Semillas de frijol de la variedad Cuba C-25-9-N (40 semillas por tratamiento) se trataron con 170 µL de una mezcla que contenía Pectimorf^® en diferentes concentraciones (1, 5, 10, 20, 40 y 100 mg L^-1) y el inoculante Azofert-F^®. Las semillas se sembraron en envases de 0,55 kg de capacidad, con suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico, éutrico ¹¹. Se establecieron ocho tratamientos: dos controles (uno inoculado con Azofert-F^® (control inoculado (CI)) y el otro no inoculado ni tratado con Pectimorf^® (control absoluto (CA)) y el resto correspondieron a cada una de las concentraciones de Pectimorf^® empleadas. Las plantas crecieron en un cuarto de luces con 16 horas luz, a una temperatura de 25-27 ^oC, con 60-70 % de humedad relativa y se regaron cada día con agua corriente. En la etapa de crecimiento R5, cuando el 50 % de las plantas presentaban los primeros botones, se evaluó el número y la masa seca de los nódulos totales (g), el número de trifoliolos, el diámetro y largo del tallo (cm), la longitud radical (cm), la biomasa aérea y de las raíces (g) y el contenido relativo de clorofilas totales en la tercera hoja trifoliada (unidades SPAD) con el medidor portátil MINOLTA SPAD 502 Plus.

Se establecieron ocho tratamientos: dos controles (uno inoculado con Azofert-F^® (CI) y el otro no inoculado ni tratado con Pectimorf^® (CA)) y el resto correspondieron a cada una de las concentraciones de Pectimorf^® empleadas. Las semillas se inocularon con Azofert-F^® y cuando el 50 % de las plantas tenían el segundo par de hojas trifoliadas desplegadas (etapa de crecimiento V3), se asperjaron con 1,5 mL de Pectimorf^® por planta a las diferentes concentraciones. El experimento se realizó en las mismas condiciones que el anterior y se evaluaron las mismas variables en la etapa de crecimiento R5.

Los experimentos se realizaron bajo un Diseño Completamente Aleatorizado con dos repeticiones y se evaluaron 20 plantas por tratamiento. Todos los resultados fueron procesados a partir de un análisis de varianza de clasificación simple y comparación de medias por la Prueba de Tukey p<0,05 en el programa estadístico SPSS, Statistics v22. Para comprobar la normalidad de los datos se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov y para la homogeneidad de varianzas se empleó el estadístico de Levene.

El efecto de la aplicación conjunta de Pectimorf^® y Azofert-F^® a las semillas de frijol a las diferentes concentraciones se observa en las Tablas 1 y 2.

En las variables de nodulación evaluadas no se evidenció la efectividad del inoculante Azofert-F^® respecto a la población nativa de las bacterias del género Rhizobium presentes en el suelo empleado. A pesar de que las plantas tratadas con Pectimorf^® no mostraron diferencias significativas con relación a los controles sí hubo diferencias entre tratamientos (Tabla 1). Las plantas tratadas con las concentraciones de 10 y 100 mg L^-1 presentaron mayor número de nódulos que las plantas tratadas con las concentraciones de 5 y 20 mg L^-1. En el caso de la masa seca de los nódulos fue menor para el tratamiento de 5 mg L^-1 que, para el resto de los tratamientos, este resultado no es suficiente para plantear que la aplicación del producto a esta concentración afecta la fijación biológica del nitrógeno.

En cuanto a las variables de crecimiento, el mayor valor en el contenido relativo de clorofilas totales en la tercera hoja trifoliada correspondió a las plantas tratadas con la concentración de 10 mg L^-1, aunque este efecto no fue significativo, en comparación con el control inoculado y con las plantas tratadas con la concentración de 5 mg L^-1..

La combinación de ambos productos incrementó la masa seca de la raíz en las plantas tratadas con la concentración de 10 mg L^-1, observándose diferencias significativas con el resto de los tratamientos, excepto con 5 mg L^-1 (Figura 1). Aunque no hubo diferencias significativas en la longitud de la raíz, el menor valor correspondió a las plantas tratadas con 10 mg L^-1 de Pectimorf^®. Estos resultados indican que este incremento en la masa seca de la raíz se debe a un aumento en el número de raíces secundarias y adventicias y no a la longitud de la raíz.

Resultados similares se obtuvieron en experimentos con plantas de soya (Glycine max) var. INCAsoy-24 inoculadas con Bradyrhizobium y tratadas con 10 mg L^-1 de Pectimorf^® antes de la siembra. El desarrollo del sistema radical en la etapa de floración, a los 60 días después de la siembra, se favoreció con la aplicación de Pectimorf^®, tanto en semillas inoculadas como no inoculadas ¹². Ambos resultados manifiestan el poder enraizador que algunos autores le atribuyen a esta mezcla de OGAs ^13-15.

En investigaciones realizadas en pecíolos de violeta africana (Saintpaulia ionantha) con Pectimorf^® a la concentración de 10 mg L^-1, se evidenció un incremento en la longitud de las raíces, pero no en la formación de raíces secundarias, efecto que fue más significativo que con la aplicación de ácido indol acético (AIA) (13). Este efecto del Pectimorf^® también se ha obtenido a concentraciones menores de 10 mg L^-1 (2 mg L^-1) en plantas de plátano cultivar ‘FHIA-18’ en condiciones in vitro¹⁶. Asimismo, a concentraciones mayores (20 mg L^-1) en esquejes de guayaba (Psidium guajava) var. Enana Roja Cubana, en el que el poder enraizador de este producto se manifestó en la formación de raíces adventicias ¹⁷.

Estos resultados corroboran lo informado por otros autores acerca de que los OGAs pueden actuar como sustituto de hormonas tradicionales, favoreciendo la diferenciación celular y la formación de órganos en las plantas ¹³.

El Pectimorf^® aplicado por aspersión foliar a la concentración de 100 mg L^-1 estimuló el número de hojas producidas, la masa seca de la parte aérea, la masa seca de la raíz y disminuyó la longitud radical. El efecto enraizador del producto también se observó a concentraciones de 1 y 5 mg L^-1. No se observó efecto de los productos en la longitud del tallo; sin embargo, la concentración de 1 mg L^-1 incrementó su diámetro (Tabla 3).

El contenido relativo de clorofilas totales en la tercera hoja trifoliada no mostró diferencias significativas entre tratamientos. Hay autores que plantean que una posible vía por la cual los OGAs incrementan el crecimiento de las plantas, es porque estas moléculas estimulan la actividad fotosintética; lo que provoca una mayor ganancia de esqueletos carbonados que pueden ser utilizados para la síntesis de proteínas ^18,19. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad fotosintética no está determinada únicamente por el contenido de clorofilas, sino que existen, además, otros elementos como la apertura y el cierre estomático y la actividad del resto de los componentes de los fotosistemas que influyen en el proceso de fotosíntesis.

En un estudio en plantas de frijol asperjadas con 10 mg L^-1 de Pectimorf^®, en la segunda etapa de la fase vegetativa de cultivo, el producto provocó modificaciones en los patrones de distribución y morfogénesis estomática con un incremento en el índice estomático. Estas modificaciones se evidenciaron, fundamentalmente, en la superficie abaxial, donde las células oclusivas se mostraron más estrechas y cortas. Asimismo, se observó que las hojas con mayor índice estomático presentaban estomas más pequeños. La menor localización de los estomas en la superficie adaxial provoca un incremento en la resistencia estomática de esta superficie, cuando está expuesta directamente a la radiación solar y así evita la pérdida de agua, lo que favorece la disponibilidad de esta sustancia para que ocurra la fotolisis, fenómeno que conjuntamente con la luz es necesario para que las plantas realicen la fotosíntesis ²⁰.

En cuanto a las variables de nodulación, el número de nódulos totales fue mayor en las plantas asperjadas con 100 mg L^-1 y la masa seca de los nódulos se incrementó con las concentraciones de 5 y 100 mg L^-1 (Figura 2).

Antecedentes de la combinación de ambos bioestimulantes sólo se tienen en condiciones de campo, en el cultivo de la soya var. INCAsoy-24 e INCAsoy-27. En ambos estudios las plantas inoculadas con Bradyrihzobium se asperjaron al inicio de la floración con Pectimorf^® a la concentración de 10 mg L^-1. Las evaluaciones se realizaron a los 60 días después de la siembra para INCAsoy-24 y a los 45 días para INCAsoy-27. En el caso de INCAsoy-24, la aplicación de ambos productos incrementó la masa seca aérea y de la raíz, mientras que en la variedad INCAsoy-27, sólo la masa seca aérea. En dichos experimentos la aplicación de ambos productos no favoreció la nodulación ^_(12-21) . Sin embargo, en nuestro caso las evaluaciones se realizaron a los 35 días después de la siembra, encontrándose que a concentraciones menores (1 y 5 mg L^-1) y mayores (100 mg L^-1) que las aplicadas en soya, el Pectimorf^® favoreció, tanto la formación de raíces secundarias, como el desarrollo de los nódulos.

El incremento en la masa seca de la raíz provocado por Pectimorf^® a 5 y 100 mg L^-1 confirma lo planteado por otros autores, de que este producto, a base de OGAs tiene actividad auxínica ^22-24, aunque también es posible que la función que realice sea la de activar señales que estimulen la síntesis de esta hormona. Para afirmar esto se requiere realizar estudios bioquímicos y moleculares.

Se plantea que el desarrollo del sistema radical le posibilita a la planta, tanto en condiciones normales de crecimiento como de estrés por sequía, una mayor absorción de agua y minerales que permite un incremento en el desarrollo foliar ²⁵, tal como se muestra en los resultados con la concentración de 100 mg L^-1, en los que el desarrollo de la raíz le permitió a la planta un incremento en el número de hojas y la masa seca de la parte aérea.

Los mejores resultados en la parte aérea se obtuvieron con la aplicación de 100 mg L^-1 de Pectimorf^®, concentración que también incrementó el número de nódulos. Este resultado pudiera ser una consecuencia del aumento en la fijación biológica de nitrógeno que propicia una mayor síntesis de ureidos, lo que permite que la planta disponga de nitrógeno para la síntesis de proteínas y otras moléculas necesarias para la formación y crecimiento del vástago.

Estos incrementos en las variables morfoagronómicas y en la nodulación a las concentraciones de 1, 5 y 100 mg L^-1 de Pectimorf^® pueden ser el resultado de un grupo de señales biológicas desencadenadas en las plantas por la combinación de estos productos. Para esto se recomienda realizar estudios bioquímicos y moleculares mediante el análisis de metabolitos y enzimas involucradas en el metabolismo del nitrógeno y el carbono que permitan explicar este efecto. Se propone además, evaluar estos bioproductos en el rendimiento y en la calidad del cultivo.

Bean seeds of the Cuba C-25-9-N variety (40 seeds per treatment) were treated with 170 µL of a mixture containing Pectimorf^® in different concentrations (1, 5, 10, 20, 40 and 100 mg L^-1) and the Azofert-F^® inoculant. The seeds were in containers of 0.55 kg capacity sown, with typical Leachate Red Ferralitic soil, eutric ¹¹. Eight treatments were established: two controls (one inoculated with Azofert-F^® (inoculated control (IC)) and the other not inoculated or treated with Pectimorf^® (absolute control (CA)) and the rest corresponded to each of the concentrations of Pectimorf^® used. The plants grew in a light room with 16 light hours, at a temperature of 25-27 ^ºC, with 60-70 % relative humidity and were every day with running water irrigated. In the growth, stage R5 when 50 % of the plants had the first buttons were evaluated the number and dry mass of the total nodules (g), the number of trifoliate leaves, the diameter and length of the stem (cm). Besides, the radical length (cm), the aerial and root biomass (g) and the relative content of total chlorophylls in the third trifoliate sheet (SPAD units) were evaluated using the MINOLTA SPAD 502 Plus portable meter.

Eight treatments were established two controls (one inoculated with Azofert-F^® (CI) and the other not inoculated or treated with Pectimorf^® (CA)) and the rest corresponded to each of the Pectimorf^® concentrations used. The seeds were inoculated with Azofert-F^® and when 50 % of the plants had the second pair of trifoliate leaves deployed (growth stage V3), they were sprinkled with 1.5 mL of Pectimorf^® per plant at different concentrations. The experiment was performed under the same conditions as the previous one; the same variables were evaluated in the growth stage R5.

Experimental design and statistical analysis

The experiments were performed under a Fully Randomized Design with two repetitions and 20 plants were evaluated per treatment. All results were processed from a simple classification variance analysis and comparison of means by the Tukey test p <0.05 in the SPSS statistical program, Statistics v22. To verify the normality of the data, the Kolmogorov-Smirnov test was used and for the homogeneity of variances, the Levene statistic was used.

The effect of the joint application of Pectimorf^® and Azofert-F^® to bean seeds at different concentrations is observed in Tables 1 and 2.

In the nodulation variables evaluated, the effectiveness of the Azofert-F^® inoculant was not evidenced with respect to the native population of the Rhizobium bacteria present in the soil used. Although the plants treated with Pectimorf^® showed no significant differences in relation to the controls, there were differences between treatments (Table 1). Plants treated with concentrations of 10 and 100 mg L^-1 had a greater number of nodules than plants treated with concentrations of 5 and 20 mg L^-1. In the case of the dry mass of the nodules, it was lower for the treatment of 5 mg L^-1 than for the rest of the treatments, this result is not sufficient to state that the application of the product at this concentration affects the biological fixation of nitrogen.

As for the growth variables, the highest value in the relative content of total chlorophylls in the third leaflet trifoliate corresponded to the plants treated with the concentration of 10 mg L^-1, although this effect was not significant, compared to the control inoculated and with the treated plants with the concentration of 5 mg L^-1.

The combination of both products increased the dry mass of the root in the treated plants with the concentration of 10 mg L^-1, observing significant differences with the rest of the treatments, except with 5 mg L^-1 (Figure 1). Although there were no significant differences in root length, the lowest value corresponded to plants treated with 10 mg L^-1 Pectimorf^®. These results indicate that this increase in dry root mass is due to an increase in the number of secondary and adventitious roots and not to the length of the root.

Similar results were obtained in experiments with soy plants (Glycine max) var. INCAsoy-24 inoculated with Bradyrhizobium and treated with 10 mg L^-1 of Pectimorf^® before sowing. The development of the radical system in the flowering stage, 60 days after sowing, was favored with the application of Pectimorf^®, both in inoculated and non-inoculated seeds ¹². Both results show the rooting power that some authors attribute to this mixture of OGAs ^13-15.

In investigations conducted in petioles of African violet (Saintpaulia ionantha) with Pectimorf^® at the concentration of 10 mg L^-1, an increase in root length was evident, but not in the formation of secondary roots, an effect that was more significant than with the application of indole acetic acid (AIA) ¹³. This effect of Pectimorf^® has also been obtained at concentrations below 10 mg L^-1 (2 mg L^-1) in banana plants cultivating ‘FHIA-18’ under in vitro conditions ¹⁶. In addition, at higher concentrations (20 mg L^-1) in guava cuttings (Psidium guajava) var. Enana Roja Cubana, in which the rooting power of this product was manifested in the adventitious root formation ¹⁷.

These results corroborate what has been reported by other authors that OGAs can act as a substitute for traditional hormones, favoring cell differentiation and the formation of organs in plants ¹³.

Pectimorf^® applied by foliar spray at the concentration of 100 mg L^-1 stimulated the number of leaves produced, the dry mass of the aerial part, and the dry mass of the root and decreased the radical length. The rooting effect of the product was also observed at concentrations of 1 and 5 mg L^-1. No effect of the products on the stem length was observed; however, the concentration of 1 mg L^-1 increased its diameter (Table 3).

The relative content of total chlorophylls in the third trifoliate leaf did not show significant differences between treatments. There are authors who suggest that a possible way by which OGAs increase plant growth is because these molecules stimulate photosynthetic activity; which causes a greater gain of carbon skeletons that can be used for protein synthesis ^18,19. However, it must be taken into account that photosynthetic activity is not determined solely by the chlorophyll content, but there are also other elements such as stomatal opening and closing and the activity of the rest of the components of the photosystems that influence in the process of photosynthesis.

In a study in bean plants sprinkled with 10 mg L^-1 of Pectimorf^®, in the second stage of the vegetative phase of cultivation, the product caused changes in distribution patterns and stomatal morphogenesis with an increase in the stomatal index. These modifications were fundamentally in the abaxial surface evidenced, where the occlusive cells were narrower and shorter. Likewise, it was observed that the leaves with the highest stomatal index had smaller stomata. The lower location of the stomata on the adaxial surface causes an increase in the stomatal resistance of this surface, when it is directly to solar radiation exposed and thus prevents water loss, which favors the availability of this substance for the photolysis to occur, a phenomenon that together with light is necessary for plants to carry out photosynthesis ²⁰.

As for the nodulation variables, the number of total nodules was higher in the plants sprinkled with 100 mg L^-1 and the dry mass of the nodules increased with the concentrations of 5 and 100 mg L^-1 (Figure 2).

Background of the combination of both biostimulants is only in field conditions taken, in the cultivation of soybean var. INCAsoy-24 and INCAsoy-27. In both studies the plants inoculated with Bradyrihzobium were sprinkled at the beginning of flowering with Pectimorf^® at the concentration of 10 mg L^-1. The evaluations were performed 60 days after planting for INCAsoy-24 and 45 days for INCAsoy-27. In the case of INCAsoy-24, the application of both products increased the aerial and root dry mass, while in the INCAsoy-27 variety, only the aerial dry mass. In these experiments, the application of both products did not favor nodulation ^12,21. However, in our case the evaluations were made 35 days after sowing, being found that at lower concentrations (1 and 5 mg L^-1) and higher (100 mg L^-1) than those applied in soy, Pectimorf^® favored both the formation of secondary roots and the development of the nodules.

The increase in the dry mass of the root caused by Pectimorf^® at 5 and 100 mg L^-1 confirms what was stated by other authors, that this product, based on OGAs has auxinic activity ^22-24, although it is also possible The function you perform is to activate signals that stimulate the synthesis of this hormone. To affirm this, biochemical and molecular studies are required.

It is proposed that the development of the radical system allows the plant, both under normal conditions of growth and drought stress, a greater absorption of water and minerals that allows an increase in foliar development ²⁵, as shown in the results with the concentration of 100 mg L^-1. The results let the development of the root allowed the plant an increase in the number of leaves and the dry mass of the aerial part.

The best results in the aerial part were with the application of 100 mg L^-1 of Pectimorf^®, obtained, a concentration that also increased the number of nodules. This result could be a consequence of the increase in the biological fixation of nitrogen that favors a greater synthesis of ureides, which allows the plant to have nitrogen for the synthesis of proteins and other molecules necessary for the formation and growth of the stem.

These increases in morphoagronomic variables and nodulation at concentrations of 1, 5 and 100 mg L^-1 of Pectimorf^® may be the result of a group of biological signals triggered in plants by the combination of these products. For this, it is recommended to carry out biochemical and molecular studies through the analysis of metabolites and enzymes involved in the metabolism of nitrogen and carbon that explain this effect. It is also proposed to evaluate these bioproducts in yield and crop quality.