El cultivo de especies y variedades de pastos más productivas, adaptadas a las diferentes condiciones edafoclimáticas en que se desarrolla la actividad pecuaria, es una de las vías para mejorar la base alimentaria del ganado ¹ y, en el caso específico de Cuba, adquiere gran importancia, pues solo entre el 15 y el 18 % de la superficie de los suelos que se dedican a la ganadería se encuentra ocupada por pastos mejorados y el resto lo constituyen pastizales naturales de muy baja productividad y escaso valor nutritivo ².

En los últimos años se han introducido en el país nuevas especies y cultivares pratenses y forrajeros obtenidos fundamentalmente en el Centro Internacional de Agricultura Tropical, entre los que se incluye el pasto Yacaré (Urochloa híbrido cv. CIAT BR 02/1752), resultante del cruzamiento de dos clones de este género, el cual se caracteriza por su elevada resistencia a la humedad, rápida cobertura del suelo y alto potencial productivo y valor nutricional. Para producir altos rendimientos con elevado valor nutritivo, este cultivo requiere un suministro adecuado de nutrientes ³.

Sin embargo, la baja fertilidad de los suelos que se dedican a la ganadería en Cuba y la escasez de fertilizantes en este sector, debido a sus altos precios en el mercado internacional, conduce a la búsqueda de alternativas para lograr su manejo sostenible ⁴.

En Cuba, durante los últimos años se ha avanzado en las investigaciones sobre el uso y manejo de los biofertilizantes micorrízicos en los pastos, quedando demostradas sus potencialidades para aumentar el rendimiento y el valor nutritivo de la biomasa y, a la vez, disminuir entre 30 y 50 % sus requerimientos de fertilizantes minerales u orgánicos ^5-7.

No obstante, en las investigaciones señaladas también se ha podido comprobar que la efectividad de la biofertilización depende de la cepa de HMA inoculada, la especie o cultivar de pasto y las condiciones edáficas donde tiene lugar su cultivo, así como de su manejo. De modo que evaluar la respuesta de las nuevas especies que formarán parte de la estructura varietal de los pastizales del país resulta imprescindible para lograr la respuesta productiva que necesita la ganadería y, a la vez, hacer un uso racional de tales insumos.

Basado en lo antes expuesto se realizó esta investigación con los objetivos de evaluar la influencia de la inoculación con especies de hongos micorrízicos arbusculares para el pasto Yacaré (Urochloa híbrido cv. CIAT BR 02-1752) cultivado en un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado y seleccionar la más efectiva para su uso como biofertilizante.

El experimento se realizó en la microestación de Pastos y Forrajes de la Empresa Pecuaria Genética “Niña Bonita”, ubicada en el municipio Bauta, provincia Artemisa, sobre un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado ⁸, cuyas principales características químicas se presentan en la Tabla 1.

El suelo poseía un pH ácido, contenido medios de materia orgánica y potasio intercambiable (K), así como una capacidad de intercambio de bases (CIB), de acuerdo con su tipo. El fósforo asimilable (P₂O₅) presentó contenidos medios. Para los análisis del suelo se utilizaron los métodos establecidos en el laboratorio de suelos, abonos orgánicos y tejido vegetal del Departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) ⁹.

Durante el período en que se desarrolló el experimento, se observaron dos épocas bien definidas, una lluviosa (mayo-octubre), donde se acumuló el 77 % de la precipitación total y otra poco lluviosa (noviembre-abril), donde sólo se acumuló el 23 %. Entre mayo y octubre se registraron los mayores valores de las temperaturas máxima (32,4-32,9 ºC), media (27,5-27,7 ºC) y mínima (20,8-3,7 ºC) ¹⁰.

La siembra se realizó en mayo de 2016 y el experimento tuvo una duración de un año. El primer corte se efectuó a los 90 días después de la siembra y, posteriormente, a intervalos aproximados de 45 y 90 días durante el período lluvioso y poco lluvioso, respectivamente, en dependencia de la producción de biomasa aérea, hasta totalizar cinco cortes.

En el experimento se evaluaron cuatro tratamientos, consistentes en la inoculación de las especies de HMA Glomus cubense (Y. Rodr. & Dalpé) ¹¹ cepa INCAM-4, Funneliformis mosseae (Nicol. & Gerd.) Walker & Schüßler ¹² cepa INCAM-2 y Rizhophagus irregularis (N. C. Schenck & G. S. Sm.) Sieverd., G. A. Silva & Oehl) cepa INCAM-11 y un testigo sin inocular, los cuales se distribuyeron en un diseño cuadrado latino. Las parcelas tenían una superficie de 28 m² y un área de cálculo de 21 m².

El suelo se preparó de forma convencional, con una secuencia de labores de roturación (arado), grada, cruce (arado) y grada, a intervalos aproximados de 20 días entre cada una. El pasto se sembró en surcos separados a 70 cm y a chorrillo, a una profundidad de 1,5 cm. Para la siembra se utilizó una dosis entre 10 kg de semilla total ha^-1, para entregar 1 kg de semilla pura germinable ha^-1. El experimento se condujo en condiciones de secano y no se aplicaron fertilizantes químicos, ni abonos orgánicos.

La inoculación se realizó al momento de la siembra por el método del recubrimiento de las semillas, para lo cual se sumergieron en una pasta fluida, elaborada mediante la mezcla de una cantidad de inóculo sólido equivalente al 10 % del peso de las mismas (1 kg) y 600 mL de agua ¹³. Una vez recubiertas las semillas y solidificado el inóculo, se procedió a la siembra. Para ello se utilizó el inoculante micorrízico EcoMic^®, producido en el Departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas del INCA, con una concentración de 35 esporas de la especie de HMA a evaluar, por gramo de inoculante.

En cada corte se cosechó la masa verde (MV) de la parte aérea de las plantas que se encontraban en el área de cálculo de las parcelas; esta se pesó con una balanza de 0,5 kg de precisión y de ella se tomó una muestra de 200 g, la cual se llevó a una estufa de circulación de aire a 70 ºC hasta alcanzar una masa constante, para determinar el porcentaje de masa seca (MS). El rendimiento de MS se calculó a partir del rendimiento de masa verde (MV) y el porcentaje de MS ¹⁰. A las muestras secas en la estufa se le determinaron el contenido de proteína bruta (PB) = N x 6,25 ¹⁴, la digestibilidad de la materia orgánica ¹⁵. La fibra Neutro Detergente FND ¹⁶. Las concentraciones de N P K se determinaron como porcentaje de la masa seca ⁹.

En cortes alternos y al momento de la cosecha de la masa verde, de cada parcela se tomaron cinco submuestras de suelo de la rizosfera a una profundidad de 0-20 cm, mediante el empleo de un cilindro metálico de 2,5 cm de diámetro y 20 cm de altura, que se distribuyeron en puntos equidistantes y separados a 10 cm de los surcos, siguiendo el protocolo para la determinación de las estructuras micorrízicas en pastizales ¹⁷. Estas se homogenizaron para formar una muestra compuesta por parcela, de las cuales se extrajo 1 g de raicillas para su tinción y clarificación ¹⁸.

Se estimaron los indicadores de frecuencia e intensidad de la colonización ¹⁹ y el número de esporas en la rizosfera ²⁰, modificado por otros autores ²¹.

Se determinó además el índice de eficiencia (IE) de las cepas de HMA inoculadas y el grado de participación de las mismas en la nutrición de los pastos. El IE se calculó mediante la fórmula ²².

donde:

Rend. MS tto inoculado = rendimiento MS (t ha^-1) del tratamiento inoculado

Rend. MS testigo = rendimiento MS (t ha^-1) del testigo

Para calcular la participación de las cepas de HMA en la nutrición de los pastos se utilizó la siguiente fórmula ²³.

donde:

Conc. N, P, K biom. Aérea tto inoc. = concentración de N, P o K (%) de la biomasa aérea del tratamiento inoculado

Conc. N, P, K biom. Aérea tto inoc. = concentración de N, P o K (%) en la biomasa aérea del tratamiento testigo

El procesamiento estadístico de los datos se hizo mediante el análisis de varianza, según el diseño experimental utilizado y cuando se encontraron diferencias significativas entre tratamientos, se compararon las medias ²⁴. A los valores promedio de los análisis del suelo, así como al índice de eficiencia y a la participación de las cepas de HMA en la nutrición del pasto, se le estimó el intervalo de confianza de las medias a α=0,05 ²⁵. Todas las variables cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, por lo que en todos los casos se analizaron los datos originales ²⁶. Para el análisis de datos se utilizó el programa SPSS Statistics 21 ²⁷.

El efecto de los tratamientos en las estructuras micorrízicas del pasto se evaluó a través de las variables colonización y densidad visual, las cuales indican, en ese orden, el nivel de ocupación de la raíz de la planta hospedera por el hongo y la intensidad de la colonización, así como por el número de esporas de HMA en 50 g de suelo. Como puede apreciarse en la Tabla 2, durante el período lluvioso, todas las cepas incrementaron los niveles de colonización, densidad visual y el número de esporas en la rizosfera en relación con el testigo sin inocular, el cual reflejó el nivel de ocupación radical de los HMA residentes; sin embargo, los mayores valores de estas variables se alcanzaron con G. cubense.

En el período poco lluvioso, solo G. cubense produjo incrementos significativos en estas variables, pues los valores alcanzados por el resto de las especies de HMA no difirieron de los observados en el testigo sin inocular. Se constató que F. mosseae y R. irregularis no solo alcanzaron niveles de ocupación radical menores que G. cubense, sino que su efecto tuvo una menor duración en el tiempo, ya que se observó solamente en el período lluvioso. En experimentos realizados en condiciones de campo ^28,29, también observaron incrementos en los niveles de colonización, densidad visual y esporas en la rizosfera de plantas forrajeras inoculadas con HMA, aunque no todas las cepas tuvieron el mismo comportamiento.

Al analizar los resultados de los indicadores de las variables fúngicas, resultó evidente que las cepas introducidas fueron más efectivas que los HMA residentes para colonizar las raíces del pasto; sin embargo, no todas lo hicieron con igual intensidad, pues los mayores valores se obtuvieron con G. cubense, cuyo efecto, a diferencia de las otras, se extendió hasta el período poco lluvioso.

Varios estudios demuestran que las especies de HMA introducidas pueden alcanzar niveles de ocupación radical mayores que las residentes, en los casos en que estas no se encuentren en cantidades adecuadas o no sean lo suficientemente efectivas para colonizar las plantas cultivadas. Pero para alcanzar una adecuada colonización, la especie que se inocula debe ser compatible con el ambiente (cultivo hospedero, tipo de suelo y niveles de nutrientes del mismo), así como poseer mayor capacidad que los HMA residentes para competir y establecerse en el medio. Ello pudiera explicar el mejor comportamiento de G. cubense en las estructuras micorrízicas del pasto, en relación con el resto de las cepas inoculadas ³⁰.

Los valores absolutos de los porcentajes de colonización, densidad visual y el número de esporas en la rizosfera fueron mayores en la época de lluvia que en el período poco lluvioso, lo que pudo deberse a la influencia de las condiciones climáticas en la producción de biomasa. El rápido crecimiento de los pastos durante el período en que concurren los mayores niveles de precipitaciones, temperatura y luminosidad, propicia una mayor demanda de nutrientes y consecuentemente, la formación de mayores cantidades de estructuras fúngicas para facilitar el acceso de las plantas micorrizadas a los recursos del suelo ³¹.

Al igual que en las variables fúngicas, durante el período lluvioso se observó que todas las cepas incrementaron las concentraciones de N, P y K en la biomasa de la parte aérea, en relación con el testigo; sin embargo, los mayores valores de N y K se alcanzaron con G. cubense (Tabla 3). Para las concentraciones de P no se encontraron diferencias entre las cepas inoculadas. Estas también tuvieron un comportamiento diferenciado en el tiempo, pues en el período poco lluvioso sólo G. cubense logró incrementar las concentraciones de nutrientes en la biomasa aérea.

La influencia de las cepas en la nutrición del pasto, la cual se evaluó a través del incremento porcentual de las concentraciones de los macronutrientes primarios en la biomasa aérea en relación con el tratamiento no inoculado, se muestra en la Figura 1. En el período lluvioso G. cubense tuvo una participación mayor que el resto de las cepas, con incrementos alrededor del 25 % de los tenores de N y K. Los aumentos de ambos nutrientes que alcanzaron F. mosseae y R. irregularis exhibieron valores que no superaron el 13 %. La participación de todas las cepas en la nutrición fosfórica fue similar, con valores alrededor del 12 %. Durante el período poco lluvioso, solo G. cubense participó en la nutrición del pasto, con incrementos en las concentraciones de N y K en la biomasa entre 15 y 16 % y del 8 % en las concentraciones de P.

Se conoce que los HMA incrementan la absorción y traslocación de los nutrientes, a partir de las modificaciones morfológicas y fisiológicas que producen en las raíces de la planta hospedera, las cuales aumentan la superficie de contacto con el suelo ³². Sin embargo, el efecto de los HMA en la absorción de nutrientes depende de la efectividad de las cepas, el grado de dependencia micorrízica de la planta hospedera y la fertilidad del suelo, entre otros factores ³³.

En poáceas perennes se ha constatado que mayores niveles de colonización micorrízica se asocian, generalmente, con un aumento en la absorción de nutrientes ^6,34. Esto pudiera explicar las mayores concentraciones de N y K en la biomasa aérea de los pastos inoculados con G. cubense, así como su mayor participación en la nutrición nitrogenada y potásica del pasto, pues sus niveles de ocupación radical fueron significativamente mayores que los alcanzados por el resto de las cepas, tal como se pudo observar en la Tabla 2.

El hecho de que aun con G. cubense la participación de las cepas de HMA en la nutrición fosfórica haya sido baja, en relación con la nitrogenada y potásica, pudiera ser consecuencia de las características de la planta hospedera, aunque no se descartan otros factores. Las especies pratenses del género Urochloa responden a la fertilización nitrogenada y potásica ^35,36 y a juzgar por los tenores de materia orgánica y los contenidos de K asimilable del suelo, donde se realizó el experimento, estos no parecen suficientes para garantizar una adecuada nutrición de las plantas. En este sentido, las micorrizas pudieron hacer una contribución importante a la nutrición del pasto, al facilitar la absorción de ambos nutrientes del suelo.

Sin embargo, los pastos de este género tienen la facultad de acceder a formas de P menos móviles en el suelo, de modo que su respuesta a la aplicación de fertilizante fosfórico suele ser baja, aun en suelos con bajos tenores de este elemento ^37,38. Ello pudiera explicar la baja participación relativa de G. cubense en la nutrición fosfórica del pasto, a pesar de que alcanzó altos niveles de colonización, ya que al parecer, las plantas no sólo dependieron de una inoculación micorrízica efectiva para garantizar una adecuada nutrición fosfórica. De hecho, la participación de G. cubense en la nutrición fosfórica no difirió de la alcanzada por F. mosseae y R. irregularis, las cuales tuvieron una participación menos marcada en la nutrición del pasto.

Según estudios recientes, al evaluar la contribución de las cepas de HMA a la nutrición de diferentes cultivos, se puede observar que la simbiosis, más que favorecer la absorción de uno u otro elemento, se comportó como un mecanismo que permitió a las plantas obtener sus requerimientos nutricionales, en dependencia de sus propias necesidades y de la disponibilidad de los mismos en el suelo ³⁹.

La Tabla 4 muestra la influencia de la inoculación en el rendimiento de la biomasa de la parte aérea del pasto, así como el índice de eficiencia de las cepas de HMA, el cual expresa, en términos porcentuales, su efecto en el incremento de la productividad con respecto al tratamiento sin inocular (testigo). Durante el período lluvioso, todas las cepas aumentaron el rendimiento; sin embargo, el mayor efecto se obtuvo con G. cubense, el cual difirió significativamente del resto de los tratamientos. Esta cepa también mostró el mayor índice de eficiencia.

En el período poco lluvioso no se encontró efecto de F. mosseae ni de R. irregularis en el rendimiento, cuyos valores fueron similares al alcanzado en el testigo sin inocular, y ello también se reflejó en los bajos índices de eficiencia que alcanzaron ambas cepas. En esta época, solo G. cubense fue capaz de incrementar el rendimiento y, consecuentemente, exhibir el índice de eficiencia más alto, demostrando no solo una mayor efectividad, sino también una mayor permanencia en el tiempo.

Estos resultados indicaron que las cepas introducidas (sobre todo G. cubense), fueron más efectivas que los HMA residentes, para promover el rendimiento del pasto; y consecuentemente, que la biofertilización con HMA podría asumirse, al menos en las condiciones en que se realizó este estudio, como una práctica agronómica promisoria para mejorar la productividad del pasto Yacaré. Resultados similares fueron obtenidos por otros autores al inocular cepas eficientes de HMA, en pastos de los géneros Megathyrsus y Urochloa, respectivamente ^28,40.

En relación con el efecto de la inoculación con HMA, si bien se reconoce que la respuesta de los pastos suele variar en función de muchos factores, debido a que la ecología de estos microorganismos en los agroecosistemas de pastizales es bastante compleja, algunos autores plantean que la introducción de cepas seleccionadas puede ser una opción de manejo deseable e incluso necesaria, en los casos en que los HMA residentes no sean lo suficientemente efectivos para producir una respuesta agronómica importante en los cultivos ³⁴.

Al igual que en las variables fúngicas, se observó que el rendimiento durante el período poco lluvioso se redujo, como promedio, en un 70 % con respecto a la época lluviosa, lo cual es el resultado del carácter estacional de la producción de biomasa de los pastos, dado por el comportamiento de las variables meteorológicas a lo largo del año.

En el sitio donde se condujo el experimento, se observaron variaciones notables en los niveles de precipitaciones y temperaturas entre una y otra época, lo que sin dudas pudo haber repercutido en el rendimiento. La producción de biomasa de los pastos tropicales está estrechamente relacionada con el comportamiento de las precipitaciones, la temperatura y la luminosidad, las cuales inciden marcadamente en su crecimiento ⁴¹.

Sin embargo, lo más interesante fue constatar que la biofertilización con HMA puede incrementar el rendimiento del pasto, aun en la época poco lluviosa, período durante el cual se deprime notablemente la producción de biomasa y, por lo tanto, se necesita producir una mayor cantidad de alimento para los animales.

La biofertilización con HMA influyó en el valor nutritivo del pasto, aunque su efecto también dependió de la cepa inoculada; pues se pudo observar que todas incrementaron el contenido de proteína bruta y la digestibilidad de la biomasa. G. cubense, además, de producir el mayor efecto en ambas variables, disminuyó su contenido de fibra neutro detergente (Tabla 5).

La mejora del valor nutritivo de la biomasa estuvo en correspondencia con el efecto positivo que produjo la biofertilización en el estado nutricional del pasto. Como se pudo apreciar, con la inoculación se obtuvieron concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea más altas que en el testigo, lo cual no solo significó un aumento del contenido de proteína bruta, sino que, al parecer, repercutió en el resto de las variables. Precisamente, la cepa con la que se obtuvieron las mayores concentraciones de N, fue la que exhibió los mayores tenores de los indicadores del valor nutritivo evaluados.

Con la estimulación del crecimiento que produce el aumento de la disponibilidad de N en el suelo, ocurre un aumento en la utilización de los carbohidratos disponibles para la formación de células, en vez de incrementar el grosor de la pared celular. De este modo se reducen los tenores de fibra y lignina, aumentando la digestibilidad y el valor nutritivo del pasto ⁴².

Al analizar de forma integral los resultados obtenidos en este experimento, se observó que la respuesta del pasto a la inoculación de HMA dependió de la efectividad de la cepa, hecho que concuerda con lo observado por otros investigadores al evaluar el efecto de la introducción de especies de HMA en gramíneas forrajeras ⁶ y que parece estar asociado a la existencia de diferentes grados de compatibilidad entre la planta hospedera y el hongo.

En otros trabajos realizados se argumenta que, aunque no existe evidencia de una especificidad estricta hongo-planta, no todas las especies de HMA colonizan con la misma intensidad y eficiencia las distintas especies vegetales, quedando demostrada la existencia de distintos grados de compatibilidad en la simbiosis, como resultado de las influencias del ambiente sobre la expresión genotípica de ambos simbiontes ⁴³.

Tampoco puede descartarse la influencia del suelo en la efectividad de la cepa introducida, pues los estudios de inoculación de HMA que se realizan en Cuba en diferentes cultivos, demuestran la existencia de una alta relación entre la eficiencia de la cepa y el ambiente edáfico, en la respuesta de los cultivos a la biofertilización con hongos micorrízicos arbusculares ⁴⁴.

El efecto de G. cubense, que sin dudas resultó la cepa más efectiva, en el incremento del rendimiento del pasto, tiene estrecha relación con la mejora de su estado nutricional. Ello se hizo evidente, tanto por las mayores concentraciones de N, P y K en la biomasa aérea que se alcanzaron como resultado de su inoculación, como por su mayor participación en la nutrición del pasto. Tal comportamiento parece estar estrechamente relacionado con un aumento del aprovechamiento de los nutrientes del suelo, a partir de la formación de cantidades de estructuras micorrízicas que facilitaron el acceso de las plantas a tales recursos ⁴⁵. De este modo, la biofertilización con G. cubense se vislumbra como una alternativa promisoria para mejorar la productividad y el valor nutritivo de la biomasa del pasto Yacaré, al menos en condiciones similares, a las presentes en este estudio.

The cultivation of more productive species and pasture varieties, adapted to the different edaphoclimatic conditions in which the livestock activity takes place, is one of the ways to improve livestock food base ¹. In the specific case of Cuba, it acquires great importance, since only between 15 and 18 % of the land area dedicated to livestock is occupied by improved pastures, and the rest is made up of natural pasturelands of very low productivity and little nutritional value ².

In recent years, new species and pasture and forage cultivars have been introduced in the country, mainly obtained from the International Center for Tropical Agriculture, including Yacaré pasture (Urochloa hybrid cv. CIAT BR 02/1752). It has been resulted from the two clones cross of this genus, which is by its high resistance to humidity, rapid soil cover and high productive potential and nutritional value characterized. To produce high yields with high nutritional value, this crop requires an adequate supply of nutrients ³.

However, the soil low fertility used for livestock in Cuba and the fertilizer shortage in this sector due to its high prices in the international market, leads to the search for alternatives to achieve its sustainable management ⁴.

In Cuba, in recent years there has been progress in research on the use and management of mycorrhizal biofertilizers in pastures, demonstrating their potential to increase the yield and biomass nutritional value and, at the same time, decrease between 30 and 50 % its requirements for mineral or organic fertilizers ^5-7.

However, in the aforementioned investigations it has also been possible to verify that the biofertilization effectiveness depends on AMF inoculated strain, the species or cultivar of pasture and the edaphic conditions where its cultivation takes place, as well as its management. Thus, evaluating the response of the new species that will form part of the varietal structure of the country's pastures is essential to achieve the productive response that livestock needs and, at the same time, make a rational use of such inputs.

Based on the aforementioned, this research was carried out with the objectives of evaluating the inoculation influence with arbuscular mycorrhizal fungi species for Yacaré pasture (Urochloa hybrid cv. CIAT BR 02-1752) cultivated on a leached Red Ferrallitic soil, and selecting the most effective for use as a biofertilizer.

The experiment was carried out at the Pastures and Forages microstation of Niña Bonita Genetic Livestock Company, located in Bauta municipality, Artemisa province, on a leached Red Ferrallitic soil ⁸, whose main chemical characteristics are presented in Table 1.

The soil had an acid pH, medium content of organic matter and exchangeable potassium (K), as well as Cationic exchange capacity (CEC) according to its type. The assimilable phosphorus (P₂O₅) presented average contents. For soil analysis, in soil laboratory, organic fertilizers and plant tissue of Biofertilizers and Plant Nutrition Department from the National Institute of Agricultural Sciences (INCA) were used the methods established ⁹.

During the period in which the experiment was carried out, two well-defined seasons were observed, one rainy (May-October), where 77 % of the total precipitation was accumulated, and another with little rain (November-April), where only the 23 %. Between May and October, the highest values of the maximum temperatures (32.4-32.9 ºC), average (27.5-27.7 ºC) and minimum (20.8- 3.7 ºC) were recorded ¹⁰.

The sowing was in May 2016 carried out and the experiment lasted one year. The first cut was made at 90 days after sowing and later at approximate intervals of 45 and 90 days during the rainy and dry season, respectively, depending on the production of aerial biomass, until totaling five cuts.

In the experiment, four treatments were evaluated, consisting of AMF inoculation of the species Glomus cubense (Y. Rodr. & Dalpé) ¹¹⁾ INCAM-4 strain, Funneliformis mosseae (Nicol. & Gerd.) Walker & Schüßler ¹² INCAM-2 strain and Rizhophagus irregularis (NC Schenck & GS Sm.) Sieverd., GA Silva & Oehl) INCAM-11 strain, and an uninoculated control, which were distributed in a Latin square design. The plots had a surface area of 28 m² and a calculation area of 21 m².

The soil was prepared in a conventional way, with a plowing sequence (plowing), harrowing, crossing (plowing) and harrowing, at intervals of approximately 20 days between each one. The pasture was in rows separated at 70 cm sown and in a stream, at 1.5 cm depth. For sowing, a dose of 10 kg of total seed ha^-1 was used to deliver 1 kg of pure germinable seed ha^-1. The experiment was conducted under dry conditions and neither chemical fertilizers nor organic fertilizers were applied.

The inoculation was carried out at sowing time by the method of coating the seeds, for which they were immersed in a fluid paste, made by mixing a quantity of solid inoculum equivalent to 10 % of their weight (1kg) and 600 mL of water ¹³. Once the seeds had been coated and the inoculum solidified, they proceeded to sowing. For this, the mycorrhizal inoculant EcoMic^®, produced in the Department of Biofertilizers and Plant Nutrition of INCA, with a concentration of 35 spores of the AMF species to be evaluated, per gram of inoculant, was used.

In each cut, the green mass (GM) of plant aerial part that were in the calculation area of the plots was harvested. This was weighed with a precision balance of 0.5 kg. A 200 g sample was taken from it, which was taken to a circulating air oven at 70 ºC until reaching a constant mass, to determine dry mass percentage (DM). The DM yield was calculated from the green mass yield (GM) and DM percentage (10). The crude protein content (CP) = N x 6.25 ¹⁴ and organic matter digestibility ¹⁵ were determined from the dried samples in the oven. Fiber Neutral Detergent FND ¹⁶. The concentrations of N P K were determined as a percentage of the dry mass ⁹.

In alternate cuts and at the time of harvesting the green mass, five subsamples of rhizosphere soil were taken from each plot at 0-20 cm depth, using a metal cylinder of 2.5 cm in diameter and 20 cm high. They were distributed in equidistant points and 10 cm apart from the furrows, following the protocol for mycorrhizal structures determination in pasturelands ¹⁷. These were homogenized to form a sample composed per plot, from which 1 g of rootlets was extracted for staining and clarification ¹⁸.

The indicators of frequency and intensity of colonization ¹⁹ and the number of spores in the rhizosphere ²⁰, modified by other authors ²¹, were estimated.

The efficiency index (EI) of the inoculated AMF strains and the degree of participation of the same in the nutrition of the pastures were also determined. The IE was calculated using the formula ²².

Where:

Yield. DM inoculated treat = DM yield (t ha^-1) of inoculated treatment

Yield. Control DM = DM yield (t ha^-1) of control.

To calculate the participation of AMF strains in pasture nutrition, the following formula was used ²³.

Where:

Conc. N, P, K biom. Aerial inoc treat. = concentration of N, P or K (%) of the aerial biomass of the inoculated treatment

Conc. N, P, K biom. Aerial inoc treat. = concentration of N, P or K (%) in the aerial biomass of control treatment

The statistical processing of the data was done through variance analysis, according to the experimental design used, and when significant differences were found between treatments, the means were compared ²⁴. At the average values of soil analyzes, as well as the efficiency index and AMF strain participation in pasture nutrition, the confidence interval of the means was estimated at α=0.05 ²⁵. All the variables fulfilled the assumptions of normality and variance homogeneity, for which the original data were analyzed in all cases ²⁶. The SPSS Statistics 21 program ²⁷ was used for data analysis.

Treatment effect on pasture mycorrhizal structures was evaluated through the variables colonization and visual density, which indicate, in that order, the root occupation level of the host plant by the fungus and colonization intensity, as well as by AMF spore number in 50 g of soil. As can be seen in Table 2, during the rainy season, all the strains increased colonization levels, visual density and spore number in the rhizosphere in relation to the uninoculated control, which reflected radical occupation level of resident AMF; however, the highest values of these variables were reached with G. cubense.

In the dry season, only G. cubense produced significant increases in these variables, since the values reached by the rest of AMF species did not differ from those observed in the control without inoculation. It was found that F. mosseae and R. irregularis not only reached lower levels of root occupation than G. cubense, but that their effect had a shorter duration in time, since it was only observed in the rainy season. In experiments carried out under field conditions, ^28,29, they also observed increases in colonization levels, visual density and spores in forage plant rhizosphere inoculated with AMF, although not all strains had the same behavior.

When analyzing indicators results of the fungal variables, it was evident that the introduced strains were more effective than resident AMF, to colonize pasture roots. However, not all did so with the same intensity, since the highest values were obtained with G. cubense, whose effect, unlike the others, extended until the dry season.

Several studies show that introduced AMF species can reach higher levels of root occupation than resident ones, in cases where these are not found in adequate quantities or are not effective enough to colonize cultivated plants. Nevertheless, to achieve adequate colonization, the species that is inoculated must be compatible with the environment (host crop, soil type and nutrient levels), as well as having a greater capacity than resident AMF to compete and establish themselves in the environment. This could explain the better behavior of G. cubense in pasture mycorrhizal structures, in relation to the rest of the inoculated strains ³⁰.

The absolute values of the colonization percentages, visual density and spore number in the rhizosphere were higher in the rainy season than in the dry one, which could be due to climatic condition influence on biomass production. The rapid growth of pastures during the period, in which the highest levels of rainfall, temperature and luminosity occur, enhances a greater demand for nutrients and consequently, greater amount formation of fungal structures to facilitate the access of mycorrhized plants to ground resources ³¹.

As in the fungal variables, during the rainy period, all the strains increased the concentrations of N, P and K in the biomass of the aerial part were observed, in relation to the control; however, the highest values of N and K were reached with G. cubense (Table 3). No differences were found between the inoculated strains for P concentrations. These also had a different behavior over time, since in the dry season, only G. cubense managed to increase nutrient concentrations in the aerial biomass.

Strain influence on pasture nutrition, which was evaluated through the percentage increase in the concentrations of the primary macronutrients in the aerial biomass in relation to the non-inoculated treatment, is shown in Figure 1. In the rainy season, G. cubense had a greater participation than the rest of the strains, with increases of around 25% in the levels of N and K. The increases of both nutrients reached by F. mosseae and R. irregularis exhibited values that did not exceed 13 %. The participation of all strains in phosphoric nutrition was similar, with values around 12 %. During the dry season, only G. cubense participated in pasture nutrition, with increases in N and K concentrations in the biomass between 15 and 16 %, and of 8 % in the concentrations of P.

AMF increases the absorption and translocation of nutrients, based on the morphological and physiological modifications that they produce in host plant roots, which increase the contact surface with the soil ³². However, AMF effect on nutrient absorption depends on strain effectiveness, mycorrhizal dependence degree of the host plant, and soil fertility, among other factors ³³.

In poaceae perennial plants, it has been found that higher levels of mycorrhizal colonization are generally associated with an increase in nutrient absorption ^34,6. This could explain the higher concentrations of N and K in pasture aerial biomass inoculated with G. cubense, as well as their greater participation in the nitrogen and potassium nutrition of the pasture, since their root occupation levels were significantly higher than the achieved ones, by the rest of the strains as could be seen in Table 2.

The fact that even with G. cubense AMF strain participation in phosphoric nutrition has been low, in relation to nitrogen and potassium, could be a consequence of host plant characteristics, although other factors are not ruled out. The pastureland species of the genus Urochloa respond to nitrogen and potassium fertilization ^35,36 and judging by the organic matter content and the assimilable K content of the soil where the experiment was carried out, these do not seem sufficient to guarantee plant adequate nutrition. In this sense, mycorrhizae were able to make an important contribution to pasture nutrition, by facilitating the absorption of both nutrients from the soil.

However, pastures of this genus have the ability to access less mobile P forms in the soil, so their response to phosphoric fertilizer application is usually low, even in soils with low levels of this element ^37,38. This could explain the low relative participation of G. cubense in the pasture phosphoric nutrition, despite the fact that it reached high levels of colonization, since; apparently, the plants not only depended on an effective mycorrhizal inoculation to guarantee adequate phosphoric nutrition. In fact, the participation of G. cubense in the phosphoric nutrition did not differ from that reached by F. mosseae and R. irregularis, which had a less marked participation in the nutrition of the pasture.

According to recent studies, when evaluating AMF strain contribution to different crop nutrition, it can be observed that symbiosis, rather than favoring the absorption of one or another element, behaved as a mechanism that allowed plants to obtain their nutritional requirements, depending on their own needs and their availability in the soil ³⁹.

Table 4 shows the inoculation influence on the biomass yield of pasture aerial part, as well as the efficiency index of the AMF strains, which expresses, in percentage terms, its effect on the productivity increase with respect to the treatment without inoculation (control). During the rainy season, all the strains increased their yield; however, the greatest effect was obtained with G. cubense, which differed significantly from the rest of the treatments. This strain also showed the highest efficiency index.

In the dry season, no effect of F. mosseae or R. irregularis was found on the yield, whose values were similar to those reached in the control without inoculation, and this was also reflected in the low efficiency indices reached by both strains. At this time, only G. cubense was able to increase performance and consequently exhibit the highest efficiency index, demonstrating not only greater effectiveness, but also greater permanence over time.

These results indicated that the introduced strains (especially G. cubense) were more effective than the resident AMF was, in promoting pasture yield and consequently, that biofertilization with AMF could be assumed, at least under the conditions in which this study was carried out, as a promising agronomic practice to improve the Yacaré pasture productivity. Similar results were obtained by other authors when inoculating AMF efficient strains, in pastures of the genera Megathyrsus and Urochloa, respectively ^28,40.

Regarding inoculation effect with AMF, although it is recognized that pasture response tends to vary depending on many factors, because of the ecology of these microorganisms in pastureland agroecosystems is quite complex. Some authors suggest that the introduction of selected strains can be a desirable and even necessary management option, in cases where resident AMF are not effective enough to produce an important agronomic response in crops ³⁴.

As in the fungal variables, it was observed that the yield during the little rainy season was reduced, on average, by 70 % with respect to the rainy season, which is the result of the seasonal nature of pasture biomass production, given by the behavior of meteorological variables throughout the year.

At the site where the experiment was conducted, notable variations in rainfall levels and temperatures were observed from one season to another, which undoubtedly could have had an impact on performance. The biomass production of tropical pastures is closely related to rainfall behavior, temperature and light, which have a marked influence on their growth ⁴¹.

However, the most interesting thing was to verify that biofertilization with AMF can increase pasture yield, even in the dry season, a period during which biomass production is significantly depressed and, therefore, a greater quantity needs to be produced of food for animals.

Biofertilization with AMF influenced the nutritional value of the pasture, although its effect also depended on the inoculated strain; it was observed that all increased the crude protein content and the biomass digestibility. G. cubense, in addition to producing the greatest effect on both variables, decreased its content of neutral detergent fiber (Table 5).

The improvement in the nutritional value of the biomass was in correspondence with the positive effect that biofertilization produced on the nutritional status of the pasture. As could be seen, with the inoculation higher concentrations of N in the biomass of the aerial part were obtained than in the control, which not only meant an increase in the crude protein content, but also, apparently, had an impact on the rest of the variables. Precisely, the strain with which the highest N concentrations were obtained was the one that exhibited the highest levels of the evaluated nutritional value indicators.

With growth stimulation produced by the increase in the N availability in the soil, there is an increase in the available carbohydrate use for the formation of cells, instead of increasing the cell wall thickness. In this way, fiber and lignin content are reduced, increasing the digestibility and nutritional value of the pasture ⁴².

When comprehensively analyzing the results obtained in this experiment, it was observed that the pasture response of to the AMF inoculation depended on the strain effectiveness. This fact agrees to that observed by other researchers when evaluating the introduction effect of AMF species in forage pastures ⁶ and that seems to be associated with the existence of different compatibility degrees between the host plant and the fungus.

In other studies carried out, it is argued that, although there is no evidence of a strict fungus-plant specificity, not all AMF species colonize the different plant species with the same intensity and efficiency, being demonstrated the existence of different compatibility degrees in the symbiosis, because of environmental influences on the genotypic expression of both symbionts ⁴³.

The soil influence on the introduced strain effectiveness cannot be ruled out either, since AMF inoculation studies carried out in Cuba in different crops demonstrate the existence of a high relationship between the strain efficiency and the edaphic environment, in crop response to biofertilization with arbuscular mycorrhizal fungi ⁴⁴.

The G. cubense effect, which was undoubtedly the most effective strain, in increasing pasture yield, is closely related to the improvement of its nutritional status. This was evident both by the higher N, P and K concentrations in the aerial biomass that were reached as a result of its inoculation, as well as by its greater participation in pasture nutrition. Such behavior seems to be closely related to an increase in soil nutrient use, from the amounts formation of mycorrhizal structures that facilitated the access of plants to such resources ⁴⁵. Thus, biofertilization with G. cubense is as a promising alternative seen to improve the productivity and nutritional value of Yacaré pasture biomass, at least under similar conditions to those present in this study.