La Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) es un proceso biológico de suma importancia pues constituye la única vía, hasta ahora conocida, donde la mayor reserva de nitrógeno que existe en el planeta (N₂ (g)) se reduce a amonio, un estado químico que puede ser asimilado por las plantas ¹. Este proceso solo se realiza por un grupo de procariotas (bacterias y archeas), denominadas diazótrofas ².

Los rizobios son las Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (BPVC) que mayor contribución realizan a la FBN en la zona terrestre del planeta. Los estudios sobre la asociación simbiótica de estas bacterias con las plantas leguminosas datan de al menos 125 años y han comprobado que dicha interacción aporta alrededor de 600 kg N ha^-1 año^{-1 (3,4}. Sin embargo, la rizosfera y endosfera de algunas gramíneas de importancia económica como el maíz (Zea mays L.) y el arroz (Oryza sativa L.), también se han descrito como hábitats de estas bacterias, por lo que desde hace algunos años se busca extender a las gramíneas los conocimientos y usos de la FBN que se conoce en las leguminosas ^5-7.

Por otra parte, existen diferentes métodos moleculares, fisiológicos y ecológicos que permiten clasificar a una BPCV como diazotrófica. Entre ellos se encuentran la amplificación del gen nifH ⁸, el crecimiento de las cepas bacterianas en medios semisólidos libre de nitrógeno ⁹, el ensayo de reducción del acetileno (ARA, por sus siglas en inglés) ¹⁰, los ensayos de inoculación de bacterias en plantas leguminosas patrones ¹¹ y las técnicas isotópicas con N^{15 (12}. Específicamente en plantas leguminosas inoculadas con estas bacterias fijadoras de nitrógeno se puede determinar, además, la actividad de la enzima glutamina sintetasa en nódulos y la concentración de ureidos en nódulos y hojas de las plantas ¹³.

Varios estudios, en los que se han empleado algunos de los métodos mencionados anteriormente, defienden la hipótesis de que la fitoestimulación es el principal mecanismo que emplean los rizobios para promover el crecimiento del arroz y no la FBN ¹⁴. Son escasas las evidencias que muestran la presencia de rizobios fijadores de nitrógeno en ecosistemas donde no hayan estado presentes leguminosas como cultivos precedentes a las gramíneas. En Cuba se carece de estudios donde se determine la capacidad para fijar nitrógeno de cepas de rizobios que se asocien, de manera natural, a gramíneas de importancia económica como el arroz. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad para fijar nitrógeno de cepas de rizobios, provenientes de la rizosfera de plantas de arroz cultivares INCA LP-5 e INCA LP-7, cultivados en monocultivo.

La investigación se realizó en el año 2018, en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) de Cuba y en el Centro de Ciencias Genómicas de la Universidad Nacional Autónoma de México.

La mayoría de los trabajos que abordan la identificación de rizobios asociados a gramíneas, se han realizado en áreas experimentales sometidas a técnicas de rotación de cultivo con plantas leguminosas ^24,25. Según estas investigaciones, las leguminosas incrementan las poblaciones de rizobios fijadores de nitrógeno y la gramínea se beneficia del nitrógeno remanente en el suelo proveniente de la FBN. En este sentido, se ha comprobado que la contribución en nitrógeno que hacían algunas cepas de rizobios al cultivo del arroz, no provenía de la FBN; sino del presente en el suelo donde se encontraba el trébol (Trifolium alexandrinum) como cultivo antecesor ¹⁴.

En la presente investigación se emplearon métodos moleculares y fisiológicos para determinar la capacidad de realizar la fijación de nitrógeno de tres cepas del género Rhizobium provenientes de la rizosfera de plantas de arroz cultivado en monocultivo intensivo. Se extrajo el ADN genómico de las cepas de rizobios en estudio, el cual se visualizó como bandas en la parte superior del gel de agarosa (Figura 1). Sin embargo, no se amplificó el gen nifH en las cepas de Rhizobium 5P1, Rpr11 y Rpd16, con ninguno de los tres pares de cebadores que se emplearon. En todos los geles se observó una banda de 300-400 pb correspondiente a la amplificación del gen nifH de la cepa de referencia CFN42 (Figura 2).

Resultados similares, en cuanto a la amplificación del gen nifH, se obtuvieron en investigaciones anteriores con cepas de Rhizobium provenientes de la rizosfera de plantas de arroz ²⁶. De los genes que codifican para el complejo de la nitrogenasa, la amplificación del gen nifH no solo se realiza para detectar la presencia de esta enzima en las bacterias, sino también para realizar estudios de filogenia con microorganismos fijadores de nitrógeno ².

Se conoce que genes como el nifH necesitan amplificarse con oligonucleótidos que contengan altos niveles de degeneración y con temperaturas adecuadas en la PCR, que permitan la hibridación entre los cebadores y la región correspondiente del ADN bacteriano ⁸. Por ello, se emplearon oligonucleótidos degenerados y un gradiente considerable de temperaturas de alineamiento. Sin embargo, no se logró su amplificación en las cepas de Rhizobium.

Otro aspecto a considerar en este tipo de estudios es la secuencia de los juegos de cebadores. Para el caso de los genes nifH, se han desarrollado cebadores de PCR universales y específicos de grupo, con el propósito de amplificar diversas secuencias de este gen. Sin embargo, la mayoría de ellos solo amplifican el 35 % de secuencias dentro de las alfa, beta y gamma proteobacterias. Además, en el caso de los cebadores universales para el gen nifH, menos del 50 % han permitido detectar secuencias conocidas de este gen, debido a la especialmente notable variación en la cobertura de este tipo de cebadores. Incluso, estudios previos demostraron que en el caso particular de los cebadores universales PolF/PolR solo cubren el 25 % de la diversidad nifH presentes en bases de datos ⁸.

Por otra parte, la falta de especificidad de algunos de los cebadores de genes nifH han amplificado secuencias del ADN de cepas de Escherichia coli, bacterias que hasta ahora no se han descrito como diazotróficas. La dimerización del cebador, la formación de horquillas, el contenido de guanina y citosina y la termodinámica del cebador; constituyen factores que afectan la especificidad y la cobertura de los cebadores ⁸. Teniendo en cuenta todo lo anterior, pudiera pensarse no solo en aspectos de la técnica de amplificación de PCR que explicarían la no detección del gen nifH en los tres aislados de Rhizobium que se estudiaron, sino también la falta de especificidad y cobertura de los juegos de cebadores que se emplearon, independientemente de que fueran diseñados a partir de secuencias de genes nifH de bacterias diazotróficas. La no detección del gen nifH en el genoma bacteriano por el método empleado, no necesariamente significa que las cepas carezcan de la capacidad para realizar la FBN. Sería necesario emplear otros juegos de cebadores que podrían diseñarse a partir de secuencias provenientes de bacterias diazotróficas asociativas de gramíneas.

En esta investigación se evaluó la capacidad de tres cepas de Rhizobium para realizar la FBN, desde el punto de vista fisiológico. Se evidenció el crecimiento de estas bacterias en dos medios de cultivo libre de nitrógeno (JMV y Rennie), a los cinco días de incubación. En ningún caso se observó cambio en la coloración del medio JMV. En investigaciones previas se constató que cepas de Bacillus, Paenibacillus y Azospirillum; géneros que presentan una elevada frecuencia de aparición en la rizosfera de plantas de maíz y arroz; también tienen la capacidad de crecer en estos medios de cultivo ^27,28.

Estudios recientes han demostrado la capacidad de cepas de rizobios provenientes de gramíneas para crecer en medios libre de nitrógeno. Tal es el caso de cepas de Bradyrhizobium asociadas a la rizosfera de sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench), las cuales crecieron en medio Rennie y cepas de Rhizobium undicola, endófitos de plantas de arroz con la capacidad de crecer en el medio JNFb ^29,30. En ambos casos, se confirma la diazotrofía de las cepas mediante la técnica del ARA. Los medios libres de nitrógeno, como los que se emplearon en esta investigación, se utilizan en múltiples trabajos con la finalidad de seleccionar microorganismos diazotróficos y así descartar gran cantidad de microorganismos cultivables que se obtienen durante el proceso de aislamiento ⁹.

En esta investigación; además, se realizaron ensayos de inoculación en plantas de siratro y soya para evaluar la capacidad de las cepas de Rhizobium para realizar la FBN. Los resultados mostraron la formación de nódulos efectivos en ambas leguminosas, tras el empleo de las cepas bacterianas provenientes de la rizosfera de plantas de arroz (Figura 3, Tabla 2).

Los resultados mostraron que la inoculación de la cepa Rpr11 en las plantas de siratro produjo los mayores valores en todas las variables de nodulación. En las plantas que se trataron con la cepa Rpd16 se observaron nódulos. Sin embargo, no existieron diferencias significativas con el tratamiento control en ninguna de las variables que se midieron. Siratro, constituye una leguminosa forrajera que se ha establecido como planta modelo para evaluar la capacidad de infección y la efectividad de la nodulación de aislados de rizobios en condiciones controladas, pues responde como hospedero a un amplio espectro de cepas de rizobios provenientes de diversos hábitats ³¹.

Independientemente de la versatilidad de leguminosas como siratro para nodular con diferentes géneros del grupo de los rizobios, se ha discutido sobre la especificidad de la planta y la bacteria para establecer la simbiosis ^32,33. En este sentido, la soya; otra de las leguminosas empleadas en esta investigación, se asocia generalmente con especies del género Bradyrhizobium³⁴. Sin embargo, investigaciones recientes demuestran que otros géneros como Rhizobium, Ensifer, Mesorhizobim y Sinorhizobium también forman nódulos en las raíces de estas plantas ³⁵. La inoculación de la cepa 5P1 incrementó significativamente el número de nódulos de la raíz primaria de las plantas de soya; mientras que, el empleo de la cepa Rpr11 produjo los mayores valores en el número de nódulos totales, totales efectivos y la masa seca de los nódulos en estas plantas.

La disección de los nódulos presentes en las plantas de siratro y soya, que se inocularon con las tres cepas de Rhizobium, permitió observar una coloración rojiza en el interior de los mismos (Figura 3C). El color marrón, rojo o rosado es característico de la leghemoglobina, proteína indicadora de la efectividad de los nódulos en el proceso de FBN ²³. Esta proteína tiene un grupo prostético tipo protohemo que se enlaza de forma reversible con el oxígeno una vez que este difunde hasta la zona central de los nódulos y lo transporta desde la membrana plasmática de las células infectadas hacia la membrana del simbiosoma. De esta manera, se establecen las concentraciones adecuadas de oxígeno en los nódulos para mantener viable al rizobio, proteger a la nitrogenasa de las altas concentraciones de oxígeno y favorecer la FBN ³⁶.

Los resultados de esta investigación constituyen evidencias aparentemente contradictorias. Por un lado, el método molecular que se empleó no permitió amplificar el gen nifH. Sin embargo, los métodos fisiológicos como el crecimiento en medios semisólidos libre de nitrógeno y los ensayos de nodulación en plantas leguminosas, muestran que estas bacterias sí tienen la capacidad de fijar el nitrógeno del aire.

El empleo de métodos moleculares más sofisticados en los estudios taxonómicos de bacterias ha permitido reformular conceptos tradicionales para intentar caracterizar, clasificar y nombrar a cepas de rizobios. Estas bacterias Gram negativas se diferencian del resto de los procariotas por su capacidad de fijar nitrógeno y formar nódulos en las leguminosas ⁴. Sin embargo, estudios recientes donde se emplean secuenciación de ADN total, indican que ambos atributos no necesariamente son propiedades inherentes a los rizobios ³⁷. Estas investigaciones concluyen que cepas del género Bradyrhizobium tienen una gran diversidad en cuanto a la presencia de los genes nif y nod, estos últimos con la información genética para la formación de los nódulos. Ese estudio contempla que algunas de las cepas de Bradyrhizobium presentan ambos grupos de genes, otras ninguno de ellos y otras cepas solo los nif; independientemente del sitio de donde fueron aisladas (suelo, nódulos de leguminosas). Por lo tanto, en el estudio de cepas de rizobios, enfocados a la capacidad de formar nódulos y fijar nitrógeno, tendría que tenerse en cuenta las particularidades genéticas descritas previamente.

Por otra parte, la capacidad de fijar nitrógeno en los rizobios tiene que contemplar la posibilidad de hacerlo, no solo en un contexto simbiótico con leguminosas, sino también en las otras formas de vida, en las que se han podido constatar que estos microorganismos pueden sobrevivir, dígase en vida libre, asociativa y endofítica ³⁷. Las tres cepas que se estudiaron en esta investigación constituyen ejemplos de rizobios que, aislados de la rizosfera de dos cultivares de arroz de importancia económica (INCA LP-5 e INCA LP-7), cuentan con la capacidad de formar nódulos efectivos en plantas de siratro y soya. Sería necesario corroborar la capacidad de las cepas para fijar nitrógeno por métodos con mayor sensibilidad y especificidad como el ARA y el empleo del N¹⁵.

El hecho de encontrar cepas de rizobios en áreas sometidas a prácticas de monocultivo intensivo de arroz, que se asocian naturalmente a esta gramínea, en suelos caracterizados por su baja fertilidad y con potencialidades de fijar nitrógeno, brinda un importante valor práctico a esas cepas bacterianas. El empleo de formulados a base de estas bacterias pudiera formar parte del manejo integrado del cultivo, con un ahorro de fertilizantes químicos. Esta tecnología adquiere especial relevancia en el contexto de una agricultura ecológica y económicamente sostenible, sobre todo en cultivos de alta demanda y de grandes áreas cultivadas como el arroz, donde cada año se incrementan los rendimientos a costa del uso irracional de fertilizantes químicos, productos que afectan negativamente a los ecosistemas ⁵.

Biological Nitrogen Fixation (BNF) is a very important biological process since it constitutes the only way where the largest nitrogen source on the planet (N₂ (g)) is reduced to ammonia, a chemical state that can be assimilated by plants ¹. This process is only carried out by a group of prokaryotes (bacteria and archeas), called diazotrophs ².

Rhizobia are Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB) that make the greatest contribution to BNF in the terrestrial planet area. Studies on the symbiotic association of these bacteria with leguminous plants date back at least 125 years and have shown that this interaction contributes around 600 kg N ha^-1 year^{-1 (3,4}. The rhizosphere and endosphere of some economically important grasses such as corn (Zea mays L.) and rice (Oryza sativa L.), have also been described as habitats for these bacteria, which is why could to extend to grasses the knowledge and uses of BNF that is known in legumes ^5-7.

There are different molecular, physiological and ecological methods that allow classifying a PGPB as diazotrophic. The nifH gene amplification ⁸, bacterial strains growth in semi-solid nitrogen-free media ⁹, acetylene reduction assay ¹⁰, bacteria inoculation trials in standard legume plants ¹¹⁾ and isotopic techniques with N^{15 (12} are some examples. In legume plants inoculated with these nitrogen-fixing bacteria, the glutamine synthetase activity in nodules and ureides concentration in nodules and leaves can also be determined ¹³.

Several studies aboard the hypothesis that phytostimulation is the main mechanism used by rhizobia to promote rice growth and not BNF ¹⁴. There is little evidence that shows the presence of nitrogen-fixing rhizobia in ecosystems where legumes have not been present as crops preceding grasses. Studies are lacking in Cuba to determine the capacity to fix nitrogen of rhizobia strains that are naturally associated with economically important grasses such as rice. Therefore, the aim of this research was to evaluate the capacity to fix nitrogen of rhizobia strains from the rhizosphere rice plants cultivars INCA LP-5 and INCA LP-7, cultivated in intensive monoculture.

The research was carried out in 2018, at the National Institute of Agricultural Sciences (INCA) from Cuba and at the Center of Genomic Sciences from the National Autonomous University of Mexico.

Most of the works about identification of rhizobia associated with grasses have been carried out in experimental areas subjected to crop rotation techniques with legume plants ^24,25. According to these, legumes increase nitrogen-fixing rhizobia populations and the grass is benefiting for nitrogen that remains in the soil from BNF. It has been verified that the nitrogen contribution to rice from some rhizobia did not come from BNF; since the soil where the clover (Trifolium alexandrinum) was cultivated as predecessor crop ¹⁴.

In the present investigation, molecular and physiological methods were used to determine the nitrogen fixation capacity of three Rhizobium strains from rice rhizosphere grown in intensive monoculture. It was possible to extract the genomic DNA of rhizobia strains which was visualized as bands in the agarose gel (Figure 1). However, nifH amplification analysis showed that this gene was not amplified with none of three primer pairs that were used. A band (300-400 bp) corresponding to nifH gene amplification of reference strain CFN42 was observed in agarose gel (Figure 2).

Similar results, regarding nifH gene amplification were obtained in previous investigations with Rhizobium strains from rice plants rhizosphere ²⁶. The nifH gene amplification is not only performed to detect the presence of nitrogenase complex in bacteria, since also to perform phylogeny studies with nitrogen-fixing microorganisms ².

It is known that genes such as nifH need to be amplified with oligonucleotides that contain high degeneracy levels and with adequate temperatures in PCR, which allow hybridization between primers and the corresponding region of bacterial DNA ⁸. Therefore, degenerate oligonucleotides and a considerable alignment temperature gradient were employed. However, its amplification was not achieved in the Rhizobium strains Rpr11, Rpd16 and 5P1.

Another aspect to consider is the primer sets sequences. Universal and group-specific PCR primers have been developed in order to amplify various sequences of nifHgene. However, most of them only amplify 35 % of sequences from alpha, beta and gamma proteobacteria. The universal primers less than 50 % detect known sequences of this gene, due to the particularly notable variation in the coverage of these primers. Even, previous studies showed that the universal PolF/PolR primers only cover 25% of nifH diversity ⁸.

The lack of specificity of some nifH gene primers have amplified DNA sequences from Escherichia coli strains, bacteria that until now have not been described as diazotrophic. Primer dimerization, hairpin formation, guanine and cytosine content and primer thermodynamics; are factors that affect the primers specificity and coverage ⁸. Thus could think that the PCR amplification technique and the lack primers specificity and coverage would explain the non-detection of nifH gene in the Rhizobium isolates studied here, regardless they were designed from nifH gene sequences from different diazotrophic bacteria. The non-detection of nifH gene by the method used here does not necessarily mean that the strains lack the ability to carry out FBN. It would be necessary to use other primer sets that could be designed from sequences from rice associated diazotrophic bacteria.

In this research, the three Rhizobium strains ability to perform BNF was evaluated too, from the physiological point of view. The bacteria growth was showed in two nitrogen-free culture media (JMV and Rennie), after five days of incubation. A change JMV medium color was not observed. Bacillus, Paenibacillus and Azospirillum strains; with a high frequency of appearance in corn and rice rhizosphere; also grow in these culture media ^27,28.

Recent studies have demonstrated that rhizobia from grasses grow in nitrogen-free media. Bradyrhizobium and Rhizobium undicola from sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) and rice, respectively grew in different nitrogen-free media (Rennie and JNFb) ^29,30. The diazotrophy of these strains was confirmed by ARA technique. Nitrogen-free media are used in multiple studies in order to select diazotrophic microorganisms and thus discard a large number of culturable microorganisms that are obtained during the isolation process ⁹.

An inoculation tests were carried out on siratro and soy plants to evaluate Rhizobium strains ability to perform BNF. The results showed effective nodule formation in both legumes inoculated with bacterial strains from rice plants rhizosphere (Figure 3, Table 2).

The results showed that the inoculation of siratro seedlings with Rpr11 strain produced the highest values in the nodulation. Nodules were observed in root plants treated with the Rpd16 strain, however there were no significant differences with the control treatment. Siratro is a forage legume that has been established as a model plant to evaluate the infection capacity and nodulation effectiveness of rhizobia isolates under controlled conditions, since responds as a host to wide spectrum of rhizobia strains from different habitats ³¹.

Regardless of siratro versatility as to nodulate with different rhizobia genera, the plant and bacterium specificity to establish symbiosis has been discussed previously ^32,33. Soy, another of legumes used here is generally associated with species of genus Bradyrhizobium³⁴. However, recent research shows that other genera such as Rhizobium, Ensifer, Mesorhizobim and Sinorhizobium also form nodules on their roots ³⁵. The inoculation of 5P1 strain significantly increased nodule number in soy plant main root; whereas, the use of Rpr11 strain produced the highest values in the total nodulation, total nodule effectiveness andand dry weight of total nodule.

The siratro and soy plants inoculated with three Rhizobium strains have root nodules, with a reddish coloration inside (Figure 3C). The brown, red or pink color is characteristic of leghemoglobin, a protein that indicates the effectiveness of the BNF effectiveness ²³. This protein has a protoheme-like prosthetic group that binds reversibly with oxygen, which diffuses to central zone of the nodules and transports it from the plasma membrane of infected cells to symbiosome membrane. This mechanism allow establishing oxygen concentrations in nodules to keep the Rhizobium alive and protect nitrogenase enzyme from high oxygen concentrations, and promote BNF ³⁶.

The results of this research are apparently contradictory. The molecular method did not allow nifH gene amplification. However, the bacteria growth in nitrogen-free semi-solid media and nodulation tests in legume plants show that these bacteria fix nitrogen.

The use of more sophisticated molecular methods in taxonomic studies of bacteria allowed reformulating traditional concepts to try to characterize, classify and name of rhizobia strains. Gram-negative bacteria, such as rhizobia, fix nitrogen and form nodules in legumes root ⁽⁴, which have not been found in the rest of prokaryotes. However, recent studies using total DNA sequencing indicate that both attributes are not necessarily inherent properties of rhizobia ³⁷. These investigations conclude that genus Bradyrhizobium strains have a great diversity in their nif (fixing nitrogen) and nod (nodule formation) genes. This study show that some of these Bradyrhizobium strains have both genes groups, others neither of them and other strains only nif genes; regardless of site from which they were isolated (soil or legume nodules). Therefore, in the study of rhizobia strains, focused on form nodules and fix nitrogen ability, the genetic peculiarities previously described would have to be taken into account.

The ability to fix nitrogen in rhizobia has to consider the possibility of do it, not only in a symbiotic context with legumes, since also in other forms of life forms of these bacteria (free life, associative and endophytic) ³⁷. The three strains studied in this research are examples of rhizobia strains, isolated from the rhizosphere of two economically important rice cultivars (INCA LP-5 and INCA LP-7), that form effective nodules in siratro and soy plants. It would be necessary to corroborate the capacity of these strains to fix nitrogen by methods with greater sensitivity and specificity such as ARA and N¹⁵ technique.

Find rhizobia from rice with potential to fix nitrogen in areas under intensive monoculture and, soil with low fertility, provides an important practical value to these bacterial strains. The use of Bioproducts based on these strains could be part of integrated crop management, with less use of mineral fertilizers. This technology acquires special relevance in the context of ecologically and economically sustainable agriculture, especially in crops with high demand and large cultivated areas such as rice. The rice yield is increased each year with a irrational use of mineral fertilizer which negatively affect ecosystems ⁵.