La teca (Tectona grandis) es una especie forestal originaria del Sudeste de Asia, cuya madera es una de las mejor valoradas y más conocidas en el mundo por sus cualidades intrínsecas, lo cual ha impulsado el desarrollo de programas de mejoramiento genético para potenciar sus atributos ^1,2. En la primera etapa de dichos programas, se ha seleccionado material élite, con características comerciales de alto valor, sin embargo, es necesario avanzar hacia el desarrollo de cruzamientos controlados entre genotipos para lograr un mayor progreso en la calidad y rendimiento de esta especie. Tanto para el proceso reproductivo como para el mejoramiento genético a partir de cruces controlados, es necesario garantizar la disponibilidad de polen viable, para asegurar el éxito de las polinizaciones y la eficiencia del mejoramiento. Por ello, es indispensable conocer la capacidad de germinación del grano de polen y de esta manera, brindar un estimado de posibles progenitores femeninos y masculinos ^3,4.

Las pruebas de germinación in vitro permiten determinar la cantidad de polen viable y el crecimiento del tubo polínico bajo condiciones controladas, ya que el medio de cultivo se asemeja a la composición del mucílago del estigma ⁴. Como parte de esta técnica, en los últimos años se han estudiado las aplicaciones de sustancias bioactivas que influyen en el crecimiento y la diferenciación celular de diversas especies vegetales, entre ellas los brasinoesteriodes (Br) y las oligosacarinas (OG) ⁵.

Los brasinoesteroides son hormonas esteroidales de las plantas, que se han encontrado principalmente en polen, hojas, yemas, flores y semillas, en proporciones y formas diferentes ⁶. Estos compuestos han demostrado tener un efecto positivo en la morfogénesis tanto in vitro como ex vitro, su respuesta depende del tipo y la concentración que se utilice, así como de su interacción con las hormonas de la planta. Dentro de estas sustancias el Biobras-16^® ha sido ampliamente utilizado, y ha demostrado ser activo a concentraciones extremadamente bajas, generalmente soluciones de 10^-2 y 10^-4 mg L^{-1 (7,8}.

Los oligogalacturónidos se generan por hidrólisis enzimática de la pared celular de plantas y a bajas concentraciones muestran actividad biológica. Estos compuestos forman parte de las oligosacarinas más estudiadas, son considerados bioestimulantes por ser moléculas bioactivas cuya función es mejorar las propiedades fisicoquímicas de las plantas, los rendimientos y la calidad de los cultivos ⁹. El principio activo de Pectimorf^® es una mezcla de oligosacáridos pécticos, obtenido a partir de residuos de la industria citrícola, incluye moléculas señalizadoras importantes en los procesos fisiológicos de las plantas, relacionados con el crecimiento y la estimulación de los mecanismos de defensa. Las concentraciones óptimas del producto para obtener una respuesta biológica satisfactoria oscilan entre los 10 y 20 mg L^{-1 (10,11}.

El empleo de sustancias bioactivas como las mencionadas, puede aumentar la eficiencia germinativa de los granos de polen y con ello, su fertilidad. El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de dos productos cubanos, Biobras-16^® y Pectimorf^® sobre la germinación in vitro de polen crioconservado de teca.

Se seleccionaron árboles establecidos en ensayos clonales de la empresa Novelteak, Guanacaste, Costa Rica. De las inflorescencias se colectaron flores sin abrir y se colocaron en bolsas plásticas con cierre hermético durante una hora, para inducir la apertura de las mismas. Una vez abiertas las flores y con ayuda de pinzas de disección, se procedió a la extracción mecánica de las anteras, las cuales se colocaron en criotubos.

Para la crioconservación, las anteras con el polen fueron congeladas mediante inmersión directa de los criotubos en nitrógeno líquido a -196 ºC durante cuatro y ocho meses. Una vez transcurrido el tiempo de almacenamiento respectivo, las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente por cinco minutos y rehidratados en cámara de humedad durante una hora ¹².

Los granos de polen contenidos en 0,1 g de anteras se desprendieron de las mismas mediante vibración, empleando un vortex y se colocaron en crioviales de 2,5 mL para la germinación. A cada vial se le añadieron 250 μL de medio de cultivo líquido compuesto por las sales de Brewbaker y Kwack (BK) diluidas al 10 %: Ca (NO₃)₂ 300 mg L^-1, MgSO₄ 200 mg L^-1, H₃BO₃ 100 mg L^-1, KNO₃ 100 mg L^{-1 (13}, así como 10 g L^-1 de sacarosa y un pH final de 6,5. Cada tratamiento fue suplementado con las concentraciones de Biobras-16^® y Pectimorf^®, según se indica en la Tabla 1 y el medio sin suplementar se utilizó como control.

Todos los tratamientos se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente y luego se les añadió 250 µL de acetocarmín (1 %) como colorante. El porcentaje de germinación se determinó mediante el cociente del número de granos germinados entre los totales encontrados en cada campo microscópico, considerando germinados únicamente los granos con un tubo polínico de longitud mayor o igual al diámetro del grano de polen. Dichos conteos se realizaron empleando muestras de 100 granos de polen por campo óptico, en un microscopio Nikon ALPHAPHOT-2 YS2 (10x).

Las mediciones correspondientes al área del grano de polen (mm²) y longitud del tubo polínico (µm) en muestras de polen frescas, se realizaron empleando un microscopio Nikon eclipse 80i con aumento 20x, acoplado a una cámara fotográfica con visualización en la computadora a través del programa Nikon Ds-Fi-L2.

En cuanto al diseño experimental para la variable germinación del polen, se realizó un diseño completamente aleatorizado, con un arreglo factorial: medio de cultivo (con cinco niveles) y tiempo de crioconservación (con tres niveles). Por su parte, para las variables área del grano de polen y longitud del tubo polínico, se realizó un diseño completo al azar. En todos los tratamientos se realizaron tres repeticiones y cinco lecturas por repetición.

Para el análisis estadístico, se comprobó el cumplimiento de los supuestos estadísticos para pruebas paramétricas y se evaluó la germinación mediante un Modelo Lineal General, con el fin de calcular el efecto de cada factor y la interacción de ambos. Los datos correspondientes al área del grano de polen y longitud de tubo polínico se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) con comparaciones múltiples de Tukey, y a un análisis de correlación lineal mediante el cálculo del coeficiente de Pearson. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con 95 % de confianza y mediante el programa estadístico Minab 19^®.

Con el análisis de los datos mediante el Modelo Lineal General, se evidenció con un 95 % de confianza, que tanto el medio de cultivo como el tiempo de crioconservación y la interacción entre ambos factores, ejercieron un efecto significativo sobre la germinación del polen de teca, todos con un valor de p=0,000.

El tratamiento control (M1) evidenció disminución de la germinación del polen a los cuatro meses de crioconservación, la cual se mantuvo a los ocho meses. El tratamiento con Pectimorf^® no mostró un efecto favorable para la germinación del polen crioconservado, de acuerdo con el comportamiento de los tratamientos M4 y M5 (Figura 1).

La disminución de germinación en polen crioconservado pudo deberse al genotipo, a la calidad del polen y a la cantidad de reservas de nutrientes del mismo, propiciadas por las condiciones ambientales donde se produjo el material genético utilizado en la investigación ¹⁴. Además, se conoce que la crioconservación puede provocar acumulación de especies reactivas de oxígeno y estrés por baja temperatura, éste último crea una desorganización del metabolismo de la planta, ocasionando alteraciones en la estabilidad de las proteínas, reacciones enzimáticas y actividad respiratoria de las células ^15,16.

Por el contrario, el medio con brasinoesteroide a 0,001 mg L^-1 (M2) favoreció la germinación de polen crioconservado durante cuatro y ocho meses, mientras que la concentración de 0,05 mg L^-1 de este compuesto mostró un efecto positivo en la germinación a los cuatro meses. Estos resultados coinciden con publicaciones recientes que informan el uso de los brasinoesteroides como promotores de crecimiento, reductores del daño oxidativo causado por factores abióticos y promotores de la germinación de polen de diversas especies ^7,10,15.

Al evaluar la germinación de polen sin crioconservar (0 meses), existieron diferencias significativas entre los tratamientos; aquellos suplementados con Pectimorf^® (M4 y M5) no difirieron del control (M1), mientras que los tratamientos con Biobras-16^® (M2 y M3) disminuyeron la germinación en este momento con respecto al control, mostrando este último un porcentaje de germinación superior (33,5 %). Esto indica que, en polen fresco, los productos evaluados no lograron un efecto positivo en la germinación.

En el caso del polen conservado en nitrógeno líquido durante cuatro meses, se observó un efecto estimulador del brasinoesteroide en ambas concentraciones evaluadas, las cuales presentaron diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Las muestras tratadas con Pectimorf^® no se diferenciaron del control.

Al transcurrir los ocho meses de conservación, la menor concentración (0,001 mg L^-1) de brasinoesteroide evidenció un mayor estímulo en la germinación de los granos de polen de teca, con resultados superiores al resto de los tratamientos, seguido por el tratamiento donde se aplicó 5 mg L^-1 de Pectimorf (Figura 1).

Estos resultados demuestran el efecto promotor del Biobras-16^® al ser aplicado exógenamente, lo cual coincide con otras investigaciones que señalan su actividad anti estrés a concentraciones entre 0,1 y 0,001 mg L ^{_{-1 (7,8)}} . Dicho efecto pudo ser el responsable de mejorar el porcentaje de germinación con los tratamientos criocongelados (cuatro y ocho meses). Por otro lado, se menciona que los brasinoesteroides afectan positivamente la fertilización, modificando las propiedades del polen a través de la estimulación de su crecimiento y de los tubos polínicos. Lo anterior ha sido atribuido a su acción sobre la división y elongación celular ⁷. En estudios realizados en la germinación in vitro de polen de Oryza sativa L., ¹⁷ y en polen de Arabidopsis thaliana¹⁸, se demostró que al aplicar 24-epibrasinólida se mejoró la germinación in vitro de granos de polen cuando estos fueron sometidos a condiciones de estrés por calor.

Adicionalmente, se constató que ni el brasinoesteroide ni la concentración más alta de oligogalacturónidos tuvieron efecto significativo en el área del grano de polen, sin embargo, la concentración de 5 mg L^-1 de Pectimorf^® (M4) afectó negativamente esta variable (Tabla 2).

En cuanto a la longitud del tubo polínico de los granos de polen fresco, se evidenció que existen diferencias significativas entre algunos tratamientos (p=0,002). Para esta variable el medio suplementado con 5 mg L^-1 Pectimorf^® (M4); mostró una mayor elongación del tubo polínico (397±76), aunque no se diferenció de la menor concentración de Biobras-16^®, ni de la mayor de Pectimorf^®. Los tratamientos enriquecidos con brasinoesteroides (M2 y M3) y con 10mg L^-1 de Pectimorf^® (M5), no evidenciaron diferencias significativas para esta variable respecto al control (Tabla 2, Figura 2).

Los resultados obtenidos concuerdan con trabajos de germinación in vitro de granos de polen de Solanum tuberosum, en los cuales Pectimorf^® favoreció notablemente el crecimiento de los tubos polínicos en concentración de 5 mg L^-1, notándose una dependencia del genotipo y las concentraciones del producto en la respuesta del material vegetal. Cabe destacar que este compuesto es conocido por su efecto como sustituto de reguladores de crecimiento tradicionales como auxinas y citoquininas, en cultivo in vitro en diferentes etapas y especies ¹⁹.

Se conoce que el tubo polínico está compuesto por una célula de rápido crecimiento que requiere una deposición masiva de la pared celular para promover su alargamiento rápido. La pared interna del tubo de polen es abundante en calosa y contiene baja cantidad de celulosa, mientras que la capa externa está formada principalmente por pectinas, que al desesterificarse y entrecruzarse mediante Ca²⁺, aportan rigidez a la pared celular especialmente en la parte posterior del tubo ²⁰.

Debido a esto, cabe mencionar que investigaciones realizadas en Arabidopsis thaliana han demostrado que los oligogalacturónidos incrementan la fosforilación de fosfoproteínas como la miosina 17 y la proteína de unión a cationes asociada a la membrana plasmática (PCaP1) ²¹. Esto podría explicar el efecto positivo del Pectimorf^® en la elongación del tubo polínico de teca, ya que la miosina estimula el tráfico a través de la actina de vesículas portadoras de componentes para la síntesis de nueva membrana y pared celular no celulósica hacia la zona apical de crecimiento. Adicionalmente, la PcaP1 es capaz de unir actina y calcio, lo cual provoca la desestabilización de los filamentos de actina. El mantenimiento del gradiente de iones calcio en el citosol permite el crecimiento polarizado del tubo polínico, por lo cual es importante la regulación de la entrada de dichos iones a través de la membrana plasmática ^21,22.

A pesar de múltiples informes que indican que los brasinoesteroides promueven el crecimiento del tubo polínico al favorecer la elongación y división celular; en polen de teca fresco no se evidenció este efecto positivo. Esto pudo deberse a que la respuesta de las especies vegetales depende del tipo y concentración del brasinoesteroide empleado, así como a la interacción de factores genéticos, químicos y ambientales, ya que el desarrollo del tubo polínico es muy sensible a factores de estrés ¹⁵.

Al realizar el análisis de correlación entre el tamaño del polen y la elongación del tubo polínico, se encontró que no existe correlación lineal entre las variables para el empleo de Biobras-16^®, donde el análisis mostró aleatoriedad al evaluar su efecto, en el cual se obtuvo un coeficiente de Pearson de 0,097 (Figura 3A). Al analizar el efecto de Pectimorf^®, se obtuvo un coeficiente de Pearson de -0,441, por lo que se pudo afirmar la existencia de correlación negativa entre las dos variables para este producto (Figura 3B).

La existencia de una correlación negativa entre las variables área del grano de polen y longitud de tubo polínico en los tratamientos suplementados con Pectimorf^®, sugiere una tendencia a que los granos de polen de menor tamaño tengan mayor habilidad de crecer sobre el pistilo y la posibilidad de ser más efectivos en la fecundación del estigma ¹⁹. Este comportamiento responde posiblemente a que los oligogalacturónidos son mensajeros químicos que realizan funciones similares a las auxinas, modulan las enzimas que intervienen en procesos específicos en planta, tales como morfogénesis, germinación y crecimiento ¹¹. Al iniciarse la germinación del polen, se presenta un desplazamiento del citoplasma hacia la región apical de elongación y conforme el tubo polínico se elonga, se van depositando calosa y vesículas transportadoras en dicha región atendiendo al crecimiento polarizado que lo caracteriza ^23,24. Estos resultados coinciden con las tendencias observadas en la germinación in vitro de polen de berenjena (Solanum melongena) sin suplementos bioactivos ²⁵.

Teak (Tectona grandis) is a forest species native to Southeast Asia, whose wood is one of the best valued and best known in the world for its intrinsic qualities, which has prompted the development of genetic improvement programs to enhance its attributes ^1,2. In the first stage of these programs, elite material has been selected, with high value commercial characteristics; however, it is necessary to advance towards the development of controlled crosses between genotypes to achieve greater progress in the quality and performance of this species. Both for the reproductive process and for genetic improvement from controlled crosses, it is necessary to guarantee the availability of viable pollen, to ensure the success of pollinations and the efficiency of improvement. Therefore, it is essential to know the germination capacity of the pollen grain and in this way, provide an estimate of possible female and male parents ^3,4.

In vitro germination tests allow determining the amount of viable pollen and the growth of the pollen tube under controlled conditions, since the culture medium resembles the composition of the mucilage of the stigma ⁴. As part of this technique, in recent years the applications of bioactive substances that influence the growth and cell differentiation of various plant species have been studied, including brassinosteriodes (Br) and oligosaccharins (OG) ⁵.

Brassinosteroids are plant steroidal hormones, which have been found mainly in pollen, leaves, buds, flowers and seeds, in different proportions and forms ⁶. These compounds have been shown to have a positive effect on morphogenesis both in vitro and ex vitro, their response depends on the type and concentration used, as well as its interaction with plant hormones. Among these substances, Biobras-16^® has been widely used, and has proven to be active at extremely low concentrations, generally solutions of 10^-2 and 10^-4 mg L^{-1 (7,8}.

Oligogalacturonides are by enzymatic hydrolysis generated of the plant cell wall and at low concentrations, they show biological activity. These compounds are part of the most studied oligosaccharins; they are biostimulants considered because they are bioactive molecules whose function is to improve the physicochemical properties of plants, the yields and the quality of crops ⁹. The active ingredient in Pectimorf^® is a mixture of pectic oligosaccharides, obtained from residues of the citrus industry; it includes important signaling molecules in the physiological processes of plants, related to growth and the stimulation of defense mechanisms. The optimal concentrations of the product to obtain a satisfactory biological response range between 10 and 20 mg L^{-1 (10,11}.

The use of bioactive substances such as those mentioned can increase the germination efficiency of pollen grains and thus their fertility. The present study was with the objective of evaluating the effect of two Cuban products carried out, Biobras-16^® and Pectimorf^® on the in vitro germination of cryopreserved teak pollen.

Trees established in clonal trials of the Novelteak Company, Guanacaste, Costa Rica were selected. Unopened flowers were collected from the inflorescences and they were placed in hermetically sealed plastic bags for one hour, to induce their opening. Once the flowers had been opened and with the help of dissection forceps, the anthers were mechanically extracted, which were placed in cryotubes.

For cryopreservation, the anthers with the pollen were frozen by direct immersion of the cryotubes in liquid nitrogen at -196 ºC for four and eight months. Once the respective storage time had elapsed, the samples were thawed at room temperature for five minutes and rehydrated in a humidity chamber for one hour ¹².

The pollen grains contained in 0.1 g of anthers were detached from them by vibration, using a vortex, and placed in 2.5 mL cryovials for germination. 250 μL of liquid culture medium composed of Brewbaker and Kwack salts (BK) diluted to 10 % were added to each vial: Ca (NO₃)₂ 300 mg L^-1, MgSO₄ 200 mg L^-1, H₃BO₃ 100 mg L^-1, KNO₃ 100 mg L^{-1 (13}, as well as 10 g L^-1 of sucrose and a final pH of 6.5. Each treatment was supplemented with the concentrations of Biobras-16^® and Pectimorf^®, as indicated in Table 1 and the non-supplemented medium was used as control.

All treatments were for two hours at room temperature incubated and then 250 µL of acetocarmine (1 %) was as a dye added. The germination percentage was determined by the quotient of the number of germinated grains among the totals found in each microscopic field, considering germinated only grains with a pollen tube of length greater than or equal to the diameter of the pollen grain. Said counts were made using samples of 100 pollen grains per optical field, in a Nikon ALPHAPHOT-2 YS2 microscope (10x).

The measurements corresponding to the area of the pollen grain (mm²) and length of the pollen tube (µm) in fresh pollen samples were carried out using a Nikon eclipse 80i microscope with 20x magnification, coupled to a photographic camera with computer visualization through of the Nikon Ds-Fi-L2 program.

Regarding the experimental design for the pollen germination variable, a completely randomized design was carried out, with a factorial arrangement: culture medium (with five levels) and cryopreservation time (with three levels). On the other hand, for the variables area of the pollen grain and length of the pollen tube, a complete random design was carried out. Three repetitions and five readings per repetition were carried out in all treatments.

For statistical analysis, compliance with the statistical assumptions for parametric tests was verified and germination was evaluated using a General Linear Model, in order to calculate the effect of each factor and the interaction of both. The data corresponding to the area of the pollen grain and the length of the pollen tube were subjected to an analysis of variance (ANOVA) with multiple Tukey comparisons and to a linear correlation analysis by calculating the Pearson coefficient. All statistical tests were performed with 95 % confidence and using the Minab 19^® statistical program.

With the analysis of the data using the General Linear Model, it was shown with 95 % confidence that both the culture medium and the cryopreservation time and the interaction between both factors exerted a significant effect on the germination of teak pollen, all with a value of p = 0.000.

The control treatment (M1) showed a decrease in pollen germination at four months of cryopreservation, which was maintained at eight months. The treatment with Pectimorf^® did not show a favorable effect for the germination of cryopreserved pollen, according to the behavior of treatments M4 and M5 (Figure 1).

The decrease in germination in cryopreserved pollen could be due to the genotype, the quality of the pollen and the amount of its nutrient reserves, caused by the environmental conditions where the genetic material used in the research was produced ¹⁴. In addition, it is known that cryopreservation can cause accumulation of reactive oxygen species and low temperature stress, the latter creating a disorganization of the plant's metabolism, causing alterations in the stability of proteins, enzymatic reactions and respiratory activity of cells ^15,16.

On the contrary, the medium with brassinosteroid at 0.001 mg L^-1 (M2) favored the germination of cryopreserved pollen for four and eight months, while the concentration of 0.05 mg L^-1 of this compound showed a positive effect on the germination at four months. These results coincide with recent publications that report the use of brassinosteroids as growth promoters, reducers of oxidative damage caused by abiotic factors, and promoters of pollen germination of various species ^7,10,15.

When evaluating the germination of pollen without cryopreservation (0 months), there were significant differences between the treatments; those supplemented with Pectimorf^® (M4 and M5) did not differ from the control (M1), while the treatments with Biobras-16^® (M2 and M3) decreased germination at this time with respect to the control, the latter showing a germination percentage higher (33.5 %). This indicates that, in fresh pollen, the evaluated products did not achieve a positive effect on germination.

In the case of pollen conserved in liquid nitrogen for four months, a stimulatory effect of the brassinosteroid was observed in both concentrations evaluated, which presented significant differences with the rest of the treatments. The samples treated with Pectimorf^® did not differ from the control.

After eight months of conservation, the lower concentration (0.001 mg L^-1) of brassinosteroid showed a greater stimulus in the germination of teak pollen grains, with results superior to the rest of the treatments, followed by the treatment where the applied 5 mg L^-1 of Pectimorf^® (Figure 1).

These results demonstrate the promoting effect of Biobras-16^® when applied exogenously, which coincides with other investigations that indicate its anti-stress activity at concentrations between 0.1 and 0.001 mg L^{-1 (7,8}. This effect could be responsible for improving the germination percentage with the cryo-frozen treatments (four and eight months). On the other hand, it is mentioned that brassinosteroids positively affect fertilization, modifying the properties of pollen through the stimulation of its growth and pollen tubes. This has been attributed to its action on cell division and elongation ⁷. In studies carried out on the in vitro germination of pollen from Oryza sativa L ¹⁷⁾ and on pollen from Arabidopsis thaliana¹⁸, the applying of 24-epibrasinolide improved the in vitro germination of pollen grains when they were subjected to heat stress conditions was shown.

Additionally, neither the brassinosteroid nor the highest concentration of oligogalacturonides had a significant effect on the area of the pollen grain was found; however, the concentration of 5 mg L^-1 of Pectimorf^® (M4) negatively affected this variable (Table 2).

Regarding to the pollen tube length of fresh pollen grains, it was evidenced that there are significant differences between some treatments (p=0.002). For this variable, the medium supplemented with 5 mg L^-1 Pectimorf^® (M4); showed greater elongation of the pollen tube (397±76), although it did not differ from the lower concentration of Biobras-16^®, nor from the higher concentration of Pectimorf^®. The treatments enriched with brassinosteroids (M2 and M3) and with 10mg L^-1 of Pectimorf^® (M5), did not show significant differences for this variable with respect to the control (Table 2, Figure 2).

The results obtained agree with in vitro germination studies of pollen grains of Solanum tuberosum, in which Pectimorf^® notably favored the growth of pollen tubes at a concentration of 5 mg L^-1, noting a dependence on the genotype and the concentrations of the product in the response of plant material. It should be noted that this compound is known for its effect as a substitute for traditional growth regulators such as auxins and cytokinins, in in vitro culture at different stages and species ¹⁹.

The pollen tube is known to be composed of a rapidly growing cell that requires a massive deposition of the cell wall to promote its rapid elongation. The inner wall of the pollen tube is abundant in callose and contains a low amount of cellulose, while the outer layer is made mainly of pectins up, which, when deesterified and cross-linked by Ca₂ ⁺, provide rigidity to the cell wall, especially in the back of the tube ²⁰

Due to this, it is worth mentioning that research carried out in Arabidopsis thaliana has shown that oligogalacturonides increase phosphorylation of phosphoproteins such as myosin 17 and the plasma membrane-associated cation-binding protein (PCaP1) ²¹. This could explain the positive effect of Pectimorf^® on the elongation of the teak pollen tube, since myosin stimulates trafficking through actin of component-bearing vesicles for the synthesis of a new membrane and non-cellulosic cell wall towards the apical zone growth. Additionally, PcaP1 is capable of binding actin and calcium, which causes destabilization of actin filaments. The maintenance of the gradient of calcium ions in the cytosol allows the polarized growth of the pollen tube, for which the regulation of the entry of these ions through the plasma membrane is important ^21,22.

Despite multiple reports that indicate that, brassinosteroids promote pollen tube growth by promoting cell elongation and division; this positive effect was not evidenced in fresh teak pollen. This could be because the response of plant species depends on the type and concentration of the brassinosteroid used, as well as the interaction of genetic, chemical and environmental factors, since the development of the pollen tube is very sensitive to stress factors ¹⁵.

When performing the correlation analysis between pollen size and elongation of the pollen tube, it was found that there is no linear correlation between the variables for the use of Biobras-16^®, where the analysis showed randomness when evaluating its effect, in which a Pearson coefficient of 0.097 was obtained (Figure 3A). When analyzing the effect of Pectimorf^®, a Pearson coefficient of -0.441 was obtained, so it was possible to affirm the existence of a negative correlation between the two variables for this product (Figure 3B).

The existence of a negative correlation between the variables pollen grain area and pollen tube length in the treatments supplemented with Pectimorf^®, suggests a tendency for smaller pollen grains to have a greater ability to grow on the pistil and the possibility to be more effective in fertilizing stigma ¹⁹. This behavior possibly responds to the fact that oligogalacturonides are chemical messengers that perform functions similar to auxins, modulate the enzymes involved in specific processes in the plant, such as morphogenesis, germination and growth ¹¹. When pollen germination begins, there is a displacement of the cytoplasm towards the apical region of elongation and as the pollen tube elongates, callose and transporter vesicles are deposited in said region, attending to the polarized growth that characterizes it ^23,24. These results coincide with the trends observed in the in vitro germination of eggplant (Solanum melongena) pollen without bioactive supplements ²⁵.