of different genotypes of Capsicum spp. it was performed with 5 % sodium hypochlorite for 10 minutes ¹⁵. On the other hand, some authors, reported that adequate disinfection of the explants (embryo-endosperm structures) of moringa seeds (Moringa oleifera Lam.) was performed with 1 % sodium hypochlorite (v:v) under stirring for seven minutes ⁽¹⁶. Calcium hypochlorite is also used at different concentrations and disinfection times, depending on the species and the cultivar. Likewise, mercury chloride II (HgCl₂) is also used in the disinfection of explants to initiate in vitro culture in different plant species, but this disinfectant is very toxic, so it should be used with great caution.

Taking into account the above, this work was carried out with the objective of determining the best treatment of sodium hypochlorite and disinfection time of pepper seeds (Capsicum annuum L.) cultivar ‘YAMIL’ for in vitro implantation.

The experiment was conducted in the Department of Genetics and Plant Improvement of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), Cuba.

Vegetal material

Certified pepper seeds (Capsicum annuum L.) from the ‘YAMIL’ cultivar of the 2016-2017 campaign were used.

Culture medium

The salts of Murashige and Skoog ¹⁷ [MS] were used as the basal culture medium. The combinations of culture media were the following:

The pH was adjusted to 5.8-0.2 before sterilizing it in an autoclave at 1.5 atmospheres of pressure and 121 °C for 20 minutes.

In all cases, 10 mL of culture medium per bottle will be used.

Growing conditions

All the flasks with the explants were placed in a growth chamber at a temperature of 24±2 ºC, at a flux density of photosynthetic photons between 220-250 µmol m^-2 s^-1, with a photoperiod of 16 light hours and eight of darkness and relative humidity between 70-75 %.

The treatments were as follows:

Evaluations

They were performed at 7, 14 and 21 days, but the results of the last evaluation will be presented at work. The variables evaluated were the following:

Experimental design and data analysis

A completely randomized design with 15 bottles was used per treatment with two seeds (explants) per bottle and it was repeated twice in time. The data were processed using Simple Classification Variance Analysis (ANOVA), with the SPSS 11.5 program for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL) and the comparison between the means was performed according to the Tukey test (p(0.05).

The results related to the percentage of disinfection and germination of pepper seeds (explants) are reflected in Figure 1. As can be seen there were significant differences in the percentage of seed disinfection; 100 % of the seeds of treatments 6 and 8 were disinfected and there were no differences between the seeds of these treatments, but if they differed from those of treatments 1 and 2. It is important to clarify that the contamination of the seeds (explants) in the different treatments it was mainly with bacteria. Regarding the percentage of seed germination, only those of treatment 8 reached 100 % germination and were statistically differentiated from the rest of the treatments.

100 % of the pepper seeds of the cultivar ‘Jalapeño M’, were disinfected with 100 and 50 % of Clorox; however, the germination percentage was higher with the highest concentration (92.6 %) and the lowest affected it (64.2 %) ¹⁹.

Explants obtained from seeds of different genotypes of Capsicum spp., were disinfected with water containing Tween 20, 70 % ethanol and 5 % NaOCl for 10 minutes and obtained a high percentage of seed germination ¹⁵. On the other hand, Stanislava and Velichka ²⁰ also obtained good results regarding the germination of the seeds of the pepper cultivars 'Yasen F1' and 'Kurtovskakapia 1619', when they were disinfected with a solution of calcium hypochlorite at 5 % for one hour.

Although calcium hypochlorite is a good disinfectant agent, it is possible that in the previous results, the percentage of germination of the seeds in both pepper cultivars has been slightly affected, since these seeds were exposed for a long time to the chemical agent.

In other crops such as Aloe vera (L.) Burm. f., Lavanya and Thayamini²¹, it was reported that the sprouts extracted from the mother plant were washed with tap water for approximately 40 minutes and then disinfected with 70 % ethanol for 30 seconds and then these explants were placed in 20 % Clorox (5.25 % NaOCl) with two drops of Tween 20 for 30 minutes. According to other authors ²², when disinfection was carried out for one minute in 96° alcohol and 20 minutes in 2 % NaOCl (5.6 g L^-1 of active chlorine), with two drops of Tween 20, the percentage of in vitro contamination of Schinus fasciculata (Griseb) seeds JM Johnstvar. fasciculata (molle), implanted in agar, -water was 16 %. These authors also reported that the percentage of physiological germination three days after inoculation in the culture medium was 40 % and after seven days they reached 84 %.

Other authors disinfected basil seeds (Ocimum basilicum L.) with 10 % NaOCl for five minutes and 70 % ethanol for 20 seconds ²³. In other investigations three methods were used for the disinfection of the seeds of Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz ²⁴, the first disinfection was carried out in a solution containing Mancozeb and Benomilo (2 g L^-1 of Mancozeb; 0.6 g Benomil L^-1, plus a few drops of Tween 20) for 20 minutes and placed on a magnetic stirrer; the second disinfection was with a 75 ° alcohol solution for five seconds and, finally, the seeds were immersed in 1 % NaOCl for 10 minutes.

Chemical fertilizers, such as Benomilo and Mancozeb, are very aggressive for use in the disinfection of explants in vitro, regardless of the results obtained, since they can be toxic and difficult to remove the explant in vitro, which is subsequently it will become a plant, consumed by people and animals and affect the environment.

The disinfection of the eggplant cultivars (Solanum melongena L.) 'Mattu Gulla' and 'Perampalli Gulla', were carried out by introducing their seeds in a soapy solution (two or three drops of Tween 20) for five minutes, followed by ethanol treatment 70 % for one minute and subsequently placed the seeds in mercury (II) chloride (HgCl₂) 0.1 % (w/v) for five minutes ²⁵. The germination of the seeds of Stenocereus queretaroensis (F. A. C. Weber) F. Buxb. (An arborescent cactus, endemic to Mexico), treated with 10 % sodium hypochlorite for five minutes, was superior to those that were not treated ^26).

Sodium and calcium hypochlorite, as well as mercury (II) chloride cause the death of infectious microorganisms such as bacteria and exogenous fungi, which allow a higher rate of establishment in the plant material. However, the first two should be used at certain concentrations and disinfection times, since they are very potent and in the latter case, they should not be used in the disinfection of explants, since it is very toxic to them when grown in vitro and very difficult to remove from them.

Table 1 shows the height of the seedlings, the number and length of the roots, as well as the vigor of the seedlings and there were significant differences between the treatments in all the variables that were evaluated. With respect to the height of the seedlings, the best treatment was in which the seeds were placed in 5 % NaOCl for one minute and they were implanted in the MS culture medium supplemented with 30 g L^-1 sucrose, with 5, 84 cm high of the seedling, which was statistically differentiated from the control treatments 1 (MS culture medium supplemented with 15 g L^-1 sucrose) and 2 (MS culture medium supplemented with 30 g L^-1 sucrose), which The seedlings reached 4.61 and 4.94 cm, respectively. The seedlings of treatment 8 also differed statistically from those of the rest of the treatments.

In relation to the number of roots, the treatment seedlings 8 were statistically superior to those of the rest of the treatments, including those of the control treatments (1 and 2). However, with respect to the length of the roots, the seedlings of treatments 3 and 6, with 4.08 and 3.94 cm, respectively achieved the best results (Table 1).

Finally, the most vigorous seedlings were those of treatment 8, which reached a vigor of 3 and exceeded those of control treatments 1 and 2, with a vigor of 2 in both cases (Table 1).

The seedlings of the 'Jalapeño M' cultivar, with 50 % Clorox applications, reached greater height and length of the cotyledon leaves unlike the seedlings in which 100 % Clorox was used. However, they did not report significant statistical differences with respect to the width of the cotyledon leaves or the length of the roots ^19).

Other authors ²⁷ in studies conducted with Escobaria cubensis (Britton and Rose) Hunts, commonly called “Holguin dwarf cactus”, reported that the treatment of the seeds with 2 % NaOCl and double disinfection, were those that had higher levels of seedling survival; the mammals responded better in terms of survival to the greater combinations of NaOCl concentration and the type of disinfection.

Obtaining different types of primary explants from three pineapple cultivars (Ananas comosus (L.) Merr.:crown yolks and the meristem of the grandfathers, from stems, which were previously washed with detergent and subsequently transferred to a diluted solution of commercial chlorine at 20 % (v/v) for 10 minutes, they observed that at four weeks of cultivation, there was an apical bud in all cultivars, approximately 3 to 4 mm long. After an additional four weeks in the same culture medium, there was elongation of the leaves and the stem (1 to 3 cm) and the elongation increased with time, without lateral sprouting being observed ²⁸. In this work, the seedlings of treatment 8 (5 % NaOCl for one minute and inoculation of the seeds in the MS basal culture medium supplemented with sucrose (30 g L^-1), showed a homogeneous development, given the high synchronization that it was observed in the g eradication of them. In addition, this material constituted an adequate source of quality explants for subsequent experiments.

From these results, a methodology of disinfection of pepper seeds is cultivar ‘YAMIL’ proposed for in vitro implantation.

Steps of the methodology: