La alfalfa es una leguminosa perenne, representativa de las regiones templadas y se utiliza principalmente como alimento para el ganado, considerándose universalmente uno de los forrajes de más alta calidad. Es un cultivo valioso porque dentro de las numerosas ventajas agronómicas y ambientales que tiene, se encuentran la preservación de la fertilidad del suelo y la biodiversidad, la protección contra la erosión del suelo, la mitigación de los impactos del cambio climático, la reducción de la contaminación por nitratos de las aguas subterráneas, la reducción del consumo de combustibles fósiles, la disminución de las emisiones de gases de efecto invernadero, entre otras ^6-9.

Esta leguminosa (alfalfa) tiene un conjunto de características morfológicas y fisiológicas variables de importancia en la agricultura mundial y contribuye con su alto y estable rendimiento como hierba nutritiva ¹⁰. Su importancia económica se basa en el alto potencial de producción de biomasa, superior a 80 t ha^-1 verde y cerca de 20 t ha^-1 de materia seca ¹¹. Los forrajes de alfalfa se caracterizan por un alto contenido de proteína cruda ¹², bien equilibrada con respecto al aminoácido. Se enriquece con vitaminas de vital importancia y varios microelementos esenciales para el crecimiento y el desarrollo normal de los animales. La alfalfa es el componente básico en el programa de alimentación para ganado lechero, así como para ganado vacuno, caballos, ovejas y otras clases de ganado ¹³.

La alfalfa también se ha vuelto interesante como fuente potencial de metabolitos secundarios, debido a que se considera una alternativa de fitoestrógenos útiles en la salud (ingrediente alimentario humano y suplementos), por lo que su crecimiento se ha generalizado en diferentes continentes, debido a su alta adaptabilidad a diferentes tipos de suelos, de valores de pH y condiciones ambientales, así como la posibilidad de producción sostenible y ecológica ^14,15.

En México ¹⁶, se han sembrado 385 992 ha de alfalfa verde, de estas se han cosechado 384,693 ha para una producción de 15 360 646 y un rendimiento de 39,930 t ha^-1. En este país el principal uso de la alfalfa es para alimentar el ganado lechero en regiones áridas, semiáridas y templadas. El cultivo se corta a intervalos medios para cosechar el mayor rendimiento de forraje al año por unidad de superficie, así como por su buen contenido de proteína cruda, digestibilidad y grado de aceptación por el ganado ^17,18. Esta planta, como forraje puede utilizarse de diferentes formas, en fresco, henificado y ensilado en mezcla con una o varias gramíneas ^19,20.

El desarrollo de un país es directamente proporcional a la cantidad de alimentos o nutrientes disponibles para la población. El aumento creciente de la población mundial crea una demanda cada vez mayor de alimentos y para suplirla, se utilizan fertilizantes que se definen como cualquier sustancia que se utiliza para aumentar la productividad del suelo, promoviendo su fertilidad al agregar nutrientes, lo que ayuda en el crecimiento de las plantas. Los fertilizantes que se componen de productos químicos crudos en forma sólida o líquida elaborados en fábricas dirigidas a los requerimientos nutricionales de las plantas se denominan, por definición, un fertilizante químico. El nitrógeno (N), el fósforo (P) y el potasio (K) llamados NPK, normalmente están presentes en estos fertilizantes químicos junto con otros nutrientes ²¹.

El uso excesivo de fertilizantes químicos ha generado diversos problemas en la naturaleza como, por ejemplo, la acidificación del agua; el daño de la capa de ozono; el efecto invernadero; utilizarlos por mucho tiempo pueden cambiar el pH del suelo, la eutrofización del agua donde el contenido nutricional en estos entornos aumenta, provocando la proliferación de algas y, en consecuencia, la reducción del oxígeno en el agua, lo que daña la vida marina ²². Una solución actual para disminuir la utilización de estos fertilizantes en la agricultura es el uso de biofertilizantes ²³.

Los biofertilizantes, son inoculantes microbianos que contienen células vivas o latentes de cepas eficientes de microorganismos fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fosfato y descomponedores de celulosa ³. Estos están destinados a aplicarlos fundamentalmente en los suelos para mejorar su fertilidad y el crecimiento de las plantas, al aumentar el número y la actividad biológica de los microorganismos beneficiosos ³.

Algunas de las ventajas que tienen los biofertilizantes es que son rentables y ecológicos, mejoran gradualmente la calidad de los suelos. Los microorganismos contenidos en el biofertilizante promueven el suministro de nutrientes a las plantas y, por lo tanto, se asegura su desarrollo, crecimiento y regulación fisiológica. Sumado a esto el rendimiento del cultivo puede aumentar en un 10 a un 25 % y con su uso las plantas son menos propensas a las enfermedades del suelo. Dentro de las principales limitaciones que tienen los biofertilizantes se pueden señalar que actúan más lentamente que los fertilizantes químicos; son difíciles de almacenar debido a su alta sensibilidad a los cambios de temperatura y humedad; no pueden reemplazar otros fertilizantes por completo, y la escasez de cepas particulares o locales de microorganismos reduce su disponibilidad ²⁴.

Los tipos de biofertilizantes disponibles ²² son:

Biofertilizante fijador de nitrógeno: Rhizobium, Azotobacter, Azospirillium, Bradyrhizobium.

Biofertilizante solubilizador de fósforo: Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus.

Biofertilizante movilizador de fósforo - Micorriza.

Biofertilizante promotores del crecimiento de las plantas: Psuedomonas, Trichoderma.

Los efectos de los biofertilizantes mencionados en cuanto a la fijación nitrógeno en el suelo, se realiza a través de los nódulos de la raíz del cultivo de leguminosas poniendo el N₂ a disposición de la planta. Otros microorganismos que pueden utilizarse como biofertilizantes son: Azolla que es un helecho heterogéneo con siete especies que son endosimbionte con Anabaena azollae, una cianobacteria fijadora de nitrógeno ²⁵ y las algas verde azules pueden fijar el nitrógeno en el entorno anaeróbico debido a una célula especializada llamada heterociste ²⁶.

Las bacterias solubilizadoras de fosfato producen ácidos orgánicos e inorgánicos como el ácido gulcónico y el ácido cetogulcónico que solubilizan el fósforo ²⁷. El ácido glucónico produce un grupo carboxilo e hidroxilo, este grupo funcionará como un quelante del Fe²⁺, Al³⁺ y Ca^2+, lo que reducirá el pH del suelo. También es importante mencionar que existe una interacción positiva entre Gluconacetobacter spp y Burklderia spp para aumentar la actividad de deshidrogenasa en el suelo. Los deshigrogenados están involucrados en el proceso de oxidación del suelo y se utilizan como indicador de la actividad microbiana del mismo ²⁸.

En la alfalfa se han realizado algunos estudios utilizando el cultivo orgánico, lo que incluye el uso de biofertilizantes. La aplicación de inoculantes microbianos líquidos en semillas de leguminosas es una práctica agrícola sostenible que puede mejorar la absorción de nutrientes de las plantas y aumentar la productividad de los cultivos. Después de aplicarlos a las semillas de leguminosas los inoculantes deben proporcionar la supervivencia a largo plazo de rizobios en el producto final y para estudiar la supervivencia de Sinorhizobium (Ensifer) meliloti L3 Si, se examinaron diez formulaciones de medios diferentes de inoculantes microbianos (caldo de manitol de levadura con la adición de agar, alginato de sodio, cloruro de calcio, glicerol o cloruro férrico y combinaciones de los mismos). Para la supervivencia de L3 Si, durante un tiempo de almacenamiento de 150 días se aplicó la formulación del medio que contenía glicerol en combinación con agar o alginato de sodio, el cual se utilizó como inoculante líquido. Las semillas de alfalfa se pre-inocularon con cuatro formulaciones (caldo de levadura de manitol (YMB), YMB con agar (1 g L^-1), YMB con 1 o 5 g L^-1 de alginato de sodio) durante tres meses. Las semillas pre-inoculadas y almacenadas durante un mes produjeron plantas de alfalfa exitosas. El contenido de nitrógeno en la alfalfa obtenido de semillas pre-inoculadas un mes antes de la siembra aumentó entre 3,72-4,19 % ²⁹.

La capacidad de 17 cepas de rizobacterias para mejorar la fisiología, la absorción de nutrientes, el crecimiento y el rendimiento de las plantas de alfalfa cultivadas en condiciones de agricultura desértica en Arabia Saudita fue estudiada por algunos autores ³⁰. Los 17 aislamientos de rizobacterias se confirmaron como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas mediante pruebas bioquímicas clásicas y utilizando análisis de secuencia de genes de ADNr 16S, las cepas se identificaron como Bacillus, Acinetobacter and Enterobacter. La inoculación de alfalfa con cualquiera de estas 17 cepas mejoró el contenido relativo de agua; clorofila a; clorofila b; contenido de carotenoides; contenido de N, P y K; altura de planta; relación hoja-tallo; masa fresca y seca. Acinetobacter pittiiJD-14 fue más eficaz para aumentar la masa fresca y seca de la alfalfa en un 41 y 34 %, respectivamente, en comparación con las plantas de control no inoculadas. Sin embargo, todas las cepas mejoraron las características de los cultivos en comparación con las plantas de control, lo que indica que estas cepas de rizobacterias del desierto podrían usarse para desarrollar un biofertilizante ecológico para la alfalfa y posiblemente otras plantas de cultivo para mejorar la producción sostenible en regiones áridas.

Se utilizaron seis dosis de biofertilizantes de estiércol de ganado fermentado en un biodigestor (0, 25, 50, 100, 200 y 400 m³ ha^-1) y cinco repeticiones. Las características químicas del biofertilizante fueron: 0,300 g N (Nitrógeno) L^-1; 0,057 g P (Fosforo) L^-1; 0,188 g K (Potasio) L^-1; 0,105 g Ca (calcio) L^-1; 0,057 g Mg (magnesio) L^-1, 1 mg Mn (manganeso) L^-1; 1 mg Fe (hierro) L^-1, y 1 mg Zn (zinc) L^-1. Como resultado se obtuvo que la mejor absorción de N, K, Ca y Mg se produjo con la dosis de 400 m³ ha^-1. En el caso del N significó un 22 % más que en el control y fue lineal con el incremento de biomasa. Los niveles de los micronutrientes Cu, Mn y Zn no tuvieron diferencias significativas entre las dosis aplicadas, al igual que las concentraciones de proteína cruda ³¹.

Por otra parte, se estudió en condiciones de macetas y de campo el efecto de la cepa ENRRI A12 de S. meliloti y el estiércol de pollo (0, 2, 4, 6, 8 y 10 t ha^-1) en el cultivar de alfalfa (M. sativa) “Hegazi”. En el experimento en maceta, la inoculación de S. melioti y los niveles de estiércol de pollo aumentaron significativamente la altura de la planta, la masa fresca y seca de la raíz y el número de nódulos y su peso seco. En el experimento de campo, tanto S. meliloti como el estiércol de pollo aumentaron significativamente la densidad de las plantas, el rendimiento de forraje fresco y el contenido de proteínas, y disminuyeron significativamente el porcentaje de fibra cruda. El rendimiento de forraje fresco y el nivel de estiércol de pollo estuvieron altamente correlacionados (r>0,99) ³².

La nanotecnología es una de las últimas innovaciones tecnológicas. El término "nanotecnología" fue acuñado por primera vez por Norio Taniguichi, profesor de la Universidad de Ciencias de Tokio, en 1974 ³³. Aunque el término "nanotecnología" se ha introducido durante mucho tiempo en múltiples disciplinas, la idea de que las nanopartículas (NPs) podrían ser de interés en el desarrollo agrícola es una innovación tecnológica reciente y todavía está en desarrollo progresivo ³⁴.

Las NPs son materiales orgánicos, inorgánicos o híbridos con al menos una de sus dimensiones que van de 1 a 100 nm (a nanoescala). Las NPs que existen en el mundo natural pueden producirse a partir de procesos de reacciones fotoquímicas, erupciones volcánicas, incendios forestales, erosión, plantas y animales o incluso por los microorganismos ³⁵. La producción de NPs derivadas de plantas y microorganismos se ha convertido en una fuente biológica eficiente de NPs verdes que atraen una atención adicional de los científicos en los últimos tiempos debido a su naturaleza ecológica y la simplicidad del proceso de producción en comparación con las otras rutas ³⁶.

Las NPs, dependiendo de sus propiedades, interactúan con las plantas provocado diversos cambios morfológicos y fisiológicos. La eficiencia de las NPs está determinada por su composición química, tamaño, cubierta de la superficie, reactividad, y lo más importante, la dosis a la cual son efectivas ³⁷. Los investigadores señalan tanto efectos positivos, como negativos en el crecimiento y desarrollo de las plantas al utilizar NPs y el impacto de estas depende de la composición, concentración, tamaño y propiedades químicas y físicas, así como, la especie de planta ³⁸.

Para la explotación de la nanotecnología verde, una serie de especies de plantas y microorganismos, incluyendo bacterias, algas y hongos, se están utilizando actualmente para la síntesis de NPs. Por ejemplo, las especies de plantas M. sativa y Sesbania se utilizan para formular nanopartículas de oro. Del mismo modo, los nanomateriales inorgánicos, hechos de plata (Ag), níquel (Ni), cobalto (Co), zinc (Zn) y cobre (Cu), pueden sintetizarse dentro de plantas vivas, como Brassicajuncea, M. sativa y Heleanthusannus³⁶.

Los nanofertilizantes sintetizados tienen un uso específico para regular la liberación de nutrientes en función de los requisitos de los cultivos, al tiempo que minimizan las pérdidas diferenciales. Por ejemplo, los fertilizantes de nitrógeno convencionales se caracterizan por grandes pérdidas en el suelo a través de la lixiviación, la evaporación o incluso la degradación de hasta un 50-70 %, lo que finalmente reduce la eficiencia de los fertilizantes y eleva el costo de producción ³⁹. Por otro lado, las nanoformulaciones de fertilizantes nitrogenados sincronizan la liberación de fertilizante-N con su demanda de absorción por parte de los cultivos. En consecuencia, las nanoformulaciones evitan pérdidas indeseables de nutrientes a través de la internalización directa por parte de los cultivos y, por lo tanto, evitan la interacción de nutrientes con el suelo, el agua, el aire y los microorganismos ³⁶.

La deficiencia de micronutrientes disminuye no solo la productividad de los cultivos, sino que también afecta la salud humana a través del consumo de alimentos con deficiencia de micronutrientes. Por ejemplo, la deficiencia de hierro causa anemia, deterioro del crecimiento, problemas de salud reproductiva e incluso disminución del rendimiento cognitivo y físico en humanos ⁴⁰. En este sentido, la utilización de micronutrientes nanoformulados para la liberación lenta o controlada de nutrientes estimularía el proceso de absorción por las plantas, promovería el crecimiento y la productividad de los cultivos y contribuiría también a mantener la salud del suelo ⁴¹. Por ejemplo, en suelos con deficiencia de zinc, la aplicación de nano óxido de zinc a dosis bajas influye positivamente en el crecimiento y las respuestas fisiológicas, como el brote y el alargamiento de la raíz, el peso seco fresco y la fotosíntesis en muchas especies de plantas en comparación con el control ^42,43.

El boro (B) se encuentra entre los nutrientes que son necesarios para el crecimiento de las plantas y la producción de rendimiento y puede mejorar las propiedades nutricionales de los cultivos forrajeros. Sin embargo, a niveles más altos, puede ser tóxico y afectar negativamente el crecimiento de las plantas y la calidad del forraje. La concentración de B en las plantas se ve afectada por diferentes parámetros, como la fertilización con este mismo micronutriente, el suelo, el clima, las especies de plantas, etc. Por todo esto se estudiaron los efectos de diferentes tratamientos de B en la alfalfa en la concentración de B y en el contenido de pigmentos, incluidos clorofila, b, total y carotenoides. Los tratamientos experimentales fueron: 1) seis tipos de suelo (S1-S6); 2) fuentes de B, incluida la fertilización con boricacida (B1) y nano boro (B2) y 3) número de pulverizaciones (cero, uno, dos y tres veces). Los resultados indicaron que el tipo de suelo, la fuente de B y el número de fumigaciones afectaron significativamente (P≤0,01) la concentración del B en la alfalfa y el contenido de pigmentos. La pulverización tres veces aumentó significativamente la concentración de B ya que resultó en un aumento del 207,81 % en comparación con el tratamiento control e igualmente incrementó el contenido de pigmentos (P≤0,05) incluyendo clorofila, b, total y carotenoides en comparación con los otros tratamientos ⁴⁴.

Se realizó un estudio en invernadero para explorar el efecto de varias dosis de NPs de sulfato de potasio (K₂SO₄) sobre el crecimiento de alfalfa y la respuesta fisiológica bajo estrés salino. Se seleccionó un genotipo tolerante a la sal (Me-sa-Sirsa) y un genotipo sensible a la sal (Bulldog 505) en función de la germinación bajo sal y se plantaron en macetas que contenían 2 kg de arena. Los dos genotipos se sometieron a niveles de sal de 0 y 6 dS m^-1 utilizando CaCl₂ ∙ 2H₂O: NaCl (2:1) mezclado con solución de Hoagland. Se aplicaron tres tratamientos de K₂SO₄NPs que consistían en 1/4, 1/8 y 1/10 del nivel de K en solución Hoagland de fuerza completa (235 mg L^-1). El mayor peso seco del brote, rendimiento relativo, longitud de la raíz y peso seco de la raíz en ambos genotipos se obtuvo al utilizar K₂SO₄NPs al nivel de 1/8. Las diferentes dosis de K₂SO₄NPs afectaron significativamente la relación Na/K y las concentraciones de Ca, P, Cu, Mn y Zn en el tejido vegetal. La aplicación de K₂SO₄NPs a una tasa de 1/8 mejoró la respuesta fisiológica de la planta al estrés salino al reducir la fuga de electrolitos, aumentar el contenido de catalasa y prolina y aumentar la actividad de las enzimas antioxidantes. Estos resultados sugieren que la aplicación de KNPs puede tener una mejor eficiencia que los fertilizantes de K convencionales para proporcionar una nutrición adecuada de las plantas y superar los efectos negativos del estrés salino en la alfalfa ⁴⁵.

La toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc (ZnONPs) en la germinación de semillas/alargamiento de raíces y la absorción de ZnONPs y Zn²⁺ en alfalfa (M. sativa), pepino (Cucumis sativus L.) y plántulas de tomate (Solanum lycopersicum L.) se investigó por ⁴⁶. Las semillas fueron tratadas con ZnONPs a 0-1 600 mg L^-1 así como a 0-250 mg L^-1 de Zn²⁺ con fines de comparación. Los resultados mostraron que a 1 600 mg L^-1 de ZnONPs, la germinación en pepino aumentó en un 10 % y la germinación de alfalfa y tomate se redujo en un 40 y 20 %, respectivamente. Con 250 mg de Zn²⁺ L^-1, sólo se redujo la germinación del tomate con respecto a los controles. El mayor contenido de Zn fue de 4 700 y 3 500 mg kg^-1 de peso seco (DW), para las plántulas de alfalfa germinadas en 1 600 mg L^-1de ZnONPs y 250 mg L^-1 de Zn²⁺ , respectivamente.

La alfalfa en la nanotecnología se ha utilizado también para la obtención de NPs. Los científicos han encontrado una manera de cultivar y cosechar oro (Au) de las plantas de cultivo. Las NPs podrían ser cosechadas industrialmente. Por ejemplo, las plantas de alfalfa cultivadas en un ambiente rico en AuCI₄ mostraron absorción de oro metálico. Las AuNPs se pueden separar mecánicamente disolviendo el material orgánico (tejido vegetal) después de la cosecha ⁴⁷. Las plantas de alfalfa también pueden absorber Ag a partir de un medio sólido rico en este elemento con la posterior formación de Ag NPs ⁴⁸.

Alfalfa is a perennial legume representative of temperate regions and it is used mainly as feed for livestock, universally considered one of the highest quality forages. It is a valuable crop because among the many agronomic and environmental advantages it has, are the preservation of soil fertility and biodiversity, protection against soil erosion, the climate change impact mitigation, pollution reduction by nitrates from groundwater, the reduction in the consumption of fossil fuels, the reduction in greenhouse gas emissions, among others ^6-9.

This legume (alfalfa) has a set of variable morphological and physiological characteristics of importance in world agriculture and contributes to its high and stable yield as a nutritious herb ¹⁰. Its economic importance is based on the high potential for biomass production, higher than 80 t ha^-1 green and about 20 t ha^-1 of dry matter ¹¹. Alfalfa forages are characterized by a high content of crude protein ¹², well balanced with respect to amino acid. It is enriched with vitamins of vital importance and several essential microelements for the normal growth and development of animals. Alfalfa is the basic component in the feeding program for dairy cattle, as well as for cattle, horses, sheep and other kinds of cattle ¹³.

Alfalfa has also become interesting as a potential source of secondary metabolites. It is considered an alternative of phytoestrogens useful in health (human food ingredient and supplements), so its growth has become widespread in different continents due to its high adaptability to different types of soils, pH values and environmental conditions, as well as the possibility of sustainable and ecological production ^14,15.

In Mexico, until April 30 of the current year, 385 992 ha of green alfalfa have been sown, of which 384,693 ha have been harvested for a production of 15 360 646 and a yield of 39,930 t ha^{-1 (16}. In this country, the main use of alfalfa is to feed dairy cattle in arid, semi-arid and temperate regions. The crop is cut at medium intervals to harvest the highest forage yield per year per unit area, as well as for its good crude protein content, digestibility, and degree of acceptance by livestock ^17,18. This plant, as forage, can be used in different ways, fresh, hay and silage mixed with one or more grasses ^19,20.

The development of a country is directly proportional to the amount of food or nutrients available to the population. The growing increase in the world population creates an increasing demand for food and to meet it, fertilizers are used that are defined as any substance that is used to increase soil productivity by promoting its fertility by adding nutrients, which helps in plant growth. Fertilizers that are composed of raw chemicals in solid or liquid form made in factories aimed at the nutritional requirements of plants are called, by definition, a chemical fertilizer. Nitrogen (N), phosphorus (P) and potassium (K) called NPK, are normally present in these chemical fertilizers along with other nutrients ²¹.

The excessive use of chemical fertilizers has generated various problems in nature, such as water acidification; ozone layer damage; the greenhouse effect; using them for a long time can change soil pH, the water eutrophication where the nutritional content in these environments increases, causing algae proliferation and, consequently, oxygen reduction in the water, which damages marine life ²². A current solution to reduce the use of these fertilizers in agriculture is biofertilizer use ²³.

Biofertilizers are microbial inoculants that contain live or latent cells of efficient strains of nitrogen-fixing microorganisms, phosphate solubilizers and cellulose decomposers. These are applied primarily to soils to improve their fertility and plant growth, by increasing the number and biological activity of beneficial microorganisms ³.

Some of the advantages that biofertilizers have is that they are profitable and ecological, gradually improving the quality of soils. The microorganisms contained in the biofertilizer promote the supply of nutrients to the plants and, therefore, their development, growth and physiological regulation are ensured. Added to this, the crop yield can increase by 10 to 25 % and with its use; the plants are less prone to soil diseases. Among the main limitations that biofertilizers have, it can be pointed out that they act more slowly than chemical fertilizers; they are difficult to store due to their high sensitivity to changes in temperature and humidity; they cannot replace other fertilizers completely, and the scarcity of particular or local strains of microorganisms reduces their availability ²⁴.

The types of biofertilizers available are ²²:

Nitrogen fixing biofertilizer: Rhizobium, Azotobacter, Azospirillium, Bradyrhizobium.

Phosphorus solubilizer biofertilizer: Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus.

Phosphorus mobilizing biofertilizer - Mycorrhiza.

Plant growth promoter biofertilizer: Psuedomonas, Trichoderma.

The effects of the aforementioned biofertilizers in nitrogen fixation terms in the soil is carried out through the root nodules of the legume crop, making the N ₂ available to the plant. Other microorganisms that can be used as biofertizates are: Azolla which is a heterogeneous fern with seven species that are endosymbiont with Anabaena azollae, a nitrogen fixing cyanobacterium ²⁵ and blue green algae can fix nitrogen in the anaerobic environment due to one cell specialized called heterocyst ²⁶.

Phosphate-solubilizing bacteria produce organic and inorganic acids such as gulconic acid and ketogulconic acid that solubilize phosphorus ²⁷. Gluconic acid produces a carboxyl and hydroxyl group, this group will function as a chelator of Fe²⁺, Al³⁺ and Ca²⁺, which will reduce soil pH. It is also important to mention that there is a positive interaction between Gluconacetobacter spp and Burklderia spp to increase dehydrogenase activity in the soil. Dehygrogenates are involved in the soil oxidation process and they are used as an indicator of its microbial activity ²⁸.

Some studies have been carried out on alfalfa using organic cultivation, which includes the use of biofertilizers. The application of liquid microbial inoculants to legume seeds is a sustainable agricultural practice that can improve the absorption of nutrients from plants and increase the productivity of crops. After application to legume seeds the inoculants should provide long-term survival of rhizobia in the final product and to study the survival of Sinorhizobium (Ensifer) meliloti L3 Si, ten different media formulations of microbial inoculants (broth of yeast mannitol with the addition of agar, sodium alginate, calcium chloride, glycerol or ferric chloride and combinations thereof). For the survival of L3 Si, during a storage time of 150 days the formulation of the medium containing glycerol was applied in combination with agar or sodium alginate, which was used as liquid inoculant. The alfalfa seeds were pre-inoculated with four formulations (yeast mannitol broth (YMB), YMB with agar (1 g L^-1), YMB with 1 or 5 g L^-1 of sodium alginate) for three months. Seeds pre-inoculated and stored for a month produced successful alfalfa plants. The nitrogen content in alfalfa obtained from seeds pre-inoculated one month before sowing increased varied between 3.72-4.19 % ²⁹.

The ability of 17 rhizobacteria strains to improve the physiology, nutrient absorption, growth and performance of alfalfa plants grown under desert agricultural conditions in Saudi Arabia was studied ³⁰. The 17 rhizobacteria isolates were confirmed as plant growth-promoting rhizobacteria by classical biochemical tests and using 16S rDNA gene sequence analysis, the strains were identified as Bacillus, Acinetobacter and Enterobacter. Inoculation of alfalfa with any of these 17 strains improved the relative water content; chlorophyll a; chlorophyll b; carotenoid content; content of N, P and K; plant height; leaf-stem relationship; and fresh, dry dough. Acinetobacter pittiiJD-14 was more effective in increasing the fresh and dry mass of alfalfa by 41 and 34 %, respectively, compared to non-inoculated control plants. However, all strains improved crop characteristics compared to control plants, indicating that these strains of desert rhizobacteria could be used to develop an ecological biofertilizer for alfalfa and possibly other crop plants to improve production sustainable in arid regions.

Six doses of fermented cattle manure biofertilizers were used in a biodigester (0, 25, 50, 100, 200 and 400 m³ ha^-1) and five repetitions. The biofertilizer chemical characteristics the were: 0.300 g N (Nitrogen) L^-1; 0.057 g P (Phosphorus) L^-1; 0.188 g K (Potassium) L^-1; 0.105 g Ca (Calcium) L^-1; 0.057 g Mg (Magnesium) L^-1, 1 mg Mn (Manganese) L^-1; 1 mg Fe (Iron) L^-1, and 1 mg Zn (Zinc) L^-1. As results, it was obtained that the best absorption of N, K, Ca and Mg occurred with the dose of 400-m3 ha^-1. In the case of N, it was 22 % more than in the control and it was linear with the increase in biomass. The Cu, Mn and Zn micronutrient levels did not have significant differences between the doses applied, as did the concentrations of crude protein ³¹.

On the other hand, the effect of the ENRRI A12 strain of S. meliloti and chicken manure (0, 2, 4, 6, 8 and 10 t ha^-1) in alfalfa (M. sativa) cultivar “Hegazi” in the potted experiment, S. melioti inoculation and chicken manure levels significantly increased plant height, fresh and dry root mass, and number of nodules and its dry weight. In the field experiment, both S. meliloti and chicken manure significantly increased plant density, fresh forage yield and protein content, and significantly decreased the percentage of crude fiber. Fresh forage and the level of chicken manure were highly correlated (r> 0.99) ³².

Nanotechnology is one of the latest technological innovations. The term "nanotechnology" was first coined by Norio Taniguichi, a professor at Tokyo University of Sciences, in 1974 ³³. Although the term "nanotechnology" has long introduced in multiple disciplines, the idea that nanoparticles (NPs) could be of interest in agricultural development is a recent technological innovation and it is still in progressive development ³⁴.

NPs are organic, inorganic or hybrid materials with at least one of their dimensions ranging from 1 to 100 nm (at the nanoscale). NPs that exist in the natural world can be produced from photochemical reaction processes, volcanic eruptions, forest fires, erosion, plants and animals, or even by microorganisms ³⁵. The production of NPs derived from plants and microorganisms has become an efficient biological source of green NPs attracting additional attention from scientists in recent times due to their ecological nature and production process simplicity compared to the other routes ^36).

NPs, depending on their properties, interact with plants causing various morphological and physiological changes. The efficiency of NPs is determined by their chemical composition, size, surface coverage, reactivity, and most importantly, the dose at which they are effective ³⁷. Researchers point out both positive and negative effects on the growth and development of plants when using NPs and the impact of these on plants depends on the composition, concentration, size and chemical and physical properties, as well as the plant species ³⁸.

For the exploitation of green nanotechnology, plant species number and microorganisms, including bacteria, algae and fungi, they are currently being used for the synthesis of NPs. For example, the plant species M. sativa and Sesbania are used to formulate gold nanoparticles. Similarly, inorganic nanomaterials, made of silver (Ag), nickel (Ni), cobalt (Co), zinc (Z), and copper (Cu), can be synthesized within living plants, such as Brassicajuncea, M. sativa, and Heleanthusannus³⁶.

Synthesized nanofertilizers have a specific use to regulate nutrient release based on crop requirements, while minimizing differential losses. For example, conventional nitrogen fertilizers are characterized by large losses to the soil through leaching, evaporation or even degradation of up to 50-70 %, which ultimately reduces the efficiency of fertilizers and raises production cost ³⁹. On the other hand, nitrogen fertilizer nanoformulations synchronize the N-fertilizer release with its demand for absorption by crops. Consequently, nanoformulations avoid undesirable nutrient losses through direct internalization by crops and thus avoid the interaction of nutrients with soil, water, air, and microorganisms ³⁶.

Micronutrient deficiency not only lowers crop productivity, but also affects human health through consumption of micronutrient-deficient foods. For example, iron deficiency causes anemia, impaired growth, reproductive health problems, and even decreased cognitive and physical performance in humans ⁴⁰. In this sense, the use of nanoformulated micronutrients for the slow or controlled release of nutrients would stimulate the absorption process by plants, promote the growth and productivity of crops and contribute to maintaining soil health ⁴¹. For example, in zinc-deficient soils, the application of nano zinc oxide at low doses positively influences growth and physiological responses, such as sprouting and root elongation, fresh dry weight, and photosynthesis in many species of plants compared to the control ^{(42, 43)}.

Boron (B) is among the nutrients that are necessary for plant growth and yield production, and it can improve the nutritional properties of forage crops. However, at higher levels it can be toxic and adversely affect plant growth and forage quality. B concentration in plants is affected by different parameters, such as fertilization with this same micronutrient, the soil, the climate, the plant species, etc. For all this, the effects of different treatments of B in alfalfa on B concentration of and on the content of pigments, including chlorophyll b, total and carotenoids, were studied. The experimental treatments were: 1) six types of soil (S1-S6), 2) B sources, including fertilization with boricacide (B1) and nano boron (B2), and 3) number of sprays (zero, one, two and three times). The results indicated that the type of soil, B source and the number of fumigations significantly affected (P≤0.01) the B concentration in alfalfa and the content of pigments. Spraying three times significantly increased B concentration of as it resulted in an increase of 207.81 % compared to the control treatment and also increased the content of pigments (P≤0.05) including chlorophyll, b, total and carotenoids compared to the other treatments ⁴⁴.

A greenhouse study was conducted to explore the effect of various doses of potassium sulfate NPs (K₂SO₄) on alfalfa growth and physiological response under salt stress. A salt-tolerant genotype (Me-sa-Sirsa) and a salt-sensitive genotype (Bulldog 505) were selected based on germination under salt and planted in pots containing 2 kg of sand. The two genotypes were subjected to salt levels of 0 and 6 dS m^-1 using CaCl₂ 2H₂O: NaCl (2:1) mixed with Hoagland's solution. Three treatments of K₂SO₄ NPs were applied consisting of 1/4, 1/8 and 1/10 of the K level in full strength Hoagland solution (235 mg L^-1). The highest shoot dry weight, relative yield, and root length and root dry using K₂SO₄ NPs obtained weight in both genotypes at the 1/8 level. The different doses of K₂SO₄ NPs significantly affected the Na/K ratio and the concentrations of Ca, P, Cu, Mn and Zn in the plant tissue. The application of K₂SO₄ NPs at a rate of 1/8 improved the physiological response of the plant to salt stress by reducing electrolyte leakage, increasing the content of catalase and proline, and increasing the activity of antioxidant enzymes. These results suggest that KNPs application may have a better efficiency than conventional K fertilizers to provide adequate plant nutrition and overcome the negative effects of salt stress on alfalfa ⁴⁵.

The toxicity of zinc oxide nanoparticles (ZnONPs) in seed germination/root elongation and the absorption of ZnONPs and Zn²⁺ in alfalfa (M. sativa), cucumber (Cucumis sativus L.) and tomato seedlings (Solanum lycopersicum L.) was investigated ⁴⁶. The seeds were treated with ZnONPs at 0-1 600 mg L^-1 as well as 0-250 mg L^-1 of Zn²⁺ for comparison purposes. The results showed that at 1,600 mg L^-1 of ZnONPs, germination in cucumber increased by 10 %, and germination in alfalfa and tomato decreased by 40 and 20 %, respectively. With 250 mg of Zn²⁺ L^-1, only tomato germination was reduced compared to controls. The highest Zn content was 4,700 and 3,500 mg kg^-1 dry weight (DW), for alfalfa seedlings germinated in 1,600 mg L^-1 of ZnONPs and 250 mg L^-1 of Zn^{2 +} respectively.

Alfalfa in nanotechnology has also been used to obtain NPs. Scientists have found a way to grow and harvest gold (Au) from crop plants. NPs could be harvested industrially. For example, alfalfa plants grown in an environment rich in AuCI4 showed metallic gold absorption. AuNPs can be separated mechanically by dissolving organic material (plant tissue) after harvest ⁴⁷. Alfalfa plants can also absorb Ag from a solid medium rich in this element with the subsequent formation of Ag NPs ⁴⁸.