Material vegetal

Como material vegetal se utilizaron esquejes (brotes con una longitud de aproximadamente 8-10 cm), procedentes de plantas madre de Stevia rebaudiana Bertoni propagadas in vitro, con 120 días después de la siembra mantenidas en el Área de Adaptación del Centro de Bioplantas de Ciego de Ávila y libre de plagas (Figura 1). Fueron previamente cultivadas en bolsas de polietileno de 1,2 L de capacidad, que contenían como sustrato una mezcla de suelo Ferralítico Rojo Compactado y cachaza (1:1 v/v) (15).

Previo a la plantación, los esquejes se pusieron en contacto por la base con polvo enraizador compuesto por Ácido Naftalen Acético (ANA) y Ácido Indol Butírico (AIB) (2000 mg kg^-1 c/u), de manera individual e inmediatamente se enterraron en el sustrato a una profundidad de 1-2 cm aproximadamente, según Instructivo del Área de Adaptación del Centro de Bioplantas.

Los esquejes enraizados con 20 días de edad se trasladaron y sembraron en condiciones de campo, en mayo de 2018, en la UEB de Plantas Medicinales. El área total sembrada para el experimento fue 0,025 ha (1374 plantas) sobre suelo Ferralítico Rojo Compactado con pH Neutro y de textura arcillosa (15). La preparación de suelo se realizó por tracción animal. La siembra fue de forma manual. Se dejó un borde de 2 m por cada lado de la parcela. Los tratamientos consistieron en tres distancias de plantación: tratamiento (Tto) 1: 15x20 cm (333 333 plantas ha^-1), Tto 2: 20x20 cm (250 000 plantas ha^-1) y Tto 3: 25x20 cm (200 000 plantas ha^-1). Se utilizó un diseño de bloque completo al azar, con 185 plantas para el tratamiento 1, 153 plantas en el tratamiento 2 y 120 plantas en el tratamiento 3. Cada uno de estos bloques se repitió tres veces. Se seleccionaron al azar e identificaron 40 plantas (n=40) para cada tratamiento, para un total de 120 plantas. Se realizaron tres evaluaciones cada 60 días durante un periodo de 180 días.

Las evaluaciones se realizaron en cada poda y se describen a continuación:

Extracción y cuantificación de extractos ricos en esteviolglicósidos

Se procedió a la extracción y cuantificación de esteviolglicósidos a partir de las hojas secas de Stevia rebaudiana Bertoni recolectadas en cada poda. Las hojas se trituraron en un molino (modelo Mikro-Feinmuhle-Culatti, MFC) con un tamaño de partículas de 0,7 µm, manteniendo la proporción masa/volumen: 1:10 (m/v). Se obtuvo un extracto acuoso clarificado para cada tratamiento. Para ello, se calentó 10 mL de agua destilada hasta 100^°C y se le añadió 1 g de hojas secas. La extracción se realizó durante 3 h en reposo. Luego se centrifugó a 21891xg durante 20 min (centrífuga modelo Heal Force).

El precipitado se desechó y el sobrenadante se clarificó con carbón activado (2 %) (16), para eliminar pigmentos que pudieran interferir en la determinación de esteviolglicósidos. Se agitó por 20 min en agitador vortex (IKA GENIUS3) y se centrifugó a 21891xg durante 20 min. Este ensayo se realizó tres veces. Se utilizaron tres réplicas por cada poda.

Posteriormente, se midió la absorbancia a 210 nm de los extractos crudos acuosos clarificados de Stevia en espectrofotómetro (Pharmacia LKB, Ultrospec II, HOLANDA) para determinar el contenido de esteviolglicósidos. Se realizaron tres determinaciones por cada réplica. El resultado se expresó en mg de esteviolglicósidos g^-1 masa seca.

Procesamiento estadístico

En el procesamiento de los datos se emplearon las pruebas estadísticas de Kolmogorov Smirnov y la prueba de Levene para comprobar los supuestos de distribución normal y homogeneidad de varianzas, respectivamente. Al cumplirse estos supuestos, se aplicó la prueba de análisis de varianza (ANOVA simple) de efectos fijos y al encontrarse diferencias significativas se aplicó la prueba de comparaciones múltiples DHS de Tukey con un nivel de significación estadística de p≤0,05. En todos los casos se utilizó como procesador estadístico el Statistical Packagefor Social Sciences (SPSS) versión 21,0. Para la variable de porcentaje de floración no se realizó prueba estadística.

Efecto de la distancia de plantación en la producción de biomasa vegetal

La altura de la planta se expone en la Figura 2A. No se observan diferencias significativas en esta variable agronómica en las tres distancias de plantación estudiadas. La altura de las plantas fue de 58, 59 y 62 cm, en las distancias 15x20, 20x20, 25x20 cm, respectivamente. Resultados inferiores de esta variable (45, 20 y 37,5 cm) fueron notificados en condiciones de campo (17-19), respectivamente.

Se considera que la distancia de 25x20 cm pudiera resultar factible. Las plantas tienen mayor espacio para el desarrollo foliar y disminuirá la competencia por nutrientes. Además, se limita el excesivo autosombreo que podría ocasionar decrecimientos en la tasa fotosintética media por unidad de área foliar con detrimentos en la biomasa total por planta (20).

Respecto al número de ramas por planta de Stevia rebaudiana Bertoni en condiciones de campo, fue significativamente superior en la distancia de plantación de 25x20 cm (35 ramas por planta) (Figura 2B).

Las distancias de 15x20 y 20x20 cm presentaron valores inferiores que no evidenciaron diferencias significativas entre ellos para este carácter. La mayor distancia de plantación pudo ser favorable para la nutrición de las plantas, así como para el desarrollo de la fotosíntesis.

El efecto de la distancia de plantación sobre la masa fresca de las hojas por planta de Stevia rebaudiana Bertoni, en condiciones de campo, se muestra en la Figura 2C. Los mayores valores se alcanzaron con la distancia de plantación de 25x20 cm con 166,8 g por planta, seguido por las otras dos distancias de plantación 20x20 y 15x20 cm. Entre todos los tratamientos existieron diferencias significativas.

La mayor distancia de plantación resultó más favorable, quizás por el espacio proporcionado tanto aéreo como en el suelo, el cual facilita la expansión de las ramas laterales y una mejor uniformidad en cuanto a la luz solar recibida por las hojas de las plantas. Por otra parte, la distancia también proporciona un mayor espacio para el desarrollo radicular y una mejor absorción de nutrientes por planta (21).

La masa fresca de los tallos de Stevia rebaudiana Bertoni en condiciones de campo (Figura 2D) presentó un comportamiento similar a la masa fresca de las hojas. Existieron diferencias significativas entre todos los tratamientos. Los valores superiores se alcanzaron con la distancia de plantación de 25x20 cm con 163,60 g planta^-1, seguidos por las distancias de 20x20 cm (130,51 g planta^-1) y 15x20 cm (110,73 g planta^-1).

La masa seca de las hojas por planta fue significativamente superior con la distancia de plantación de 25x20 cm (Figura 2E), con valor de 7,4 g planta^-1. Entre las distancias de plantación de 20x20 (5,53 g) y de 15x20 cm (3,3 g) también existió diferencias significativas.

Resultados similares de esta variable (4 a 7 g planta^-1 de masa seca de las hojas por planta) fueron observados en condiciones de campo (22-24). Sin embargo, otros autores encontraron valores superiores (6,25 a 10,57 g planta^-1) en esta variable (24).

La masa seca de los tallos por planta de Stevia rebaudiana Bertoni en condiciones de campo con diferentes distancias de plantación se muestra en la Figura 2F. Existe diferencia significativa en esta variable agronómica en las tres distancias de plantación. Con la distancia de 25x20 cm se observaron los mejores resultados, coincidiendo con un estudio previo (25). En forma decreciente, continúan las distancias de 20x20 y 15x20 cm con 17,42 y 12,55 g planta^-1, respectivamente. De este modo, en la presente investigación, el aumento de la distancia de plantación favoreció el crecimiento y desarrollo de las plantas; lo que se refleja en la mayoría de las variables agronómicas descritas.

La distancia de plantación influyó positivamente sobre el rendimiento de las plantas de Stevia rebaudiana Bertoni (Figura 2G). El rendimiento mayor se obtuvo con la distancia de plantación de 25x20 cm con 1,48 t ha^-1, seguido por el observado en la distancia de plantación de 20x20 cm (1,38 t ha^-1) y el inferior correspondió a la de 15x20 cm (1,10 t ha^-1).

Los resultados de la distancia de plantación sobre el porcentaje de floración de las plantas de Stevia rebaudiana Bertoni demostraron que todas las plantas florecieron en el mes de noviembre, sin observarse diferencias significativas. La floración es independiente de la distancia de plantación, siendo más dependiente del fotoperiodo, de la época del año y de las bajas temperaturas (26).

Efecto de la distancia de plantación en el contenido de esteviolglicósidos

La Tabla 1 muestra los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la distancia de plantación en el contenido de esteviolglicósidos de Stevia rebaudiana Bertoni. Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizaron las distancias de plantación 25x20 cm y 20x20 cm con 450,89 y 447,34 mg g^-1 MS, respectivamente, sin diferencias estadísticas entre sí.

Estos resultados son superiores a los informados en estudios previos que se realizaron en condiciones de vivero y de laboratorio in vitro (24,26), respectivamente. Además de las condiciones propias de estudio, las diferencias en cuanto al contenido de sustancias edulcorantes respecto a este trabajo pudieran estar relacionadas con varios factores como el ciclo de crecimiento de la planta (27), la edad de la planta (28), la región donde se cultiva (29) y la densidad de plantación utilizada (30).

Específicamente la distancia de plantación es un factor especial en el crecimiento y desarrollo de las plantas de Stevia y su contenido de esteviolglicósidos (30), aunque otros autores refieren en sus resultados un efecto poco significativo (31). La raíz de Stevia rebaudiana Bertoni, es pivotante, filiforme y no profundiza, es decir se distribuye cerca de la superficie (32). No se puede descartar la posibilidad de que haya existido competencia entre las plantas de esta especie. Sí se descarta la competencia con plantas indeseables, ya que los surcos se mantuvieron limpios de plantas arvenses durante el tiempo de las evaluaciones. Sin embargo, la distancia de siembra de 25x20 cm puede ser beneficiosa para una mejor obtención de nutrientes por planta. Igualmente, puede favorecer una iluminación eficiente y consecuentemente, el desarrollo de la fotosíntesis y por ende un elevado contenido de esteviolglicósidos.

En las evaluaciones realizadas en el presente estudio, todos los resultados para las variables analizadas fueron superiores en la distancia de plantación de 25x20 cm, con excepción de las variables altura de la planta, porcentaje de floración y contenido de esteviolglicósidos que no mostraron diferencias significativas.

Plant material

As vegetal material were used cuttings (sprouts with a length of approximately 8-10 cm), coming from mother plants of Stevia rebaudiana Bertoni propagated in vitro, with 120 days after sowing, kept in the Bioplant Center Adaptation Area from Ciego de Avila and free of pests (Figure 1). They were previously cultivated in polyethylene bags of 1.2 L capacity, containing as substrate a mixture of Ferrallitic Red Compacted Ferrallitic soil and filter cake (1:1 v/v) (15).

Prior to planting, cuttings were put in contact at the base with rooting powder composed of Naftalene Acetic Acid (NAA) and Indole Butyric Acid (IBA) (2000 mg kg^-1 each), individually and immediately buried in the substrate at a depth of approximately 1-2 cm, according to Instructions of the Bioplant Center Adaptation Area.

The rooted cuttings with 20 days of age were transferred and planted in field conditions, in May 2018, in the UEB of Medicinal Plants. The total area planted for the experiment was 0.025 ha (1374 plants) on Compacted Red Ferrallitic soil with Neutral pH and clay texture (15). Soil preparation was done by animal traction. Planting was done manually. A 2 m border was left on each side of the plot. Treatments consisted of three planting distances: treatment (Tment) 1: 15x20 cm (333 333 plants ha^-1), Tment 2: 20x20 cm (250 000 plants ha^-1) and Tment 3: 25x20 cm (200 000 plants ha^-1). A randomized complete block design was used, with 185 plants for treatment 1, 153 plants in treatment 2 and 120 plants in treatment 3. Each of these blocks was repeated three times. Forty plants (n=40) were randomly selected and identified for each treatment, for a total of 120 plants. Three evaluations were made every 60 days for a period of 180 days.

The evaluations were conducted at each pruning and they are described below:

Extraction and quantification of steviolglycoside-rich extracts

Steviolglycosides were extracted and quantified from dried leaves of Stevia rebaudiana Bertoni collected from each pruning. Leaves were crushed in a mill (Mikro-Feinmuhle-Culatti model, MFC) with a particle size of 0.7 µm, maintaining the mass/volume ratio: 1:10 (m/v). A clarified aqueous extract was obtained for each treatment. For this, 10 mL of distilled water was heated to 100 °C and 1 g of dried leaves was added. The extraction was carried out for 3 h at rest. It was then centrifuged at 21891xg for 20 min (Heal Force model centrifuge). The precipitate was discarded and the supernatant was clarified with activated carbon (2 %) (16), to eliminate pigments that could interfere in the determination of steviolglycosides. It was shaken for 20 min in vortex shaker (IKA GENIUS3) and centrifuged at 21891xg for 20 min. This assay was performed three times. Three replicates were used for each pruning. Subsequently, the absorbance at 210 nm of the clarified aqueous crude extracts of Stevia was measured in spectrophotometer (Pharmacia LKB, Ultrospec II, HOLLAND) to determine the content of steviolglycosides. Three determinations were performed for each replicate. The result was expressed as mg steviolglycosides g^-1 dry mass.

Statistical processing

The Kolmogorov Smirnov test and Levene's test were used to check assumptions of normal distribution and homogeneity of variances, respectively. When these assumptions were met, the variance test analysis (simple ANOVA) for fixed effects was applied and when significant differences were found, Tukey's DHS multiple comparisons test was applied with a statistical significance level of p≤0.05. In all cases, Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 21.0 was used as the statistical processor. No statistical test was performed for the flowering percentage variable.

Effect of planting distance on plant biomass production

Plant height is shown in Figure 2A. No significant differences in this agronomic variable were observed in the three planting distances studied. Plant height was 58, 59 and 62 cm, at distances 15x20, 20x20, 25x20 cm, respectively. Lower results for this variable (45, 20 and 37.5 cm) were reported under field conditions (17-19), respectively.

It is considered that the distance of 25x20 cm could be feasible. Plants have more space for leaf development and competition for nutrients will be reduced. In addition, excessive self-shading is limited, which could cause decreases in the average photosynthetic rate per unit of leaf area with detriments in the total biomass per plant (20).

Branch number per plant of Stevia rebaudiana Bertoni under field conditions was significantly higher at the 25x20 cm planting distance (35 branches per plant) (Figure 2B). The distances of 15x20 and 20x20 cm presented lower values that did not show significant differences between them for this trait. The longer planting distance could be favorable for plant nutrition as well as for the development of photosynthesis.

The planting distance effect on the fresh mass of leaves per plant of Stevia rebaudiana Bertoni, under field conditions, is shown in Figure 2C. The highest values were reached with the 25x20 cm planting distance with 166.8 g per plant, followed by the other two planting distances 20x20 and 15x20 cm. Significant differences existed among all treatments.

The longer planting distance was more favorable, perhaps because of the space provided both above and below ground, which facilitates the expansion of lateral branches and better uniformity in terms of sunlight received by plant leaves. On the other hand, the distance also provides more space for root development and better nutrient absorption per plant (21).

The fresh mass of Stevia rebaudiana Bertoni stems under field conditions (Figure 2D) showed a similar behavior to the fresh mass of leaves. There were significant differences among all treatments. The highest values were reached with the planting distance of 25x20 cm with 163.60 g plant^-1, followed by the distances of 20x20 cm (130.51 g plant^-1) and 15x20 cm (110.73 g plant^-1).

Leaf dry mass per plant was significantly higher with the 25x20 cm planting distance (Figure 2E), with value of 7.4 g plant^-1. There were also significant differences between the 20x20 cm (5.53 g) and 15x20 cm (3.3 g) planting distances.

Similar results for this variable (4 to 7 g plant^-1 of leaf dry mass per plant) were observed under field conditions (22-24). However, other authors found higher values (6.25 to 10.57 g plant-1) for this variable (24). The dry mass of stems per plant of Stevia rebaudiana Bertoni under field conditions with different planting distances is shown in Figure 2F. There is significant difference in this agronomic variable at the three planting distances. The best results were observed with the 25x20 cm distance, coinciding with a previous study (25). The distances of 20x20 and 15x20 cm continued to decrease, with 17.42 and 12.55 g plant^-1, respectively. Thus, in the present investigation, the increase in planting distance anhanced plant growth and development, which is reflected in most of the agronomic variables described.

Planting distance positively influenced the yield of Stevia rebaudiana Bertoni plants (Figure 2G). The highest yield was obtained with the 25x20 cm planting distance with 1.48 t ha^-1, followed by that observed at the 20x20 cm planting distance (1.38 t ha^-1) and the lowest corresponded to the 15x20 cm (1.10 t ha^-1).

Planting distance results on the flowering percentage of Stevia rebaudiana Bertoni plants showed that all plants flowered in November, with no significant differences. Flowering is independent of planting distance, being more dependent on photoperiod, time of year and low temperatures (26).

Effect of planting distance on steviolglycoside content

Table 1 shows the results when evaluating the planting distance effect on the steviolglycoside content of Stevia rebaudiana Bertoni. The best results were obtained when the planting distances 25x20 cm and 20x20 cm were used with 450.89 and 447.34 mg g^-1 DM, respectively, with no statistical differences between them.

These results are superior to those reported in previous studies carried out under nursery and in vitro laboratory conditions (24,26), respectively. In addition to the study conditions, differences in sweetener content with respect to this work could be related to several factors such as the growth cycle of the plant (27), the plant age (28), the region where it is grown (29), and the planting density used (30).

Specifically, planting distance is a special factor in the growth and development of Stevia plants and their content of steviolglycosides (30), although other authors report an insignificant effect in their results (31). The root of Stevia rebaudiana Bertoni, is pivoting, filiform and does not go deep, that is to say, it is distributed near the surface (32). The possibility of competition among plants of this species cannot be ruled out. Competition with undesirable plants can be ruled out, since the furrows were kept clean of weeds during evaluation time. However, the planting distance of 25x20 cm may be beneficial for better nutrient uptake per plant. Likewise, it can favor an efficient illumination and consequently, the development of photosynthesis and therefore a high content of steviolglycosides.

In the evaluations carried out in the present study, all the results for variables analyzed were superior at the 25x20 cm planting distance, with the exception of the variables plant height, flowering percentage and steviolglycoside content, which did not show significant differences.