Material vegetal

Los frutos maduros fueron colectados en la UCTB “Félix Duque” de Jagüey Grande, perteneciente al Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT); a partir de plantas de citrumelo Swingle que mostraron un 40 % de poliembrionía y un promedio de 1,8 plántulas por semilla (datos no mostrados).

Explantes

Los explantes irradiados en los Protocolos 1 y 2 fueron semillas y segmentos de epicótilo, respectivamente.

Las semillas se extrajeron de los frutos frescos, se descascararon y desinfectaron con hipoclorito de sodio (0,7 %) y se transfirieron a tubos de cultivo que contenían medio de Murashige y Skoog (MS) basal, sin vitaminas ni sacarosa ni reguladores del crecimiento vegetal (RCV). Luego de la irradiación, se transfirieron inmediatamente a nuevos tubos de cultivo con medio fresco, una semilla por tubo y se mantuvieron para su germinación por 30 días en cuarto de crecimiento controlado a 25 ^oC, 60 % de humedad relativa, fotoperiodo de 16-h luz / 8-h oscuridad e iluminancia de 2500 lx suministrada con lámparas fluorescentes Chiyoda. Las plántulas germinadas se transfirieron a MS líquido con mioinositol (0,1 g L^-1) y 30 g L^-1 de sacarosa y se subcultivaron por 60 días hasta tener al menos tres entrenudos. En las semillas poliembriónicas solo se tomó la plántula más vigorosa por semilla.

Los segmentos de epicótilo se obtuvieron de plántulas etioladas (regeneradas de semillas germinadas en la oscuridad en MS basal por 30 días). De la región del epicótilo se cortaron segmentos de aproximadamente 0,5 cm que se colocaron en Placas Petri con MS basal. Inmediatamente después de irradiados, los segmentos se transfirieron a nuevas placas Petri con medio de brotación: Murashige y Tucker (MT) suplementado con 2,0 mg L^-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP) (16) y fueron mantenidos en cuarto controlado en la oscuridad para la brotación.

Protocolos

En la Figura 1 se muestra un esquema con las etapas de los protocolos evaluados. En el Protocolo 1 se irradiaron semillas y se propagaron los brotes axilares de las plántulas regeneradas. En el Protocolo 2 se irradiaron segmentos de epicótilo y se propagaron los brotes adventicios inducidos. Ambos propágulos se sometieron a etapas de elongación, enraizamiento y adaptación a sustrato.

Curvas de radiosensibilidad

Los explantes fueron irradiados a 10, 20, 30, 40 y 50 Gy de rayos gamma de Cobalto 60 (⁶⁰Co), a 35 ºC y a una tasa de dosis de 14 Gy/min. El rango de dosis se seleccionó basado en estudios previos de radiosensibilidad en Citrus spp. con estos tipos de explantes (16,17). Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado. Se irradió una semilla por tubo y 20 semillas por tratamiento (dosis de irradiación), en dos experimentos independientes. Para los segmentos de epicótilo se irradiaron dos placas Petri por dosis en dos experimentos independientes. Cada placa contuvo 15 segmentos en el primer experimento y 20 segmentos en el segundo. Como criterio de radiosensibilidad de semillas y segmentos de epicótilo se consideró la fracción de semillas germinadas (FSG); es decir, semillas con brotes completos del total de semillas y la fracción de segmentos que respondieron a la inducción de brotes adventicios (FSR) del total de segmentos, respectivamente.

Propagación in vitro

Radiosensibilidad y dosis mutagénicas

A partir de las curvas dosis-efecto se determinó una dosis letal media (DL50) de 40 Gy y 45 Gy para semillas y segmentos de epicótilo, respectivamente (Figura 2).

Aunque se encontró un valor de DL50 mayor (200 Gy) para semillas de C. suhuiensis ‘limau madu’ que fueron desecadas hasta un 25 % de humedad antes de la irradiación (17), los mismos autores hallaron una DL50 de 50 Gy cuando las semillas de C. suhuiensis ‘limau langkat’ fueron irradiadas sin desecar. Este valor es más cercano a nuestro resultado, donde las semillas fueron irradiadas inmediatamente después de extraídas de los frutos frescos con un elevado contenido de humedad. Esta puede ser la causa de las diferencias entre estos resultados, ya que en las semillas, los contenidos de agua y de dioxígeno son los principales factores que modifican la radiosensibilidad (22,23).

En el caso de los segmentos de epicótilo, se informan valores de DL50 menores al obtenido en este trabajo en otras especies cítricas como las mandarinas Fremont y Thomas, el tangor Murcott y la lima de Rangpur, los que variaron entre 22 y 34,5 Gy (16). Aunque estas diferencias pudieran estar explicadas por una respuesta dependiente del genotipo; otros factores como las condiciones del cultivo, de la irradiación (temperatura, tasa de dosis, energía de la radiación gamma) y el estado fisiológico del material vegetal, contribuyen también a las diferencias.

La selección de la dosis mutagénica depende de la experiencia del mejorador, así como de la genética y fisiología del material vegetal. Frecuentemente se recomienda el uso de la DL50 (±10%), ya que se considera la dosis a la cual ocurre la mayor frecuencia de mutaciones (23,24). Sin embargo, ocurren numerosas mutaciones deletéreas que causan la pérdida del 50 % del material irradiado. Por ello, muchos estudios recomiendan una dosis intermedia que permita inducir mutaciones sin un alto grado de daño fisiológico; por ejemplo, la dosis que reduce en un 30 % la supervivencia (DL30) o el crecimiento (GR30) de la planta o del propágulo (16,23,25). En este estudio, se determinó y se recomienda una DL30 de 29 Gy y 37 Gy para los Protocolos 1 y 2, respectivamente.

Brotación y elongación

Se obtuvieron elevados porcentajes de brotación y un número similar de brotes por explante (BE) tanto para brotes axilares como adventicios (Tabla 1).

Para los brotes axilares, el valor de 2,16 BE resultó mayor al obtenido en estudios previos con la misma concentración de 1 mg L^-1 de 6-BAP, tanto para el mismo genotipo (BE=1,14) (26), como para mandarina Cleopatra, naranjo agrio y C. macrophylla (1 a 1,5) (21).

El valor de BE (2,01) para los brotes adventicios resultó más bajo que el obtenido para este tipo de explante en otros cultivares copa (10); mientras que, fue mayor al obtenido en otros portainjertos como mandarina Cleopatra, naranjo agrio y C. macrophylla (BE entre 0,8-1,4) (27). En especies de Citrus, está demostrado un marcado efecto del genotipo tanto en la vía de regeneración, como en los requerimientos ambientales y hormonales para la óptima formación del brote adventicio (27), por lo que estas condiciones deben ser bien establecidas para cada cultivar.

Varios autores han demostrado el efecto estimulante del 6-BAP y su interacción con otros RCV en la organogénesis directa o indirecta de diferentes especies (19,21). En este estudio se indujo la brotación adventicia de citrumelo Swingle con 2 mg L^-1 de 6-BAP, la misma concentración utilizada previamente en varios cultivares de Citrus spp. (16), mientras que otros autores utilizaron hasta 6 mg L-1 de 6-BAP, con fines de transformación genética en brotes adventicios de citrange Carrizo (28). Sin embargo, otros autores coinciden en señalar que concentraciones de 6-BAP superiores a 1 mg L^-1 resultaron inhibitorias de la brotación (18-20). Por ello, para incrementar el grado de multiplicación de los brotes adventicios en estudios posteriores deberían evaluarse cuidadosamente las concentraciones de 6-BAP y probar combinaciones de este con otros reguladores del crecimiento, considerando el efecto sinérgico que estas tienen.

En cuanto al medio de elongación utilizado, se observó una buena respuesta de ambos propágulos. A los 30 días, el 94,3 % de los brotes axilares sobrepasó los 15 mm (LB=26,5 mm), casi tres veces su valor inicial y el 95,3 % de los brotes adventicios sobrepasó los 10 mm (LB=15,1 mm) (Tabla 1).

Enraizamiento y supervivencia en el sustrato

A los 60 días no hubo diferencias significativas entre el enraizamiento de los brotes axilares en MS basal (67 %) y MS suplementado con ANA o con AIB (69 %) (Figura 3).

En investigaciones anteriores se obtuvo un 65 y 95 % de enraizamiento en mandarina Cleopatra y naranjo agrio, respectivamente (21), con 2 mg L^-1 de ANA; mientras que se indujo un 80 % de enraizamiento en C. macrophylla con una combinación de AIB (1 mg L^-1) + ácido indolacético (AIA) (1 mg L^-1). Por el contrario, los resultados de este trabajo sugieren cierta competencia de los brotes axilares de citrumelo Swingle para enraizar, independientemente de la acción de RCV exógenos. De hecho, otros investigadores encontraron hasta un 55 % de enraizamiento de brotes axilares de este portainjertos en RMAN (18): un medio de enraizamiento estándar para Citrus, que contiene muy baja concentración de ANA (0,02 mg L^-1). Estudios posteriores que incluyan la determinación los niveles de auxinas endógenas en brotes axilares de citrumelo Swingle serían necesarios para corroborar esta hipótesis.

Aunque el suplemento de auxinas no incrementó el porcentaje de enraizamiento de los brotes axilares respecto al medio de cultivo MS basal, sí se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos en cuanto al número de raíces por explante (RE) y a la longitud de la raíz (LR). El AIB (0,5 mg L^-1) indujo raíces más largas (9,6 cm) comparadas con el medio de cultivo suplementado con ANA (6,5 cm). Sin embargo, este último indujo un número significativamente mayor de raíces por explante (3,7), en comparación con el medio de cultivo MS basal (1,7) o MS+AIB (1,7).

En un estudio previo, en citrumelo Swingle, se encontró el máximo enraizamiento y un promedio de 5,66 RE, cuando se usó 2 mg L^-1 de ANA (26). Cuando se propagan in vitro explantes de especies leñosas, es importante desarrollar suficientes raíces que permitan un trasplante y supervivencia en condiciones ex vitro exitosos. Por lo tanto, el enraizamiento de brotes axilares con ANA (0,5 mg L^-1) fue mejor, ya que se indujo un mayor número de raíces por explante mientras que la longitud de estas no fue significativamente diferente del obtenido con el medio de cultivo MS basal.

Los brotes adventicios mostraron elevados porcentajes de enraizamiento, incluso en el medio de cultivo sin RCV. Su capacidad de enraizamiento fue mayor que la de los brotes axilares: 86 % en el medio de cultivo MS basal, 93 % en el MS+ANA y 91 % en el MS+AIB (Figura 4).

En este estudio se observó una respuesta diferencial en el porcentaje de enraizamiento entre los brotes axilares y los adventicios. En cada tipo de explante podrían estar actuando diferentes mecanismos de regulación de la biosíntesis, el transporte o la respuesta a la señal auxínica. Por ejemplo, se conoce que los receptores de la señal auxínica de tipo TIR1/AFB forman parte de un complejo ligasa ubiquitina-proteina (SCF^TIR1/AFB) y que existen proteínas (Aux/IAA) que normalmente actúan como represores de los factores de transcripción de la respuesta a auxinas (ARF). Al detectarse la presencia de auxinas en la célula, el complejo SCF^TIR1/AFB marca las proteínas Aux/IAAs para su degradación. Al eliminarse estas, se activan los factores ARFs, desencadenando la respuesta a las auxinas. Sólo en A. thaliana existen 6 AFBs, 29 AUX/IAAs y 23 ARFs y las diferentes combinaciones de estos pueden dar diferentes respuestas transcripcionales, en dependencia de su presencia en ciertos tejidos o del estado fisiológico de las plantas. Aún más, existe una afinidad diferencial de estos receptores por los análogos sintéticos de las auxinas, que complejiza mucho más las vías de señalización de estas respuestas (29).

En cuanto al número de raíces para los brotes adventicios se observó un mayor número de raíces primarias (1,6) y de mayor longitud (14,9 cm) en el medio de cultivo MS+AIB (Figura 4), en contraste con otros estudios en Citrus spp. que informaron mejores enraizamientos con ANA, que con AIB o AIA (21,30). Sin embargo, desde los 30 días se observó un enraizamiento lateral o secundario, que alcanzó un valor significativo (92 %) a los 60 días en el medio suplementado con ANA (Figura 5). En este medio de cultivo, la inducción y la elongación de las raíces primarias fueron reemplazadas por la emisión de raíces secundarias y se obtuvo el mayor promedio de raíces secundarias por explante.

A los 60 días, los brotes axilares mostraron valores mucho más bajos que los brotes adventicios: 10, 10 y 8 % para el medio MS basal, MS+ANA y MS+AIB, respectivamente y estos no fueron, estadísticamente, diferentes.

La acción de las auxinas exógenas en la formación de un sistema radicular completo es conocida en varias especies. En plántulas de maíz, el ANA está asociado a este proceso. Se demostró que a bajas concentraciones (0,002 mg L^-1) se inhibe la elongación de raíz primaria incrementando la emisión de raíces laterales y que el mecanismo está asociado a un alargamiento de las células del periciclo (31).

El porcentaje de supervivencia en condiciones ex vitro se comparó en base al tratamiento de enraizamiento previo (Tabla 2). Los brotes axilares no mostraron diferencias significativas en la supervivencia, independientemente del tratamiento de enraizamiento in vitro previo. Por su parte, los brotes adventicios provenientes del medio de cultivo MS+ANA mostraron una mayor supervivencia (91,8 %) que los provenientes del medio de cultivo suplementado con AIB y del MS basal. Esto se debió probablemente a un sistema radical más eficiente que incluyó el desarrollo de raíces secundarias. Excepto este, el resto de los tratamientos estuvieron entre el 58 y el 74 % de supervivencia, por lo que sería de interés probar otras condiciones de aclimatación, probando diferentes mezclas de sustrato, fertilización, mejor control de la iluminación y el uso de algún fungicida previo al pase a sustrato.

Comparación de la eficiencia

Con el Protocolo 1 se pueden obtener 15 plantas que sobrevivieron por cada plántula germinada, mientras que con el Protocolo 2, se produjeron 19 plantas por cada plántula inicial (Tabla 3).

Como se observa en la Tabla 3, en el Protocolo 1 se incluye un paso de propagación de los brotes axilares hasta la generación M1V3, con el objetivo de aislar los sectores mutados y disminuir el quimerismo. En tejidos pluricelulares que se propagan vegetativamente sin pasar por la fase haploide (meiótica), la célula mutada deberá enfrentar una selección diplóntica, es decir, una competencia con el resto de los linajes diploides no mutantes que por lo general tienen más probabilidad de dividirse exitosamente. Por ello, muchas mutaciones recesivas se pierden (32). En los meristemos axilares, si la célula mutante logra dividirse hasta cierta extensión, se desarrollarán quimeras sectoriales. Estos brotes axilares darán origen a plantas quiméricas no deseadas. Por el contrario, si se propagan vegetativamente los brotes M1V1, es probable que se generen nuevas yemas axilares a partir del sector mutado con un menor grado de quimerismo. Se ha demostrado que al propagar hasta la generación vegetativa M1V3, se reduce entre un 60 a un 80 % el número de citoquimeras (33).

Es por ello que en el Protocolo 1 se incluye el avance de las generaciones vegetativas hasta M1V3. Con este proceso, el valor inicial de 2,16 brotes por explante se incrementa a 32 brotes por semilla germinada al final de la propagación. Sin embargo, esto hace al Protocolo 1 cuatro veces más extenso en esta etapa, con respecto al Protocolo 2 (Figura 6). Por el contrario, cuando el método in vitro involucra una etapa unicelular, como los brotes adventicios, se evitan las quimeras (15) y es innecesaria la propagación vegetativa de cuatro meses. Los brotes adventicios mostraron además una elevada capacidad de enraizamiento secundario y una mayor supervivencia ex vitro en el sustrato. Por ello, se perdieron menos brotes adventicios en esta etapa, en comparación con los axilares. Estos resultados indican una mayor eficiencia del Protocolo 2 para citrumelo Swingle.

Tamaño de la población mutada

Al aumentar el número de explantes tratados se debe esperar una mayor probabilidad de éxito; es decir, la obtención de los mutantes deseados depende del tamaño de la población mutada. Para estimar el mismo, deben considerarse el número de ciclos de propagación vegetativa después de la irradiación, así como los porcentajes de enraizamiento y de supervivencia (33). A partir de los resultados de este trabajo, se puede estimar el número de posibles mutantes a obtener en cada protocolo.

Con el Protocolo 1, de una población inicial de 1000 semillas (irradiadas a la DL30), se regenerarán 700 plántulas y 2800 segmentos nodales, los cuales rendirán unos 21000 brotes axilares después de la micropropagación. A partir de los porcentajes de enraizamiento y supervivencia ex vitro obtenidos, se regenerarán 10100 plantas. Con el Protocolo 2, 1000 semillas darán lugar a 12000 segmentos de epicótilo. Al irradiar los mismos a la DL30, se regenerarán unos 16800 brotes adventicios. Después de la propagación, enraizamiento y supervivencia ex vitro en el sustrato, se obtendrán 13655 plantas. Considerando que la frecuencia común de mutaciones inducidas está en el orden de 0,5 % (33), se podrán esperar entre 50 y 70 mutantes, partiendo de 1000 semillas iniciales, en los Protocolos 1 y 2, respectivamente.

El grado de poliembrionía puede influir en el número total de plantas obtenidas en estos protocolos. Como la mayoría de los portainjertos, citrumelo Swingle es un cultivar poliembriónico, donde más de un embrión puede desarrollarse de una semilla. Un lote con un elevado grado de poliembrionía podría producir un mayor número de plántulas y con ello, de posibles mutantes. Además, los embriones nucelares son más vigorosos y competitivos que los embriones cigóticos producidos por autopolinización, por lo que a mayor grado de poliembrionía mayor será la frecuencia de plántulas nucelares, con el mismo genotipo de la planta madre (34). Como la mutagénesis inducida está dirigida a la mejora de determinados caracteres sin cambiar el fondo genético del cultivar, es recomendable usar frutos de aisladores o campos controlados, donde es más elevada la frecuencia de plántulas nucelares. Por el contrario, el número de plántulas híbridas se incrementa en semillas provenientes de polinización abierta debido a que estos embriones cigóticos son más vigorosos. La calidad de la polinización, la nutrición y el ambiente, entre otros factores (34), afectan el grado de poliembrionía. Por ello, aunque los lotes usados en este trabajo mostraron un 40 % de poliembrionía, con un promedio de 1,8 plántulas por semilla, en este análisis solo se consideró una plántula (la más vigorosa) por semilla (Tabla 3). En cualquier caso, es recomendable confirmar el origen nucelar de los mutantes seleccionados.

La embriogénesis somática se propone como un enfoque adecuado en programas de transformación genética y mutagénesis in vitro de especies cítricas por ser una importante fuente de explantes unicelulares (30). Aunque este método permite elevados grados de embriogénesis y regeneración, el proceso total puede ser largo y la supervivencia después del trasplante puede disminuir entre un 30 y un 40 % (35,36). Además, los explantes ovulares de citrumelo Swingle son recalcitrantes a la embriogénesis somática, mientras que este genotipo tiene una elevada respuesta a la micropropagación vía organogénesis (30). En este sentido, la combinación de radiomutagénesis in vitro con organogénesis adventicia propuesta en este trabajo, permitió elevados porcentajes de enraizamiento y supervivencia en siete meses. Este enfoque pudiera considerarse una alternativa a la embriogénesis somática para el mejoramiento por radiomutagénesis de este portainjertos.

Plant material

Ripen fruits were collected at the UCTB “Félix Duque” in Jagüey Grande, Tropical Fruit Research Institute (IIFT), from Swingle citrumelo trees that showed 40 % polyembryony and an average of 1,8 plantlets per seed (data not shown).

Explants

Seeds and epicotyl segments were the explants irradiated in Protocols 1 and 2, respectively.

Sees were removed from fresh fruits, de-shelled and disinfested with 0.7 % sodium hypochlorite and transferred to fresh, basal Murashige and Skoog medium (MS) without vitamins, sucrose or plant growth regulators (PGR). After irradiation, seeds were immediately transferred to fresh medium, one seed per culture tube and germinated for 30 days in a controlled growth room (25 ^oC, 60% relative humidity, 16-h light/8-h darkness photoperiod and illuminance of 2500 lx provided by Chiyoda fluorescent lamps. Germinated plantlets were transferred to liquid MS containing myoinositol (0.1 g L^-1) and 30 g L^-1 sucrose. These were subcultured for 60 days until there were at least three internodes. In polyembryonic seeds, only the most vigorous plantlet per seed was selected.

Epicotyl segments were obtained from etiolated plantlets (regenerated form seeds germinated in darkness on basal MS for 30 days). Segments of approximately 0.5 cm were cut from the epicotyl region and put on Petri dishes containing basal MS. After irradiated, these were immediately transferred to Petri dishes with shoot induction medium: Murashige and Tucker (MT) supplemented with 2.0 mg L^-1 of 6-benzylaminopurine (6-BAP) (16) and they were kept in controlled growth room, in darkness for shoot induction.

Protocols

A diagram of the evaluated protocols is shown in Figure 1. In Protocol 1, seeds were irradiated and axillary shoots from regenerated plantlets were propagated. In Protocol 2, epicotyl segments were irradiated and the induced adventitious shoots were propagated. Both propagules were subjected to elongation, root induction and substrate adaptation stages.

Radiosensitivity curves

Explants were irradiated at 10, 20, 30, 40 and 50 Gy of Cobalt 60 (⁶⁰Co) gamma rays, at 35 ºC and a dose rate of 14 Gy/min. The dose range was selected based on previous radiosensitivity studies of these explant types on Citrus spp. (16,17). A randomized experimental design was used. One seed per culture tube and 20 seeds per treatment (dose) were irradiated in two independent experiments. For epicotyl segments, two Petri dishes per dose were irradiated in two independent experiments. Each Petri dish contained 15 and 20 segments in the first and second experiment, respectively. The fraction of germinated seeds (GSF), that is, seeds with entire shoots from the total number of seeds and the fraction of responsive segments (RSF), that is, segments with induced adventitious shoots out of the total number of segments, were considered as radiosensitivity criteria for seeds and epicotyl segments, respectively.

In vitro propagation

Radiosensitivity and mutagenic doses

From the dose-effect curves, median lethal doses (LD50) of 40 and 45 Gy for seeds and epicotyl segments, respectively were determined (Figure 2).

Although a higher LD50 value (200 Gy) was found for C. suhuiensis ‘limau madu’ seeds desiccated to 25.5 % moisture content before irradiation (17), the same authors reported a LD50 of 50 Gy when C. suhuiensis ‘limau langkat’ seeds were irradiated without desiccation. This value is closer to our result, where seeds were irradiated immediately after being removed from fresh fruits, with high moisture content.

This could cause the differences among the results, since oxygen and water content are the main factors modifying radiosensitivity in seeds (22,23).

For epicotyl segments, lower LD50 values were reported for other Citrus species such as Fremont and Thomas mandarins, Murcott tangor and Rangpur lime, which varied between 22 and 34.5 Gy (16). Although a genotype-dependent response may explain these differences, other factors such as culture and irradiation conditions (temperature, dose rate, gamma radiation energy) as well as physiological status of plant material also contribute to the differences.

Mutagenic dose selection depends on the breeder’s experience and on the plant material genetics and physiology. Frequently, the use of the LD50 (±10 %) is recommended as it is considered the dose at which the highest frequency of mutations occurs (23,24). However, many deleterious mutations occur which cause the loss of 50 % of the irradiated material. Therefore, many studies recommend an intermediate dose to allow for inducing mutations without a high level of physiological damage; for instance, the dose that reduces by 30 % the survival (LD30) or growth (GR30) of the plant or propagule (16,23,25). In this study, LD30 of 29 Gy and 37 Gy were determined and recommended in Protocols 1 and 2, respectively.

Shoot induction and elongation

High shoot induction percentages and similar SE values were obtained for both axillary and adventitious shoots (Table 1).

For axillary shoots, the 2.16 SE value is higher than those obtained in previous studies using the same 6-BAP concentration (1 mg L^-1) either for the same genotype (SE=1,14) (26), as well as for Cleopatra mandarin, sour orange and C. macrophylla (1 to 1.5) (21).

The SE value (2.01) for adventitious shoots was lower than those reported for this explant type in scion cultivars (10), while it was higher than those reported for other rootstocks such as Cleopatra mandarin, sour orange and C. macrophylla (SE 0.8 - 1.4) (27). For Citrus species, a marked genotype effect on either the regeneration pathway or environment and hormone requirements for optimal formation of the adventitious shoot has been demonstrated (27). Thus, these conditions should be well established for each cultivar.

The stimulating effect of 6-BAP and its interaction with other PGRs on direct or indirect organogenesis in different species has been demonstrated (19,21). In this study, 2 mg L^-1 of 6-BAP allowed for adventitious shoot induction, the same concentration previously used for several Citrus cultivars (16), while some authors used up to 6 mg L^-1 for genetic transformation of citrange Carrizo adventitious shoots (28). However, other researchers agree with the fact that 6-BAP concentrations higher than 1 mg L^-1 resulted in shoot induction inhibition (18-20). Therefore, in further studies to increase the multiplication rate of adventitious shoots, 6-BAP concentrations should be carefully evaluated as well as its combination with other PGRs, considering their synergistic effect.

A good response of both propagules to the elongation medium was observed. After 30 days, 94.3 % of axillary shoots exceeded 15 mm (SL = 26.5 mm) which is almost three times their initial length and 95.3 % of adventitious shoots was longer than 10 mm (SL = 15.1 mm) (Table 1).

Root induction and survival in the substrate

After two months, there were no significant differences between root induction of axillary shoots on basal MS (67 %) and on MS supplemented with NAA or IBA (69 %) (Figure 3).

In previous results, 65 and 95 % of root induction in Cleopatra mandarin and sour orange were obtained, respectively (21) with 2 mg L^-1 of NAA; while 80 % of rooting was induced for C. macrophylla using a combination of AIB (1 mg L^-1) + indolacetic acid (IAA) (1 mg L^-1). On the contrary, our results suggest certain competence of Swingle citrumelo axillary shoots to induce rooting, independent of exogenous PGRs. In fact, some authors found up to 55 % root induction for axillary shoots of this rootstock in RMAN (18): a standard rooting medium for Citrus, with a very low NAA concentration (0.02 mg L^-1). Further studies including endogenous auxins evaluation in Swingle citrumelo axillary shoots would be necessary in order to corroborate this hypothesis.

Although auxin addenda did not increase root induction percentage for axillary shoots compared to basal MS, significant differences among treatments were found regarding number of roots per explant (RE) and average root length (RL). IBA (0.5 mg L^-1) induced longer roots (9.6 cm) compared to NAA-supplemented medium (6.5 cm). However, the last one induced a significantly higher number of roots per explant (3.7) compared to basal MS (1.7) or MS+IBA (1.7).

The highest root induction and 5,66 RE average was previously found for Swingle citrumelo (26) when NAA (2 mg L^-1) was used When explants from woody species are propagated in vitro, it is important to develop enough roots to allow a successful transplanting and ex vitro survival. Therefore, for axillary shoots, a better rooting was obtained with NAA (0.5 mg L^-1) since it induced a higher number of roots per explants while the average root length was not significantly different from that obtained with basal MS.

Adventitious shoots showed high rooting percentages, even on medium without PGRs. Their rooting capacity was higher than that of axillary shoots: 86 % RI in basal MS, 93 % in MS + NAA and 91 % in MS + IBA (Figure 4).

In this study, a differential response to root induction between axillary and adventitious shoots was observed. Different mechanisms regulating biosynthesis, transport or response to auxin signals could be acting in each explant type. For instance, it is known that the TIR1/AFB-type auxin receptors are part of a ligase ubiquitin-protein complex (SCF^TIR1/AFB). Also, there are proteins (Aux/IAA) which act as repressors of the auxin response transcription factors (ARF). When auxins are perceived intracellularly, the SCF^TIR1/AFB complex targets the Aux/IAAs proteins for degradation. When these are removed, the ARF factors become active, which on their turn activate the auxin responses. Only in A. thaliana, 6 AFBs, 29 AUX/IAAs and 23 ARFs are known and their combination can result in different transcriptional responses depending on their presence in certain tissues or the plant physiological status. Even more, the differential affinity of these receptors for synthetic analogues of auxin makes the response signaling pathways much more complex (29).

For adventitious shoots, primary roots were more (1.6) and longer (14.9 cm) in MS + IBA (Figure 4), in contrast with other studies in Citrus spp. that report better root induction using NAA than using IBA or IAA (21,30). However, form 30 days, secondary roots induction was observed in NAA supplemented medium, which became significantly higher (92 %) at 60 days (Figure 5). In this culture medium the induction and elongation of primary roots was replaced by secondary roots emission and the highest average of secondary roots per explant was obtained.

At 60 days, axillary shoots showed lower secondary root induction than adventitious shoots: 10, 10 and 8 % for basal MS, MS + NAA and MS + IBA, respectively, with no statistical differences among them.

Exogenous auxin action in the formation of a complete root system is well known in several species. In fact, NAA is associated to this process in maize plantlets. It was demonstrated that low NAA concentrations (0.002 mg L^-1) inhibit primary root elongation thus increasing lateral roots emission by a mechanism associated to the pericycle cells length (31).

Ex vitro survival percentages were compared based on the previous rooting treatment (Table 2). No significant differences were seen for axillary shoots survival, regardless their previous rooting treatment. On the other hand, adventitious shoots from MS + NAA showed the highest survival (91.8 %), probably due to a more efficient root system, involving secondary roots development. Except this, the remaining treatments ranged only between 58 and 74 % of survival. Thus, alternative acclimatization conditions should be proven, including substrate mixtures, fertilization, illumination as well as fungicide application before transfer to substrate.

Efficiency comparison

Fifteen plants survived per each germinated plantlet with Protocol 1, while 19 plants per initial plantlet are produced with Protocol 2 (Table 3).

As seen in the table, Protocol 1 includes a propagation step of axillary shoots until M1V3 generation in order to isolate mutant sectors and reduce chimerism. In vegetatively propagated tissues which do not undergo a haploid stage (meiotic), the mutated cell most face a diplontic selection. That is, a competition with the remaining diploid, non-mutant cell lineages which generally have a better chance to divide successfully. That is why many recessive mutations are lost (32). In axillary meristems, if the mutant cell divides to certain extent, sectorial chimeras will develop and these axillary shoots will give rise to unwanted chimeric plants. On the contrary, by vegetatively propagating the M1V1 shoots, new axillary buds will probably generate from the mutated sector with a lower chimerism rate. It has been proved that a reduction in 60 - 80 % of citochimeras is achieved by propagating until M1V3 generation (33).

Therefore, Protocol 1 includes the vegetative generation advance to M1V3. By this, the initial value of 2.16 axillary shoots per explant is increased to 32 shoots per germinated seed at the end of the propagation stage. However, it makes Protocol 1 four months longer than Protocol 2 (Figure 6). On the contrary, if the in vitro method involves a single-cell stage as in the case of adventitious shoots, chimeras are avoided (15) and the four-month vegetative propagation step is unnecessary. Adventitious shoots also showed a high capacity of secondary rooting and a higher survival in substrate. Because of that, less adventitious shoots were lost during this stage, in comparison to axillary shoots. These results indicate a higher efficiency of Protocol 2 for Swingle citrumelo.

Mutated population size

By increasing the number of treated explants one may expect a higher probability of success; that is, obtaining the desired mutants depends on the mutated population size. To estimate this size, the number of vegetative propagation cycles after irradiation, root induction and plant survival percentages must be taken into account (33). Considering our results, the number of putative mutants that can be obtained for each protocol can be estimated.

In Protocol 1, starting from a 1000 seeds population (irradiated at LD30), 700 seedlings and 2800 nodal segments will be regenerated, which will yield around 21000 axillary shoots after micropropagation. Considering the rooting and ex vitro survival percentages, approximately 10100 plants will be obtained. With Protocol 2, 1000 seeds will produce 12000 epicotyl segments. By irradiating them at LD30, 16800 adventitious shots will be regenerated. After propagation, root induction and substrate survival, approximately 13655 plants will be obtained. Considering that a common induced mutation frequency is in the order of 0.5 percent (33), about 50 and 70 mutants out of 1000 initial seeds can be expected in Protocols 1 and 2, respectively.

Polyembryony rate can affect the total number of plants obtained in these protocols. As most citrus rootstocks, Swingle citrumelo is a polyembryonic cultivar, in which more than one embryo can develop from a single seed. A seed lot with a high polyembryony rate could produce a higher number of seedlings and therefore, putative mutants. Besides, nucellar embryos are more vigorous and competitive than zygotic embryos produced by self-pollination, thus the higher the polyembryony rate, the greater the frequency of nucellar seedlings, with the same mother plant genotype (34). As induced mutagenesis is aimed at improving certain traits without changing the cultivars genetic background, using fruits from greenhouses or controlled field conditions, where the chances of nucellar seedlings are higher, is recommended. On the contrary, the number of hybrid seedlings increases in seeds from open-pollinated fruits as these zygotic embryos are more vigorous. Pollination quality, nutrition and environment among other factors (24) can affect polyembryony rate. Therefore, although the Swingle citrumelo lots in this work showed 40 % polyembryony with an average of 1.8 seedlings per seed (data not shown), only one (the most vigorous) seedling per seed was considered in our analysis (Table 3). In any case, it is recommended to confirm the nucellar origin of the selected mutants.

Somatic embryogenesis has been proposed as a proper approach for genetic transformation and in vitro mutagenesis programs in Citrus spp. as it offers an important source of unicellular explants (30). However, in spite that high embryogenesis and regeneration rates are obtained, the overall process can be time consuming and survival to transplantation may decrease from 30 to 40 % (35,36). Moreover, Swingle citrumelo ovular explants are recalcitrant to somatic embryogenesis while this genotype is highly responsive to in vitro micropropagation via organogenesis (30). The combination of in vitro radiation-induced mutagenesis with adventitious organogenesis proposed in this work, allowed high root induction and survival in seven months. This approach could be considered an alternative to somatic embryogenesis for mutation breeding of this rootstock.