Las plantas muestran varias reacciones defensivas cuando perciben patrones moleculares asociados a microorganismos (MAMP) que pueden ser reconocidas por receptores de la membrana plasmática ^1-3. Las leguminosas son capaces de detectar los MAMP y así reconocer y discriminar entre rizobios y patógenos para desencadenar el proceso de simbiosis o la respuesta de defensa, respectivamente. Los factores de nodulación (Nod) producidos por los diferentes rizobios son los encargados de iniciar el proceso de formación del nódulo en las raíces y, en su estructura básica, poseen oligosacáridos de quitina que son reconocidos inductores de respuestas defensivas en plantas ³, mientras que otros compuestos específicos derivados de los rizobios modulan la inducción defensiva en las plantas hospederas y benefician la infección simbiótica ^4-6.

La quitina, un polisacárido presente en la pared celular de los hongos y sus derivados (quitosanos y quitooligosacáridos parcialmente N-acetilados) son liberados mediante la degradación de la pared celular fúngica por enzimas β 1-3 glucanasas y quitinasas. Estas enzimas se secretan por la planta como respuesta al ataque del patógeno en el proceso de patogénesis ^7,8.Los quitosanos han sido implicados en la inducción de una gran variedad de respuestas vinculadas a la defensa en varios sistemas de plantas, como son la expresión de genes defensivos, la inducción de fitoalexinas y proteínas de resistencia, la lignificación de las paredes celulares, entre otros ^9,10. Esta respuesta inducida en plantas depende de numerosos factores, tales como la especie vegetal, el microorganismo patógeno, las características físico-químicas del quitosano y la forma en que se aplican ¹¹.

Estudios previos en soya cv INCAsoy-27 demostraron el efecto negativo de altas concentraciones de polímeros y oligosacáridos de quitosano adicionados al medio de cultivo vegetal en la respuesta de variables de nodulación y de crecimiento in vitro de las plántulas inoculadas con Bradyrhizobium elkanii¹². El efecto negativo encontrado en la nodulación de soya con el polímero de quitosano, pudiera relacionarse con la acción inhibitoria a las concentraciones de 500 y 1000 mg L^-1 en la viabilidad del simbionte. Esta afectación podría, además, estar relacionada con la estimulación de respuestas defensivas en la plántula por el quitosano, lo cual afectaría directamente la entrada del microsimbionte a las raíces y comprometería el balance energético requerido para otras funciones de crecimiento en la planta.

Por lo anterior, la hipótesis de este trabajo fue conocer si la presencia de un polímero de quitosano en el medio de cultivo de crecimiento de soya inoculada con Bradyrhizobium causa la inducción de indicadores defensivos (actividad β 1-3 glucanasa, quitinasa y fenilalanina amoniaco-liasa, PAL) en las hojas y raíces de las plántulas.

En la Figura 1, aparece el contenido de proteínas en hojas y raíces durante el crecimiento in vitro de plantas de soya tratadas con quitosano e inoculadas con Bradyrhizobium.

El contenido de proteínas solubles totales en las hojas fue menor a los 7 ddi en comparación con los 21 ddi, excepto la concentración más alta de polímero (1000 mg L^-1), que excedió notablemente al resto de las concentraciones en esta variable, a los 7 ddi (Figura 1A). Además, las concentraciones de 50 y 500 mg L^-1, con diferencias entre ellas, acumularon mayor contenido de proteínas totales con valores superiores a las plantas inoculadas (0 mg L^-1).

Se observó un comportamiento similar a los 21 ddi, ya que los valores más altos se registraron con concentraciones de 50 y 1000 mg L^-1. En ambos momentos evaluados, la concentración 10 mg L^-1 del polímero disminuyó el contenido de proteínas totales (Figura 1A). Sin embargo, el contenido de proteínas solubles en las raíces mostró una respuesta diferente (Figura 1B). Los niveles disminuyeron significativamente en cada tratamiento a los 21 ddi, excepto la concentración más baja de polímero (10 mg L^-1), respecto al tratamiento control. En contraste con la respuesta de proteínas en hojas a los 7 ddi, la concentración de 10 mg L^-1 mejoró la síntesis de proteínas en las raíces, sin diferencias con la concentración más alta de quitosano evaluada y seguida por 500 mg L^-1. Las concentraciones restantes no difirieron del tratamiento control (Figura 1B).

Concerniente a las hojas, las concentraciones de 50 a 1000 mg L^-1 del polímero redujeron los niveles de actividad de β 1-3 glucanasa hasta alcanzar cinco veces menos el valor de control, a los siete días. La respuesta de esta enzima fue variable a los 21 ddi. Las concentraciones 10 y 100 mg L^-1 de quitosano incrementaron la actividad enzimática por encima del control, mientras que esta fue reducida por las concentraciones 500 y 1000 mg L^-1 (Figura 2A).

Sin embargo, en las raíces, la actividad β 1-3 glucanasa aumentó a los 7 ddi con las concentraciones altas (500 y 1000 mg L^-1) a diferencia de 100 mg L^-1 del polímero (Figura 2B). Por otro parte, a los 21 ddi, concentraciones mayores de 50 mg L^-1, principalmente 100 mg L^-1, aumentaron esta actividad (Figura 2B).

La concentración inferior (10 mg L^-1) de quitosano redujo la β 1-3 glucanasa en raíces, pero sin diferencias con el control (Figura 2B). Curiosamente, los valores absolutos de la actividad enzimática fueron casi cinco veces mayores a los 21 ddi que a los siete días después de efectuada la inoculación de las plantas.

A los 7 ddi, la actividad quitinasa en hojas disminuyó al aumentar la concentración de quitosano por encima de 100 mg L^-1, mientras que a los 21 ddi las plantas, los niveles de la actividad de la enzima se redujeron con 1000 mg L^-1. El resto de las otras concentraciones no difirieron del control en ambos momentos evaluados (Figura 3A).

En contraste, la mayor actividad de quitinasa en raíces de soya, a los 7 ddi, se observó con la concentración 500 mg L^-1 del polímero, seguido de 100 y 10 mg L^-1 (Figura 3B).

Las concentraciones 50 y 1000 mg L^-1 de quitosano redujeron la enzima con relación al control. Sin embargo, a los 21 ddi, las plantas tratadas con la concentración de 100 mg L^-1 de quitosano aumentó significativamente la actividad de quitinasa, seguida de las concentraciones más altas (500 y 1000 mg L^-1), que aumentaron la actividad enzimática de cuatro a seis veces más, que las restantes concentraciones y las plantas controles (Figura 3B).

Los niveles de fenilalanina amonio-liasa (PAL) en hojas de soya fueron más altos en el primer tiempo de muestreo evaluado, que en el segundo (Figura 4A). Las concentraciones 10 y 50 mg L^-1 del polímero incrementaron la enzima PAL a los 7 y 21 ddi, respectivamente.

En hojas, el quitosano aumentó la actividad PAL hasta un 75 % con la concentración de 10 mg L^-1 a los 7 ddi, respecto al control inoculado. Por otro lado, las concentraciones más altas del polímero redujeron estos niveles enzimáticos en las hojas a los 7 ddi, mientras que a los 21 ddi este efecto solo se observó en plantas tratadas con 1000 mg L^-1 de quitosano (Figura 4A).

La actividad PAL en raíces fue similar a la respuesta encontrada a los 21 ddi con la actividad β 1-3 glucanasa (Figura 4B).

La concentración 50 mg L^-1 causó los mayores niveles de actividad PAL, seguida de las concentraciones más altas a los 7 ddi, mientras que 10 mg L^-1 y el control mostraron los niveles más bajos de actividad. Sin embargo, a los 21 ddi, las concentraciones 100 y 1000 mg L^-1 de quitosano incrementaron la actividad de esta enzima (Figura 4B).

Las determinaciones de los coeficientes de correlación de las proteínas solubles totales y las tres actividades enzimáticas, entre ambos órganos de la planta, mostraron correlaciones positivas y negativas, tanto a los siete días como los veintiún días de efectuada la inoculación en soya, en presencia de quitosano (Tabla 1).

La aplicación de quitosano en el medio de cultivo vegetal aumentó los niveles de las proteínas totales tanto en raíces como en hojas (Tabla 1). Se encontró una correlación positiva y de mayor significación (R²= 92) en los niveles de concentración del indicador en ambos órganos a los 21 ddi, que a los 7 ddi. Similar comportamiento se encontró en la actividad enzimática PAL, donde ambos órganos correlacionaron de forma positiva y significativa a los 7 ddi (R²= 76) y 21 ddi (R²= 59) (Tabla 1). Sin embargo, la actividad β 1-3 glucanasa correlacionó inversamente y significativamente (R²= 76) entre ambos órganos, por lo que los aumentos de actividad de esta enzima en las hojas se corresponden con reducciones significativas de actividad en las raíces a los 21 ddi, mientras que no fue significativa la correlación a los 7 ddi. A su vez, la actividad quitinasa aumentó en raíces, pero se redujo en hojas, por lo que la correlación entre órganos fue negativa y de baja significación en los dos momentos de crecimiento de las plantas evaluados (Tabla 1)..

Las actividades β1-3 glucanasa, quitinasa y fenilalanina amonio-liasa (PAL) son consideradas indicadores de resistencia basal contra fitopatógenos ¹⁶. Asimismo, estas enzimas han sido evaluadas previamente en plantas tratadas con quitosano ^17,18. Es conocido que el quitosano y sus derivados son potentes inductores de respuestas defensivas y de resistencia contra patógenos y, aumentan la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas ^8,17. Este trabajo demostró que el quitosano moduló los niveles enzimáticos de las respuestas defensivas en hojas y raíces de soya inoculada con B. elkanii, en dependencia del órgano de la planta y del momento evaluado. Además, estos aumentos están en el rango de los niveles informados en plantas tratadas con quitosano ¹⁸.

En general, en ambos momentos en que se evaluaron los indicadores defensivos, las tres concentraciones mayores causaron disminuciones y aumentos significativos de los niveles enzimáticos en las hojas y raíces, respectivamente, comparadas con el control (Figuras 2, 3 y 4). En consecuencia, los aumentos enzimáticos encontrados constatan una inducción defensiva estimulada por el polímero de quitosano en las raíces de soya, lo que podría permitir elevar el estado de resistencia en la planta contra posibles infecciones por patógenos.

Entre las proteínas PR, las enzimas quitinasas y β 1-3 glucanasas han sido las más estudiadas e informadas en respuesta a patógenos y elicitores bióticos ^16,17. Los resultados de este trabajo demostraron aumentos de actividad de ambas enzimas con 10 mg L^-1 de quitosano en las hojas, de manera diferente en las raíces, donde se destacaron las concentraciones entre 100 y 1000 mg L^-1, en ambos momentos. A los 21 días, en el caso de la β 1-3 glucanasa, se lograron aumentos de hasta dos veces, mientras que, en el caso de la quitinasa, entre tres y cuatro veces en las raíces, con respecto a las plantas controles (Figuras 2 y 3).

De manera similar, las mismas concentraciones que indujeron los mayores incrementos de las enzimas en este trabajo, se han informado como inductoras de actividad quitinasa en hojas de soya mediante imbibición de semillas previo a la siembra ¹⁹. Otros resultados en este cultivo demostraron aumentos de la actividad quitinasa, en dependencia de la concentración de quitosano utilizada ²⁰.

Otros autores demostraron mayor acumulación de actividad quitinasa en raíces cultivadas en soluciones que contenían oligómero de quitosano o factores Nod; sin afectar la nodulación de plantas de soya ²¹. Lo anterior sugiere que la estimulación de esta actividad enzimática puede deberse tanto a una respuesta defensiva como a la asociación simbiótica de rizobios con la planta hospedero. Sin embargo, en varias especies de leguminosas se ha informado, que las enzimas quitinasas hidrolizan los factores Nod excretados por las bacterias y, por tanto, reducen el reconocimiento de estas señales por la planta ^22,23. Esto puede ser respaldado por la disminución en el número y la masa seca de los nódulos observada en plantas de soya cultivadas in vitro tratadas con concentraciones elevadas de quitosano incluido en el medio de cultivo ¹². Lo anterior concuerda con el incremento en la actividad β 1-3 glucanasa y quitinasa observado en el presente estudio en plantas tratadas con las concentraciones más altas del polímero.

La actividad de PAL en las hojas aumentó en concentraciones de 10 y 50 mg L^-1 del polímero a los 21 ddi, mientras que, con las concentraciones intermedias a altas, disminuyeron los niveles enzimáticos en ambos momentos del crecimiento de la soya (Figura 4A). Sin embargo, en las raíces a los 7 ddi, se indujo actividad PAL con las concentraciones más altas, principalmente 50 mg L^-1, que duplicó el valor de control (Figura 3B). Se informaron respuestas similares en la inducción de esta actividad por quitosano en raíces de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L) y de pino (Pinus koraiensis) con esta concentración ^19,24, además de encontrarse incrementos de esta actividad enzimática en soya y otras leguminosas cuando se aplican otras formas del inductor ^18,25-27.

Algunos compuestos formados en la vía de los Fenilpropanoides, como por ejemplo flavonoides e isoflavonoides, están involucrados en el proceso de reconocimiento simbiótico entre rizobios y plantas hospederas ^28,29. Es bien conocido que el quitosano activa la formación de compuestos secundarios por la vía de los fenilpropanoides, reforzando la resistencia en las plantas ante estreses bióticos ^18,30, pero también pudiendo contribuir positivamente en el proceso simbiótico mencionado ³¹. El aumento de la actividad PAL encontrado en las raíces de soya en este estudio podría contribuir en ambos procesos. Por ejemplo, se ha informado del aumento de flavonoides en soya como resultado de la aplicación previa de quitosano ^8,22 o de factores Nod a las plantas ^28,32.

Sin embargo, se ha informado que la inducción de respuestas defensivas en plantas contra patógenos inhibe el proceso simbiótico en las leguminosas ³³. Las actividades enzimáticas en este trabajo fueron determinadas en dos momentos importantes del proceso simbiótico de la soya: a los 7 ddi, cuando la planta está en plena formación de nódulos, luego de la colonización de los pelos radicales por la bacteria y su conversión a bacteroide y a los 21 ddi, cuando los nódulos están formados y los bacteroides dentro de ellos en forma activa, ejerciendo una intensa actividad de fijación del nitrógeno. Además, se ha demostrado que las leguminosas autorregulan la magnitud de la simbiosis mediante la inducción de respuestas defensivas ⁴ que limitan la entrada del microsimbionte y causan, entonces, la formación de nódulos menos desarrollados o disfuncionales ³³. En este sentido, el quitosano podría inducir mecanismos defensivos en la planta que afectarían directamente la entrada del microsimbionte a las raíces de la planta.

Los resultados del trabajo también demostraron una relación de activación de las variables evaluadas en los dos órganos, dependiente del momento evaluado. A los 7 ddi correlacionaron negativamente las proteínas y positivamente la actividad PAL, mientras que a los 21 ddi las cuatro variables correlacionaron entre raíces y hojas (Tabla 1).

La concentración de proteínas aumentó en ambos órganos con la aplicación de quitosano a 1000 mg L^-1 y en las raíces a los 21 ddi cuando solamente se inocularon las plántulas. Ambos comportamientos coinciden con resultados previos informados en plantas de caupí ^34,35.

A los 21 ddi, las concentraciones mayores de quitosano elevaron las actividades β 1-3 glucanasas y quitinasas en raíces, en la medida que se redujeron en las hojas. Aunque este comportamiento puede estar vinculado a un balance energético en la propia planta, son necesarias investigaciones adicionales para dilucidar el significado biológico de los comportamientos observados. Por tanto, es necesario evaluar el efecto inductor del quitosano en la regulación de otras respuestas defensivas que pudieran estar implicadas en mejorar o impedir el proceso simbiótico de la soya con Bradyrhizobium, en bioensayos ex vitro, más allá del aumento de resistencia basal de la planta contra patógenos.

Plants show various defensive reactions when they perceive molecular patterns associated with microorganisms (MAMP) that can be recognized by receptors on the plasma membrane ^1-3. Legumes are capable of detecting MAMPs and thus recognizing and discriminating between rhizobia and pathogens to trigger the symbiosis process or the defense response, respectively. The nodulation factors (Nod) produced by the different rhizobia are responsible for initiating the nodule formation process in the roots and, in their basic structure, have chitin oligosaccharides that are recognized inducers of plant defensive responses ³, while other specific compounds derived from rhizobia modulate defensive induction in host plants and benefit symbiotic infection ^4-6.

Chitin, a polysaccharide present in the cell wall of fungi, and its derivatives (chitosans and partially N-acetylated chitooligosaccharides) are released by degradation of the fungal cell wall by enzymes β 1-3 glucanases and chitinases. These enzymes are secreted by the plant in response to pathogen attack in the pathogenesis process ^7,8. Chitosans have been implicated in the induction of a wide variety of defense-related responses in various plant systems, such as the expression of defensive genes, the induction of phytoalexins and resistance proteins, cell wall lignification, among others ^9,10. This induced response in plants depends on numerous factors, such as plant species, the pathogenic microorganism, chitosan physicochemical characteristics and the way in which they are applied ¹¹.

Previous studies in soybean cv INCAsoy-27 demonstrated the negative effect of high chitosan polymer concentrations and oligosaccharides added to the plant culture medium on nodulation response and in vitro growth variables of the seedlings inoculated with Bradyrhizobium elkanii¹². The negative effect found in soybean nodulation with the chitosan polymer could be related to the inhibitory action at concentrations of 500 and 1000 mg L^-1 on symbiont viability. This affectation could also be related to defensive response stimulation in the seedling by chitosan, which would directly affect the microsymbiont entry to the roots and would compromise the energy balance required for other growth functions in the plant.

Therefore, the hypothesis of this work was to know if the presence of a chitosan polymer in the culture medium of soybean growth inoculated with Bradyrhizobium causes defensive indicator induction of (activity β 1-3 glucanase, chitinase and phenylalanine ammonia- lyase, PAL) on the leaves and roots of the seedlings.

Figure 1 shows the protein content in leaves and roots during in vitro growth of soybean plants treated with chitosan and inoculated with Bradyrhizobium.

The content of total soluble proteins in the leaves was less than 7 dai compared to 21 dai, except for the highest concentration of polymer (1000 mg L^-1), which significantly exceeded the rest of the concentrations in this variable, at the 7 dai (Figure 1A). In addition, the concentrations of 50 and 500 mg L^-1, with differences between them, accumulated higher content of total proteins with values higher than the inoculated plants (0 mg L^-1).

A similar behavior was observed at 21 dai, since the highest values were registered with concentrations of 50 and 1000 mg L^-1. At both moments evaluated, the 10 mg L^-1 polymer concentration decreased the total protein content (Figure 1A). However, the soluble protein content in roots showed a different response (Figure 1B). The levels decreased significantly in each treatment at 21 dai, except for the lowest polymer concentration (10 mg L^-1), compared to the control treatment. In contrast to the protein response in leaves at 7ddi, the concentration of 10 mg L^-1 improved protein synthesis in roots, without differences with by 500 mg L^-1. The remaining concentrations did not differ from the control treatment (Figure 1B).

Concerning the leaves, the concentrations of 50 to 1000 mg L^-1 of the polymer reduced the levels of activity of β 1-3 glucanase until reaching five times less than the control value, at seven days. The response of this enzyme was variable at 21 dai. The 10 and 100 mg L^-1 concentrations of chitosan increased the enzymatic activity above the control, while it was reduced by the 500 and 1000 mg L^-1 concentrations (Figure 2A).

However, in roots, β 1-3 glucanase activity increased at 7 dai with high concentrations (500 and 1000 mg L^-1) as opposed to 100 mg L^-1 of the polymer (Figure 2B). On the other hand, at 21 dai, concentrations greater than 50 mg L^-1, mainly 100 mg L^-1, increased this activity (Figure 2B).

The lower concentration (10 mg L^-1) of chitosan reduced the β 1-3 glucanase in roots, but without differences with the control (Figure 2B). Interestingly, the absolute values of the enzymatic activity were almost five times higher at 21 dai than at 7 days after the inoculation of the plants.

At 7 dai, the chitinase activity in leaves decreased with increasing chitosan concentration above 100 mg L^-1, while at 21 dai in plants, enzyme activity levels decreased with 1000 mg L^-1 one. The rest of the other concentrations did not differ from the control at both evaluated moments (Figure 3A).

In contrast, the highest chitinase activity in soybean roots, at 7 ddi, was observed with the concentration of 500 mg L^-1 of the polymer, followed by 100 and 10 mg L^-1 (Figure 3B).

Chitosan concentrations 50 and 1000 mg L^-1 reduced the enzyme in relation to the control. However, at 21 dai, the plants treated with the concentration of 100 mg L^-1 of chitosan significantly increased the chitinase activity, followed by the highest concentrations (500 and 1000 mg L^-1), which increased the enzymatic activity four to six times more than the remaining concentrations and the control plants (Figure 3B).

The phenylalanine ammonium-lyase (PAL) levels in soybean leaves were higher in the first time of sampling evaluated, than in the second (Figure 4A). The concentrations of 10 and 50 mg L^-1 of the polymer increased the PAL enzyme at 7 and 21 dai, respectively.

In leaves, chitosan increased PAL activity up to 75% with a concentration of 10 mg L^-1 at 7 dai, compared to the inoculated control. On the other hand, the higher concentrations of the polymer reduced these enzymatic levels in the leaves at 7 dai, while at 21 dai this effect was only observed in plants treated with 1000 mg L^-1 of chitosan (Figure 4A).

PAL activity in roots was similar to the response found at 21 dai with β 1-3 glucanase activity (Figure 4B).

The 50 mg L^-1 concentration caused the highest levels of PAL activity, followed by the highest concentrations at 7 dai, while 10 mg L^-1 and the control showed the lowest levels of activity. However, at 21 dai, the concentrations of 100 and 1000 mg L^-1 of chitosan increased this enzyme activity of (Figure 4B).

The correlation coefficient determinations of the total proteins and the three enzymatic activities, between both plant organs, showed positive and negative correlations, both 7 days and 21 days after inoculation in soybeans (Table 1).

The application of chitosan in the vegetable culture medium increased the levels of total proteins in both roots and leaves (Table 1). A positive and more significant correlation (R²=92) was found in the concentration levels of the indicator in both organs at 21 dai, than at 7 dai. Similar behavior was found in PAL enzyme activity, where both organs correlated positively and significantly at 7 dai (R²=76) and 21 dai (R²=59) (Table 1). However, β 1-3 glucanase activity was inversely and significantly correlated (R²=76) between both organs, so that increases in activity of this enzyme in leaves correspond to significant reductions in activity in roots at 21 dai , while the correlation at 7 dai was not significant. In turn, chitinase activity increased in roots, but decreased in leaves, so the correlation between organs was negative and of low significance in the two growth moments of the evaluated plants (Table 1).

The activities β1-3 glucanase, chitinase and phenylalanine ammonium lyase (PAL) are considered indicators of basal resistance against phytopathogens ¹⁶. Likewise, these enzymes have been previously evaluated in plants treated with chitosan ^17,18. It is known that chitosan and its derivatives are potent inducers of defensive responses and resistance against pathogens and increase the synthesis of secondary metabolites in plants ^8,17. This work shows that chitosan modulated the enzymatic levels of the defensive responses in soybean leaves and roots inoculated with B. elkanii, depending on the plant organ and the moment evaluated. Furthermore, these increases are in the range of levels reported in plants treated with chitosan ¹⁸.

In general, at both moments in which the defensive indicators were evaluated, the three highest concentrations caused significant decreases and increases in enzyme levels in leaves and roots, respectively, compared to the control (Figures 2, 33 and 4). Consequently, the enzymatic increases found confirm a defensive induction stimulated by the chitosan polymer in soybean roots, which could make it possible to increase the plant resistance status against possible infections by pathogens.

Among the PR proteins, the enzymes chitinases and β 1-3 glucanases have been the most studied and reported in response to biotic pathogens and elicitors ^16,17. The results of this work demonstrated increases in both enzymes´ activity with 10 mg L^-1 of chitosan in the leaves, differently in roots, where concentrations between 100 and 1000 mg L^-1 stood out, at both times. At 21 days, in the case of β 1-3 glucanase, increases of up to two times were achieved, while in chitinase case, between three and four times in the roots, with respect to the control plants (Figures 2 and 3).

Similarly, the same concentrations that induced the highest enzyme increases in this work have been reported as inducers of chitinase activity in soybean leaves by seed imbibition prior to sowing ¹⁹. Other results in this culture showed increases in chitinase activity, depending on the concentration of chitosan used ²⁰.

Some authors demonstrated greater accumulation of chitinase activity in roots grown in solutions that contained a chitosan oligomer or a Nod factor ²¹; without affecting the nodulation of soybean plants. This suggests that this enzymatic activity stimulation may be due both to a defensive response and to the symbiotic association of rhizobia with the host plant. However, in several legumes species it has been reported that chitinase enzymes hydrolyze Nod factors excreted by bacteria, and therefore, reduce the recognition of these signals by the plant ^22,23. This can be supported by the decrease in the number and dry mass of the nodules observed in soybean plants grown in vitro treated with high chitosan concentrations included in the culture medium ¹². This is consistent with the increase in β 1-3 glucanase and chitinase activity observed in the present study in plants treated with the highest concentrations of the polymer.

PAL activity in the leaves increased at concentrations of 10 and 50 mg L^-1 of the polymer at 21 dai, while with intermediate to high concentrations, enzyme levels decreased at both times of soybean growth (Figure 4A) . However, in the roots at seven days, PAL activity was induced with the highest concentrations, mainly 50 mg L^-1, which doubled the control value (Figure 3B). Similar responses were reported in the induction of this activity by chitosan in tobacco roots (Nicotiana tabacum L) and pine (Pinus koraiensis) plants with this concentration ^19,24, in addition to finding increases of this enzymatic activity in soybeans and other legumes when other forms of the inducer are applied ^18,25-27.

Some compounds formed in the phenylpropanoid pathway, such as flavonoids and isoflavonoids, are involved in the process of symbiotic recognition between rhizobia and host plants ^28,29. It is well known that chitosan activates the formation of secondary compounds via phenylpropanoids, reinforcing the resistance in plants to biotic stresses ^18,30, but also being able to contribute positively to the aforementioned symbiotic process ³¹. The increased PAL activity found in soybean roots in this study could contribute to both processes. For example, an increase in flavonoids in soybeans has been reported as a result of the previous chitosan application ^8,22) or Nod factors to plants ^28,32.

However, defensive response induction in plants against pathogens has been reported to inhibit the symbiotic process in legumes ³³. The enzymatic activities in this work were determined in two important moments of the soybean symbiotic process: at 7 dai, when the plant is in full formation of nodules, after the colonization of root hairs by the bacteria and their conversion to bacteroide and at 21 dai, when the nodules are formed and the bacteroides within them are active, exerting an intense nitrogen fixation activity. Furthermore, legumes have been shown to self-regulate the magnitude of symbiosis by inducing defensive responses ⁴ that limit microsymbiont entry and thus cause the formation of less developed or dysfunctional nodules ³³. In this sense, chitosan could induce defense mechanisms in the plant that would directly affect the microsymbiont entry to plant roots.

The results of the work also demonstrated an activation relationship of the variables evaluated in the two organs, depending on the moment evaluated. At 7 dai the proteins were negatively correlated and PAL activity positively, while at 21 dai the four variables correlated between roots and leaves (Table 1).

The protein concentration increased in both organs with the application of chitosan at 1000 mg L^-1 and in roots at 21 days when only the seedlings were inoculated. Both behaviors coincide with previous results reported in cowpea plants ^34,35.

At 21 days, the higher chitosan concentrations increased the β 1-3 glucanase and chitinase activities in roots, while they were reduced in leaves. Although this behavior may be linked to an energy balance in the plant itself, additional research is necessary to elucidate the biological significance of the observed behaviors. Therefore, it is necessary to evaluate the inducing chitosan effect in other defensive response regulation that could be involved in improving or preventing the symbiotic process of soybeans with Bradyrhizobium, in ex vitro bioassays, beyond the increase in basal plant resistance against pathogens.