Los bioestimulantes usados en la agricultura, en los que se incluyen a las sustancias húmicas (SH), incrementan la eficiencia en la nutrición, la tolerancia al estrés abiótico y la calidad de los cultivos ^1,2. Las SH son formadas por transformaciones químicas y biológicas de material de plantas y animales, así como del metabolismo microbiano y representan la mayor reserva de carbono en la superficie terrestre ³. Estas sustancias se definen químicamente como una mezcla de diversas pequeñas moléculas que forman una asociación supramolecular estabilizada por interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrogeno ⁴ y se clasifican en función de su solubilidad en función del pH en ácidos húmicos (AH) y ácidos fúlvicos (AF).

Los efectos de las SH en las plantas son complejos e involucran procesos dinámicos no lineales e interrelacionados que deben ser tratados con una visión interdisciplinaria: arquitectura de las raíces, actividad H⁺-ATPasa de membrana, metabolismo primario y secundario, proteínas y expresión de genes, los que son dependientes de las condiciones ambientales, tipo de plantas y su ontogénesis ⁵. La intensidad y tipo de bioactividad de las SH en plantas está más relacionada a su complejidad estructural (conformación y organización estructural) que al tipo de estructuras presentes en estas ⁶.

La mayoría de las SH usadas en la agricultura son actualmente derivadas de fuentes no renovables y se requiere del desarrollo de productos húmicos a partir de fuentes renovables³, como es el caso de las SH aisladas de vermicompost. En el Departamento de Química de la Facultad de Agronomía de la Universidad Agraria de La Habana, durante varios años se ha venido desarrollando diferentes productos líquidos (extractos de SH:ESH) y sólidos (residuos sólidos obtenidos del proceso de extracción de SH:RS) a base de sustancias húmicas extraídas de vermicompost de estiércol vacuno. En otros trabajos ^7,8 se compilan los resultados de varios estudios con los ESH y RS en la agricultura y el medio ambiente y se señala que estos productos pueden incrementar la producción agrícola, mejorar las condiciones del suelo y retener cationes de metales pesados presentes en residuales líquidos. Varios estudios continúan demostrando que la aplicación foliar de los ESH en diferentes cultivos genera efectos beneficiosos en la productividad biológica y agrícola de los mismos ^9-12. En el cultivo del arroz se reportan estudios del efecto protector de los AH aislados de vermicompost frente a estrés oxidativo y estrés hídrico ^13-15; sin embargo, estudios en este cultivo sobre el uso de ESH son escasos. De esta forma, este trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad biológica de dos extractos de sustancias húmicas (ESH I y ESH II) en el cultivo del arroz (Oryza sativa L.), cultivar INCA LP-5.

El estudio se desarrolló en los laboratorios del Departamento de Química de la Facultad de Agronomía en la Universidad Agraria de La Habana (UNAH), durante el primer semestre del 2015. Se utilizó el cultivar de ciclo corto INCA LP-5, obtenido por Pérez y Castro ¹⁶ mediante el método de hibridación de las variedades CP1C8 y 2077, el cual fue donado y certificado por la Unidad Científica Tecnológica de Base (UCTB) “Los Palacios”, Pinar del Río, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA).

Los extractos de sustancias húmicas (ESH I y ESH II) fueron obtenidos a partir de un vermicompost de estiércol vacuno suministrado por la finca Guayabal, perteneciente al Complejo Científico de la UNAH, el que fue realizado en pilas sobre suelo con lombrices rojas africanas (Eiseinafoetida) durante tres meses. El vermicompost de estiércol vacuno tamizado (2 µm) y seco, fue sometido a extracción con una solución básica (KOH/Urea/KH₂PO₄-0,15/0,1/0,03 mol L^-1), en una proporción 1:10 (m:v), con modificaciones de la metodología de Hernández ¹⁷, propuestas por Lukambani ¹⁸. En la Figura 1 se presenta el diagrama de flujo para la obtención de los ESH, algunas propiedades químicas y físico-químicas de los extractos obtenidos se reportan en la Tabla 1.

La actividad biológica de extractos de sustancias húmicas en el cultivo del arroz fue evaluada en la fase germinativa y en la fase vegetativa, montando un experimento para cada una de estas. En la fase germinativa, semillas de arroz previamente seleccionadas por flotación fueron embebidas en agua durante 24 h; transcurrido este tiempo se secaron al aire y se colocaron a germinar en placa Petri, presencia de diluciones de los extractos ESH I y ESH II (Tabla 2), a razón de 100 semillas por placa. A los tres, cinco y siete días de colocadas a germinar, se efectuó el conteo de semillas germinadas tomándose la emisión de la radícula como criterio de germinación. Se calculó el porcentaje de germinación y se efectuó la medición de las longitudes de la radícula (en cm) y del coleoptilo (en cm) a 15 plántulas por tratamiento, correspondiente a cinco plántulas por placa.

Para la fase vegetativa, las semillas previamente seleccionadas fueron embebidas durante 24 horas en agua y en las diferentes diluciones de ESH I y ESH II (Tabla 2). Posteriormente, fueron sembradas en bandejas plásticas (18x3 cm) con suelo Gleysol Vértico ¹⁹ aproximadamente 50 semillas. A los 7 y 14 días de germinadas; se procedió a la aspersión foliar (200 mL) de diluciones de ESH I y ESH II, manteniéndose los tratamientos descritos anteriormente en la Tabla 2. A los 14 y 21 días de germinadas; se muestrearon de manera aleatoria 15 plántulas por tratamiento distribuidas en cinco plántulas por bandeja y se hizo la medición de la altura de la plántula (cm) y la longitud de las raíces (cm).

En ambos experimentos se empleó un diseño completamente aleatorizado con un total de siete tratamientos con tres réplicas para cada uno. Los datos se procesaron mediante un Análisis de Varianza de Clasificación Simple (ANOVA) con el software Statgraphics Plus versión 5.1, utilizándose la transformación arcos √ (%) cuando fue requerido y cuando se encontraron diferencias significativas entre las medias, se aplicó la prueba de Tukey al 95 % de probabilidad.

En la fase germinativa se aprecia para todos los tratamientos (Figura 2A) el efecto fisiológico deseado sobre la germinación (más del 90 % de las semillas germinan), además que las diluciones empleadas de los extractos húmicos ESH I y ESH II no afectan el porcentaje de germinación de las semillas de arroz.

Existen pocos reportes del efecto de las SH en el porciento de germinación, proceso en el que ocurren eventos metabólicos y celulares complejos, que se inician con la absorción de agua y finaliza con la emergencia de la radícula y que no incluye el crecimiento de la plántula ²⁰.

Los indicadores longitud del coleoptilo y longitud de la radícula de las plántulas de arroz a los 7 ddg las semillas (Figura 2 B) se modifican con el uso de los extractos de sustancias húmicas ESH I y ESH II. Es apreciable una tendencia al aumento de la longitud del coleoptilo con el uso de los ESH; sin embargo, solamente el tratamiento T5, que se corresponde con ESH II (1:50), difiere significativamente con el tratamiento control (T1). En el caso de la longitud de la radícula, a excepción de los tratamientos T3 y T4, es perceptible el incremento significativo de este indicador con el uso de los ESH. Sin embargo, solamente el tratamiento T7, que se corresponde con ESH II (1:70), difiere significativa y positivamente con el tratamiento control (T1).

La acción estimuladora de las SH en el crecimiento de las plántulas se ha reportado por varios autores ^3,7,21,22, la que ha sido asociada a un incremento de la actividad de la enzima H⁺-ATPasa de membrana plasmática ^23-25, de la misma forma que las auxinas exógenas inducen el crecimiento de las plantas; a la presencia de diferentes fitohormonas en la estructura de las SH ²⁶; y a la producción de especies reactivas de oxigeno (EROs), que funcionan como moléculas señal, provocando eventos como la hiperpolarización de la membrana y la activación de canales de Ca²⁺ intra y extracelulares ²⁷. Además, según García ⁶, la recalcitrancia y labilidad de las fracciones húmicas son propiedades químicas que definen la estimulación de los parámetros radiculares de las plantas, donde la longitud de la raíz y la emisión de raíces más pequeñas están relacionadas con estructuras menos complejas y funcionalizadas.

Los resultados de la aplicación foliar de los ESH en la fase vegetativa del arroz se presentan en la Figura 3 (A y B). La altura de las plantas de arroz (Figura 3 A), en ambos momentos de evaluación, de manera general se estimula con el uso de los ESH. Mientras que a los 14 ddg los tratamientos T2 y T3 (ESH I dilución 1:50 y 1:60, respectivamente) muestran valores de altura significativamente superior al control, a los 21 ddg solamente el tratamiento T5 (ESH II dilución 1:50) es el que muestra este comportamiento.

No se observó el mismo comportamiento en el indicador longitud de la raíz (Figura 3 B). Tanto a los 14 ddg como a los 21 ddg solamente el tratamiento T3 mostró valores significativamente superiores al control. Además a los 21 ddg, aunque no se aprecia un efecto inhibitorio del uso del ESH II se observa que el uso de las diluciones de este extracto resultaron las de menores valores de longitud de la raíz. Es posible que con el extracto ESH II sea necesario el uso de otras diluciones, considerando que el contenido de C orgánico de este extracto es superior al del ESH I (Tabla 1).

Los mecanismos de estimulación del crecimiento vegetal por la aplicación foliar de las SH son pocos discutidos. Las principales investigaciones están relacionados con la aplicación de estas sustancias por la raíz; no obstante, el efecto estimulante de la aplicación foliar está bien documentado. En una revisión sobre el empleo de AH y AF como bioestimulantes en plantas hortícolas ³, se reportan varios trabajos donde se realiza aplicación foliar de SH y los efectos encontrados son de incrementos en la floración, la fructificación, la producción, la calidad de fruto y el uso eficiente de nutrientes; pocos trabajos (3 de 19 trabajos reportados con aplicación foliar), relatan el efecto en el crecimiento de la raíz.

Los ESH de este trabajo son humatos potásicos aislados de vermicompost de estiércol vacuno, obtenido a partir del protocolo propuesto por Lukambani ¹⁸, quien modificó el protocolo de Hernández ¹⁷, por lo que nuestros resultados se corresponden con los reportados por Hernández et al., ²⁸, quienes en la evaluación de la aplicación foliar de diluciones de un humato aislado de vermicompost en el cultivo de la lechuga, encontraron que la dilución 1:60 produjo los impactos más notables en los indicadores de productividad biológica y agrícola, reduciendo el ciclo de producción del cultivo en 21 días, lo cual beneficia enormemente a los productores de esta hortaliza.

Es posible que la acción estimulante observada para los ESH sea debido a las SH que contienen (AH y AF), cuya polifuncionalidad y composición estructural heterogénea pueden contener compuestos estimuladores de actividades enzimáticas ²⁸ o a la presencia de otros componentes como aminoácidos, minerales, fitohormonas o precursores de fitohormonas, así como también de microorganismos ^8,17,18, o quizás a la acción conjunta de estos.

Los resultados encontrados en este trabajo sugieren la necesidad de evaluar en futuras investigaciones, las diferencias estructurales que pudieran presentar las sustancias húmicas de cada uno de los extractos, así como también las dosis y formas de aplicación de los ESH, incluso la posibilidad de combinarlos con bacterias promotoras del crecimiento vegetal ²⁹ para que estos bioestimulantes puedan ser incluidos en la producción orgánica y sostenible del arroz.

The biostimulants used in agriculture, which include humic substances (HS), increase the efficiency in nutrition, tolerance to abiotic stress and the quality of the crops ^1,2. HS are formed by chemical and biological transformations of plant and animal material, as well as microbial metabolism, and represent the largest carbon reserve on the earth's surface ³. These substances are defined chemically as a mixture of various small molecules that form a supramolecular association stabilized by hydrophobic interactions and hydrogen bonds ⁴ and they are classified according to their solubility as a function of pH in humic acids (HA) and fulvic acids (FA).

The effects of HS on plants are complex and involve non-linear and interrelated dynamic processes that must be treated with an interdisciplinary vision: architecture of the roots, membrane H⁺-ATPase activity, primary and secondary metabolism, proteins and gene expression, those that are dependent on environmental conditions, plant type and their ontogenesis ⁵. The intensity and HS bioactivity type in plants is more related to their structural complexity (conformation and structural organization) than to structure type present in them ⁶.

Most of the HS used in agriculture are currently derived from non-renewable sources and the humic product development from renewable sources is required ³, as it is the case of HS isolated from vermicompost. In the Chemistry Department of the Agronomy Faculty from Agrarian University of Havana, for several years different liquid products (HS: HSE extracts) and solid (solid waste obtained from the HS: RS extraction process) have been developed based on humic substances extracted from bovine manure vermicompost. In other works ^7,8 the results of several studies with HSE and RS in agriculture and the environment are compiled, and it is pointed out that these products can increase agricultural production, improve soil conditions and retain cations of heavy metals present in liquid waste. Several studies show that the foliar application of HSE in different crops generates beneficial effects on their biological and agricultural productivity ^9-12. In rice cultivation, studies of the protective effect of HA isolated from vermicompost against oxidative stress and hydric stress are reported ^13-15, however studies in this crop on the use of HSE are scarce. In this way, this work aimed to evaluate the biological activity of two extracts of humic substances (I and II HSE) in the cultivation of rice (Oryza sativa L.), cultivar INCA LP-5.

The study was developed in the laboratories of the Department of Chemistry of the Agronomy Faculty at the Agrarian University of Havana (UNAH), during the first semester of 2015. The short-cycle INCA LP-5 cultivar ¹⁶ using the hybridization method of the varieties CP1C8 and 2077, which was donated and certified by the Base Scientific Technological Unit (UCTB) Los Palacios, Pinar del Río, belonging to the National Institute of Agricultural Sciences (INCA).

The humic substance extracts of (I and II HSE) were obtained from a bovine manure vermicompost supplied by the Guayabal farm belonging to the UNAH Scientific Complex, which was carried out in piles on soil with African red worms (Eiseinafoetida) during three months. The sifted (2 µm) and dry bovine manure vermicompost was subjected to extraction with a basic solution (KOH/Urea/KH₂PO₄- 0.15/0.1/0.03 mol L^-1), in a ratio of 1: 10 (m: v), with modifications ¹⁷ and methodology proposed by Lukambani ¹⁸. In Figure 1 the flow diagram for obtaining HSE is presented, some chemical and physicochemical properties of the extracts obtained are reported in Table 1.

The biological activity of extracts of humic substances in rice cultivation was evaluated in the germination phase and in the vegetative one, setting up an experiment for each of these. In the germination phase, rice seeds previously selected by flotation were soaked in water for 24 h; after this time, they were air-dried and placed to germinate in a petri dish with dilutions of the HSE I and HSE II extracts (Table 2), at a rate of 100 seeds per plate. At 3, 5 and 7 days after being placed to germinate, the germinated seeds were counted, taking the radicle emission as germination criteria. The germination percentage was calculated and radicle lengths (in cm) and of the coleoptile (in cm) were measured at 15 seedlings per treatment, corresponding to 5 seedlings per plate.

For the vegetative phase, the previously selected seeds were soaked for 24 h in water and in the different dilutions of HSE I and II HSE, (Table 2). Subsequently, approximately 50 seeds were sown in plastic trays (18x3 cm) with Gleysol Vertic soil ¹⁹. At 7 and 14 days after germination the foliar spraying (200 mL) of HSE I and HSE II dilutions was carried out, maintaining the treatments described previously in Table 2. At 14 and 21 days after germination; 15 seedlings were randomly sampled per treatment distributed in 5 seedlings per tray, and the height of the seedling (cm) and root length (cm) were measured.

In both experiments, a completely randomized design was used with 7 treatments with 3 replications for each one. The data were processed through a Simple Classification Analysis of Variance (ANOVA) with the Statgraphics Plus software version 5.1, using the arcs √ (%) transformation when required and when significant differences were found between the means, the Tukey test was applied at 95 % probability.

In the germination phase, the desired physiological effect on germination is seen for all treatments (Figure 2 A) (more than 90 % of the seeds germinate), in addition that the dilutions used of the humic extracts HSE I and HSE II do not affect the percentage germination of rice seeds.

There are few reports of HS effect on the germination percentage, a process in which complex metabolic and cellular events occur, which begins with the water absorption and ends with the radicle emergence and does not include seedling growth ²⁰.

The indicators coleoptile length and radicle length of rice seedlings at 7 dag the seeds (Figure 2 B) are modified with the use of humic substance extracts HSE I and HSE II. A tendency to increase the coleoptile length with HSE use is appreciable, however only the T5 treatment, which corresponds to HSE II (1:50), differs significantly from the control treatment (T1). In the radicle length case, with the exception of treatments T3 and T4, the significant increase of this indicator with the HSE use is perceptible. However, only the T7 treatment, which corresponds to HSE II (1:70), differs significantly and positively from the control treatment (T1).

The HS stimulating action on seedling growth has been reported by several authors ^3,7,21,22. It has been associated with an increase in the activity of the plasma membrane H+-ATPase enzyme ^23-25 in the same way that exogenous auxins induce plant growth also the presence of different phytohormones in HS structure ²⁶. Besides, the production of reactive oxygen species (ROS), which function as signal molecules, causing events such as membrane hyperpolarization and the activation of intra and extracellular Ca^{2 +} channels ²⁷. Furthermore, the recalcitrance and lability of humic fractions are chemical properties that define the stimulation of plant root parameters, where root length and the emission of smaller roots are related to less complex structures and functionalized ⁶.

The results of HSE foliar application in rice vegetative phase are presented in Figure 3 (A and B). The rice plant height (Figure 3 A), in both evaluation moments, is generally stimulated with the HSE use. While at 14 dag treatments T2 and T3 (HSE I dilution 1:50 and 1:60 respectively) show significantly higher height values than the control, at 21 dag only treatment T5 (HSE II dilution 1:50) is the one that shows this behavior.

The same behavior was not observed in the root length indicator (Figure 3 B). At both 14 dag and 21 dag, only the T3 treatment showed significantly higher values than the control. Furthermore, at 21 dag, although an inhibitory effect of the use of HSE II is not observed, it is observed that this extract dilution use resulted in the lowest values of root length. It is possible that with the HSE II extract the use of other dilutions is necessary, considering that the organic C content of this extract is higher than that of HSE I (Table 1).

The plant growth stimulation mechanisms by HS foliar application are few discussed. The main investigations are related to these substance application by the root; however, the stimulating effect of foliar application is well documented. In a review on the use of HA and FA as biostimulants in horticultural plants ³. Several works are reported where HS foliar application is carried out and the effects found are of increases in flowering, fruiting, production, fruit quality and efficient use of nutrients, few studies (3 of 19 studies reported with foliar application) report the effect on root growth.

The HSE of this work are potassium humates isolated from bovine manure vermicompost, obtained from the protocol proposed ¹⁸, who modified the Hernández protocol ¹⁷, so that our results correspond to those reported by some authors ²⁸. They, in the evaluation of the foliar application of dilutions of a humate isolated from vermicompost in the lettuce crop, found that the 1:60 dilution produced the most notable impacts on the indicators of biological and agricultural productivity, reducing the crop's production cycle by 21 days, which greatly benefits the producers of this vegetable.

It is possible that the stimulating action observed for HSE is due to the HS they contain (HA and FA). Its polyfunctionality and heterogeneous structural composition may contain compounds that stimulate enzymatic activities ²⁸ or to the presence of other components such as amino acids, minerals, phytohormones or precursors of phytohormones, as well as microorganisms ^{(8, 17,18)}, or perhaps the joint action of these.

The results found in this work suggest the need to evaluate in future research, the structural differences that the humic substances of each of the extracts could present. Also, the doses and forms of application of the HSE, including the possibility of combining them with plant growth promoting bacteria ²⁹ so that these biostimulants can be included in the organic and sustainable production of rice.