Los pastos y forrajes constituyen las fuentes más baratas de alimentos para el ganado bovino, de modo que la obtención de altos volúmenes de biomasa con suficiente calidad para satisfacer los requerimientos nutricionales de los animales continúa siendo una necesidad de primer orden para el sector ganadero.

La fertilización de los pastos y cultivos forrajeros contribuye a incrementar la oferta de biomasa por unidad de superficie y tiempo y, consecuentemente, la producción animal. Por esta vía, no sólo se restituyen los nutrientes que se extraen del suelo a través del alimento que consume el ganado, sino también se mejora su valor nutritivo y persistencia ^1,2.

Los estudios sobre la fertilización de los pastos, hasta hace pocos años se enfocaban, principalmente, en el incremento de la producción de biomasa por unidad de superficie; sin embargo, el aumento creciente de los precios de los fertilizantes, unido a la necesidad de disponer de tecnologías amigables con el medio ambiente, impone el diseño de estrategias de fertilización que garanticen una nutrición adecuada de estos cultivos, disminuyan el uso de insumos externos y, a la vez, aseguren la protección de los recursos naturales ^3,4.

Dentro de tales estrategias se incluye la biofertilización, por sus potencialidades para incrementar los rendimientos de los cultivos agrícolas, mejorar las propiedades biológicas de los suelos y reducir el uso de fertilizantes minerales ^5,6; por ello, la obtención y empleo de biofertilizantes para aumentar la eficiencia del uso de los nutrientes y promover el crecimiento de los plantas sigue siendo objeto de estudio.

El cultivo de especies forrajeras del género Brachiaria, específicamente B. híbrido cv. Mulato II, se ha ido extendiendo en las zonas tropicales, debido a su alto potencial de producción de biomasa y valor nutritivo para la alimentación del ganado; sin embargo, sus requerimientos de fertilizantes para alcanzar altos rendimientos suelen ser elevados ⁷.

Se ha demostrado que el uso de bacterias asociativas del género Azospirillum contribuye a mejorar el rendimiento de las poáceas forrajeras, no sólo por su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico y su contribución a la reducción de las necesidades de un suministro de este nutriente vía fertilización, sino también por otros beneficios como la producción de fitohormonas, la solubilización de fosfatos, el biocontrol de patógenos y la protección de las plantas contra estreses abióticos ^8-10.

Por otra parte, los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) son componentes integrales de la rizosfera de los pastos, cuyas plantas permanecen estrechamente asociadas mediante una red de hifas interconectadas que incrementan el volumen de suelo que exploran las raíces y facilitan la absorción de los nutrientes y el agua ^11,12, además de otros servicios, como el incremento de su tolerancia al estrés hídrico, la protección contra patógenos y el restablecimiento de los tejidos fotosintéticos después de la defoliación ¹³. De hecho, el manejo de la biofertilización con estos microorganismos edáficos, también ha arrojado resultados positivos en el aumento de los rendimientos y la mejora en la absorción de nutrientes de los pastos ^14,15.

Sin embargo, los estudios sobre el manejo conjunto de la biofertilización a base de bacterias asociativas y HMA en pastos y cultivos forrajeros no abundan, a pesar de las posibles ventajas de la introducción de ambos microorganismos en los esquemas de suministro de nutrientes de estos cultivos ^16,17.

Basado en tales premisas se realizó el presente trabajo, con el objetivo de evaluar la respuesta de Brachiaria híbrido cv. 36087 (Mulato II) a la aplicación simple y combinada de biofertilizantes a base de la rizobacteria Azospirillum brasilense y la especie de HMA Rhizoglomus irregulare.

Se realizó un experimento en la Vaquería Típica 23 de la Unidad Básica de Producción Cooperativa “Juan Oramas”, ubicada en el municipio de Guanabacoa, provincia de La Habana, a los 23^o08’ de latitud norte y a los 82º11’ de longitud oeste, sobre un suelo Pardo Mullido Carbonatado ¹⁸, cuyas principales características químicas se presentan en la Tabla 1.

El suelo poseía pH alcalino, contenidos medio y alto de materia orgánica (MO) y fósforo asimilable, respectivamente, así como alta capacidad de intercambio de bases (CIB), destacándose dentro de estas, los altos valores de Ca y K intercambiables ¹⁹.

El comportamiento de las precipitaciones y temperatura durante el período en que se condujo el experimento se muestran en la Figura 1.

Durante el tiempo en que se condujo el experimento (mayo 2015-abril 2016), la precipitación total fue de 1187 mm, de la cual el 75 % ocurrió durante el período lluvioso (mayo y octubre de 2015) y el resto, entre noviembre de 2015 y abril de 2016 ²⁰.

Se evaluaron cuatro tratamientos, conformados por un testigo sin biofertilización, más las aplicaciones solas y combinadas de biofertilizantes a base de la rizobacteria A. brasilense y la especie de HMA R. irregulare, en un diseño cuadrado latino. Las parcelas constituyeron la unidad experimental y tenían una superficie total de 21 m² y un área de cálculo de 14 m².

El suelo se preparó mediante labores de roturación (arado), grada, cruce (arado) y grada, a intervalos aproximados de 25 días entre cada una. La siembra del pasto se realizó en mayo de 2015, en surcos separados a 50 cm y a chorrillo, con una dosis de 10 kg de semilla total ha^-1 (1 kg de semilla pura germinable ha^-1) y a una profundidad de 1.5 cm. Previo a la siembra, se tomaron con una barrena 10 muestras de suelo por el método del zigzag, a una profundidad de 0-20 cm, a las cuales se les determinó el pH en H₂O (potenciometría, relación suelo-agua 1:2.5), y los contenidos de materia orgánica (Walkley y Black), P asimilable (extracción con H₂SO₄ 0.05 mol L^-1 y determinación colorimétrica), cationes intercambiables [extracción con NH₄Ac 1 mol L^-1 pH 7 y determinación por complejometría (Ca y Mg) y fotometría de llama (Na y K)] y la CIB (suma de bases intercambiables), según las técnicas analíticas establecidas en el laboratorio de suelo y plantas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) ²¹.

Para la biofertilización con A. brasilense se utilizó el producto comercial Nitrofix^®, procedente del Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA), que contenía la cepa 8I, con una concentración de 10⁹ UFC L^-1. Se preparó una solución compuesta por una mezcla de biofertilizante y agua en una relación 1:10, en la cual se sumergieron las semillas durante 15 minutos; posteriormente se extrajeron y secaron a la sombra y se procedió a la siembra. A los 30 días después de la siembra, se preparó una mezcla del biofertilizante y agua en la proporción ya descrita y mediante una mochila manual se aplicó al suelo, muy próximo a los surcos, a razón de 20 L ha^-1 de Nitrofix^®.

Para la aplicación del biofertilizante micorrízico se utilizó la cepa INCAM-11 de la especie de HMA Rhizoglomus irregulare²² procedente de la colección del INCA. El inóculo se multiplicó en un sustrato arcilloso esterilizado en autoclave a 120 °C por una hora durante tres días, con el uso de Brachiaria decumbens cv. Basilisk como planta hospedera y contenía 30 esporas por gramo de sustrato, así como abundantes fragmentos de raicillas e hifas del hongo.

La inoculación se realizó por el método del recubrimiento de las semillas, para lo cual estas se sumergieron en una pasta fluida, elaborada mediante la mezcla de una cantidad de inóculo sólido equivalente al 10 % del peso de las mismas y agua, en una proporción de 60 mL de agua por cada 100 g de inóculo. Las semillas después de secadas a la sombra se sembraron. En el tratamiento donde se aplicaron conjuntamente ambos biofertilizantes, se adicionó el producto que contenía A. brasilense al agua utilizada para la preparación del inoculante micorrízico para la siembra, manteniendo la misma relación inóculo-agua. En el experimento no se aplicaron fertilizantes.

Se realizaron cuatro cortes a una altura de 10 cm de la superficie del suelo, los dos primeros a los 90 y 150 días después de la siembra, ambos en la época lluviosa y los otros a intervalos de 90 días, coincidiendo con el período menos lluvioso. En cada corte se pesó la masa fresca de la parte aérea del pasto que ocupaba el área de cálculo de las parcelas y se tomaron muestras de 200 g, las cuales se llevaron a una estufa de circulación de aire a 70 ºC durante 72 horas, para determinar el porcentaje de masa seca, estimar el rendimiento de masa seca y las concentraciones de N, P, K en la biomasa ²¹.

En el momento de cada corte, en cinco puntos del área de cálculo de cada parcela se midió la altura del dosel mediante una regla graduada y se consideró el punto de lectura, aquel donde la mayoría de las hojas perdían su posición vertical. En el segundo y cuarto corte, enmarcados en el período lluvioso y poco lluvioso, respectivamente, de cada parcela se tomaron tres sub-muestras de raíces y de suelo de la rizosfera a una profundidad de 0‒20 cm, mediante el empleo de un cilindro metálico de 5 cm de diámetro y 20 cm de altura. Los puntos de muestreo se distribuyeron equidistantes y separados a 10 cm de los surcos.

Las submuestras fueron homogenizadas para formar una muestra compuesta por parcela, de la cual se extrajo 1 g de raicillas para su tinción y clarificación ²³. Se evaluaron la frecuencia de colonización micorrízica, mediante el método de los interceptos ²⁴, la densidad visual o intensidad de la colonización ²⁵ y el número de esporas en la rizosfera, a partir del tamizado y decantado por vía húmeda de dichas estructuras y su observación en microscopio ²⁶.

La densidad de raíces se determinó momentos antes del segundo corte; para ello, en tres puntos equidistantes ubicados en el área de cálculo de cada parcela y a 10 cm del surco, se realizó un corte vertical del suelo hasta la profundidad 25 cm y se introdujo un cilindro metálico de 5 cm de diámetro y 20 cm de longitud. El suelo contenido en cada cilindro se depositó en un recipiente de vidrio, se agregó agua corriente y se agitó manualmente hasta deshacer los agregados gruesos y, seguidamente, se pasó por un tamiz de 0.5 mm. Las raíces recolectadas en el tamiz fueron lavadas nuevamente para eliminar los restos de suelo, secadas al aire e introducidas en una estufa a 70 ºC hasta obtener una masa constante.

El procesamiento estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de varianza y la prueba de rangos múltiples de Duncan ²⁷ a p<0,05. En las variables correspondientes a la caracterización química del suelo, así como en aquellas cuyos resultados se muestran en gráficos, se utilizó el intervalo de confianza de las medias (α=0,05) como estadígrafo de dispersión o como criterio para su comparación ²⁸. En todos los casos se utilizó el programa estadístico SPSS 25 ²⁹.

En la Figura 2 se presenta la influencia de los tratamientos en las variables fúngicas. Tanto en el período lluvioso como en el poco lluvioso, con la inoculación de R. irregulare se encontró un aumento significativo de la frecuencia e intensidad de la colonización micorrízica (densidad visual), así como del número de esporas en la rizosfera; sin embargo, los mayores efectos se observaron con la coinoculación de A. brasilense y R. irregulare, lo que puede atribuirse a un efecto positivo de las sustancias estimuladoras del crecimiento producidas por A. brasilense en el incremento de la longitud y ramificación de las raíces y en consecuencia, en el aumento de los sitios de colonización, así como al propio estímulo de estas sustancias en la formación y multiplicación de las estucturas micorrízicas ^16,30.

Los valores de las variables fúngicas fueron mayores en el período lluvioso que en el poco lluvioso debido, probablemente, a la estacionalidad de la producción de biomasa del pasto. Durante la época de lluvias ocurre un rápido crecimiento de los pastos en virtud de los mayores niveles de precipitaciones y temperatura, tal como se muestra en la Figura 1 y ambos factores, unido al aumento de la luminosidad ^31,32, conducen a la absorción de una mayor cantidad de nutrientes para la formación de biomasa y consecuentemente, a la formación de mayores cantidades de estructuras micorrízicas para garantizar el acceso de las plantas a los recursos del suelo ^33,34.

La Tabla 2 muestra el efecto de la biofertilización sobre las concentraciones de macronutrientes (N, P y K) en la biomasa aérea del pasto. Tanto en el período lluvioso como en el poco lluvioso, la aplicación por separado de ambos biofertilizantes incrementó las concentraciones de N, en relación con el tratamiento no inoculado (testigo), aunque entre ambos tratamientos, los valores más altos correspondieron a A. brasilense, pero los mayores efectos se encontraron con la aplicación conjunta de los biofertilizantes.

Al evaluar la participación de los biofertilizantes en el aumento de las concentraciones de nitrógeno en la biomasa (Figura 3) se observó un resultado similar; es decir, la aplicación sola de uno u otro biofertilizante mejoró la nutrición del pasto con este nutriente durante ambos períodos, aunque los mayores valores correspondieron al tratamiento con A. brasilense. Sin embargo, la mayor participación se alcanzó con la aplicación conjunta de ambos biofertilizantes.

Las poáceas forrajeras requieren cantidades importantes de N para mejorar su rendimiento y valor nutritivo ^7,35 y a juzgar por el contenido de materia orgánica, las concentraciones de N del suelo donde se ejecutó el experimento no fueron suficientes para satisfacer la demanda del cultivo; además, en el experimento no se aplicó fertilizante nitrogenado. Por otra parte, se ha demostrado que los HMA participan activamente en la transferencia de N del suelo a la planta hospedera ³⁶. A partir de estas premisas, se podía esperar un efecto positivo de la inoculación con R. irregulare en la absorción de N, en el incremento en las concentraciones de este elemento en la biomasa aérea, como se observó en la Figura 3 y, en consecuencia, una mejora de la nutrición nitrogenada del pasto.

Con respecto a la inoculación con A. brasilense, se conoce que este microorganismo puede fijar cantidades importantes de N en especies de pastos del género Brachiaria^8,37, de modo que ello pudiera explicar su mayor efecto en el aumento de las concentraciones de N en la biomasa y su mayor contribución a la nutrición nitrogenada, en relación con R. irregulare. Sin embargo, el hecho de que ambas variables hayan alcanzado los mayores valores con el tratamiento donde se aplicaron los microorganismos de manera conjunta, refleja un efecto complementario de los mismos en la mejora de la nutrición nitrogenada del pasto.

Los tratamientos no tuvieron efectos en las concentraciones de P y K en la biomasa aérea, lo que estuvo en correspondencia con los altos contenidos de ambos elementos en el suelo (Tabla 1); de hecho, este fue un criterio para decidir la no aplicación de fertilizante fosfórico ni potásico en el experimento.

En la Tabla 3 se presenta el efecto de los tratamientos sobre algunos indicadores del crecimiento y el rendimiento de MS masa seca de la parte aérea del pasto. Al igual que en las variables analizadas anteriormente, se encontró un efecto significativo de la biofertilización sobre la altura del dosel y el rendimiento de MS, tanto en la época de lluvias como en la época menos lluviosa, así como sobre la densidad de raíces del pasto. Al comparar los resultados obtenidos con la aplicación de estos microorganismos por separado, la inoculación con A. brasilense mostró valores mayores que los alcanzados con R. irregulare en estas variables, aunque los mayores efectos se obtuvieron con la aplicación conjunta de ambos biofertilizantes.

El efecto de los tratamientos en el crecimiento y el rendimiento del pasto, parece estar relacionado con la influencia de los biofertilizantes en las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea de las plantas. Se conoce que, de todos los nutrientes minerales, este elemento es, cuantitativamente, el más importante para las poáceas forrajeras ^7,38. De este modo, la mejora de la nutrición nitrogenada provocada por la aplicación de los biofertilizantes, tal como se observó en la tabla anterior, pudo haber repercutido favorablemente en la altura del dosel y el crecimiento de las raíces y, consecuentemente, en el rendimiento del pasto.

En el caso de A. brasilense, además de su contribución a la fijación biológica de N anteriormente citada, este microorganismo también ejerce diferentes mecanismos de estímulo del crecimiento a través de la producción de fitohormonas, principalmente ácido indolacético y giberelinas, lo cual modifica el metabolismo de las plantas y conduce a una mejor captación de agua y minerales ^8,39. Ello también pudiera explicar su mayor influencia en el crecimiento del pasto, en relación con R. irregulare.

Con respecto a los HMA, varios autores han encontrado un efecto positivo en las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea de los pastos inoculados con cepas eficientes, a partir de un aumento del aprovechamiento de este elemento, dado, tanto por el aumento de la superficie radical de las plantas, como por la formación de estructuras micorrízicas que le permiten acceder a este y otros recursos del suelo ³⁶, lo cual pudiera estar influyendo en los resultados obtenidos.

Resulta de interés destacar que la adición de R. irregulare haya sido efectiva para mejorar las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea, el crecimiento y el rendimiento del pasto, a pesar de las altas concentraciones de P del suelo, pues algunos trabajos refieren que el efecto de la inoculación micorrízica puede inhibirse en presencia de altos contenidos de este elemento ⁴⁰. Sin embargo, otros han encontrado que las plantas inoculadas con cepas de HMA eficientes, pueden alcanzar un funcionamiento micorrízico efectivo, aun en suelos con altas concentraciones de P, siempre que otros nutrientes limiten su crecimiento y desarrollo ⁴¹.

Pastures and forages are the cheapest sources of food for cattle, so obtaining high volumes of biomass of sufficient quality to meet the nutritional requirements of animals continues to be a first-rate need for the livestock sector.

The fertilization of pastures and fodder crops contributes to increasing the biomass supply per unit area and time, and consequently, animal production. In this way, not only are the nutrients extracted from the soil restored through the feed consumed by livestock, but their nutritional value and persistence are also improved ^1,2.

Studies on pasture fertilization, until a few years ago, focused mainly on increasing biomass production per unit area. However, the increasing increase in fertilizer prices, together with the need for environmentally friendly technologies, imposes the design of fertilization strategies that guarantee adequate nutrition for these crops, decrease the use of external inputs, and at the same time, ensure the protection of natural resources ^3,4.

Such strategies include biofertilization, due to its potential to increase the yields of agricultural crops, improve the biological properties of the soil and reduce the use of mineral fertilizers ^5,6; therefore, the obtaining and use of biofertilizers to increase the efficiency of the use of nutrients and promote the growth of plants continues to be studied.

The cultivation of forage species of the Brachiaria genus, specifically B. hybrid cv. Mulato II, has been spreading in tropical areas due to its high potential for biomass production and nutritional value for livestock feed; however, their fertilizer requirements to achieve high yields are usually high ⁷.

The use of associative bacteria of the genus Azospirillum has been shown to contribute to improving the performance of forage Poaceae. Not only for their ability to fix atmospheric nitrogen and their contribution to reducing the need for a supply of this nutrient via fertilization, but also for other benefits such as the production of phytohormones, the solubilization of phosphates, the biocontrol of pathogens and the protection of plants against abiotic stresses ^8-10.

On the other hand, arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are integral components of the rhizosphere of grasses, whose plants remain closely associated through a network of interconnected hyphae that increase the volume of soil explored by the roots and facilitate the absorption of the nutrients and water ^11,12. In addition, to other services, such as increased tolerance to water stress, protection against pathogens, and restoration of photosynthetic tissues after defoliation ¹³. In fact, the management of biofertilization with these edaphic microorganisms has also yielded positive results in increasing yields and improving nutrient absorption from pastures ^14,15.

However, studies on the joint management of biofertilization based on associative bacteria and AMF in pastures and forage crops are not abundant, despite the possible advantages of the introduction of both microorganisms in the nutrient supply schemes of these crops ^16,17.

Based on such premises, the present work was carried out, with the objective of evaluating the response of Brachiaria hybrid cv. 36087 (Mulato II) to the simple and combined application of biofertilizers based on the rhizobacterium Azospirillum brasilense and the species of AMF Rhizoglomus irregulare.

An experiment was carried out in the Typical Vaquería 23 of the Basic Unit of Cooperative Production Juan Oramas, located in Guanabacoa municipality, Havana province, at 2º 08 'north latitude and 82º 11' west longitude, on a Brown soil Fluffy Carbonate ¹⁸, whose main chemical characteristics are presented in Table 1.

The soil had alkaline pH, medium and high contents of organic matter (OM) and assimilable phosphorus, respectively, as well as high base exchange capacity (CIB), highlighting within these, the high values of interchangeable Ca and K ¹⁹.

The behavior of rainfall and temperature during the period in which the experiment was conducted are shown in Figure 1.

During the time the experiment was conducted (May 2015-April 2016), the total precipitation was 1187 mm, of which 75 % occurred during the rainy period (May and October 2015) and the rest, between November 2015 and April 2016 ²⁰.

Four treatments were evaluated, consisting of a control without biofertilization, and the single and combined applications of biofertilizers based on the rhizobacteria A. brasilense and the species of R. irregulare AMF, in a Latin square design. The plots constituted the experimental unit, and had a total area of 21 m² and a calculation area of 14 m².

The soil was prepared by mowing (plowing), harrowing, crossing (plowing) and harrowing, at intervals of approximately 25 days between each one. The sowing of the grass was carried out in May 2015, in rows 50 cm apart and by dripping, with a dose of 10 kg of total seed ha^-1 (1 kg of pure germinable seed ha^-1) and at a depth of 1.5 cm. Before sowing, 10 soil samples were taken with an auger by the zigzag method, at a depth of 0-20 cm, to which the pH in H₂O was determined (potentiometry, soil-water ratio 1: 2.5). The contents of organic matter (Walkley and Black), assimilable P (extraction with H₂SO₄ 0.05 mol L^-1 and colorimetric determination), interchangeable cations [extraction with NH₄Ac 1 mol L^-1 pH 7 and determination by complexometry (Ca and Mg) were determined. As well as, flame photometry (Na and K)], and the CIB (sum of interchangeable bases) were determined according to the analytical techniques established in the soil and plant laboratory of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA) ²¹.

For biofertilization with A. brasilense, the commercial product Nitrofix^®, from the Cuban Institute for Research on Sugar Cane Derivatives (ICIDCA) was used, which contained the 8I strain, with a concentration of 109 CFU ml^-1. A solution composed of a mixture of biofertilizer and water in a 1:10 ratio was prepared, in which the seeds were immersed for 15 minutes. Subsequently they were extracted and dried in the shade, and planting was carried out. 30 days after sowing, a mixture of the biofertilizer and water was prepared in the proportion already described, and it was applied to the soil, very close to the furrows, using a manual backpack at a rate of 20 L ha^-1 of Nitrofix^®.

For the application of the mycorrhizal biofertilizer, the INCAM-11 strain of the AMF species Rhizoglomus irregulare²² from the INCA collection was used. The inoculum was multiplied in a clay substrate autoclaved at 120 °C for one hour for 3 days, with the use of Brachiaria decumbens cv. Basilisk as a host plant, and contained 30 spores per gram of substrate, as well as abundant fragments of rootlets and hyphae of the fungus.

The inoculation was carried out by the seed coating method, for which the seeds were immersed in a fluid paste, made by mixing a quantity of solid inoculum equivalent to 10 % of the weight of the seeds and water, in a proportion of 60 mL of water for every 100 g of inoculum. The seeds were after drying in the shade, sown. In the treatment where both biofertilizers applied together, the product containing A. brasilense was added to the water used to prepare the mycorrhizal inoculant for planting, maintaining the same inoculum-water ratio. Fertilizers were not applied in the experiment.

Four cuts were at a height of 10 cm made from the soil surface, the first two at 90 and 150 days after planting, both in the rainy season, and the others at 90-day intervals, coinciding with the least period rainy. In each cut, the fresh mass of the aerial part of the grass that occupied the calculation area of the plots was weighed and samples of 200 g were taken. These were taken to an air circulation stove at 70 ºC for 72 hours, to determine the percentage of dry mass, estimate the yield of dry mass, and the concentrations of N, P, K in the biomass ²¹.

At the time of each cut, at five points in the calculation area of each plot, the height of the canopy was measured using a graduated ruler, and the reading point was considered, the point where most of the leaves lost their vertical position. In the second and fourth cut, framed in the rainy and dry season, respectively, three sub-samples of roots and soil were taken from the rhizosphere at a depth of 0‒20 cm, using a cylinder metallic 5 cm in diameter and 20 cm high. The sampling points were equidistant distributed and separated 10 cm from the grooves.

The subsamples were homogenized to form a sample composed of a plot, from which 1 g of rootlets was extracted for staining and clarification ²³. The frequency of mycorrhizal colonization was using the intercepts method evaluated ²⁴, the visual density or intensity of colonization ²⁵, and the number of spores in the rhizosphere, from the sieving and decantation of these structures by the wet route and its observation under a microscope ²⁶.

Root density was determined just before the second cut; to do this, at three equidistant points located in the calculation area of each plot and 10 cm from the furrow, a vertical cut of the soil was made to a depth of 25 cm, and a metal cylinder 5 cm in diameter and 20 cm in diameter length was inserted. The soil contained in each cylinder was deposited in a glass container, running water was added and manually stirred until the coarse aggregates were dissolved, and then it was passed through a 0.5 mm sieve. The roots collected in the sieve were washed again to remove soil remains, air-dried and placed in a stove at 70 ºC until a constant mass was obtained.

Statistical data processing was performed using analysis of variance and Duncan's multiple range test ²⁷ at p<0.05. In the variables corresponding to the chemical characterization of the soil, as well as in those whose results are shown in graphs, the confidence interval of the means (α=0.05) was used as a dispersion statistic or as a criterion for comparison ²⁸. In all cases, the statistical program SPSS 25 was used ²⁹.

Figure 2 shows the influence of treatments on fungal variables. Both in the rainy and in the rainy period, with the inoculation of R. irregulare, a significant increase in the frequency and intensity of mycorrhizal colonization (visual density) was found, as well as the number of spores in the rhizosphere. However, the greatest effects were observed with the coinoculation of A. brasilense and R. irregular. It can be attributed to a positive effect of the growth-stimulating substances produced by A. brasilense in increasing the length and branching of the roots and consequently, in the increase of colonization sites, as well as the stimulation of these substances in the formation and multiplication of mycorrhizal structures ^16,30.

The values of the fungal variables were higher in the rainy period than in the dry period, probably due to the seasonality of the biomass production of the grass. During the rainy season, a rapid growth of the pastures occurs due to the higher levels of rainfall and temperature, as shown in Figure 1. Both factors, together with the increase in luminosity ^31,32, lead to the absorption of a greater quantity of nutrients for the formation of biomass and consequently, the formation of greater amounts of mycorrhizal structures to guarantee the access of the plants to the soil resources ^33,34.

Table 2 shows the effect of biofertilization on macronutrient concentrations (N, P and K) in the pasture biomass of the pasture. Both in the rainy and in the rainy period, the separate application of both biofertilizers increased the concentrations of N in relation to the non-inoculated treatment (control), although between both treatments, the highest values corresponded to A. brasilense but the greatest effects were found with the joint application of biofertilizers.

When evaluating the participation of biofertilizers in the increase of nitrogen concentrations in biomass (Figure 3), a similar result was observed; that is, the application of one or the other biofertilizer alone improved grass nutrition with this nutrient during both periods, although the highest values corresponded to treatment with A. brasilense. However, the greatest participation was achieved with the joint application of both biofertilizers.

Forage poaceae require significant amounts of N to improve their yield and nutritional value ^7,35, and judging by the organic matter content, the concentrations of N in the soil where the experiment was carried out were not sufficient to satisfy the demand of the crop. ; Furthermore, no nitrogen fertilizer was applied in the experiment. Furthermore, AMF has been shown to actively participate in the transfer of N from the soil to the host plant ³⁶. From these premises, a positive effect of inoculation with R. irregulare on the absorption of N, on the increase in the concentrations of this element in the above-ground biomass, as observed in Figure 3, could be expected, and consequently , an improvement of the nitrogen nutrition of the grass.

With respect to inoculation with A. brasilense, it is known that this microorganism can fix significant amounts of N in grass species of the Brachiaria genus ^8,37, so that this could explain its greater effect in increasing concentrations of N in biomass and its greatest contribution to nitrogen nutrition, in relation to R. irregulare. However, the fact that both variables have reached the highest values with the treatment where the microorganisms were applied jointly reflects a complementary effect of the same in improving the nitrogen nutrition of the grass.

The treatments had no effect on the concentrations of P and K in the above-ground biomass, which was in correspondence with the high contents of both elements in the soil (Table 1); in fact, this was a criterion for deciding not to apply phosphoric or potassium fertilizer in the experiment.

Table 3 shows the effect of the treatments on some indicators of growth and dry mass DM yield of the aerial part of the grass. As in the variables previously analyzed, a significant effect of biofertilization was found on canopy height and DM yield, both in the rainy season and in the least rainy season, as well as on the grass root density. When comparing the results obtained with the application of these microorganisms separately, the inoculation with A. brasilense showed higher values than those achieved with R. irregulare in these variables, although the greatest effects were obtained with the joint application of both biofertilizers.

The effect of the treatments on the growth and yield of the pasture seems to be related to the influence of biofertilizers on the concentrations of N in the biomass of the aerial part of the plants. It is known that, of all the mineral nutrients, this element is, quantitatively, the most important for forage crops ^7,38. Thus, the improvement of nitrogen nutrition caused by the application of biofertilizers, as observed in the previous table could have favorably affected canopy height and root growth, and consequently, grass yield.

In the case of A. brasilense, in addition to its contribution to the biological fixation of N previously mentioned, this microorganism also exerts different growth stimulation mechanisms through the production of phytohormones, mainly indolacetic acid and gibberellins, which modifies the metabolism of plants and leads to better uptake of water and minerals ^8,39. This could also explain its greater influence on grass growth, in relation to R. irregulare.

With regard to AMF, several authors have found a positive effect on N concentrations in the biomass of the aerial part of pastures inoculated with efficient strains. It is from an increase in the use of this element, given both by the increase of the radical surface of plants; such as by the formation of mycorrhizal structures that allow access to this and other soil resources ³⁶, which could be influencing the results, obtained.

It is interesting to note that the adding of R. irregulare has been effective in improving the concentrations of N in the biomass of the aerial part, the growth and the yield of the pasture, despite the high concentrations of P in the soil. Some works report that the effect of mycorrhizal inoculation can be in the presence of high contents of this element inhibited ⁴⁰. However, others have found that plants inoculated with efficient AMF strains can achieve effective mycorrhizal function even in soils with high concentrations of P, if other nutrients limit their growth and development ⁴¹.