Conservación en bancos de germoplasma en el campo

Los bancos de germoplasma en el campo que mantienen significativas colecciones de C. arabica se localizan en África (Camerún, Costa de Marfil, Etiopía, Kenya y Tanzania), Madagascar, India y en América (Brasil, Colombia y Costa Rica). Las colecciones de campo en Camerún, Costa de Marfil, India y Madagascar también mantienen una buena representación de C. canephora. Una gran parte de las especies de cafeto silvestre no cultivadas, se conservan en bancos de germoplasma en Madagascar, que mantiene unas 50 especies y Costa de Marfil, con unas 30 especies de cafeto africano (22).

En jardines botánicos de 50 países también son conservadas unas 445 accesiones de cafeto que provienen de 26 especies y algunos híbridos interespecíficos. C. arabica, C. canephora y C. liberica aportan el 81 % de estas accesiones en jardines botánicos (1). De las 73 accesiones con designación de especies, once son conservadas solo en un jardín botánico y cuatro de estas especies no han sido mantenidas en ninguna otra colección. De esta forma, los jardines botánicos pueden ser reservorios de especies únicas o de un nivel de diversidad de variedades, que necesita ser considerado como parte del sistema global para la conservación ex situ de cafeto (1).

A lo largo de los años, han ocurrido pérdidas sustanciales de genotipos de cafeto en varios bancos de germoplasma, que han resultado en la pérdida de accesiones enteras. Tomando como ejemplo la colección del CATIE (Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza) en Costa Rica, uno de los principales retos enfrentados incluye el envejecimiento de los árboles (la mayoría fueron establecidos en los años 70, aunque hay colecciones que se iniciaron en la década del 40 del pasado siglo). También influyen las condiciones climáticas y la elevación sub-óptimas, la necesidad de variadas prácticas culturales debido a la naturaleza diversa de las colecciones, con genotipos cultivados y silvestres que difieren en sus necesidades de sombra, poda, fertilizantes, así como falta de financiamiento y otros recursos. Se considera que unas 53 accesiones se han perdido a lo largo de los años debido al envejecimiento y al efecto de plagas y enfermedades (1,22).

Cuba no constituye un país de origen del cafeto, por lo que la conservación in situ no tiene lugar; en cambio, existen áreas dedicadas a su conservación ex situ, como las pertenecientes a la Estación Central de Investigaciones de Café y Cacao (ECICC), localizada en la provincia de Santiago de Cuba, donde se conservan 1597 accesiones (1).

Las colecciones de germoplasma de cafeto en campo se encuentran expuestas a diferentes riesgos, desde eventos climáticos extremos hasta la ausencia de prioridad de autoridades locales (1). Frecuentemente se encuentran localizadas en condiciones ecológicas que no son las ideales para su mantenimiento o para la supervivencia de todo el material, ocasionando erosión genética (21). Otras causas de esta son la pérdida de árboles como consecuencia del envejecimiento, métodos de cultivo inapropiados, así como la emergencia de plagas y enfermedades (23). Algunas de las medidas de prevención tomadas contra el estrés biótico y abiótico incluyen el monitoreo frecuente de las colecciones, la adecuada irrigación, la aplicación de fertilizantes, el sombreo, la protección química y el manejo integrado de plagas y enfermedades (1). De todo ello, se pone de manifiesto la necesidad de aplicar otras alternativas a la conservación en campo de recursos fitogenéticos de cafeto.

Almacenamiento de semillas de cafeto

Sobre la base de sus características durante el almacenamiento, las semillas de cafeto han sido clasificadas como intermedias, ya que toleran determinado nivel de desecación, pero no sobreviven la desecación total, ni los efectos combinados de la desecación y las bajas temperaturas (24). Se conoce que la viabilidad de las semillas de C. arabica decrece rápidamente luego de cuatro a seis meses a temperatura ambiente (25).

Aunque la vía más común para producir plántulas de cafeto es la semilla botánica, la pérdida de germinación durante el almacenamiento es una limitación para la conservación y propagación de este género (26). De aquí la necesidad del estudio de formas alternativas de conservación ex situ, como la aplicación de métodos biotecnológicos a la preservación de recursos fitogenéticos del cafeto.

Conservación in vitro

Entre las múltiples aplicaciones del cultivo in vitro se encuentra la conservación in vitro, valiosa opción para la preservación de germoplasma de especies con semillas de corta viabilidad como el cafeto. Los métodos de crecimiento mínimo permiten llevar a cabo este objetivo (27).

Los métodos de crecimiento mínimo consisten en reducir la velocidad de crecimiento de las plantas, basados en la disminución de la división celular y el metabolismo, lo cual se logra mediante la alteración de las condiciones óptimas de cultivo. Es posible variar la composición del medio de cultivo o modificar el ambiente de crecimiento (temperatura, intensidad luminosa, disponibilidad de oxígeno) (28). De esta manera, resulta factible conservar las plantas a corto o mediano plazos, lo que permite una reducción en la frecuencia de los subcultivos y un incremento en la longevidad in vitro del material vegetal, así como un mínimo riesgo de cambios genéticos (27,29).

Para la conservación in vitro de cafeto se han estudiado diferentes variantes de crecimiento mínimo (30), como las variaciones en la temperatura de cultivo, en combinación con la disminución del contenido de oxígeno (31,32), la modificación en la concentración de la fuente de carbono (33,34) y la adición de reguladores osmóticos del crecimiento (35). La más utilizada ha sido la modificación de la concentración de reguladores del crecimiento en el medio de cultivo (36-38). En la última década se han realizado otras contribuciones a estos temas, como se detallará a continuación.

Para la conservación in vitro de germoplasma de C. arabica cv S. 795 se desarrolló un protocolo consistente en inocular los embriones cigóticos en medio MS (39), suplementado con sacarosa (3,0 %) y diferentes concentraciones de ácido abscísico (ABA) (0; 0,1; 0,5 y 1,0 mg L^-1). Se mantuvieron a una temperatura de 25±1 ºC y fotoperíodo de 16 h, durante doce meses. Para la germinación, los embriones se subcultivaron en medio MS suplementado con diferentes concentraciones de kinetina (KIN) o ácido giberélico (AG3) (0; 0,1; 0,5; 1,0 y 5,0 mg L^-1) y a los 45 días se realizó su evaluación (40). Los resultados mostraron que los embriones cigóticos colocados en medio de cultivo con las diferentes concentraciones de ABA, exhibieron respuestas de maduración variables.

En el control, los embriones germinaron después de una semana y el brote y la raíz se desarrollaron más largos, en comparación con los medios con bajas concentraciones, donde se indujo una germinación muy lenta. Cuando se cultivaron los embriones en concentraciones de ABA más elevadas, se observó su alargamiento, seguido de un cambio de color de blanco a verde oscuro en un intervalo de dos semanas. Estos embriones alcanzaron la madurez completa y permanecieron inactivos, sin desarrollo de brotes y raíces (40). De las diversas concentraciones de KIN, el tratamiento de 0,1 mg L^-1 fue más efectivo para el desarrollo de plántulas, con una longitud máxima de brote y la raíz más larga con numerosas raíces laterales, en comparación con las concentraciones más elevadas de KIN, que provocaron la completa inhibición del desarrollo de este órgano. La adición de AG3 a 0,1 y 0,5 mg L^-1 incrementó la longitud del brote, en comparación con el control, mientras que un aumento en la concentración de AG3 no tuvo este efecto. Estos resultados mostraron que la KIN fue más adecuada que el AG3 para desarrollar plántulas vigorosas (40). Un estudio realizado por investigadoras cubanas, se propuso determinar el efecto de la disminución del contenido mineral del medio de cultivo en la respuesta de plantas de cafeto (C. arabica) conservadas in vitro por un período entre dos y seis meses. Las plantas, obtenidas in vitro previamente, se cultivaron en medio MS modificado, con tratamientos consistentes en la reducción al 75, 50 y 25 % de sus macro y microelementos. Fueron evaluados la supervivencia, el número de pares de hojas, la abscisión foliar y el porcentaje de plantas con raíces. En el tratamiento de MS al 50 %, los porcentajes de supervivencia variaron entre el 85 y 100 % y con respecto al resto de los tratamientos, se obtuvieron valores intermedios de pares de hojas y de abscisión foliar. A pesar de la carencia de nutrientes, las plantas desarrollaron raíces que les permitieron sobrevivir en estas condiciones, por lo que con este tratamiento se considera factible conservar hasta seis meses las plantas in vitro de cafeto (41).

Crioconservación

La crioconservación, el almacenamiento de material biológico preferentemente a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C), es una alternativa a la conservación ex situ de germoplasma, que permite mantener los recursos genéticos vegetales a largo plazo, de manera segura y rentable, con requisitos mínimos de espacio, y mantenimiento de rutina (42). Además, la crioconservación elimina la necesidad de una renovación regular de la colección, lo que reduce el riesgo de erosión genética causada por plagas, enfermedades, condiciones climáticas, contaminación y variaciones genéticas (43).

Se han realizado varios estudios en el campo de la crioconservación de cafeto (30), utilizando diferentes métodos y tipos de explantes: ápices (44), embriones somáticos y callos embriogénicos (45-49), embriones cigóticos (50-53), semillas (47,50,54-58) y se han obtenido resultados diversos. La tendencia de las investigaciones se dirige, principalmente, hacia la crioconservación de semillas y embriones cigóticos, campo liderado en la actualidad por científicos brasileños.

Crioconservación de semillas

La evaluación de la calidad fisiológica de semillas de C. arabica crioconservadas por inmersión directa en nitrógeno líquido, posterior a su desecación rápida o lenta, ha sido objeto de estudio recientemente. Las semillas de los cultivares Arara, Catiguá, Catuaí Amarelo y Mundo Novo se sometieron a la desecación rápida con la utilización de silica gel, y lenta con la utilización de una solución saturada de NaCl (75 % de humedad relativa), hasta que alcanzaron un contenido de humedad del 20 % (base seca) en ambas variantes. Se sumergieron en nitrógeno líquido durante 24 horas y luego se recalentaron en baño de María a 40 °C, durante dos minutos. La calidad fisiológica de las semillas después de la crioconservación se evaluó mediante pruebas de germinación, tetrazolio y pruebas de vigor. Se determinó que aun con diferentes niveles de tolerancia, las semillas de estos cultivares pueden ser sometidas a la crioconservación, siendo el Catuaí amarillo el más tolerante y Arara el más sensible, independientemente de la velocidad de desecación. El secado rápido en silica gel hasta el 20 % del contenido de humedad, seguido de la inmersión directa en nitrógeno líquido, permite obtener mayores porcentajes de plántulas normales, hojas cotiledonares expandidas y masa seca y, por tanto, favorece la crioconservación de las semillas de cafeto (59).

Otra investigación se propuso como objetivo determinar el contenido de agua, la velocidad de enfriamiento y la temperatura final más adecuada para la crioconservación de semillas de C. arabica. Estas se desecaron con silica gel hasta contenidos de agua de 5, 10, 15, 20, 30 y 40 % (base húmeda), se sometieron a tratamientos de enfriamiento lento a velocidades de -1, -3 y -5 °C min^-1 a temperaturas finales de -40, -50 y -60 °C y luego se sumergieron directamente en nitrógeno líquido (NL). Después del almacenamiento, las semillas se volvieron a calentar a 40 °C durante dos minutos. La tasa de supervivencia y la viabilidad de las semillas y los embriones se evaluaron mediante las pruebas de tetrazolio y germinación. Los resultados de la prueba de tetrazolio indican que los embriones extraídos de semillas crioconservadas son menos sensibles a la crioconservación que las semillas enteras. En general, el contenido de agua de 20 % y el uso de embriones cigóticos condujeron a la tasa de supervivencia más alta de las semillas de cafeto, dependiendo de la velocidad de enfriamiento y la temperatura final de pre-enfriamiento (60).

Para semillas de C. canephora desecadas en silica gel hasta un contenido de agua de 0,25 g g^-1, han sido utilizados tratamientos de enfriamiento lento idénticos a los citados anteriormente (60). El mejor resultado de estos tratamientos fue comparado con el enfriamiento rápido, en el cual las semillas se sumergieron directamente en nitrógeno líquido y se evaluaron las alteraciones fisiológicas y bioquímicas que ocurren en estas después de la crioconservación. La desecación hasta 0,25 g g^-1 del contenido de agua, no afecta la viabilidad de las semillas de C. canephora y estas responden mejor a la crioconservación, mediante un enfriamiento rápido, en comparación con el enfriamiento lento. Las enzimas catalasa y esterasa son buenos marcadores bioquímicos para las semillas de cafeto crioconservadas y su actividad es mayor en las de mejor calidad fisiológica (61).

También se han investigado las condiciones físicas y fisiológicas ideales para la crioconservación de semillas de C. canephora, para reducir la mortalidad causada por la formación de cristales de hielo intracelulares y evitar el daño celular causado por la desecación excesiva. Las semillas se sometieron a desecación rápida en silica gel, y lenta en solución saturada de NaCl hasta contenidos de humedad de 0,20; 0,25 y 0,28 g g^-1 (base seca), seguida de inmersión directa en nitrógeno líquido para su congelación rápida. Se realizaron análisis fisiológicos y bioquímicos para evaluar la calidad de estos explantes antes y después de la crioconservación. El secado rápido a valores cercanos a 0,20 g g^-1 no causa una reducción en la calidad fisiológica, mientras que el contenido de humedad de 0,25 g g^-1 produce una mayor supervivencia de las semillas, después de la crioconservación. La velocidad de desecación afecta la calidad fisiológica luego de la crioconservación, puesto que el secado rápido en silica gel es más favorable que el secado lento, en una solución saturada de NaCl. La actividad de las enzimas catalasa, esterasa, transaminasa oxaloacética glutámica y polifenol oxidasa representa un indicador de la calidad de semillas de C. canephora sometidas a crioconservación (62).

Las semillas de cafeto (C. arabica), han sido sometidas a diferentes tipos de desecación y almacenadas en cámara fría y en crioconservación, con el propósito de estudiar el desarrollo posterior de las plántulas. Las semillas se sometieron a cuatro tratamientos de desecación en un secador estacionario hasta que alcanzaron el 12 % y el 32 % de humedad y en solución salina saturada y silica gel, hasta alcanzar el 17 % de humedad. Las que tenían 12 % y 32 % de humedad se almacenaron en una cámara fría y seca (a 10 °C y 45 % de humedad relativa) y las que tenían 17 % de humedad, en cámaras criogénicas (-196 °C), durante un período de seis meses, al cabo del cual se sembraron en bolsas de plástico en un vivero. Las plántulas de semillas desecadas en silica gel presentaron resultados de desarrollo vegetativo similares a los de las plántulas producidas a partir de semillas con 32 % de humedad y almacenadas durante seis meses. Se considera que el uso de semillas de C. arabica desecadas en silica gel y crioconservadas, constituye una alternativa viable para la producción de plántulas vigorosas (63) y un método más simple que el resto de los ensayados en este estudio.

Crioconservación de embriones

Otros explantes utilizados con frecuencia para la crioconservación de recursos fitogenéticos de cafeto, son los embriones cigóticos y somáticos. En el caso de C. arabica L. cv. Catuaí Vermelho IAC 144, se han probado diferentes tiempos de desecación en silica gel para los embriones cigóticos (0; 15; 30; 60; 120; 240 min) y los embriones somáticos (0; 60; 120 min). Aunque se obtuvo un elevado porcentaje de germinación (98 %) de los embriones cigóticos a los 120 min de desecación, solo el 41 % de las plántulas regeneradas fueron consideradas normales. En cambio, para los embriones somáticos resultó imposible aplicar el tratamiento de crioconservación, ya que no se obtuvo germinación debido a la sensibilidad de estos explantes a la deshidratación (64).

El método de vitrificación también ha sido utilizado para desarrollar un protocolo de crioconservación de embriones cigóticos de C. arabica L. cv. "Catuaí Vermelho" - IAC 144. Para ello, los embriones se sumergieron en PVS 2 (65) (Plant Vitrification Solution o Solución de Vitrificación de Plantas) (compuesta por 30 % de glicerol, 15 % de etilenglicol, 15 % de dimetilsulfóxido y 0,4 M de sacarosa, en medio MS líquido), en distintos momentos (0, 10, 25, 50, 100 y 250 min) y a dos temperaturas (0 y 25 °C). Para la descongelación se evaluaron diferentes tiempos en baño de María: 1, 3, 5 min o directamente en solución de recuperación. Se realizó un estudio anatómico en embriones almacenados con o sin el uso de PVS 2, y no almacenados. Se determinó que la inmersión en solución crioprotectora, durante 100 min a 0 °C permite la crioconservación de los embriones, que pueden ser descongelados directamente en la solución de recuperación después del almacenamiento en nitrógeno líquido. Se observó que PVS 2 redujo el contenido interno de agua en las células, lo que permitió la reanudación posterior del crecimiento de los embriones cigóticos (66).

Investigadoras cubanas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), en colaboración con científicos del Gosling Research Institute for Plant Preservation (GRIPP), perteneciente a la Universidad de Guelph en Canadá, determinaron la efectividad de dos métodos derivados de la vitrificación, en la crioconservación de embriones cigóticos de C. arabica, con la utilización de PVS 3 (67) (50 % glicerol + 50 % sacarosa p/v), con resultados promisorios para la conservación de recursos fitogenéticos de cafeto por esta vía (68).

Conservation in germplasm banks in the field

Field genebanks that maintain significant collections of C. arabica are located in Africa (Cameroon, Côte d'Ivoire, Ethiopia, Kenya and Tanzania), Madagascar, India and in the Americas (Brazil, Colombia and Costa Rica). Field collections in Cameroon, Côte d'Ivoire, India and Madagascar also maintain a good representation of C. canephora. A large part of the uncultivated wild coffee species are conserved in germplasm banks in Madagascar, which maintains about 50 species, and Côte d'Ivoire, with about 30 species of African coffee plants (22).

In botanical gardens in 50 countries, some 445 accessions of coffee plants from 26 species and some interspecific hybrids are also conserved. C. arabica, C. canephora and C. liberica account for 81 % of these accessions in botanical gardens (1). From 73 accessions with species designation, eleven are kept only in one botanical garden and four of these species have not been kept in any other collection. Thus, botanic gardens can be reservoirs of unique species or of a level of diversity of varieties that needs to be considered as part of the global system for ex situ conservation of coffee plants (1).

Over the years, substantial losses of coffee genotypes have occurred in several germplasm banks, resulting in the loss of entire accessions. Taking as an example the CATIE (Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza) collection in Costa Rica, one of the main challenges faced includes the aging of the trees (most were established in the 1970s, although there are collections that were initiated in the 1940s). Also influential are sub-optimal climatic conditions and elevation, the need for varied cultural practices due to the diverse nature of the collections, with cultivated and wild genotypes that differ in their needs for shade, pruning, fertilizers, as well as lack of funding and other resources. Some 53 accessions are considered to have been lost over the years due to aging and the effect of pests and diseases (1,22).

Cuba is not a country of origin of the coffee plant, so in situ conservation does not take place; however, there are areas dedicated to ex situ conservation, such as those belonging to the Central Station for Coffee and Cocoa Research (ECICC), located in Santiago de Cuba province, where 1597 accessions are conserved (1).

Coffee germplasm collections in the field are exposed to different risks, from extreme climatic events to the lack of priority from local authorities (1). They are frequently located in ecological conditions that are not ideal for their maintenance or for the survival of all the material, causing genetic erosion (21). Other causes of this are the loss of trees as a consequence of aging, inappropriate cultivation methods, as well as the emergence of pests and diseases (23). Some of the preventive measures taken against biotic and abiotic stress include frequent monitoring of collections, adequate irrigation, fertilizer application, shading, chemical protection, and integrated pest and disease management (1). From all this, the need to apply other alternatives to the field conservation of coffee plant genetic resources is evident.

Storage of coffee seeds

Based on their characteristics during storage, coffee seeds have been classified as intermediate, since they tolerate a certain level of desiccation, but do not survive total desiccation, nor the combined effects of desiccation and low temperatures (24). It is known that the viability of C. arabica seeds decreases rapidly after four to six months at room temperature (25).

Although the most common way to produce coffee seedlings is by botanical seed, the loss of germination during storage is a limitation for the conservation and propagation of this genus (26). Hence the need to study alternative forms of ex situ conservation, such as the application of biotechnological methods to the preservation of phytogenetic resources of the coffee plant.

In vitro preservation

Among the multiple applications of in vitro culture is in vitro conservation, a valuable option for the preservation of germplasm of species with seeds of short viability, such as coffee plants. Minimal growth methods make it possible to achieve this objective (27).

Minimal growth methods consist of reducing the growth rate of plants, based on the reduction of cell division and metabolism, which is achieved by altering the optimal culture conditions. It is possible to vary the composition of the culture medium or modify the growth environment (temperature, light intensity, oxygen availability) (28). In this way, it is feasible to conserve the plants in the short or medium term, which allows a reduction in the frequency of subcultures and an increase in the in vitro longevity of the plant material, as well as a minimum risk of genetic changes (27,29).

For the in vitro conservation of coffee plants, different variants of minimal growth have been studied (30), such as variations in culture temperature, in combination with a decrease in oxygen content (31,32), modification in the concentration of the carbon source (33,34) and the addition of osmotic growth regulators (35). The most widely used has been the modification of the concentration of growth regulators in the culture medium (36-38). Other contributions to these topics have been made in the last decade, as will be detailed below.

For in vitro conservation of C. arabica cv S. 795 germplasm, a protocol was developed consisting of inoculating zygotic embryos in MS medium (39), supplemented with sucrose (3.0 %) and different concentrations of abscisic acid (ABA) (0; 0.1; 0.5 and 1.0 mg L^-1). They were maintained at a temperature of 25±1 ºC and photoperiod of 16 h, for twelve months. For germination, embryos were subcultured in MS medium supplemented with different concentrations of kinetin (KIN) or gibberellic acid (AG3) (0; 0.1; 0.1; 0.5; 1.0 and 5.0 mg L^-1) and after 45 days were evaluated (40). The results showed that zygotic embryos placed in culture medium with the different concentrations of ABA exhibited variable maturation responses.

In the control, embryos germinated after one week and the shoot and root developed longer, compared to the media with low concentrations, where very slow germination was induced. When embryos were grown in higher ABA concentrations, elongation was observed, followed by a color change from white to dark green at a two-week interval. These embryos reached full maturity and remained dormant, with no shoot or root development (40).

Of the various concentrations of KIN, the 0.1 mg L^-1 treatment was more effective for seedling development, with maximum shoot length and the longest root with numerous lateral roots, compared with the higher concentrations of KIN, which resulted in complete inhibition of the development of this organ. Addition of AG3 at 0.1 and 0.5 mg L^-1 increased shoot length compared to the control, whereas an increase in AG3 concentration did not have this effect. These results showed that KIN was more suitable than AG3 for developing vigorous seedlings (40).

A study conducted by Cuban researchers set out to determine the effect of decreasing the mineral content of the culture medium on the response of coffee plants (C. arabica) preserved in vitro for a period of two to six months. The plants, previously obtained in vitro, were grown in modified MS medium, with treatments consisting of a 75, 50 and 25 % reduction of their macro and microelements. Survival, number of leaf pairs, leaf abscission and percentage of plants with roots were evaluated. In the 50 % MS treatment, the survival percentages varied between 85 and 100 % and with respect to the rest of the treatments, intermediate values of leaf pairs and leaf abscission were obtained. In spite of the lack of nutrients, the plants developed roots that allowed them to survive under these conditions, so that with this treatment it is considered feasible to conserve coffee plants in vitro for up to six months (41).

Cryopreservation

Cryopreservation, the storage of biological material preferably at liquid nitrogen temperature (-196 °C), is an alternative to ex situ conservation of germplasm, which allows long-term, safe and cost-effective maintenance of plant genetic resources with minimal space requirements and routine maintenance (42). In addition, cryopreservation eliminates the need for regular renewal of the collection, which reduces the risk of genetic erosion caused by pests, diseases, climatic conditions, contamination, and genetic variation (43).

Several studies have been carried out in the field of coffee plant cryopreservation (30), using different methods and types of explants: apices (44), somatic embryos and embryogenic callus (45-49), zygotic embryos (50-53), seeds (47,50,54-58) and have obtained diverse results. The research trend is mainly directed towards cryopreservation of seeds and zygotic embryos, a field currently led by Brazilian scientists.

Seed cryopreservation

The evaluation of the physiological quality of C. arabica seeds cryopreserved by direct immersion in liquid nitrogen, following rapid or slow drying, has recently been studied. Seeds of the cultivars Arara, Catiguá, Catuaí Amarelo and Mundo Novo were subjected to rapid drying using silica gel, and slow drying using a saturated NaCl solution (75 % relative humidity), until they reached a moisture content of 20 % (dry basis) in both variants. They were immersed in liquid nitrogen for 24 hours and then reheated in a water bath at 40 °C for two minutes. The physiological quality of the seeds after cryopreservation was evaluated by germination, tetrazolium and vigor tests. It was determined that even with different levels of tolerance, the seeds of these cultivars can be subjected to cryopreservation, with yellow Catuaí being the most tolerant and Arara the most sensitive, regardless of the speed of desiccation. Rapid drying in silica gel up to 20 % of moisture content, followed by direct immersion in liquid nitrogen, allows obtaining higher percentages of normal seedlings, expanded cotyledonary leaves and dry mass and, therefore, favors the cryopreservation of coffee tree seeds (59).

Another research aimed to determine the water content, the cooling speed and the most adequate final temperature for cryopreservation of C. arabica seeds. These were dried with silica gel to water contents of 5, 10, 15, 15, 20, 30 and 40 % (wet basis), subjected to slow cooling treatments at rates of -1, -3 and -5 °C min^-1 to final temperatures of -40, -50 and -60 °C and then immersed directly in liquid nitrogen (LN). After storage, the seeds were re-warmed at 40 °C for two minutes. The survival rate and viability of seeds and embryos were assessed by the tetrazolium and germination tests. The results of the tetrazolium test indicate that embryos extracted from cryopreserved seeds are less sensitive to cryopreservation than whole seeds. In general, water content of 20 % and the use of zygotic embryos led to the highest survival rate of coffee plant seeds, depending on the cooling rate and final pre-cooling temperature (60).

For C. canephora seeds dried in silica gel up to a water content of 0.25 g g^-1, slow cooling treatments identical to those cited above have been used (60). The best result of these treatments was compared with rapid cooling, in which the seeds were directly immersed in liquid nitrogen and the physiological and biochemical alterations occurring in the seeds after cryopreservation were evaluated. Desiccation to

0.25 g g^-1 of water content did not affect the viability of C. canephora seeds and they responded better to cryopreservation by rapid cooling compared to slow cooling. Catalase and esterase enzymes are good biochemical markers for cryopreserved coffee seeds and their activity is higher in those of better physiological quality (61).

The ideal physical and physiological conditions for cryopreservation of C. canephora seeds have also been investigated to reduce mortality caused by intracellular ice crystal formation and to avoid cell damage caused by excessive desiccation. Seeds were subjected to rapid desiccation in silica gel, and slow desiccation in saturated NaCl solution to moisture contents of 0.20, 0.25 and 0.28 g g^-1 (dry basis), followed by direct immersion in liquid nitrogen for flash freezing. Physiological and biochemical analyses were performed to evaluate the quality of these explants before and after cryopreservation. Rapid drying at values close to 0.20 g g^-1 does not cause a reduction in physiological quality, while moisture content of 0.25 g g^-1 results in higher seed survival, after cryopreservation. The speed of drying affects physiological quality after cryopreservation, since rapid drying in silica gel is more favorable than slow drying in a saturated NaCl solution. The activity of catalase, esterase, glutamic oxaloacetic transaminase, and polyphenol oxidase enzymes is an indicator of the quality of C. canephora seeds subjected to cryopreservation (62).

Coffee plant (C. arabica) seeds have been subjected to different types of desiccation and stored in cold storage and cryopreservation, with the purpose of studying the subsequent development of the seedlings. The seeds were subjected to four drying treatments in a stationary dryer until they reached 12 and 32 % humidity and in saturated saline solution and silica gel, until they reached 17 % humidity. Those with 12 and 32 % moisture were stored in a cold, dry chamber (at 10 °C and 45 % relative humidity) and those with 17 % moisture were stored in cryogenic chambers (-196 °C) for a period of six months, after which they were planted in plastic bags in a nursery. Seedlings from seeds dried in silica gel showed vegetative development results similar to those of seedlings produced from seeds at 32 % humidity and stored for six months. The use of silica gel-dried and cryopreserved C. arabica seeds is considered a viable alternative for the production of vigorous seedlings (63) and a simpler method than the others tested in this study.

Embryo cryopreservation

Other explants frequently used for the cryopreservation of coffee plant genetic resources are zygotic and somatic embryos. In the case of C. arabica L. cv. Catuaí Vermelho IAC 144, different drying times in silica gel were tested for zygotic embryos (0; 15; 30; 60; 120; 240 min) and somatic embryos (0; 60; 120 min). Although a high germination percentage (98 %) was obtained for zygotic embryos at 120 min of desiccation, only 41 % of the regenerated seedlings were considered normal. On the other hand, for somatic embryos it was impossible to apply the cryopreservation treatment, since no germination was obtained due to the sensitivity of these explants to dehydration (64).

The vitrification method has also been used to develop a cryopreservation protocol for zygotic embryos of C. arabica L. cv. "Catuaí Vermelho" - IAC 144. For this purpose, embryos were immersed in PVS 2 (65) (Plant Vitrification Solution) (composed of 30 % glycerol, 15 % ethylene glycol, 15 % dimethyl sulfoxide and 0.4 M sucrose, in liquid MS medium), at different times (0, 10, 25, 50, 50, 100 and 250 min) and at two temperatures (0 and 25 °C). For thawing, different times in water bath were evaluated: 1, 3, 5 min or directly in recovery solution. An anatomical study was performed on embryos stored with or without the use of PVS 2, and not stored. It was determined that immersion in cryoprotective solution, for 100 min at 0 °C allows cryopreservation of embryos, which can be thawed directly in the recovery solution after storage in liquid nitrogen. It was observed that PVS 2 reduced the internal water content in the cells, which allowed the subsequent resumption of zygotic embryo growth (66).

Cuban researchers from the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), in collaboration with scientists from the Gosling Research Institute for Plant Preservation (GRIPP), belonging to the University of Guelph in Canada, determined the effectiveness of two methods derived from vitrification, in the cryopreservation of zygotic embryos of C. arabica, with the use of PVS 3 (67) (50 % glycerol + 50 % sucrose w/v), with promising results for the conservation of phytogenetic resources of coffee plants by this method (68).