Para la caracterización cultural, los aislados se cultivaron por agotamiento y por triplicado en el medio Levadura Manitol Agar (LMA) ¹⁰ con rojo Congo. Las placas se incubaron durante 48 h a 30 °C. Los parámetros a tener en cuenta fueron: el color, la mucosidad y el tamaño de la colonia. Se tomaron como colonias grandes aquellas cuyo diámetro estuvo entre 2-4 mm, colonias medianas entre 1-2 mm y colonias pequeñas cuyo diámetro correspondiera con 1 mm. La caracterización morfo-tintorial se realizó mediante Tinción de Gram y se determinó la morfología de la célula, la respuesta a la tinción y la presencia de endosporas.

Ensayo de la cetolactasa

Los aislados bacterianos se cultivaron por agotamiento y por triplicado en medio Levadura-Lactosa-Agar (LLA) ¹¹ y las placas se incubaron a 30 °C durante siete días. Posteriormente, se añadieron 10 mL del reactivo de Benedict sobre el crecimiento bacteriano y se observó cambios de coloración del medio a los 10 min de incubación a temperatura ambiente. El resultado positivo a esta prueba se consideró ante un cambio de coloración del medio de azul a amarillo y negativo si el medio mantenía la coloración azul.

Producción de ácido y base

Los aislados bacterianos se cultivaron por agotamiento y por triplicado en medio LMA con indicador azul de bromotimol (0,5 % en NaOH 0,016N) y las placas se incubaron durante tres días a 30 °C. El cambio de coloración del medio de verde a amarillo se interpretó como la producción de ácido y de color verde a azul, se consideró como la producción de base ¹².

Crecimiento en medios de cultivo libre de nitrógeno

Se prepararon suspensiones de los aislados bacterianos. Para ello, se resuspendieron varias colonias en 1 mL de solución salina de NaCl (0,9 % (m/v)) estéril. Cien microlitros de las suspensiones se inocularon en frascos que contenían 10 mL de los medios semisólidos carentes de nitrógeno ^13,14. La inoculación se realizó introduciendo la punta de una micro pipeta en el interior de los medios de cultivo y posteriormente se fue liberando la suspensión bacteriana desde el interior del medio hasta su superficie. Se empleó como control positivo frascos que se inocularon con el mismo volumen de un inoculante a base de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, cepa de referencia en la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) en soya (Glicine max L.) ¹⁵.

Todos los aislados produjeron colonias mucosas en medio LMA. Sin embargo, defirieron en tamaño y coloración (Tabla 1). Resultados similares se encontraron en estudios anteriores con colecciones bacterianas provenientes de frijol chileno (Lablab purpureus (L.) Sweet) y de guisante (Pisum sativum) ^16,17.

El 87,5 % de los aislados resultaron cocobacilos; Gram negativos y no esporulados. Los aislados 1LL y 5FF2, que constituyen el 12,5 % restante, presentaron características culturales e incluso algunas morfológicas similares al resto. Sin embargo, ambos aislados resultaron Gram positivos. Los rizobios, generalmente, son cocobacilos no esporulados y Gram negativos ¹⁸, por lo cual los aislados 1LL y 5FF2 se eliminaron de las determinaciones posteriores que se realizaron en esta investigación.

La respuesta a la cetolactasa fue el tercer indicador que se empleó para determinar si los aislados bacterianos en estudio pertenecían al grupo de los rizobios, luego de la caracterización cultural y morfo tintorial. Esta determinación fue por mucho tiempo un carácter fenotípico confiable, que permitió diferenciar la familia Rhizobiaceae del género Agrobacterium. Los rizobios y el género Agrobacterium tienen hábitats similares y comparten características culturales y morfo tintoriales ¹⁹. Agrobacterium forma colonias mucosas y semitraslúcidas, a los 2-3 días en medio LMA y la tinción de Gram revela células en forma de bacilos Gram negativos y no esporulados. Este género produce agallas o tumores en las raíces y tallo de las plantas, estructuras muy similares a los nódulos que forman los rizobios en las leguminosas ²⁰.

Todos los aislados que se seleccionaron en este trabajo como posibles rizobios, por sus características culturales y morfo tintoriales, resultaron negativos a la prueba de la cetolactasa. Evidencias científicas han permitido modificar la redistribución de numerosas especies de bacterias a otros grupos taxonómicos, pues constituyen excepciones a la norma que hasta ese entonces estuvo establecida. Por ejemplo, según el Manual de Bergey, especies que anteriormente se identificaron como Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi y Agrobacterium vitis son cetolactasa negativo y Agrobacterium tumefaciens es cetolactasa positivo ²¹.

Los métodos de biología molecular han permitido un mayor esclarecimiento de estos temas, de manera que estas tres especies de Agrobacterium, se encuentran en la actualidad dentro del género Rhizobium^22,23. Teniendo en cuenta éstas y otras evidencias científicas, se hace necesario emplear, además de las pruebas fenotípicas convencionales, la secuenciación del ARNr 16S para identificar los aislados bacterianos asociados a las plantas de ambos cultivares de arroz.

La producción de ácido/base fue otro de los criterios fenotípicos que se estudiaron en esta investigación. Excepto el aislado 5FF1, el resto produjo ácido al medio de cultivo. Los ácidos de origen microbiano actúan como sideróforos, moléculas que captan el hierro del suelo ²⁴. Otros permiten la solubilización del fósforo e incrementa su disponibilidad para las plantas ²⁵. El ácido indol 3-acético y el salicílico también constituyen ácidos que producen las BPCV, que incrementan el crecimiento de las plantas ²⁶ e inducen respuestas defensivas en estas contra el ataque de patógenos ²⁷, respectivamente.

Por otra parte, el crecimiento de los aislados bacterianos en medios de cultivo libres de nitrógeno se empleó como un acercamiento a la capacidad de estos para realizar la FBN. El 100 % de los aislados crecieron en los medios JMV y Rennie (Tabla 1). Estos resultados concuerdan con los que publicaron Quim et al. ²⁶, con bacterias asociadas a plantas de arroz.

Los medios semisólidos carentes de nitrógeno se emplean sobre todo para restringir la búsqueda de microorganismos diazotróficos que se aíslan del suelo, rizosfera o del interior de los tejidos de las plantas ²⁷. A partir de aquí, es necesario aplicar técnicas como la amplificación del gen nifH²⁸ y el ensayo de Reducción del Acetileno (ARA) ²⁹, las cuales permiten tener mayor seguridad de la capacidad de las bacterias para fijar el nitrógeno.

La FBN constituye uno de los mecanismos directos que emplean las BPCV para promover el crecimiento de las plantas ³⁰. Los rizobios se han estudiado fundamentalmente por su capacidad para fijar el nitrógeno, en el contexto de la simbiosis con las leguminosas ³¹. La presencia de este atributo en los aislados de rizobios que se estudiaron en esta investigación permitiría emplearlos como parte de un biopreparado para arroz y así disminuir la aplicación de fertilizante nitrogenado al cultivo.

For the cultural characterization, isolates were cultured by exhaustion on Yeast Mannitol (YM) medium ¹⁰ with Congo red. The cultures were incubated for 48 h at 30 °C. The parameters to take into account were color, mucus and colony size, large 2-4 mm, medium 1-2 mm small 1 mm. The morphological characterization of bacterial isolates was carried out by Gram stain and the cell morphology, response to staining and presence of endospores were determined.

Cetolactase test

Bacterial isolates were cultured by exhaustion and in Yeast-Lactose (YL) solid medium ¹¹ and incubated at 30 °C for seven days. Subsequently, 10 mL of Benedict's reagent were added on the bacterial growth and changes of the medium color were observed after 10 min at room temperature. The positive result was considered when the medium changed from blue to yellow, and negative if the medium maintained the blue coloration.

Acid and base production

Bacterial isolates were by cultured exhaustion and in YM solid medium with bromothymol blue indicator (0.5 % in 0.016N NaOH) and the plates were for three days at 30 °C. The change in the color of the medium from green to yellow was interpreted as the acid production, and from green to blue as base production ¹².

Growth in nitrogen-free culture media

Bacterial suspensions were prepared. To this, several colonies were re-suspended in 1 mL of sterile NaCl solution (0.9 % (m/v)). One hundred microliters of the suspensions were inoculated into flasks containing 10 mL of the semi-solid nitrogen-free media JMV and Rennie ^13,14. The inoculation was carried out by introducing the tip of a micro pipette inside the culture media. Flasks were inoculated with a suspension of Bradyrhizobium elkanii ICA 8001 strain which is a reference strain in the Biological Nitrogen Fixation (BNF) were used as positive control ¹⁵.

All isolates produced mucous colonies in YM solid medium. However, they did differ in size and coloration (Table 1). Similar results were found in previous studies with bacterial isolates from Chilean beans (Lablab purpureus (L.) Sweet) and pea (Pisum sativum) ^16,17.

The 87.5 % of isolates were coccobacilli Gram negative and not sporulated. Isolates 1LL and 5FF2, which make up the remaining 12.5 %, presented cultural and even some morphological characteristics similar to the rest. However, both isolates were Gram positive.

The rhizobia are generally non-sporulated and Gram-negative coccobacilli ¹⁸. Thus isolates 1LL and 5FF2 isolates were eliminated from the subsequent determinations.

The response to cetolactase test was the third indicator used to determine if the bacterial isolates belong to rhizobia group. This determination was for a long time a reliable phenotypic character, which allowed to differentiate the Rhizobiaceae family from Agrobacterium genus. Rhizobia and the genus Agrobacterium have similar habitats and cultural and morphological characteristics ¹⁹. Agrobacterium forms mucous and semitranslucent colonies, after 2-3 days in YM solid medium and the Gram stain reveals in the form of Gram negative and non-sporulated cells. This genus produces galls or tumors on the roots and stem of plants, very similar to the nodules that form rhizobia in legumes ²⁰.

All isolates selected in this work as possible rhizobia, taking into account the cultural and morphological characteristics, were cetolactase negative test. Scientific evidence has allowed atoxonomic redistribution of some bacteria species, since they constitute exceptions to rule. For example, according to the Bergey Manual, species that were previously identified as Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, and Agrobacterium vitis are cetolactase negative and Agrobacterium tumefaciens is cetolactase positive ²¹.

Molecular biology methods have allowed a greater clarification of these issues, so that these three species of Agrobacterium are currently within the genus Rhizobium^22,23. Taking into account these and other scientific evidences it is necessary to use, in addition to conventional phenotypic tests, 16S rRNA sequencing to identify bacterial isolates associated with the rice plants cultivar “INCA LP-7”.

Acid/base production was another phenotypic criteria studied in this research. Except isolate 5FF1, the rest produced acid in the culture medium. Some microbial acids act as siderophores, which capture iron from the soil ²⁴. Others allow the phosphorus solubilization and increases its availability of plants ²⁵. Indole-3-acetic acid and salicylic acid are also acids that produce PGPB, which increase plant growth ²⁶ and induce defensive responses against pathogens ²⁷, respectively.

On the other hand, the growth of bacterial isolates in nitrogen-free culture media was used as an approach to their ability to perform the biological nitrogen fixation (BNF). The 100 % of isolates grew on JMV and Rennie media (Table 1). These results are similar to recent studies with those from other authors ²⁶, with bacteria associated with rice plants.

Nitrogen-free semi-solid media are used isolate diazotrophic microorganisms from soil, rhizosphere, or interior of plant ²⁷. Thus, it is necessary to apply techniques such as the amplification of the nifH gene ²⁸⁾ and the Acetylene Reduction Assay (ARA) ²⁹, which allow confirming the bacteria ability to fix nitrogen.

Biological Nitogen Fixation is one of the direct mechanisms used by PGPB to promote the plant growth ³⁰. Rhizobia have been studied primarily for their ability to fix nitrogen, symbiosis with legumes ³¹. The presence of this attribute in rhizobia isolates studied here would allow their use as biofertilizer allowed the reduction of nitrogen fertilizer to the crop.