El quitosano es un biopolímero lineal de monómeros de glucosamina y una pequeña cantidad de monómeros de N-acetil-glucosamina, derivado por desacetilación parcial de la quitina, la cual es reconocida como el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza después de la celulosa ¹. El quitosano es un reconocido bioestimulante agrícola por causar efectos biológicos en las plantas como son la promoción del crecimiento y desarrollo y la protección anti estrés a través de la activación del metabolismo vegetal. De esta forma, la estimulación del crecimiento y desarrollo en las plantas por polímeros y oligómeros de quitosano es el resultado del beneficio de la acumulación de nutrientes esenciales, del proceso de fotosíntesis y la acumulación de carbohidratos, de la activación de enzimas del metabolismo del carbono y el nitrógeno y del aumento del contenido de metabolitos secundarios ^2-5.

Algunos autores han informado beneficios en el desarrollo de la soya con quitosano y sus derivados con diferentes masas moleculares, concentraciones, formas y momentos de aplicación de estos compuestos ^6-9. En particular, la mayor parte de las investigaciones realizadas en el cultivo con la aspersión foliar han empleado concentraciones altas de quitosano y sus derivados (de 1 a 40 g L^-1), con consecuencias significativas en su desarrollo que, inclusive, han reducido los efectos negativos causados por estreses abióticos ^3,10. Sin embargo, resultados previos en el cultivar IS-27 demuestran el efecto positivo de concentraciones menores a 1 g L^-1 de un polímero y un oligómero de quitosano, en la nodulación y el crecimiento in vitro¹¹. Dichas concentraciones no se han evaluado en este cultivar mediante aspersión foliar del polímero.

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de diferentes concentraciones (1, 10, 50, 100, 500 y 1000 mg L^-1) de quitosano, aplicadas en las etapas V1 y V2 por aspersión foliar, en indicadores de la nodulación, la fisiología y el crecimiento vegetativo de soya cv IS-27 inoculada con Azofert-S^®, en condiciones controladas.

Al evaluar el efecto del quitosano aplicado por aspersión foliar de soya se observa una superioridad de las concentraciones 10 y 50 mg L^-1, en la formación de nódulos en la raíz principal (RP), además de 500 mg L^-1 en las raíces secundarias (RS), en comparación con el CA; mientras que en el número de nódulos totales (NT), se destacaron las concentraciones antes mencionadas, respecto a los controles. Los incrementos de estas concentraciones de quitosano oscilaron entre 32 y 74 %, respecto a las plantas inoculadas con Bradyrhizobium (Figura 1).

Aún, cuando se encontraron grandes diferencias en el número de nódulos, las diferencias en la masa seca de los mismos fueron menor, entre las plantas inoculadas (CI) y las tratadas con quitosano por aspersión foliar (Figura 1). El quitosano aplicado por aspersión foliar de soya no modificó la masa seca de los nódulos formados en las raíces principales de las plantas inoculadas. Sin embargo, la masa seca de los nódulos formados en las raíces secundarias (RS) se benefició con las concentraciones 10 y 500 mg L^-1 de quitosano, mientras que la masa de los nódulos totales se benefició con las concentraciones 10, 50, 500 y 1000 mg L^-1 de quitosano, con incrementos en esta variable, de aproximadamente entre 40 y 67 %, respecto al CI (Figura 1).

En la Tabla 1, se aprecia la actividad enzimática nitrato reductasa (NR) determinada en hojas colectadas en tres momentos del crecimiento vegetativo de plantas IS-27 de soya. Un primer momento (V1), en el cual no se había realizado la aspersión foliar de quitosano, para comparar los valores de las plantas controles. Los otros dos momentos fueron a los siete días de realizada cada aspersión foliar de quitosano.

En la fase V1 de crecimiento de las plantas, la prueba t de student arrojó diferencias significativas entre los controles (CA y CI), destacándose la inoculación de B. elkanii sobre las plantas no inoculadas en una mayor actividad NR (40 % de incremento) determinada en hojas (Tabla 1). En las siguientes etapas, las plantas asperjadas con quitosano produjeron mayores valores de nitrito (NO^-2), que inmediatamente se convierten en amonio (forma asimilable por las plantas). Las concentraciones desde 10 a 500 mg L^-1 de quitosano, contribuyeron a la acumulación de esta actividad en ambos momentos. Sin embargo, en la fase V2, hubo incrementos entre 10 y 28 %, respecto al control inoculado; mientras que en V3, los incrementos de actividad con quitosano estuvieron entre 0,5 y 4,3 veces por encima del valor de actividad del control inoculado a pesar de tener los valores absolutos más bajos (Tabla 1).

La aplicación foliar de quitosano no modificó la respuesta encontrada en la concentración de N en los órganos de soya más allá del incremento obtenido con la inoculación de las semillas con la bacteria, excepto con la concentración de 1000 mg L^-1 en los nódulos que aumentó en 10 % el contenido de N, respecto al CI (Tabla 2 y 3).

En los trifoliolos de soya, la concentración de P y K no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 2) y de forma general, tampoco hubo diferencias a nivel de los nódulos, excepto las concentraciones 100 y 1000 mg L^-1, que redujeron el contenido de K y P respecto al CI, en un 5 y 40 %, respectivamente (Tabla 3).

Aunque la inoculación con Bradyrhizobium no aumentó los niveles de Ca y Mn respecto al CI, sí se elevaron ambos nutrientes con varios de los tratamientos de quitosano en ambos órganos evaluados (Tabla 2 y 3). Las concentraciones entre 50 y 1000 mg L^-1 aumentaron el contenido de Ca entre 56 y 87 % en las hojas y 10 y 22 % en los nódulos, estando el mayor incremento con 500 mg L^-1. Por su parte, el aumento del contenido de Mn en las hojas ocurrió con las aplicaciones de quitosano entre 1 y 500 mg L^-1 con incrementos entre 70 y 200 % por encima de los controles, siendo el mejor tratamiento 500 mg L^-1, mientras en los nódulos los incrementos ocurrieron entre 50 y 1000 mg L^-1, estando el mejor comportamiento con 50 mg L^-1 y con aumentos entre 94 y 170 % respecto al CI que, a su vez, redujo en 34 % el contenido de Mn obtenido con el CA.

La inoculación con la bacteria simbionte aumentó el contenido de Mg en 219 y 156 % en hojas y nódulos de las plantas respectivamente, sin embargo, la aplicación de todas las concentraciones de quitosano redujeron entre 123 y 370 % en las hojas, excepto la concentración de 10 mg L^-1 que aumentó un 23 % el valor de Mg del control inoculado. Similar comportamiento ocurrió en los nódulos. Todos los tratamientos de quitosano sin excepción, redujeron el contenido de Mg, respecto a la inoculación entre 57 y 1550 % (Tabla 2 y 3).

Los niveles de Fe no se vieron afectados por la inoculación con Bradyrhizobium en ambos órganos y solo fueron aumentados respecto al CA con la aplicación de 100 mg L^-1 de quitosano en las hojas con un 53 % de incremento y con 10 y 50 mg L^-1 en los nódulos que aumentaron 21 y 58 %, respectivamente (Tabla 2 y 3).

En hojas de soya, las concentraciones desde 50 a 1000 mg L^-1 de quitosano redujeron la concentración de Zn y aumentaron la concentración de Na, mientras aumentaron el Zn en los nódulos, excepto 100 mg L^-1. La inoculación no afectó el comportamiento de Zn en ambos órganos (Tabla 2 y 3).

El quitosano afectó la concentración de macronutrientes y oligoelementos determinados en los órganos de soya inoculada con Bradyrhizobium, en dependencia de la concentración del polímero y del órgano de la planta. De forma general, los nutrientes en los nódulos se incrementaron con 50 mg L^-1 de quitosano y en los terceros trifoliolos, con las concentraciones más bajas (1 y 10 mg L^-1), excepto el nitrógeno en ambos órganos de las plantas.

El contenido relativo de clorofilas totales se benefició con la aplicación de las concentraciones de 10 a 500 mg L^-1 de quitosano, que incrementaron la variable entre un 6 y 8,4 %, respecto a las plantas no inoculadas aunque sin diferencias con el control inoculado (Figura 2).

La respuesta en el crecimiento vegetativo de soya con la aplicación foliar de quitosano mostró diferencias significativas en todas las variables morfoagronómicas evaluadas en la fase V4 (Tabla 4).

Todas las concentraciones de quitosano favorecieron la emisión de hojas en las plantas, aunque sin diferencias significativas con CI. Las concentraciones mayores (500 y 1000 mg L^-1) de quitosano estimularon el diámetro del tallo de las plantas, con incrementos entre un 10 y 16 %, con respecto a los controles CA y CI; así como la masa seca radical, que se diferenció solo del CA, con incrementos de aproximadamente 44 % (Tabla 4).

La longitud del tallo fue estimulada con las concentraciones 100 y 500 mg L^-1, con diferencias de la concentración menor (1 mg L^-1) asperjada y el CA. Similar resultado fue encontrado en la longitud radical, pero con las concentraciones 100 y 1000 mg L^-1 (Tabla 1). Sin embargo, todas las concentraciones del quitosano aplicadas por aspersión foliar estimularon la masa seca de la parte aérea, entre 48,96 y 23,06 %, con relación a los controles CA y CI. La concentración de 1000 mg L^-1 fue quién más se destacó en incrementar este indicador (Tabla 4).

Las concentraciones mayores de quitosano favorecieron el área foliar de soya, específicamente, la concentración de 500 mg L^-1 que elevó la variable en un 49,24 %, diferenciándose de 1 mg L^-1 y de los dos controles (Tabla 4).

El quitosano aplicado por aspersión foliar benefició la respuesta morfoagronómica de la soya inoculada con B. japonicum. La mayor respuesta estimuladora del crecimiento de las plantas se tuvo con las concentraciones de 100 a 1000 mg L^-1 de quitosano, fundamentalmente, en el diámetro del tallo, la biomasa seca y el área foliar.

En este trabajo se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de un polímero de quitosano en la nodulación, la actividad enzimática nitrato reductasa foliar, la concentración de macro y oligoelementos en nódulos y terceros trifoliolos y el contenido de clorofilas; así como el crecimiento vegetativo de soya cv IS-27 inoculada con Bradyrhizobium elkanii, en condiciones de cámara de crecimiento. En los procesos antes mencionados, se observó un efecto beneficioso de la aplicación foliar del polímero (fases V1 y V2) en la mayoría de las variables analizadas en la fase V4 de las plantas (Figuras 1 y 2, Tablas 1, 2, 3 y 4).

Las distintas concentraciones de quitosano aplicadas por aspersión foliar en soya inoculada con B. elkanii, influyeron positivamente en la nodulación de las plantas, con los mayores incrementos en el número y la masa seca nodular, respecto a las plantas que solo se inocularon, con las concentraciones 10, 50 y 500 mg L^-1 del polímero (Figura 1 A y B). El incremento de ambas variables se traduce en un mayor contenido de bacteroides, lo que incrementaría la tasa de fijación del nitrógeno ¹⁶. Estos resultados confirman lo obtenido por otros autores en el número de nódulos y la actividad de reducción de acetileno (ARA) en soya, mediante otras formas de aplicación de compuestos de quitosano, en concentraciones de 40, 50 y 1000 mg L^{-1 (17-19}.

Por otra parte, varios trabajos en leguminosas informan el efecto beneficioso de la inoculación con biofertilizantes respecto a las plantas que no han sido inoculadas ^20-23, lo que es consistente con los resultados obtenidos en este estudio. Las plantas que no se inocularon apenas nodularon, lo que demuestra la efectividad de la cepa de Bradyrhizobium, la concentración celular y dosis del inóculo utilizado, respecto a la población residente de bradyrizobios en el suelo empleado (Figura 1). Esto corrobora lo informado por otros autores ^23,24.

Las plantas de los distintos tratamientos inoculados presentaron un número de nódulos adecuados para la etapa vegetativa, de tamaño uniforme y se localizaron, fundamentalmente, en la corona y en la raíz principal de las plantas (Figura 1 A y B), lo que se atribuye a una efectividad de la inoculación. Esto se corroboró con el 100 % de nódulos efectivos encontrados en todos los tratamientos. Algunos autores plantean que la ocurrencia y distribución de los nódulos en las plantas hospederas dependen del desarrollo radical, de las condiciones del suelo y de la especie de leguminosa. En el caso de la soya, los nódulos se ubican mayoritariamente en la raíz principal ^25,26. A partir de lo informado por estos autores, el incremento del número de nódulos en el presente estudio, quizás sea resultado del aumento del desarrollo radical por la inoculación de las plantas y a las condiciones favorables del suelo.

La actividad enzimática Nitrato reductasa (NR) puede presentarse en diferentes órganos y proporciona una estimación del contenido de N en la planta y, muy a menudo, se correlaciona con su crecimiento y rendimiento ^27,28. En el trabajo, la inoculación de las semillas con B. elkanii causó aumentos de la actividad NR en las hojas como se ha demostrado para este cultivo y otras leguminosas inoculadas con Bradyrhizobium^29,30. Los mayores valores de NR se alcanzaron en la fase V2, que luego disminuyeron en V3-V4, inclusive, muy inferiores a los obtenidos en V1 (Tabla 1). Esto pudo deberse a que en esta última fase el aporte de N está más relacionado con la fijación del nitrógeno simbiótico ³¹.

Por su parte, la aspersión foliar del quitosano estimuló la enzima NR en soya, en dependencia de la concentración empleada. Aumentos de la actividad enzimática se han informado por investigadores ^32,33 en diversos cultivos, que dependieron de la concentración y la especie vegetal tratada, con la aspersión foliar de las concentraciones de quitosano evaluadas en nuestro trabajo. Las concentraciones 10 y 50 mg L^-1 de quitosano en este trabajo, favorecieron el número y la masa seca de los nódulos formados, pero redujeron la actividad NR en hojas durante la etapa V3-V4 de crecimiento de la soya. Sin embargo, en esta etapa, la actividad NR se benefició con las distintas concentraciones de quitosano a partir de 10 mg L^-1, en menor medida 1000 mg L^-1, con relación a las plantas controles (Tabla 1). Lo anterior demuestra que el aporte de N con las concentraciones más bajas de quitosano pudo deberse más al proceso de fijación biológica del nitrógeno, mientras que con las concentraciones medianas pudo estar más relacionado a la actividad NR.

Es sabido que las plantas inoculadas con Bradyrhizobium favorecen el estado nutricional de la soya en relación a las plantas que no se inoculan ^23,34 porque activan cambios metabólicos en la planta, específicamente el incremento del contenido de proteínas, nitrógeno y otros nutrientes ³⁵, lo cual se traduce en una mejora del rendimiento de las leguminosas y ha sido explotado en la agricultura durante años. El efecto que algunos autores le atribuyen a la inoculación es constatado en el trabajo, con los incrementos de la concentración de magnesio, manganeso y sodio en nódulos; así como también, nitrógeno y magnesio en hojas, respecto a las plantas no inoculadas (Tablas 2 y 3). Estos nutrientes minerales influyen en el desarrollo nodular, en la FBN y en el crecimiento de las plantas, en cantidades, momentos y modos diferentes ^36,37.

A su vez, las concentraciones más bajas de quitosano también estimularon la concentración de algunos nutrientes, fundamentalmente los oligoelementos (Tablas 2 y 3), que coincidieron en estimular la formación y la masa seca de los nódulos en las raíces de soya, lo que sugiere que dichas concentraciones favorecieron el proceso simbiótico del cultivo. Este planteamiento es motivo de futuras investigaciones para dilucidar el posible mecanismo de estimulación del quitosano. Similares resultados de incrementos del contenido de nutrientes en leguminosas se han informados con la aplicación conjunta de quitosano y biofertilizantes a base de bacterias diazotróficas libres, con 40 % de incrementos en el contenido de nitrógeno en plantas de caupí (Vigna unguiculata) y maíz (Zea mays) ^34,38. Se ha informado que el quitosano aumenta la disponibilidad y la absorción de nutrientes en plantas con otras formas de aplicación ^5,19,39.

En este estudio, el fósforo se encontró en mayores concentraciones en los nódulos que en hojas (Tablas 2 y 3). Se ha comprobado que los nódulos son importantes sumideros de este nutriente porque se requiere para la interacción simbiótica, la nodulación y la fijación biológica del nitrógeno (FBN) ³⁶. Estos procesos están fuertemente influenciados por la disponibilidad de fósforo en el suelo. Teniendo en cuenta lo anterior, la disponibilidad de fósforo en el suelo donde se crecieron las plantas de soya fue elevada (Tabla 1), lo que pudo favorecer su absorción por la planta.

Por su parte, el quitosano a la concentración de 1000 mg L^-1 incrementó la concentración de nitrógeno en los nódulos, pero disminuyó la concentración de fósforo (Tabla 2), quizás como resultado del gasto energético que se requirió para mantener la FBN, la translocación de fotosintatos a las hojas desde los nódulos y su asimilación en este órgano.

Es conveniente destacar que el polímero también aumentó la concentración de calcio y manganeso en ambos órganos de soya (Tablas 2 y 3). Incrementos de estos nutrientes se han informado en pepino ⁴⁰ y otros cultivos ^41,42, con la aplicación de quitosano. El calcio actúa como un mensajero secundario en los procesos metabólicos relacionados con la morfogénesis, el desarrollo y la protección de las plantas ante estreses a (bióticos) ⁴³. De igual modo, el manganeso induce la síntesis de poliamidas que son requeridas para el crecimiento de las plantas y la detoxicación de especies reactivas de oxígeno, principalmente en las etapas iniciales de la interacción simbiótica ³⁶.

En hojas de diferentes especies de plantas se ha comprobado una mejora en la eficiencia de la utilización de la luz, la estabilidad de las clorofilas e incrementos en el diámetro de los cloroplastos con la aplicación de quitosano ⁵. También, Hasanah & Sembiring ⁴⁴ informaron incrementos de las clorofilas y la densidad estomática, en hojas de soya con la aplicación previa de quitosano. Además, según Soundararajan ⁴⁵, existe una relación positiva entre el contenido de clorofilas y la asimilación del carbono en soya, cómo resultado de un incremento lineal de la tasa fotosintética y de la actividad de las enzimas Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y Ribulosa-bifosfato carboxilasa (Rubisco).

Por lo anterior, el aumento del contenido relativo de clorofilas en los trifoliolos entre 6 y 8 %, con las concentraciones entre 10 y 500 mg L^-1 de quitosano respecto al control absoluto (CA), y del área foliar hasta el 49 % (500 mg L^-1), debe favorecer una mayor fotosíntesis de las plantas y por ende, la disponibilidad de azúcares para la síntesis de nuevos asimilados, lo que puede ser una ventaja agroproductiva de las plantas asperjadas con el polímero. La soya, como típica planta C3 es más dependiente de la función dual de la enzima Rubisco, por lo que los tratamientos con quitosano deben desplazar el equilibrio fotosíntesis-respiración en favor del primer proceso y por tanto hacia un mejor crecimiento vegetativo, lo cual se demuestra con la ganancia de una mayor masa seca aérea y radical en las plantas de este trabajo con determinadas concentraciones.

Aunque no se conoce totalmente el mecanismo de acción a través del cual el quitosano aumenta el crecimiento y la productividad de los cultivos, si se ha informado un efecto antitranspirante cuando se aplica por aspersión foliar ⁴². El quitosano causa el cierre estomático en las hojas ⁴⁶ y evita la pérdida de agua por transpiración (efecto antitranspirante), lo cual reduce el consumo de agua por la planta y regula su disponibilidad para los distintos procesos de la planta, siendo esto esencial en plantas C3 en beneficio de la fotosíntesis. A lo anterior se le debe adicionar el incremento encontrado, con la aplicación de quitosano, en el contenido de algunos nutrientes esenciales relacionados con el desarrollo vegetativo como el calcio, hierro y manganeso.

El quitosano estimuló las variables morfoagronómicas, el contenido relativo de clorofilas y el desarrollo radicular, fundamentalmente, a las concentraciones de 100 a 1000 mg L^-1, específicamente, la aplicación 500 mg ^-1 de quitosano mejoró el número de hojas en un 19 %, la masa seca aérea en más de un 40 %, la masa seca radical y el área foliar en un 55 %. Estos resultados confirman lo obtenido por otros autores, con la aspersión foliar de quitosano en leguminosas y otras especies de plantas ^22,23,47,48. Sin embargo, la sola inoculación con el simbionte mejoró el comportamiento general de las plantas, la concentración de nitrógeno foliar (40 %), el número de hojas (10 %) y la masa seca aérea (21 %).

En consecuencia, y a partir de los resultados obtenidos, el efecto en el crecimiento de las plantas de soya, encontrado en este trabajo, se debió a un aumento en el contenido de nutrientes disponibles en la planta, tanto como resultado de la inoculación con Bradyrhizobium como por la aplicación adicional de quitosano que en dependencia de la concentración empleada, mejoró la fijación biológica del N y la actividad de la enzima NR más allá del efecto de la inoculación, lo que potencialmente mejora el contenido proteico y de compuestos nitrogenados del que dispone la planta para su crecimiento. A lo anterior, debe añadirse una mejora en el proceso fotosintético de las plantas evaluadas. Es por ello que los estudios futuros en este tema deben estar encaminados a conocer cómo se comportan ambas formas de entrada y transporte de nitrógeno en soya, en diferentes órganos (nódulos, raíz y hojas) y dinámicas de tiempo, cuando se aplica quitosano por aspersión foliar, y se inocula con Bradyrhizobium, para dilucidar el aporte de cada vía al crecimiento y la productividad de IS-27 y en indicadores relacionados con la fotosíntesis.

Teniendo en cuenta los resultados alcanzados en la nodulación, la fisiología y el crecimiento vegetativo de las plantas inoculadas con Bradyrhizobium y asperjadas foliarmente con quitosano, estos pudieran repercutir en el incremento de los rendimientos de soya cv IS-27, algo por demostrar a escala productiva. En tal dirección se demostró que existe una correlación positiva entre las clorofilas (0,85) y área foliar (0,743) con la tasa fotosintética de plantas de soya en la etapa V4 de crecimiento y de esta, a su vez, con el rendimiento del cultivo ⁴⁹.

Chitosan is a linear biopolymer of glucosamine monomers and a small amount of N-acetyl-glucosamine monomers, derived by partial deacetylation of chitin, which is as the second most abundant polysaccharide in nature after cellulose recognized ¹. Chitosan is a recognized agricultural biostimulant for causing biological effects in plants such as promoting growth and development and anti-stress protection through the activation of plant metabolism. In this way, the stimulation of growth and development in plants by polymers and oligomers of chitosan is the result of the benefit of the accumulation of essential nutrients, of the photosynthesis process and the accumulation of carbohydrates, of the activation of enzymes of carbon metabolism and nitrogen and the increase in the content of secondary metabolites ^2-5.

Some authors have reported benefits in the development of soybeans with chitosan and its derivatives with different molecular masses, concentrations, forms and times of application of these compounds ^6-9. In particular, most of the investigations carried out in the cultivation with foliar spraying have used high concentrations of chitosan and its derivatives (from 1 to 40 g L^-1), with significant consequences in its development that, even, have reduced the negative effects caused by abiotic stresses ^3,10. However, previous results in the cultivar IS-27 demonstrate the positive effect of concentrations lower than 1 g L^-1 of a chitosan polymer and oligomer, on nodulation and growth in vitro¹¹.These concentrations have not been in this cultivar evaluated by foliar spraying of the polymer.

Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of different concentrations (1, 10, 50, 100, 500 and 1000 mg L^-1) of chitosan, applied in stages V1 and V2 by foliar spraying, on indicators of nodulation, physiology and vegetative growth of soybean cv IS-27 inoculated with Azofert-S^®, under controlled conditions.

When evaluating the effect of chitosan applied by foliar spray of soybeans, a superiority of concentrations 10 and 50 mg L^-1 is observed, in the formation of nodules in the main root (RP), in addition to 500 mg L^-1 in the roots secondary (RS), compared to CA. While in the number of total nodules (NT), the aforementioned concentrations stood out, with respect to the controls. The increases in these chitosan concentrations ranged between 32 and 74 %, with respect to the plants inoculated with Bradyrhizobium (Figure 1).

Even when large differences were found in the number of nodules, the differences in their dry mass were lower, between the inoculated plants (CI) and those treated with chitosan by foliar spraying (Figure 1). Chitosan applied by foliar spray of soybean did not modify the dry mass of the nodules formed on the main roots of the inoculated plants. However, the dry mass of the nodules formed in the secondary roots (RS) benefited with the 10 and 500 mg L^-1 concentrations of chitosan. The mass of the total nodules benefited with the 10, 50, 500 concentrations and 1000 mg L^-1 of chitosan, with increases in this variable, of approximately between 40 and 67 %, with respect to the CI (Figure 1).

Table 1 shows the nitrate reductase (NR) enzymatic activity determined in leaves collected at three moments of vegetative growth of soybean IS-27 plants. A first moment (V1), in which the chitosan foliar spraying had not been carried out, to compare the values of the control plants. The other two moments were seven days after each chitosan foliar spray was performed.

In phase V1 of plant growth, the student's t test showed significant differences between the controls (CA and CI), highlighting the inoculation of B. elkanii on the non-inoculated plants in a higher NR activity (40 % increase) determined in sheets (Table 1). In the following stages, the plants sprayed with chitosan produced higher values of nitrite (NO^-2), which immediately became ammonia (a form assimilable by the plants). Chitosan concentrations from 10 to 500 mg L^-1 contributed to the accumulation of this activity at both times. However, in phase V2, there were increases between 10 and 28 %, with respect to the inoculated control0 while in V3 the activity increases with chitosan were between 0.5 and 4.3 times higher than the activity value of the inoculated control despite having the lowest absolute values (Table 1).

The foliar application of chitosan did not modify the response found in the concentration of N in the soybean organs beyond the increase obtained with the inoculation of the seeds with the bacteria. It is excepted with the concentration of 1000 mg L^-1 in the nodules that increased in 10 % the content of N, with respect to the CI (Table 2 and 3).

In soybean trifoliole, the concentration of P and K did not show significant differences between the treatments (Table 2). In general, there were no differences at the level of the nodules, except for the concentrations of 100 and 1000 mg L^-1, which reduced the content of K and P with respect to the CI, by 5 and 40 %, respectively (Table 3).

Although inoculation with Bradyrhizobium did not increase Ca and Mn levels with respect to CI, both nutrients were increased with several of the chitosan treatments in both organs evaluated (Table 2 and 3). Concentrations between 50 and 1000 mg L^-1 increased the Ca content between 56 and 87 % in the leaves and 10 and 22 % in the nodules, with the highest increase being 500 mg L^-1. On the other hand, the increase in the content of Mn in the leaves occurred with the applications of chitosan between 1 and 500 mg L^-1 with increases between 70 and 200 % above the controls, with the best treatment being 500 mg L^-1. In the nodules the increases occurred between 50 and 1000 mg L^-1, the best performance being with 50 mg L^-1 and with increases between 94 and 170 % with respect to the CI, which, in turn, reduced the content of Mn obtained with the CA.

The inoculation with the symbiont bacteria increased the Mg content by 219 and 156 % in leaves and nodules of the plants respectively, however, the application of all concentrations of chitosan reduced between 123 and 370 % in the leaves, except the concentration of 10 mg L^-1 that increased the Mg value of the inoculated control by 23 %. Similar behavior occurred in the nodules. All the chitosan treatments without exception reduced the Mg content, with respect to the inoculation between 57 and 1550 % (Table 2 and 3).

Fe levels were not affected by inoculation with Bradyrhizobium in both organs and were only increased with respect to CA with the application of 100 mg L^-1 of chitosan in the leaves with a 53 % increase and with 10 and 50 mg L^-1 in the nodules that increased 21 and 58 %, respectively (Table 2 and 3).

In soy leaves, concentrations from 50 to 1000 mg L^-1 of chitosan reduced the concentration of Zn and increased the concentration of Na, while Zn increased in the nodules, except for 100 mg L^-1. The inoculation did not affect the behavior of Zn in both organs (Table 2 and 3).

Chitosan affected the concentration of macronutrients and trace elements determined in soybean organs inoculated with Bradyrhizobium, depending on the concentration of the polymer and the plant organ. In general, the nutrients in the nodules were increased with 50 mg L^-1 of chitosan and in the third trifoliole, with the lowest concentrations (1 and 10 mg L^-1), except for nitrogen in both organs of the plants.

The relative content of total chlorophylls benefited with the application of concentrations of 10 to 500 mg L^-1 of chitosan, which increased the variable between 6 and 8.4 %, with respect to the non-inoculated plants, although without differences with the control inoculated (Figure 2).

The response in the vegetative growth of soybeans with the foliar application of chitosan showed significant differences in all the morphoagronomic variables evaluated in phase V4 (Table 4). All chitosan concentrations favored the emission of leaves in the plants, although without significant differences with CI. The higher concentrations (500 and 1000 mg L^-1) of chitosan stimulated the diameter of the stem of the plants, with increases between 10 and 16 %, with respect to the CA and CI controls; as well as the radical dry mass, which differed only from the CA, with increases of approximately 44 % (Table 4).

The length of the stem was stimulated with the concentrations 100 and 500 mg L^-1, with differences of the lower concentration (1 mg L^-1) sprayed and the CA. A similar result was found in the root length, but with the concentrations 100 and 1000 mg L^-1 (Table 1). However, all chitosan concentrations applied by foliar spraying stimulated the dry mass of the aerial part, between 48.96 and 23.06 %, in relation to the CA and CI controls. The concentration of 1000 mg L^-1 was the one who most stood out in increasing this indicator (Table 4).

The higher concentrations of chitosan favored the soybean leaf area, specifically, the concentration of 500 mg L^-1 that raised the variable by 49.24 %, differing from 1 mg L^-1 and the two controls (Table 4).

Chitosan applied by foliar spraying benefited the morphoagronomic response of soybeans inoculated with B. japonicum. The highest stimulating response to plant growth was found with concentrations of 100 to 1000 mg L^-1 of chitosan, mainly in the diameter of the stem, the dry biomass and the foliar area.

In this work, the effect of different concentrations of a chitosan polymer on nodulation, the enzymatic activity of foliar nitrate reductase, the concentration of macro and trace elements in nodules and third trifolioles and the content of chlorophylls was evaluated; as well as the vegetative growth of soybean cv IS-27 inoculated with Bradyrhizobium elkanii, under growth chamber conditions. In the aforementioned processes, a beneficial effect of the foliar application of the polymer (phases V1 and V2) was observed in most of the variables analyzed in phase V4 of the plants (Figures 1 and 2, Tables 1, 2, 3 and 4).

The different concentrations of chitosan applied by foliar spraying in soybeans inoculated with B. elkanii had a positive influence on the nodulation of the plants, with the greatest increases in the number and the nodular dry mass. All this with respect to the plants that were only inoculated, with the concentrations 10, 50 and 500 mg L^-1 of the polymer (Figure 1 A and B). The increase in both variables translates into a higher content of bacteroides, which would increase the rate of nitrogen fixation ¹⁶. These results confirm what other authors in the number of nodules obtained and acetylene reduction activity (ARA) in soybeans, through other forms of application of chitosan compounds, in concentrations of 40, 50 and 1000 mg L^{-1 (17-19}.

On the other hand, several studies on legumes report the beneficial effect of inoculation with biofertilizers with respect to plants that have not been inoculated ^20-23, which is consistent with the results obtained in this study. The plants that were not inoculated barely noduled, which shows the effectiveness of the Bradyrhizobium strain, the cell concentration and dose of the inoculum used, with respect to the resident population of bradyrizobia in the soil used (Figure 1). This corroborates what has been reported by other authors ^23,24.

The plants of the different inoculated treatments presented a number of nodules suitable for the vegetative stage, of uniform size and were located, fundamentally, in the crown and the main root of the plants (Figure 1 A and B), which is attributed to an effectiveness of the inoculation. This was corroborated with 100 % effective nodules found in all treatments. Some authors suggest that the occurrence and distribution of nodules in host plants depend on root development, soil conditions and the legume species. In the case of soybeans, the nodules are located mainly in the main root ^25,26. Based on the information reported by these authors, the increase in the number of nodules in the present study is perhaps the result of the increase in root development due to the inoculation of plants and favorable soil conditions.

Nitrate reductase (NR) enzymatic activity can occur in different organs and provides an estimate of the N content in the plant and, very often, is correlated with its growth and yield ^27,28. At work, the inoculation of the seeds with B. elkanii caused increases in the NR activity in the leaves, as has been demonstrated for this crop and other legumes inoculated with Bradyrhizobium^29,30. The highest NR values were reached in phase V2, which later decreased in V3-V4, inclusive, much lower than those obtained in V1 (Table 1). This could be because in this last phase the contribution of N is more related to the fixation of symbiotic nitrogen ⁽³¹.

For its part, the foliar spraying of chitosan stimulated the NR enzyme in soybeans, depending on the concentration used. Increases in enzyme activity have been reported in various crops ^32,33, which depended on the concentration and the plant species treated, with foliar spraying of the chitosan concentrations evaluated in our work. The concentrations of 10 and 50 mg L^-1 of chitosan in this work favored the number and dry mass of the nodules formed, but reduced the NR activity in leaves during the V3-V4 stage of soybean growth. However, in this stage, the NR activity benefited with the different concentrations of chitosan from 10 mg L^-1, to a lesser extent 1000 mg L^-1, in relation to the control plants (Table 1). The above shows that the contribution of N with the lowest concentrations of chitosan could be due more to the process of biological nitrogen fixation, while with the medium concentrations it could be more related to the activity NR.

It is known that plants inoculated with Bradyrhizobium favor the nutritional status of soybeans in relation to plants that are not inoculated ^23,34) because they activate metabolic changes in the plant, specifically the increase in the content of proteins, nitrogen and other nutrients ³⁵, which translates into improved legume yields and has been exploited in agriculture for years. The effect that some authors attribute to inoculation is verified at work, with increases in the concentration of magnesium, manganese and sodium in nodules; as well as nitrogen and magnesium in leaves, with respect to non-inoculated plants (Tables 2 and 3). These mineral nutrients influence nodular development, BNF and plant growth, in different amounts, times and ways ^36,37.

In turn, the lower concentrations of chitosan also stimulated the concentration of some nutrients, fundamentally the trace elements (Tables 2 and 3), which coincided in stimulating the formation and dry mass of nodules in soybean roots, which suggests that said concentrations favored the symbiotic process of the culture. This approach is the reason for future research to elucidate the possible stimulation mechanism of chitosan. Similar results of increases in the content of nutrients in legumes have been reported with the joint application of chitosan and biofertilizers based on free diazotrophic bacteria, with 40 % increases in nitrogen content in cowpea (Vigna unguiculata) and corn (Zea may) ^34,38. Chitosan has been reported to increase nutrient availability and absorption in plants with other forms of application ^5,19,39.

In this study, phosphorus was found in higher concentrations in nodules than in leaves (Tables 2 and 3). Nodules have been shown to be important sinks for this nutrient because it is required for symbiotic interaction, nodulation, and biological nitrogen fixation (BNF) ³⁶. These processes are strongly influenced by the availability of phosphorus in the soil. Taking into account the above, the availability of phosphorus in the soil where the soybean plants were grown was high (Table 1), which could favor its absorption by the plant.

For its part, chitosan at a concentration of 1000 mg L^-1 increased the concentration of nitrogen in the nodules, but decreased the concentration of phosphorus (Table 2), perhaps because of the energy expenditure required to maintain the BNF, the translocation of photosynthates to the leaves from the nodules and their assimilation in this organ.

It should be noted that the polymer also increased the concentration of calcium and manganese in both soybean organs (Tables 2 and 3). Increases in these nutrients have been reported in cucumber ⁴⁰⁾ and other crops ^41,42, with the application of chitosan. Calcium acts as a secondary messenger in metabolic processes related to morphogenesis, development and protection of plants against (biotic) stresses ⁴³. Similarly, manganese induces the synthesis of polyamides that are required for plant growth and the detoxification of reactive oxygen species, mainly in the initial stages of symbiotic interaction ³⁶.

In leaves of different plant species, an improvement in the efficiency of the use of light, the stability of chlorophylls and increases in the diameter of chloroplasts with the application of chitosan has been verified ⁵. In addition, researchers reported increases in chlorophylls and stomatal density in soy leaves with the previous application of chitosan ⁴⁴. In addition, there is a positive relationship between chlorophyll content and carbon assimilation in soybeans ⁴⁵, because of a linear increase in the photosynthetic rate and the activity of the enzymes Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Ribulose-bisphosphate carboxylase (Rubisco).

Therefore, the increase in the relative content of chlorophylls in trifoliole between 6 and 8 %, with concentrations between 10 and 500 mg L^-1 of chitosan with respect to the absolute control (CA), and of the leaf area up to 49 % ( 500 mg L^-1). It must favor a greater photosynthesis of the plants and therefore, the availability of sugars for the synthesis of new assimilates, which can be an agro-productive advantage of the plants sprinkled with the polymer. Soy, as a typical C3 plant, is more dependent on the dual function of the Rubisco enzyme, so chitosan treatments must shift the photosynthesis-respiration balance in favor of the first process and therefore towards better vegetative growth. It shows with the gain of a greater aerial and radical dry mass in the plants of this work with certain concentrations.

Although the mechanism of action through which chitosan increases crop growth and productivity is not fully understood, an antiperspirant effect has been reported when applied by foliar spray ⁴². Chitosan causes stomatal closure in the leaves ⁴⁶ and prevents water loss through perspiration (antiperspirant effect), which reduces water consumption by the plant and regulates its availability for the different processes of the plant, this being essential in C3 plants to benefit photosynthesis. To this must be added the increase found, with the application of chitosan, in the content of some essential nutrients related to vegetative development such as calcium, iron and manganese.

Chitosan stimulated morphoagronomic variables, relative chlorophyll content and root development, mainly at concentrations of 100 to 1000 mg L^-1, specifically; the application of 500 mg L^-1 of chitosan improved the number of leaves by 19 %, the aerial dry mass in more than 40%, the root dry mass and the foliar area in 55 %. These results confirm what was obtained by other authors, with the foliar spraying of chitosan in legumes and other plant species ^22,23,47,48. However, the single inoculation with the symbiont improved the general behavior of the plants, the foliar nitrogen concentration (40 %), the number of leaves (10 %) and the aerial dry mass (21 %).

The effect on the growth of soybean plants from the results obtained, found in this work, was due to an increase in the content of nutrients available in the plant. Both as a result of inoculation with Bradyrhizobium and by the additional application of chitosan which, depending on the concentration used, improved the biological fixation of N and the activity of the NR enzyme beyond the effect of inoculation, which potentially improves the protein content and nitrogen compounds available to the plant for its growth. To the above, an improvement in the photosynthetic process of the evaluated plants must be added. That is why, future studies on this topic should be aimed at knowing how both forms of nitrogen entry and transport behave in soybeans, in different organs (nodules, roots and leaves) and time dynamics, when chitosan is applied by aspersion foliar, and inoculated with Bradyrhizobium. All this to elucidate the contribution of each pathway to the growth and productivity of IS-27 and in indicators related to photosynthesis.

Taking into account the results achieved in the nodulation, physiology and vegetative growth of plants inoculated with Bradyrhizobium and foliar sprayed with chitosan, these could have an impact on the increase in the yields of soybean cv IS-27, something to be demonstrated on a productive scale. In this direction, some studies showed that there is a positive correlation between chlorophylls (0.85) and leaf area (0.743) with the photosynthetic rate of soybean plants in the V4 growth stage ⁴⁹⁾ and of this, in turn, with the crop yield.