La soya (Glycine max [L.] Merrill) es la oleaginosa de mayor importancia a nivel mundial porque de sus granos, que constituyen la principal fuente de proteína vegetal, se obtienen diversos productos esenciales en la alimentación humana y animal ^1,2. El cultivo de soya finalizó con 348 millones de toneladas en la campaña 2016-2017, constituyendo un récord histórico a nivel mundial ³. Debido a su relevancia, este cultivo se ha utilizado como modelo en investigaciones dirigidas al estudio de las respuestas de plantas hacia la aplicación de inductores biológicos. Entre estos, el quitosano y sus derivados son reconocidos bioestimulantes no microbianos ^_4,5) muy utilizados en la agricultura porque mejoran la germinación, el crecimiento y los rendimientos de los cultivos en condiciones normales y bajo estreses abióticos, además de emplearse en el recubrimiento de semillas y conservación de frutas y verduras ^5-7. El quitosano es un copolímero de N-acetil-D-glucosamina y D-glucosamina, que se obtiene de la quitina presente en el exoesqueleto de los crustáceos, cuando se eliminan más del 80 % de los grupos acetilos de los residuos de N-acetil-D-glucosamina presentes en su precursor ⁶. Su papel biológico en plantas depende de sus principales características físico-químicas (masa molecular, grado de acetilación y concentración), además de la forma y momento de aplicación ^6,8. La aplicación de quitosano a semillas es una de las formas más importantes en la estimulación de la germinación, el crecimiento y los rendimientos de algunos cultivos, el control de enfermedades o la activación de defensas innatas de las plantas contra patógenos, ya sea por imbibición, recubrimiento o cebado de las semillas ^6,9-11. En leguminosas se han realizado estos estudios y la respuesta en la germinación y el crecimiento de las plantas ha dependido de la concentración de quitosano ^12-14. En soya, sin embargo, no se conoce la influencia de la masa molecular del quitosano cuando se aplica por imbibición de las semillas en el proceso germinativo y el crecimiento temprano de las plantas, por lo que el objetivo del presente trabajo fue comparar el efecto de dos polímeros de quitosano, de mediana y baja masa molecular, en la germinación y el crecimiento vegetativo (V1) in vitro, mediante imbibición de semillas del cultivar IS-27 de soya.

Semillas del cultivar IS-27 de soya fueron desinfectadas con alcohol (75 %) e hipoclorito de sodio (25 %) por cinco minutos y se enjuagaron seis veces con agua destilada estéril antes de ser embebidas durante una hora en soluciones estériles de quitosano (100 mL) y agua destilada, como tratamiento control. Las concentraciones de quitosano probadas fueron de 10, 100 y 500 mg L^-1 de los polímeros con masas moleculares de 124 kDa (Q₁) y 25,3 kDa (Q₂) con 85 % de desacetilación promedio. Luego, las semillas fueron colocadas en placas Petri con medio vegetal semisólido Phytoagar-agua (0,8 %) e incubadas en la oscuridad a 29 ^oC, durante 72 horas para su germinación. Transcurrido este tiempo, se determinó el porcentaje de germinación de las semillas (5 réplicas de 15 semillas en cada placa) y la longitud de la radícula (3 réplicas de 10 semillas cada una), antes de ser transferidas a recipientes (0,41 kg), que contenían 20 mL de solución nutritiva Hougland estéril, a razón de cuatro recipientes con 10 plantas cada uno, por tratamiento. Los recipientes fueron colocados en un cuarto de luces: fotoperiodo de 12 horas, temperatura de 25-30 ^oC y humedad de 60 % durante diez días (fase R1) para realizar las evaluaciones morfoagronómicas de desarrollo vegetativo de las plántulas. Las evaluaciones realizadas fueron: número de hojas trifoliadas (primer par), longitud del tallo y radical (cm), masa seca (MS) de la parte aérea (PA) y de las raíces (g) a 70 ^oC durante 72horas, y el área foliar (AF, cm²) con el medidor portátil AM 300, UK, a cada plántula. Además, se calculó la relación raíz-vástago (r/v)= MS raíz/MS vástago y el índice de área foliar (IAF)= AF/MS total de la planta (cm² g^-1).

En el experimento repetido dos veces, se utilizó un análisis bifactorial 3 x 2, entre los factores: concentración y compuesto de quitosano, con tres y dos niveles, respectivamente, comparado con un testigo de referencia (control de imbibición en agua). La comparación de medias se realizó con el empleo de la Prueba de Rangos Múltiples de Tukey HSD (p< 0,05) para discriminar diferencias entre las medias, en el paquete de programas Statgraphics Plus, versión 5.1.

En el proceso de germinación de semillas de soya y la longitud de la radícula no hubo interacción de los factores: concentración (10, 100 y 500 mg L^-1) y masa molecular de los quitosanos (124 kDa (Q₁), 25,3 kDa (Q₂), ni diferencias significativas entre los niveles de cada factor por separados (Datos no mostrados).

El porcentaje de germinación que se determinó a las 72 horas de embebidas las semillas con ambos polímeros, mostró valores superiores (82 y 87 %) y diferentes respecto a las embebidas en agua (76,2 %). Los valores de longitud de la radícula alcanzados con todos los tratamientos, oscilaron entre 5,3 cm y 5,7 cm de largo.

En la respuesta morfoagronómica de las plántulas de soya, a pesar de haber interacción entre los factores estudiados en todas las variables de crecimiento evaluadas, se observó una mayor influencia de la concentración que de la masa molecular de los polímeros de quitosano (Tabla 1).

El número de hojas trifoliadas fue estimulado con 10 mg L^-1 del quitosano de mayor masa (Q₁) y las concentraciones 100 y 500 mg L^-1 del quitosano de menor masa molar (Q₂), pero solo con la concentración mayor de Q₂ se obtuvieron valores superiores y diferentes de las plántulas que fueron embebidas en agua (Tabla 1).

El quitosano de mayor masa (Q₁) a la concentración de 500 mg L^-1 se destacó en la longitud del tallo, pero sin diferencias con el quitosano de menor masa (Q₂) a las concentraciones mayores, mientras que este último quitosano, a la concentración de 100 mg L^-1, fue quién incrementó la longitud radical, con diferencias significativas de 10 y 100 mg L^-1 del quitosano Q₁ (Tabla 1).

A pesar de estimularse la masa seca de la parte aérea con la concentración de 10 mg L^-1 de Q₁ y 500 mg L^-1 de Q₂, que tan solo se diferenciaron de la concentración de 100 mg L^-1 del quitosano de mayor masa; estos no superaron a las plantas controles (semillas embebidas en agua).Contrariamente, la masa seca radical se incrementó por efecto de la imbibición de las semillas con los quitosanos, específicamente, con el quitosano Q₂ a las concentraciones de 100 y 500 mg L^-1además de esta última concentración de Q₁ (Tabla 1).

En cuanto al área foliar sólo la concentración de 500 mg L^-1 del quitosano de mayor masa estimuló esta variable, respecto a las plántulas controles (Tabla 1).

De forma general, la respuesta morfoagronómica de soya a la imbibición de semillas dependió de la concentración de los polímeros, obteniéndose los mayores incrementos con 500 mg L^-1, que en algunas variables no difirió de 100 mg L^-1 con ambos quitosanos.

El crecimiento de soya puede cuantificarse por la masa seca y el área foliar total de la planta, siendo esta última variable, la más relevante para cuantificar la producción por unidad de superficie ¹⁵. Por esta razón, en este trabajo, se determinaron las proporciones obtenidas con la ganancia de biomasa seca y el índice de área foliar (IAF) de las plántulas, causadas por la interacción entre las concentraciones y los compuestos de quitosano (Figuras 1 y 2).

En la Figura 1 se observa un incremento en la proporción de la biomasa de las plántulas (raíces y vástago) por efecto de la aplicación de ambos polímeros de quitosano, que duplica el valor obtenido en las plantas controles provenientes de semillas embebidas en agua. Las concentraciones de 500 mg L^-1 del polímero de mayor masa molecular (Q₁) y 100 mg L^-1 de Q₂, fueron más efectivas para aumentar la relación (r/v) respecto al efecto causado por las concentraciones de 10 y 100 mg L^-1 de Q₁.

El índice de área foliar (IAF) de soya se incrementó con el quitosano de mayor masa molecular (Q₁), con incrementos de diez porciento más con la concentración de 500 mg L^-1al aplicarse por imbibición de semillas (Figura 2).

Resultados de investigaciones con quitosano como estimulador del crecimiento de varias especies de plantas y condiciones de cultivo, refieren la influencia de la masa molecular y la concentración de quitosano en el desarrollo de las plantas ^6,8,9,16. El efecto de la masa molecular y la forma de aplicación del quitosano ha sido demostrado en la estimulación del crecimiento de arroz (Oryza sativa L.) y del rendimiento de flores y cormos de fresa (Fragaria sp.)^17,18. En soya, la respuesta en la nodulación y el crecimiento de las plantas ha sido afectada por la influencia de la concentración, la masa molecular y el modo de aplicación de los compuestos de quitosano ^17,19,20.

Aunque en leguminosas se han encontrado efectos beneficiosos en su desarrollo con la aplicación de quitosano por diferentes métodos de tratamiento a las semillas ^12,21,22, no se conoce cómo influye las diferencias de masa molecular de quitosanos en la germinación de soya por imbibición de las semillas. En este sentido, al comparar los quitosanos de diferentes masas moleculares por imbibición de semillas se encontraron diferencias ligeras entre los polímeros de mediana (Q₁) y baja (Q₂) masa molecular, y estas diferencias se debieron más bien a la concentración de quitosano, en el desarrollo vegetativo inicial in vitro de soya (Tabla 1, Figuras 1 y 2). El porcentaje de germinación se estimuló con la aplicación de ambos polímeros respecto a las semillas embebidas en agua, mientras que el largo de la radícula de las semillas germinadas no fue modificado ni por la masa molecular ni por las concentraciones de quitosano evaluadas (Datos no mostrados).

En todas las variables de crecimiento del cultivar IS-27 de soya hubo un efecto estimulador de la concentración de 500 mg L^-1, excepto en la emisión de hojas con el polímero de mayor masa molecular (Q₁), además de incrementarse el índice de área foliar con Q₁ (Tabla 1, Figura 1). Zeng & colaboradores ^₁₂₎ propusieron que el efecto estimulador del tratamiento de semillas con quitosano en la germinación, el crecimiento, los rendimientos y la protección de soya contra insectos, es causado por la formación de una película semipermeable en la superficie de la semilla, que mantiene la humedad de la misma y absorbe la humedad del suelo, promoviendo así la germinación. Además, evita la entrada de oxígeno y restringe la pérdida de dióxido de carbono (CO₂) en la semilla, manteniendo una concentración alta de CO₂ en la película que impide la respiración y disminuye el consumo de nutrientes en el interior de la semilla. Por otro lado, el quitosano puede aumentar los azúcares solubles y reforzar la actividad proteolítica que genera la liberación de aminoácidos libres que tienen efecto inhibitorio en muchos hongos patógenos de plantas.

En leguminosas, como en otros cultivos, la relación r/v se ha determinado para conocer la influencia de múltiples factores como genotipos, estadios de crecimiento, sistema de labranza, déficit hídrico en el suelo, entre otros ^23-25. En la fase R1 del crecimiento de las plántulas, la relación de la biomasa raíz-vástago mostró diferencias a favor de la aplicación de quitosano, con el doble de incremento que las plantas controles (Figura 1). Se observó un aumento del desarrollo radicular en longitud y masa seca que pudo favorecer la absorción y translocación de nutrimentos desde la raíz hacia la parte área de la planta (Tabla 1). Varios trabajos refieren el efecto estimulante del quitosano en el crecimiento de los cultivos como resultado de incrementar la disponibilidad y la absorción de nutrientes y el proceso de fotosíntesis mediante la acumulación de metabolitos y el aumento de pigmentos foliares ^6,11,26,27. En particular, el tratamiento de semillas con quitosano mejora la asimilación del nitrógeno en plantas de IS-27 de soya debido a un aumento de la actividad enzimática nitrato reductasa ya la acumulación de nitrógeno foliar ²² y resultados no publicados.

El índice de área foliar (IAF) se puede relacionar con los procesos de fotosíntesis, respiración, y productividad de los cultivos ¹⁵. En soya, el área foliar delas plantas difiere para distintos genotipos y momentos de siembras ²⁸. En el trabajo, el área foliar de las plántulas fue incrementada con la concentración de 500 mg L^-1del polímero de mayor masa molecular (Q₁), así como el IAF, con las tres concentraciones evaluadas (10,100 y 500 mg L^-1) (Tabla 1, Figura 2). Esta estimulación en el área foliar de soya ha sido informado con anterioridad, al aplicarse a las semillas conjuntamente con el inoculante Azofert^®, previo a la siembra y, por aspersión foliar en las fases V2 y R2 en campo, con la concentración de 1 g L^-1 del polímero de mediana masa molecular empleado en este trabajo, con incrementos de 62,85 % respecto a las plantas controles ²². Este efecto, también ha influenciado la actividad fotosintética (área foliar y pigmentos) de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.), con la aplicación de nanopartículas de quitosano de bajo masa molecular (27 kDa) combinadas con ácido giberélico ²⁹.

Tomando en cuenta lo anterior y los resultados de este trabajo se puede concluir que polímeros de mediana y baja masa molecular causan ligeras diferencias biológicas en los estadios iniciales de las plántulas cultivadas en solución Hougland

Soy (Glycine max [L.] Merrill) is the most important oilseed in the world because of its grains, which constitute the main source of vegetable protein; various essential products are obtained in human and animal feed ^1,2. Soy cultivation ended with 348 million tons in the 2016-2017 campaign, constituting a world-wide historical record ³. Due to its relevance, this crop has been used as a model in research aimed at the study of plant responses to the application of biological inducers. Among these, chitosan and its derivatives are recognized non-microbial biostimulants ^4,5 widely used in agriculture because they improve germination, growth and crop yields under normal conditions and under abiotic stresses, in addition to being used in the coating of seeds and preservation of fruits and vegetables ^5-7. Chitosan is a copolymer of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine, which is obtained from the chitin present in the exoskeleton of crustaceans, when more than 80 % of the acetyl groups are, removed from the N-acetyl residues -D-glucosamine present in its precursor ⁶. Its biological role in plants depends on its main physical-chemical characteristics (molecular mass, degree of acetylation and concentration), in addition to the form and timing of application ^6,8. The application of chitosan to seeds is one of the most important ways in the stimulation of germination, growth and yields of some crops, disease control or activation of innate plant defenses against pathogens, whether by imbibition, coating or priming of the seeds ^6,9-11. These studies have been carried out in legumes and the response in germination and plant growth has depended on the concentration of chitosan ^12-14. In soybeans, however, the influence of the chitosan molecular mass is not known when applied by imbibition of the seeds in the germination process and the early growth of the plants, so the objective of the present work was to compare the effect of two polymers of chitosan, of medium and low molecular mass, in germination and vegetative growth (V1) in vitro, by imbibition of seeds from the soybean cultivar IS-27.

Seeds from the IS-27 cultivar of soybeans were disinfected with alcohol (75 %) and sodium hypochlorite (25 %) for five minutes and rinsed six times with sterile distilled water before being immersed for one hour in sterile chitosan solutions (100 mL) and distilled water, as a control treatment. The chitosan concentrations tested were 10, 100 and 500 mg L^-1 of polymers with molecular masses of 124 kDa (Q₁) and 25.3 kDa (Q₂) with 85 % average deacetylation. Then, the seeds were placed in Petri dishes with Phytoagar-water semi-solid vegetable medium (0.8 %) and incubated in the dark at 29 ^oC for 72 hours for germination. After this time, the percentage of germination of the seeds (5 replicates of 15 seeds in each plate) and the length of the radicle (3 replicates of 10 seeds each) were determined, before being transferred to containers (0.41 kg ), containing 20 mL of sterile Hougland nutrient solution, at the rate of four containers with 10 plants each, per treatment. The containers were placed in a light room: 12-hour photoperiod, temperature of 25-30 ^oC and humidity of 60 % for ten days (phase R1) to perform morphoagronomic evaluations of vegetative development of seedlings. The evaluations were: number of trifoliate leaves (first pair), stem and radical length (cm), dry mass (MS) of the aerial part (PA) and roots (g) at 70 ^oC for 72 hours, and the leaf area (AF, cm²) with the portable meter AM 300, UK, to each seedling. In addition, the root-stem ratio (r/v) = root MS/stem DM was calculated and the leaf area index (IAF) = total plant AF/MS (cm² g^-1).

In the experiment repeated twice, a 3 x 2 bifactorial analysis was used, between the factors: concentration and chitosan compound, with three and two levels, respectively, compared with a reference control (imbibition control in water). The comparison of means was made with the use of the Tukey HSD Multiple Range Test (p <0.05) to discriminate differences between the means, in the Statgraphics Plus program package, version 5.1.

In the process of germination of soybeans and the length of the radicle there was no interaction of the factors: concentration (10, 100 and 500 mg L^-1) and molecular mass of chitosans (124 kDa (Q₁), 25.3 kDa (Q₂), nor significant differences between the levels of each factor separately (Data not shown).

The percentage of germination that was determined after 72 hours of embedding the seeds with both polymers, showed higher values (82 and 87 %) and different values compared to those embedded in water (76.2 %). The radicle length values achieved with all treatments ranged between 5.3 and 5.7 cm long.

In the morphoagronomic response of soybean seedlings, despite having interaction between the factors studied in all the growth variables evaluated, a greater influence of the concentration than of the molecular mass of the chitosan polymers was observed (Table 1).

The number of trifoliate leaves was stimulated with 10 mg L^-1 of the highest mass chitosan (Q₁) and the 100 and 500 mg L^-1 concentrations of the lowest molar mass chitosan (Q₂), but only with the highest concentration of Q₂ they obtained higher and different values of the seedlings that were embedded in water (Table 1).

The chitosan of greater mass (Q₁) at the concentration of 500 mg L^-1 stood out in the stem length, but without differences with the chitosan of smaller mass (Q₂) at the higher concentrations, while the latter chitosan, at the concentration of 100 mg L^-1, it was who increased the radical length, with significant differences of 10 and 100 mg L^-1 of chitosan Q₁ (Table 1).

Despite the dry mass of the aerial part being stimulated with the concentration of 10 mg L^-1 of Q₁ and 500 mg L^-1 of Q₂, they only differed from the concentration of 100 mg L^-1 of the larger mass chitosan; these did not surpass the control plants (seeds embedded in water). On the contrary, the radical dry mass increased due to the imbibition of the seeds with the chitosans, specifically with the chitosan Q₂ at the concentrations of 100 and 500 mg L^-1 in addition to the latter concentration of Q₁ (Table 1).

As for the leaf area, only the concentration of 500 mg L^-1 of the largest mass chitosan stimulated this variable, with respect to the control seedlings (Table 1).

In general, the morphoagronomic response of soybeans to seed imbibition depended on the concentration of the polymers, obtaining the greatest increases with 500 mg L^-1, which in some variables did not differ from 100 mg L^-1 with both chitosans.

Soybean growth can be quantified by dry mass and leaf area

Total of the plant, the latter being the most relevant variable to quantify the production per unit area ¹⁵. For this reason, in this work, the proportions obtained with the dry biomass gain and the leaf area index (IAF) of the seedlings, caused by the interaction between concentrations and chitosan compounds (Figures 1 and 2) were determined.

Figure 1 shows an increase in the proportion of the biomass of the seedlings (roots and stem) due to the application of both chitosan polymers, which doubles the value obtained in control plants from seeds embedded in water. The concentrations of 500 mg L^-1 of the polymer of greater molecular mass (Q₁) and 100 mg L^-1 of Q₂ were more effective in increasing the ratio (r/v) with respect to the effect caused by the concentrations of 10 and 100 mg L^-1 of Q1.

The leaf area index (IAF) of soybeans increased with the highest molecular mass chitosan (Q₁), with increments of ten percent more with the concentration of 500 mg L^-1 when applied by seed imbibition (Figure 2).

Results of investigations with chitosan as a stimulator of the growth of several plant species and culture conditions, refer to the influence of molecular mass and the concentration of chitosan in the development of plants ^6,8,9,16. The effect of molecular mass and the form of application of chitosan has been demonstrated in the stimulation of rice growth (Oryza sativa L.) and the yield of flowers and strawberry corms (Fragaria sp.) ^17,18. In soy, the response in nodulation and plant growth has been affected by the influence of concentration, molecular mass and the mode of application of chitosan compounds ^17,19,20.

Although beneficial effects on its development have been found in legumes with the application of chitosan by different methods of treatment to seeds ^12,21,22, it is not known how the molecular mass differences of chitosans influence soy germination by imbibition of the seeds. In this sense, when comparing the chitosans of different molecular masses by imbibition of seeds, slight differences were found between the polymers of medium (Q₁) and low (Q₂) molecular mass, and these differences were due rather to the concentration of chitosan, in the initial in vitro vegetative development of soy (Table 1, Figures 1 and 2). The germination percentage was stimulated with the application of both polymers with respect to the seeds embedded in water, while the length of the radicle of the germinated seeds was not modified neither by the molecular mass nor by the chitosan concentrations evaluated (Data not shown).

In all the variables of growth of the cultivar IS-27 of soybean there was a stimulating effect of the concentration of 500 mg L^-1, except in the emission of leaves with the polymer of greater molecular mass (Q₁), in addition to increasing the index of leaf area with Q₁ (Table 1, Figure 1). Zeng & collaborators ¹² proposed that the stimulating effect of seed treatment with chitosan on germination, growth, yields and protection of soybeans against insects is caused by the formation of a semipermeable film on the surface of the seed, it maintains the humidity of the same and absorbs moisture from the soil, thus promoting germination. In addition, it prevents the entry of oxygen and restricts the loss of carbon dioxide (CO₂) in the seed, maintaining a high concentration of CO₂ in the film that prevents breathing and decreases the consumption of nutrients inside the seed. On the other hand, chitosan can increase soluble sugars and reinforce the proteolytic activity that generates the release of free amino acids that have an inhibitory effect on many plant pathogenic fungi.

In legumes, as in other crops, the r/v ratio has been determined to know the influence of multiple factors such as genotypes, growth stages, tillage system, and water deficit in the soil, among others ^23-25. In the R1 phase of seedling growth, the root-stem biomass ratio showed differences in favor of the application of chitosan, with twice the increase of the control plants (Figure 1). An increase in root development in length and dry mass was observed that could favor the absorption and translocation of nutrients from the root to the area part of the plant (Table 1). Several works refer to the stimulating effect of chitosan on the growth of crops as a result of increasing the availability and absorption of nutrients and the process of photosynthesis through the accumulation of metabolites and the increase of foliar pigments ^6,11,26,27 . In particular, the treatment of seeds with chitosan improves the assimilation of nitrogen in soybean IS-27 plants due to an increase in the nitrate reductase enzyme activity and the accumulation of foliar nitrogen ²² and unpublished results.

The leaf area index (IAF) can be related to the processes of photosynthesis, respiration, and crop productivity ¹⁵. In soybeans, the leaf area of the plants differs for different genotypes and planting moments ²⁸. At work, the leaf area of the seedlings was increased with the concentration of 500 mg L^-1 of the polymer with the highest molecular mass (Q₁), as well as the IAF, with the three concentrations evaluated (10, 100 and 500 mg L^-1) (Table 1, Figure 2). This stimulation in the foliar area of soybeans has been previously informed, when applied to the seeds together with the Azofert^® inoculant, prior to sowing and, by foliar spray in the V2 and R2 phases in the field, with the concentration of 1 g L^-1 of the polymer of medium molecular mass used in this work, with increases of 62.85 % with respect to the control plants ²². This effect has also influenced the photosynthetic activity (leaf area and pigments) of bean plants (Phaseolus vulgaris L.), with the application of chitosan nanoparticles of low molecular mass (27 kDa) combined with gibberellic acid ²⁹.

Taking into account the above and the results of this work it can be concluded that polymers of medium and low molecular mass cause slight biological differences in the initial stages of seedlings grown in Hougland solution