Comunicación corta

  

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Efecto de la inoculación de PGPR aisladas de maíz en el crecimiento de este cultivo bajo condiciones controladas

[0000-0002-5144-212X] Reneé Pérez-Pérez [1] [*]

[0000-0001-7349-7036] Simón Pérez-Martínez [2]

[0000-0002-5187-5881] Iván Almeida-Acosta [3]

[1] Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700

[2] Universidad Estatal de Milagros (UNEMI). Milagros, Provincia del Guayas, Ecuador

[3] Estudiante, Universidad Agraria de La Habana “Fructuoso Rodríguez Pérez”, carretera a Tapaste y Autopista Nacional, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

  [*] Autor para correspondencia: riny@inca.edu.cu

RESUMEN

La aplicación de inoculantes formulados a base de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, en cultivos de interés agrícola como el maíz, representa una alternativa ecológica al uso de químicos en la agricultura. Por otro lado, la utilización de cepas nativas para la inoculación de las plantas, podría representar una ventaja con respecto al uso de cepas alóctonas y, por lo tanto, mejorar la producción del cultivo. En consecuencia, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de la inoculación de 20 cepas bacterianas, aisladas de la rizosfera de maíz y previamente caracterizadas, correspondientes a los géneros Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium y Enterobacter, en el desarrollo de variables morfoagronómicas del propio cultivo. Para ello, se prepararon inoculantes con cada una de las cepas en medio LB líquido. La inoculación se realizó sobre las semillas de maíz sembradas en suelo Ferralítico Rojo no esterilizado, a razón de 300 μl de inóculo por semilla. El experimento se estableció en condiciones controladas de luz, humedad relativa, temperatura y riego y se determinó: altura de la planta, longitud radical, masa seca aérea, masa seca radical y concentración de clorofilas totales, a los 30 días después de la inoculación. Los mejores resultados se obtuvieron con los tratamientos inoculados con Stenotrophomonas sp. INCA-FRr1, Stenotrophomonas sp. INCA-FRc24 y Rhizobium sp. INCA-FRc1. Este estudio representa la base para la concepción de un nuevo bioproducto destinado a la fertilización del cultivo de maíz.

Palabras clave: 

FBN; Stenotrophomonas; Rhizobium; nutrición; fitoestimulación.

 

INTRODUCCIÓN

El suelo alberga gran cantidad de seres vivos, fundamentalmente microorganismos. La variedad genética y la diversidad de nichos ecológicos de las poblaciones microbianas tienen un alto impacto en las funciones del suelo y, en especial, en el crecimiento y desarrollo vegetal 1. Las interacciones que se establecen entre las raíces de las plantas y los microorganismos edáficos constituye un ambiente dinámico denominado rizosfera 2, donde la diversidad y el tamaño de las poblaciones microbianas es superior en comparación con el suelo no cultivado 3. Dichas poblaciones participan activamente en los ciclos biogeoquímicos de nutrientes, principalmente del nitrógeno y del fósforo, producen hormonas vegetales, sintetizan antibióticos, entre otras características y, como resultado, favorecen el establecimiento, la nutrición y el desarrollo de las plantas 4.

El maíz es uno de los cereales más importantes, desde el punto de vista nutricional; también, es el más cultivado y cosechado a nivel mundial, junto con el trigo y el arroz 5. Dado el proceso de domesticación que ha sufrido este cultivo, se hace necesario emplear grandes cantidades de fertilizantes para obtener rendimientos aceptables 6. La fertilización, sobre todo la incorporación de nitrógeno mineral al cultivo, representa el mayor costo del proceso productivo 7; además, el uso irracional de estos insumos impacta de forma negativa sobre el agroecosistema 8 e incluso sobre la salud humana 9.

La elaboración y aplicación de inoculantes formulados con diversas especies microbianas es una práctica bien conocida en la agricultura. Actualmente, en el marco de la sostenibilidad, la búsqueda de nuevos microorganismos con diversas propiedades promotoras del crecimiento vegetal, es una línea de investigación emergente, ya que en determinadas circunstancias, pueden sustituir parcialmente el empleo de pesticidas y fertilizantes químicos 10. La utilización de cepas nativas como inoculantes, promueve el manejo ecológico-sostenible de los agroecosistemas y podría mejorar la producción de los cultivos 11. La capacidad de las cepas nativas para interactuar positivamente con la microbiota edáfica residente y su adaptabilidad a las condiciones climáticas y agroecológicas locales, a menudo potencia su rendimiento en comparación con cepas alóctonas 12.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la inoculación de 20 cepas, caracterizadas como PGPR, aisladas de la rizosfera de maíz, correspondientes a cuatro géneros bacterianos (Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium y Enterobacter), en el crecimiento de plantas de maíz bajo condiciones controladas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material microbiológico

Se utilizaron 20 cepas aisladas de la rizosfera de los cultivares comerciales de maíz ‘Raúl’ y ‘Canilla’. Estas se identificaron y se caracterizaron previamente, en función de su capacidad para realizar la FBN, solubilizar sales de fósforo y potasio e inhibir el crecimiento micelial del patógeno Fusarium oxysporum13. Las características de las cepas se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. 

Identificación y caracterización cualitativa como PGPR de 20 cepas provenientes de la rizosfera de Zea mays L. cultivares ‘Raúl’ y ‘Canilla’

CepasIdentificaciónFBNSolubilización (PO4 -2)Solubilización (K+)Antagonismo
INCA-FRr1Stenotrophomonas sp.++++
INCA-FRr2Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr3Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr4Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr5Pseudomonas sp.+++-
INCA-FRr6Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr7Stenotrophomonas sp.++-+
INCA-FRr8Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr9Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr10Rhizobium sp.+---
INCA-FRr11Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr12Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr13Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr16Enterobacter sp.++--
INCA-FRc1Rhizobium sp.+---
INCA-FRc4Rhizobium sp.+---
INCA-FRc8Rhizobium sp.+---
INCA-FRc16Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRc19Rhizobium sp.+---
INCA-FRc24Stenotrophomonas sp.++-+

Los inoculantes se prepararon en frascos Erlenmeyers de 150 mL de capacidad, con 20 mL de medio LB líquido. Estos se inocularon con una asada de cada cepa, conservadas a 4 ºC en medio LB sólido. Los frascos se mantuvieron en condiciones de agitación en zaranda orbital termostatada a 150 rpm y 29 °C durante 24 h. La densidad óptica se ajustó por espectrofotometría a 0,5 (λ=600 nm) en cada inoculante.

Se utilizó semillas de maíz cultivar ‘Raúl’, procedente del banco de semillas del Departamento de Genética y Mejoramiento de las Plantas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Estas se desinfectaron superficialmente con etanol al 70 % durante 5 min, hipoclorito de sodio al 20 %, durante 10 min y seis lavados consecutivos con agua destilada estéril. Luego, se colocaron superficialmente en macetas con 700 g de suelo Ferralítico Rojo Lixiviado, no esterilizado, a razón de dos semillas por maceta. La inoculación se realizó con 300 μl de inóculo sobre cada semilla, estableciéndose 20 tratamientos y un control no inoculado. A los cinco días después de la inoculación, se extrajeron, de cada maceta, la plántula menos desarrollada o no germinada, manteniendo una planta por maceta. El ensayo se mantuvo durante 30 días bajo condiciones controladas de fotoperiodo (12 h luz/12 h oscuridad), temperatura (día/noche de 26/22 °C) y humedad relativa (70 %). El riego se efectuó cada tres días a todos los tratamientos, incluido el control, con una modificación de la solución nutritiva de Hoagland (5 gL-1 KH2PO4, 27 g L-1 MgSO4.7H2O, 0,14 g L-1 H3BO3, 0,15 g L-1 CuSO4.5H2O, 0,008 g L-1 (NH4)6Mo7O24.6H2O, 0,06 g L-1 ZnSO4.7H2O, 0,2 g L-1 MnSO4.4H2O, 1,87 g L-1 Fe-EDTA (6 %)), de la cual se retiraron las sales nitrogenadas. Posteriormente se determinó altura (cm), largo de raíz (cm), masa seca aérea (MSA) (g), masa seca radical (MSR) (g) y contenido de clorofilas totales (SPAD).

Se establecieron ocho réplicas por tratamiento y se empleó un diseño completamente aleatorizado. Los valores de las variables que se determinaron se sometieron a la prueba de normalidad de Bartlett y homogeneidad de varianza de Kormogorov-Smirnov. Posteriormente, se aplicó análisis de varianza de clasificación simple, utilizando el test de comparación de medias de Tukey para p<0,05. Se empleó el programa SPSS Statistic (ver. 21) para el procesamiento estadístico de los datos. El experimento se realizó por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inoculación en plantas de maíz bajo condiciones controladas

A los 30 días después de la inoculación se observó diferencias estadísticas entre los indicadores de crecimiento evaluados en cada uno de los tratamientos (Tabla 2).

Los tratamientos con mejores resultados correspondieron a las plantas inoculadas con las cepas INCA-FRr1 e INCA-FRc24, identificadas como Stenotrophomonas, además de INCA-FRc1, identificada como Rhizobium. Estos tratamientos presentaron valores estadísticamente superiores al control en cuatro de las cinco variables evaluadas, lo cual podría estar relacionado con los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal que presentan.

Tabla 2. 

Efecto de la inoculación de las cepas bacterianas en el crecimiento de plantas de maíz cultivar ‘Raúl’, bajo condiciones controladas

CepasAltura (cm)Largo Raíz (cm)MSA (g)MSR (g)Clorofilas totales (SPAD)
INCA-FRr165,34 a38,60 ab0,63 abc0,53 a19,14 d
INCA-FRr257,90 abcd35,79 abc0,70 a0,45 abc28,56 abc
INCA-FRr361,64 abc35,04 abc0,66 ab0,42 abc25,96 bc
INCA-FRr459,52 abcd35,82 abc0,55 adcd0,36 abc27,59 abc
INCA-FRr558,26 abcd34,40 abc0,60 abcde0,43 abc29,26 abc
INCA-FRr653,40 de38,34 ab0,51 bcde0,40 abc33,38 a
INCA-FRr755,32 bcd41,98 a0,58 abcd0,51 a23,94 cd
INCA-FRr852,14 de34,38 abc0,49 bcde0,41 abc26,75 bc
INCA-FRr963,76 ab30,60 c0,64 abc0,49 a19,35 d
INCA-FRr1056,04 abcd32,70 bc0,55 abcd0,53 a26,44 bc
INCA-FRr1157,30 abcd32,00 bc0,48 cde0,44 abc28,43 abc
INCA-FRr1260,04 abcd35,04 abc0,52 abcde0,48 ab28,01 abc
INCA-FRr1354,08 cde37,90 ab0,50 bcde0,38 abc28,86 abc
INCA-FRr1661,53abc35,06 abc0,67 ab0,44 abc24,22 cd
INCA-FRc164,90 a37,20 ab0,66 abc0,50 a18,74 d
INCA-FRc457,24 abcd37,92 ab0,56 abcd0,40 abc23,25 cd
INCA-FRc844,66 f34,80 abc0,34 f0,36 abc33,83 a
INCA-FRc1664,80 a37,18 ab0,52 bcde0,39 abc29,74 abc
INCA-FRc1953,40 de30,90 bc0,44 de0,28 c29,08 abc
INCA-FRc2443,89 f37,84 ab0,63 abc0,52 a33,66 a
Control51,24 e29,60 c0,39 ef0,31 bc18,70 d
Error estándar0,7940,5930,0120,0151,793

Se representa la media de cada tratamiento y el error estándar para cada variable medida

Letras iguales en la misma columna no difieren significativamente (Tukey p<0,05, n=8)

También se destacaron los tratamientos con las cepas Pseudomonas sp. INCA-FRr9 Stenotrophomonas sp. INCA-FRr12 y Stenotrophomonas sp. INCA-FRc16. Los géneros Stenotrophomonas, Pseudomonas y Rhizobium, se reportan como microbiota natural, rizosférica y endofítica, de diversos cultivos incluido el maíz 14-16. Trabajos previos aseguran el efecto fitoestimulante de estos microorganismos sobre diferentes cultivos de interés agrícolas, tanto leguminosos como no leguminosos 17-20.

La altura de la planta no tiende a incrementar mucho más que los controles no inoculados, tras aplicar algún tratamiento biológico 21; sin embargo, los resultados muestran aumentos significativos de hasta el 27,5 % entre las cepas INCA-FRr1, INCA-FRc1 e INCA-FRc16, con respecto al control no inoculado. Diferentes ensayos de inoculación de Rhizobium y Stenotrophomonas en maíz, resultan en un ligero aumento en la longitud de las plantas, en comparación con los resultados obtenidos en esta investigación 21-24). Por otro lado, la longitud radical se vio favorecida en las plantas inoculadas con estos mismos tratamientos, además de las cepas INCA-FRc24 e INCA-FRr7. Según la literatura, la inoculación con diferentes especies de Rhizobium, propicia el aumento de la longitud radical, número de raíces y masa seca radical en plantas de maíz 22. En el caso de la inoculación con Stenotrophomonas, no se reportan en investigaciones previas, aumentos significativos en cuanto al desarrollo radical 24-26; sin embargo, los mejores resultados en este ensayo, corresponden al tratamiento con Stenotrophomonas sp. INCA-FRr7, el cual presentó un aumento en la longitud radical del 41,8 %, por encima del tratamiento control.

Las cepas que más aportaron al desarrollo de la masa seca aérea, fueron Pseudomonas sp. INCA-FRr2, Pseudomonas sp. INCA-FRr3 y Enterobacter sp. INCA-FRr16, las cuales presentaron aumentos de hasta un 79,5 % respecto al control. En la literatura se reportan resultados similares para algunas especies de Enterobacter y Pseudomonas, los cuales se atribuyen, fundamentalmente, a la FBN y producción de fitohormonas 27,28. En cuanto a la masa seca radical, se obtuvieron incrementos de hasta un 71 %, respecto a las plantas controles en los tratamientos INCA-FRr1, INCA-FRc1 e INCA-FRc24, principalmente. Algunos autores plantean que el crecimiento y el desarrollo de las variables morfoagronómicas en el maíz, es causado por una suma de factores y no por valores individuales obtenidos in vitro29. Otros afirman que los productos provenientes de la FBN, contribuyen en altos porcientos al desarrollo de la biomasa total del maíz y resaltan el papel de las auxinas como principales causantes del aumento de biomasa radical y aérea 30.

Por su parte, las mayores concentraciones de clorofilas totales fueron obtenidas, nuevamente, en los tratamientos inoculados con Rhizobium y Stenotrophomonas, destacándose las cepas INCA-FRr6, INCA-FRc8 e INCA-FRc24, con un aumento del 81 %, por encima del control. El contenido de clorofila en la planta está estrechamente relacionado con el estado nutricional de la misma 31 y, particularmente, con el contenido de nitrógeno como componente esencial de esta biomolécula 32. Diversas investigaciones estiman una relación directa entre la producción de clorofilas y el suministro de nitrógeno a la planta, basado en la obtención de mayores concentraciones de clorofilas totales, a medida que aumenta la dosis de nitrógeno mineral en el suelo 32,33. Así, uno de los factores importantes que indica la eficiencia de la fertilización nitrogenada, es el contenido de pigmentos fotosintéticos en las hojas, pues las proteínas del ciclo de Calvin y de los tilacoides representan la mayor parte del nitrógeno foliar 21.

Teniendo en cuenta que todas las cepas utilizadas presentaron la capacidad de realizar la FBN, se podría decir que este aspecto favoreció la producción de clorofilas totales. No obstante, las plantas inoculadas con las cepas INCA-FRr1 e INCA-FRc1, mostraron los valores más bajos de esta variable, lo que contrasta con el resto las variables, en las que se destacaron ambos tratamientos de forma positiva. Esto pudiera sugerir que tal vez, la FBN no constituyó el principal mecanismo de promoción del crecimiento vegetal empleado por estas cepas.

En esta investigación, el suelo utilizado provino de la misma región de donde fueron aisladas las cepas inoculadas; además, no fue esterilizado para el ensayo, por lo que no debe haber cambios significativos en la microbiota residente 34. En efecto, las poblaciones microbianas presentes en este suelo, debieron influir en la actividad promotora del crecimiento vegetal de las cepas inoculadas, ya sea potenciándola o inhibiéndola. Por lo tanto, en vista de los resultados obtenidos, podríamos decir que existe compatibilidad y sinergismo entre las cepas INCA-FRr1, INCA-FRc1 e INCA-FRc24 y la microbiota edáfica residente. Por otro lado, tampoco se aplicó fertilizante mineral a los tratamientos, lo que podría influir en la expresión de mecanismos de promoción del crecimiento vegetal que presentan las cepas inoculadas, en especial, la FBN.

Está demostrado que una deficiencia en los compuestos nitrogenados en el medio, estimula la síntesis del complejo enzimático Nitrogenasa, responsable de la FBN 35. En este caso, el bajo contenido de materia orgánica presente en los suelos Ferralíticos Rojos 36, la eliminación de compuestos nitrogenados de la solución nutritiva de Hoagland y la falta de fertilizante mineral, pudieron favorecer las condiciones para la expresión de actividad fijadora de nitrógeno de estas cepas. Por otro lado y sin descartar el papel fundamental de este elemento en el crecimiento de las plantas, especialmente del maíz, es posible que estos microorganismos presenten otros mecanismos de promoción del crecimiento vegetal que no se han determinado en este trabajo. También cabe destacar, que los géneros Stenotrophomonas y Rhizobium, los más sobresalientes en este ensayo, a pesar de su carácter diazotrófico, en plantas no leguminosas son más conocidos por su capacidad fitoestimulante que por el aporte de la FBN 21-24,37,38. Por estas razones, sería conveniente realizar una caracterización más completa de las cepas estudiadas.

CONCLUSIONES

  • Los inoculantes conformados por Stenotrophomonas sp. INCA-FRr1, Stenotrophomonas sp. INCA-FRc24 y Rhizobium sp. INCA-FRc1, presentaron incrementos significativos con respecto al control no inoculado en un mayor número de variables. Aunque el aumento de la disponibilidad de nitrógeno mediante la FBN es imprescindible para el crecimiento de la planta, podrían existir otros mecanismos que contribuyan a ello de forma significativa. Por esto, se hace necesario profundizar en otras características promotoras del crecimiento vegetal que podrían presentar estas cepas.

  • Las cepas INCA-FRr1, INCA-FRc1 e INCA-FRc24, constituyen inoculantes promisorios para una nueva fase de experimentación en condiciones semicontroladas y de campo.

 

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Recibido: 14/10/2019

Aceptado: 29/03/2021

 

 

Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons

 

Short communication

 

Effect of the inoculation of PGPR isolated from corn on the growth of this crop under controlled conditions

[0000-0002-5144-212X] Reneé Pérez-Pérez [1] [*]

[0000-0001-7349-7036] Simón Pérez-Martínez [2]

[0000-0002-5187-5881] Iván Almeida-Acosta [3]

[1] Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700

[2] Universidad Estatal de Milagros (UNEMI). Milagros, Provincia del Guayas, Ecuador

[3] Estudiante, Universidad Agraria de La Habana “Fructuoso Rodríguez Pérez”, carretera a Tapaste y Autopista Nacional, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

  [*] Author for correspondence: riny@inca.edu.cu

ABSTRACT

The application of inoculants formulated based on plant growth promoting rhizobacteria in crops of agricultural interest such as corn, represents an ecological alternative to the use of chemicals in agriculture. On the other hand, the use of native strains for the inoculation of plants could represent an advantage over the use of alien strains and, therefore, improve crop production. Consequently, the present work aimed to evaluate the inoculation effect of 20 bacterial strains, isolated from the rhizosphere of corn and previously characterized, corresponding to the genera Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium and Enterobacter, in the development of morphoagronomic variables of its own culture. For this, inoculants were prepared with each of the strains in liquid LB medium. The inoculation was carried out on the corn seeds sown in unsterilized Red Ferrallitic soil, at a rate of 300 μl of inoculum per seed. The experiment was established under controlled conditions of light, relative humidity, temperature and irrigation and it was determined: plant height, root length, aerial dry mass, root dry mass and concentration of total chlorophylls, 30 days after inoculation. The best results were obtained with treatments inoculated with Stenotrophomonas sp. INCA-FRr1, Stenotrophomonas sp. INCA-FRc24 and Rhizobium sp. INCA-FRc1. This study represents the basis for the conception of a new bioproduct destined for the fertilization of corn crop.

Key words: 

FBN; Stenotrophomonas; Rhizobium; nutrition; phytostimulation.

INTRODUCTION

The soil houses a large number of living beings, mainly microorganisms. The genetic variety and the diversity of ecological niches of microbial populations have a high impact on soil functions and, especially, on plant growth and development 1. Interactions established between plant roots and edaphic microorganisms constitute a dynamic environment called rhizosphere 2, where the diversity and size of microbial populations is higher compared to uncultivated soil 3. These populations actively participate in the biogeochemical cycles of nutrients, mainly nitrogen and phosphorus, produce plant hormones, synthesize antibiotics, among other characteristics and, as a result, favor the establishment, nutrition and development of plants 4.

Corn is one of the most important cereals, from a nutritional point of view; also, it is the most cultivated and harvested worldwide, along with wheat and rice 5. Given the domestication process that this crop has undergone, it is necessary to use large amounts of fertilizers to obtain acceptable yields 6. Fertilization, especially the incorporation of mineral nitrogen to the crop, represents the highest cost of the production process 7; Furthermore, the irrational use of these inputs has a negative impact on the agroecosystem 8 and even on human health 9.

The manufacture and application of inoculants formulated with various microbial species is a well-known practice in agriculture. Currently, within the framework of sustainability, the search for new microorganisms with various properties that promote plant growth is an emerging line of research, since in certain circumstances, they can partially replace the use of pesticides and chemical fertilizers 10. The use of native strains as inoculants promote the ecological-sustainable management of agroecosystems and could improve crop production 11. The ability of native strains to interact positively with the resident edaphic microbiota and their adaptability to local climatic and agroecological conditions often enhances their performance compared to non-native strains 12.

The objective of this work was to evaluate the inoculation effect of 20 strains, characterized as PGPR, isolated from the corn rhizosphere, corresponding to four bacterial genera (Stenotrophomonas, Pseudomonas, Rhizobium and Enterobacter), on the growth of low corn plants. controlled conditions.

MATERIALS AND METHODS

Microbiological material

Twenty strains isolated from the rhizosphere of commercial corn cultivars 'Raúl' and 'Canilla' were used. These were previously identified and were characterized, based on their ability to perform BNF, solubilize phosphorus and potassium salts and inhibit mycelial growth of the pathogen Fusarium oxysporum13. The characteristics of the strains are shown in Table 1.

Table 1. 

Identification and qualitative characterization as PGPR of 20 strains from the rhizosphere of Zea mays L. cultivars 'Raúl' and 'Canilla'

StrainsIdentificationBNFSolubilization (PO4 -2)Solubilization (K+)Antagonism
INCA-FRr1Stenotrophomonas sp.++++
INCA-FRr2Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr3Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr4Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr5Pseudomonas sp.+++-
INCA-FRr6Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr7Stenotrophomonas sp.++-+
INCA-FRr8Pseudomonas sp.++-+
INCA-FRr9Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr10Rhizobium sp.+---
INCA-FRr11Pseudomonas sp.++--
INCA-FRr12Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr13Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRr16Enterobacter sp.++--
INCA-FRc1Rhizobium sp.+---
INCA-FRc4Rhizobium sp.+---
INCA-FRc8Rhizobium sp.+---
INCA-FRc16Stenotrophomonas sp.++--
INCA-FRc19Rhizobium sp.+---
INCA-FRc24Stenotrophomonas sp.++-+

Inoculants were prepared in Erlenmeyer flasks of 150 mL capacity, with 20 mL of liquid LB medium. These were inoculated with a roast of each strain, stored at 4 ºC in solid LB medium. The flasks were kept under shaking conditions on a thermostated orbital shaker at 150 rpm and 29 °C for 24 h. The optical density was adjusted by spectrophotometry to 0.5 (λ = 600 nm) in each inoculant.

Corn cultivar ‘Raúl’ seeds were used, from the seed bank of the Department of Genetics and Plant Breeding of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA). These were superficially disinfected with 70 % ethanol for 5 min, 20 % sodium hypochlorite, for 10 min and six consecutive washes with sterile distilled water. Then, they were placed superficially in pots with 700 g of Leached Red Ferralitic soil, not sterilized, at the rate of two seeds per pot. The inoculation was carried out with 300 μl of inoculum on each seed, establishing 20 treatments and a non-inoculated control. Five days after inoculation, the less developed or non-germinated seedling was extracted from each pot, keeping one plant per pot. The test was maintained for 30 days under controlled conditions of photoperiod (12 h light/12 h darkness), temperature (day/night 26/22 °C) and relative humidity (70 %). Irrigation was carried out every three days for all treatments, including the control, with a modification of the Hoagland nutrient solution (5 gL-1 KH2PO4, 27 g L-1 MgSO4.7H2O, 0.14 g L-1 H3BO3, 0.15 g L-1 CuSO4.5H2O, 0.008 g L-1 (NH4) 6Mo7O24.6H2O, 0.06 g L-1 ZnSO4.7H2O, 0.2 g L-1 MnSO4.4H2O, 1.87 g L-1 Fe-EDTA (6%)), from which the nitrogenous salts were removed. Subsequently, height (cm), root length (cm), aerial dry mass (ADM) (g), radical dry mass (RDM) (g) and total chlorophyll content (SPAD)

Eight replications per treatment were established and a completely randomized design was used. Variable values that were determined were subjected to the Bartlett normality test and the Kormogorov-Smirnov homogeneity of variance test. Subsequently, a simple classification analysis of variance was applied, using the Tukey mean comparison test for p <0.05. The SPSS Statistic program (ver. 21) was used for the statistical processing of the data. The experiment was carried out in triplicate.

RESULTS AND DISCUSSION

Inoculation in corn plants under controlled conditions

At 30 days after inoculation, statistical differences were observed between the growth indicators evaluated in each of the treatments (Table 2).

The treatments with the best results corresponded to the plants inoculated with the INCA-FRr1 and INCA-FRc24 strains, identified as Stenotrophomonas, in addition to INCA-FRc1, identified as Rhizobium. These treatments presented statistically superior values to the control in four of the five variables evaluated, which could be related to the mechanisms of plant growth promotion that they present.

Table 2. 

Inoculation effect of bacterial strains on the growth of corn plants cultivar 'Raúl', under controlled conditions

StrainsHeight (cm)Root Length (cm)ADM (g)RDM (g)Total chlorophylls (SPAD)
INCA-FRr165.34 a38.60 ab0.63 abc0.53 a19.14 d
INCA-FRr257.90 abcd35.79 abc0.70 a0.45 abc28.56 abc
INCA-FRr361.64 abc35.04 abc0.66 ab0.42 abc25.96 bc
INCA-FRr459.52 abcd35.82 abc0.55 adcd0.36 abc27.59 abc
INCA-FRr558.26 abcd34.40 abc0.60 abcde0.43 abc29.26 abc
INCA-FRr653.40 de38.34 ab0.51 bcde0.40 abc33.38 a
INCA-FRr755.32 bcd41.98 a0.58 abcd0.51 a23.94 cd
INCA-FRr852.14 de34.38 abc0.49 bcde0.41 abc26.75 bc
INCA-FRr963.76 ab30.60 c0.64 abc0.49 a19.35 d
INCA-FRr1056.04 abcd32.70 bc0.55 abcd0.53 a26.44 bc
INCA-FRr1157.30 abcd32.00 bc0.48 cde0.44 abc28.43 abc
INCA-FRr1260.04 abcd35.04 abc0.52 abcde0.48 ab28.01 abc
INCA-FRr1354.08 cde37.90 ab0.50 bcde0.38 abc28.86 abc
INCA-FRr1661.53abc35.06 abc0.67 ab0.44 abc24.22 cd
INCA-FRc164.90 a37.20 ab0.66 abc0.50 a18.74 d
INCA-FRc457.24 abcd37.92 ab0.56 abcd0.40 abc23.25 cd
INCA-FRc844.66 f34.80 abc0.34 f0.36 abc33.83 a
INCA-FRc1664.80 a37.18 ab0.52 bcde0.39 abc29.74 abc
INCA-FRc1953.40 de30.90 bc0.44 de0.28 c29.08 abc
INCA-FRc2443.89 f37.84 ab0.63 abc0.52 a33.66 a
Control51.24 e29.60 c0.39 ef0.31 bc18.70 d
Standard error0.7940.5930.0120.0151.793

The mean of each treatment and the standard error for each measured variable are represented.

Equal letters in the same column do not differ significantly (Tukey p <0.05, n = 8)

Treatments with the strains Pseudomonas sp. INCA-FRr9 Stenotrophomonas sp. INCA-FRr12 and Stenotrophomonas sp. INCA-FRc16. The genera Stenotrophomonas, Pseudomonas and Rhizobium, are reported as natural, rhizospheric and endophytic microbiota of various crops including corn 14-16. Previous works ensure the phytostimulant effect of these microorganisms on different crops of agricultural interest, both legumes and non-legumes 17-20.

Plant height does not tend to increase much more than the non-inoculated controls, after applying some biological treatment 21; however, the results show significant increases of up to 27.5 % between the INCA-FRr1, INCA-FRc1 and INCA-FRc16 strains, with respect to the non-inoculated control. Different tests of inoculation of Rhizobium and Stenotrophomonas in corn result in a slight increase in the length of the plants, in comparison with the results obtained in this investigation 21-24. On the other hand, the root length was favored in the plants inoculated with these same treatments, in addition to the INCA-FRc24 and INCA-FRr7 strains. According to the literature, inoculation with different species of Rhizobium enhances an increase in root length, root number and root dry mass in corn plants 22. In the case of inoculation with Stenotrophomonas, significant increases in root development have not been reported in previous research 24-26; however, the best results in this trial correspond to treatment with Stenotrophomonas sp. INCA-FRr7, which presented an increase in root length of 41.8 %, above the control treatment.

The strains that contributed the most to the development of the aerial dry mass were Pseudomonas sp. INCA-FRr2, Pseudomonas sp. INCA-FRr3 and Enterobacter sp. INCA-FRr16, which presented increases of up to 79.5% compared to the control. Similar results are reported in the literature for some species of Enterobacter and Pseudomonas, which are mainly attributed to BNF and phytohormone production 27,28. Regarding the radical dry mass, increases of up to 71 % were obtained, with respect to control plants in the INCA-FRr1, INCA-FRc1 and INCA-FRc24 treatments, mainly. Some authors suggest that the growth and development of morphoagronomic variables in corn is caused by a sum of factors and not by individual values obtained in vitro29. Others affirm that the products from BNF contribute in high percentages to the total biomass development of maize and highlight the role of auxins as the main causes of the increase in root and aerial biomass 30.

On the other hand, the highest concentrations of total chlorophylls were obtained, again, in treatments inoculated with Rhizobium and Stenotrophomonas, highlighting the INCA-FRr6, INCA-FRc8 and INCA-FRc24 strains, with an increase of 81 %, above the control. The chlorophyll content in plant is closely related to its nutritional status 31 and, particularly, to the nitrogen content as an essential component of this biomolecule 32. Various investigations estimate a direct relationship between the production of chlorophylls and the supply of nitrogen to the plant, based on obtaining higher concentrations of total chlorophylls, as the dose of mineral nitrogen in the soil increases 32,33. Thus, one of the important factors that indicates the efficiency of nitrogen fertilization is the content of photosynthetic pigments in leaves, since the proteins of the Calvin cycle and of the thylakoids represent most of the foliar nitrogen 21.

Taking into account that all the strains used had the ability to perform BNF, it could be said that this aspect favored the production of total chlorophylls. However, plants inoculated with the INCA-FRr1 and INCA-FRc1 strains showed the lowest values of this variable, which contrasts with the rest of the variables, in which both treatments stood out positively. This could suggest that perhaps, BNF was not the main plant growth promotion mechanism used by these strains.

In this research, the soil used came from the same region from which the inoculated strains were isolated; furthermore, it was not sterilized for the trial, so there should be no significant changes in the resident microbiota 34. Indeed, the microbial populations present in this soil must have influenced the plant growth promoting activity of the inoculated strains, either by enhancing or inhibiting it. Therefore, it could appreciate that there is compatibility and synergism between the INCA-FRr1, INCA-FRc1 and INCA-FRc24 strains and the resident edaphic microbiota. On the other hand, mineral fertilizer was not applied to the treatments, which could influence the expression of plant growth promotion mechanisms presented by inoculated strains, especially BNF.

It has been shown that a deficiency in nitrogen compounds in the medium stimulates the synthesis of the enzymatic complex Nitrogenase, responsible for BNF 35. In this case, the low content of organic matter present in the Red Ferrallitic soils 36, the nitrogen elimination of compounds from the Hoagland nutrient solution and the lack of mineral fertilizer, could enhance conditions for the expression of nitrogen-fixing activity of these strains. On the other hand, and without ruling out the fundamental role of this element in the growth of plants, especially corn, it is possible that these microorganisms present other mechanisms to promote plant growth that have not been determined in this work. It should also be noted that the genera Stenotrophomonas and Rhizobium, the most outstanding in this trial, despite their diazotrophic character, in non-legume plants are better known for their phytostimulant capacity than for the contribution of BNF 21-24,37,38. For these reasons, it would be convenient to carry out a more complete characterization of the strains studied.

CONCLUSIONS

  • The inoculants made up of Stenotrophomonas sp. INCA-FRr1, Stenotrophomonas sp. INCA-FRc24 and Rhizobium sp. INCA-FRc1, presented significant increases with respect to the non-inoculated control in a greater number of variables. Although increasing nitrogen availability through BNF is essential for plant growth, there could be other mechanisms that contribute to it significantly. For this reason, it is necessary to delve into other characteristics that promote plant growth that these strains could present.

  • The INCA-FRr1, INCA-FRc1 and INCA-FRc24 strains are promising inoculants for a new phase of experimentation under semi-controlled and field conditions.