Material vegetal

Se utilizaron semillas certificadas de frijol del cultivar ‘Delicias 364’ suministradas por la Empresa Provincial de Semillas del municipio Jovellanos, provincia de Matanzas.

Prueba de germinación

La prueba de germinación se realizó en placas Petri de 9 cm de diámetro. Las semillas (10 por placa Petri) se colocaron sobre papel de filtro humedecido con diferentes concentraciones (3, 6, 9, 12, 15 y 18 %) de polietilenglicol-6000 (PEG-6000) y un tratamiento control, que no se le aplicó el compuesto osmóticamente activo. Se utilizaron cuatro placas Petri por tratamiento (concentraciones de PEG). El agente estresante (PEG) se aplicó en una proporción de tres veces la masa del sustrato seco. El proceso de germinación se evaluó diariamente durante siete días y los resultados se expresaron en porcentaje de plántulas normales. Las placas Petri se colocaron en un cuarto de crecimiento a una temperatura de 25 ± 2ºC, con un fotoperíodo de 16 h (35 µmol m^-2s^-1).

Valor de germinación

Se evaluó diariamente la cantidad de semillas germinadas y no germinadas durante los siete días del ensayo de germinación. Con los datos obtenidos se calculó el valor de la germinación (VG) mediante la fórmula de Djavanshir y Pourbeik (1313. Djavanshir K, Pourbeik H. Germination value-a new formula. Silvae genetica [Internet]. 1976;25(2):79-83. Available from: https://www.thuenen.de/media/institute/fg/PDF/Silvae_Genetica/1976/Vol._25_Heft_2/25_2_79.pdf ):

donde:

Ved = velocidad de emergencia diaria, calculada como el porcentaje de la emergencia acumulada entre el número de días desde el inicio de la prueba.

N = frecuencia o número de Ved que se calculó durante la prueba.

Ef = porcentaje de la emergencia de las plántulas al final de los siete días de la prueba.

Emergencia pico

Se determinó mediante porcentaje máximo de emergencia en un mismo día (EP) (1414. Murillo Gamboa O. Variación en parámetros de germinación de una población natural de Alnus acuminata de Guatemala. 1998; Available from: https://repositorio.catie.ac.cr/bitstream/handle/11554/6916/A7182e.pdf?sequence=1 ).

Relación raíz/parte aérea

Se determinó mediante la razón entre la longitud de la raíz (cm) y la longitud de la parte aérea (cm).

Indicadores morfológicos

Se evaluaron los indicadores siguientes: longitud de raíz, hipocótilo y epicótilo y presencia (porcentaje) de hojas verdaderas. Los datos de longitud se obtuvieron con el uso de un papel milimetrado y se expresaron en centímetro.

Indicadores bioquímicos

La extracción y cuantificación de proteínas, carbohidratos solubles totales y azúcares reductores se realizó en las raíces y en la parte aérea de las plántulas al final del ensayo de germinación. El material vegetal se maceró en frío con solución tampón de fosfato de sodio 50 mmol L^-1, pH 7,0 y en en una relación de 25 %:75 %. El homogenizado se centrifugó a 10 000 rpm y el sobrenadante se colectó y conservó a -20 ºC hasta el momento de las determinaciones.

Contenido de proteínas solubles totales

El contenido proteico se determinó colorimétricamente mediante el método descrito por Lowry (1515. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry [Internet]. 1951;193:265-75. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14907713/ ), con el uso de albúmina de suero bovino como patrón. Los valores de absorbancia se obtuvieron a 750 nm y las concentraciones (mg mL^-1) se determinaron mediante la curva patrón.

Contenido de carbohidratos solubles totales

El contenido de carbohidratos en las muestras se determinó colorimétricamente mediante el método del fenol-sulfúrico (1616. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers P t, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry [Internet]. 1956;28(3):350-6. Available from: https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac60111a017 ). Se utilizó la D-glucosa como azúcar patrón y la absorbancia se determinó a 490 nm.

Las concentraciones se determinaron a partir de la curva patrón y se expresaron en mg mL^-1.

Contenido de azúcares reductores

El contenido de azúcares reductores se cuantificó por el método del ácido dinitrosalisílico y se empleó la D-glucosa (Sigma) como azúcar patrón (1717. Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry [Internet]. 1959;31(3):426-8. Available from: https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac60147a030 ). Los valores de absorbancia se obtuvieron a una longitud de onda de 456 nm y la concentración se expresó en mg L^-1 a partir de la curva patrón.

Contenido de fenoles solubles

La extracción de fenoles solubles se realizó por el método de Friend (1818. Gurr SI, McPherson J, Bowles DJ. Lignin and associated phenolic acids in cell walls. Molecular plant pathology and practical approach. 1992;3:62.). Se maceró 0,1 g del material vegetal en 1,0 mL de metanol y se agitó vigorosamente. La muestra se centrifugó a 12 000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se colectó para la determinación de los fenoles solubles. Para determinar la concentración de fenoles se utilizó el ácido clorogénico (0,05 mol L^-1) como patrón y los valores de absorbancia se obtuvieron a 725 nm.

Todas las mediciones espectrofotométricas descritas se realizaron en un espectrofotómetro UV/VIS Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Suecia).

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro repeticiones. Para los análisis bioquímicos se tomaron cinco muestras por tratamientos, mientras que para la evaluación de los parámetros morfológicos y fisiológicos se analizaron 10 plántulas.

Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el Paquete estadístico SPSS versión 18.0. Se comprobó la normalidad y la homogeneidad de varianza mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la prueba de Levene, respectivamente. Con los datos que cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, se aplicó un análisis de varianza y la prueba de rangos múltiples de Duncan para un nivel de confianza del 95 %. En el caso donde no se cumplieron estos supuestos se realizó un análisis no paramétrico mediante las pruebas de Kruskal Wallis y Mann Whitney (p<0,05).

La comparación entre los porcentajes de plántulas con hojas verdaderas entre tratamientos, se realizó mediante un análisis de proporciones con el uso del programa CompaProp versión 3.01 sobre Windows (1919. Castillo Duvergel Y, Miranda I. COMPAPROP: Sistema para comparación de proporciones múltiples. Revista de Protección Vegetal [Internet]. 2014;29(3):231-4. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522014000300013&script=sci_arttext&tlng=pt ).

Germinación

El polietilenglicol afectó el porcentaje de germinación de Phaseolus vulgaris L. cv. ‘Delicias 364’ (Figura 1). En concentraciones bajas (3 y 6 %) del agente osmótico se obtuvieron porcentajes superiores al 90 % a partir del segundo día de experimento. En contenidos superiores del polímero (9, 12 y 15 %) el porcentaje de germinación disminuyó de manera significativa con valores de 76,7; 73,3 y 20,0 %, respectivamente, mientras que 18 % del polímero provocó la inhibición total de la germinación.

La presencia del polietilenglicol en concentraciones elevadas provocó también una disminución en la velocidad de germinación dada en función de la emergencia pico (Tabla 1). En los tratamientos control, 3 y 6 % de PEG se observó el mayor porcentaje de germinación (día pico) en el segundo día. En concentraciones superiores del agente osmótico (9, 12 y 15 %) se observó un retardo del proceso de germinación y un máximo de germinación en el cuarto día del experimento.

El efecto negativo del polietilenglicol sobre la germinación puede estar relacionado con una disminución en el proceso de imbibición de las semillas, debido al carácter altamente hidrofílico de polímero que provoca una disminución del potencial osmótico e hídrico del medio (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ). La imbibición es fundamental para que se inicie la germinación, ya que la entrada de agua permite la hidratación de enzimas y sustratos respiratorios que activan los procesos metabólicos en el embrión y en el endospermo de la semilla. Entre estos procesos están los de hidrólisis enzimática que permiten el uso de las reservas alimenticias para el crecimiento del embrión. Además, una disminución en el proceso de imbibición afecta la entrada de dioxígeno y la respiración aerobia, lo que reduce la obtención de energía metabólica que se requiere para suplir el costo elevado de la germinación (2121. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology 4th ed Sinauer Sunderland [Internet]. MA; 2006. Available from: https://www.scirp.org/(S(351jmbntvnsjt1aadkozje))/reference/referencespapers.aspx?referenceid=717115 ). Estos resultados coinciden con los referidos por otros autores quienes demostraron el efecto negativo del estrés hídrico inducido por polietilenglicol sobre la germinación y el crecimiento temprano de fabáceas como Phaseolus vulgaris L. (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ) y Vigna radiata L. (1212. Imtiaz AA, Shahriar SA, Baque MA, Eaty MNK, Falguni MR. Screening of Mungbean Genotypes under Polyethylene Glycol (PEG) Induced Drought Stress Condition. Annual Research & Review in Biology [Internet]. 2020;1-12. Available from: https://www.journalarrb.com/index.php/ARRB/article/view/30184 ), así como otras especies no leguminosas de importancia económica como Sorghum bicolor (L.) Moench (55. Rezende RKS, Masetto TE, Oba GC, Jesus MV. Germination of sweet Sorghum seeds in different water potentials. American Journal of Plant Sciences [Internet]. 2017;8(12):3062. Available from: https://www.scirp.org/html/9-2603419_80311.htm?pagespeed=noscript ), Brassica napus L. (44. Channaoui S, El Kahkahi R, Charafi J, Mazouz H, El Fechtali M, Nabloussi A. Germination and seedling growth of a set of rapeseed (Brassica napus) varieties under drought stress conditions. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology [Internet]. 2017;2(1):238696. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Hamid-Mazouz/publication/314235482_Germination_and_Seedling_Growth_of_a_Set_of_Rapeseed_Brassica_napus_Varieties_under_Drought_Stress_Conditions/links/58bd64b2aca27261e52d6acf/Germinationand-Seedling-Growth-of-a-Set-of-Rapeseed-Brassica-napus-Varieties-under-Drought-StressConditions.pdf ) y Triticum aestivum L. (2323. Ghosh S, Shahed MA, Robin AHK. Polyethylene glycol induced osmotic stress affects germination and seedling establishment of wheat genotypes. Plant Breeding and Biotechnology [Internet]. 2020;8(2):174-85. Available from: https://www.plantbreedbio.org/journal/view.html?doi=10.9787/PBB.2020.8.2.174 ).

Indicadores morfológicos y fisiológicos

El polietilenglicol disminuyó significativamente el crecimiento de las raíces en todas las concentraciones estudiadas (Figura 2). Los tratamientos 6, 9 y 12 % de PEG disminuyeron la longitud de las raíces en un 69,8; 77,6 y 90,4 %, respectivamente, en comparación con el tratamiento control. La concentración 15 % del agente osmótico inhibió completamente el desarrollo radical. De manera similar, el hipocótilo evidenció una reducción significativa del crecimiento en presencia de polietilenglicol y una mayor sensibilidad con relación a la raíz, ya que en 12 % de PEG se inhibió totalmente el crecimiento de este órgano. Con relación al epicótilo, la presencia de PEG en baja concentración (3 %) redujo significativamente el crecimiento con relación al control. Contenidos más elevados del polímero en el medio inhibió totalmente el crecimiento del mismo.

Estos resultados coinciden con los referidos por otros autores quienes observaron una disminución del crecimiento de la raíz y de la parte aérea de plántulas de Phaseolus vulgaris L. (22. Moliehi R, Mateboho M, Motlatsi M. Screening of common bean cultivars (Phaseolus vulgaris L.) for drought tolerance. Global J. Agril. Res [Internet]. 2017;5(4):20-9. Available from: https://www.eajournals.org/journals/global-journal-of-agricultural-research-gjar/vol-5-issue-4november-2017/screening-common-bean-cultivars-phaseolus-vulgaris-l-drought-tolerance-1/ ,2424. García LR, Leiva-Mora M, Pérez AC, Collado R, Martínez IP, Veitía N, et al. Efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. cv.‘ICA Pijao.’ Biotecnología Vegetal [Internet]. 2015;15(4). Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/502 ), Vigna unguiculata cv. ‘BRS Tumucumaque’ (2525. Ferreira ACT, Felito RA, ROCHA A, CARVALHO MACD, Yamashita OM. Water and salt stresses on germination of cowpea (Vigna unguiculata cv. BRS Tumucumaque) SEEDS 1. Revista Caatinga [Internet]. 2017;30:1009-16. Available from: https://www.scielo.br/j/rcaat/a/h7XW96tcPgM6gvcRryPMCVC/?lang=en&format=html ), Glycine max (L.) Merr. (2626. Pavli OI, Foti C, Skoufogianni G, Karastergiou G, Panagou A, Khah EM. PEG-Induced Drought Stress During Germination Effects on Soybean Germplasm. Agricultural Research & Technology: Open Access Journal [Internet]. 2020;23(5):70-80. Available from: https://juniperpublishers.com/artoaj/ARTOAJ.MS.ID.556250.php ), Brassica napus L. (44. Channaoui S, El Kahkahi R, Charafi J, Mazouz H, El Fechtali M, Nabloussi A. Germination and seedling growth of a set of rapeseed (Brassica napus) varieties under drought stress conditions. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology [Internet]. 2017;2(1):238696. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Hamid-Mazouz/publication/314235482_Germination_and_Seedling_Growth_of_a_Set_of_Rapeseed_Brassica_napus_Varieties_under_Drought_Stress_Conditions/links/58bd64b2aca27261e52d6acf/Germinationand-Seedling-Growth-of-a-Set-of-Rapeseed-Brassica-napus-Varieties-under-Drought-StressConditions.pdf ) y Ocimum basilicum L. (2727. Ojeda-Silvera CM, Murillo-Amador B, Nieto-Garibay A, Troyo-Diéguez E, Ruíz-Espinoza FH, GarcíaHernández JL. Emergencia y crecimiento de plántulas de variedades de albahaca (Ocimum basilicum L.) sometidas a estrés hídrico. Ecosistemas y recursos agropecuarios [Internet]. 2015;2(5):151-61. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-90282015000200003 ) en presencia de PEG-6000. No obstante, los trabajos evidenciaron que existieron distintos niveles de tolerancia frente al agente osmótico debido a las diferencias genotípicas que existen entre las especies y variedades evaluadas.

La disminución de la longitud de las raíces y la parte aérea de las plántulas, puede estar relacionada con el estrés osmótico de los tejidos en presencia del agente estresante. En condiciones de bajo potencial hídrico ocurre la salida de agua de las células vegetales, para compensar la diferencia de potencial osmótico entre los tejidos del vegetal y el medio. Esto provoca a su vez, una disminución de la presión de turgencia que se requiere para la expansión y el crecimiento celular (2828. Sanchez-Reinoso AD, Ligarreto-Moreno GA, Restrepo-Diaz H. Physiological and biochemical responses of common bush bean to drought. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca [Internet]. 2018;46(2):393-401. Available from: https://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/article/view/10965 ). Otro factor que pudo afectar el crecimiento de las plántulas está relacionado con el estrés oxidativo que se genera en condiciones de estrés osmótico (2929. Cao Y, Luo Q, Tian Y, Meng F. Physiological and proteomic analyses of the drought stress response in Amygdalus Mira (Koehne) Yü et Lu roots. BMC plant biology [Internet]. 2017;17(1):1-16. Available from: https://link.springer.com/article/10.1186/s12870-017-1000-z ). En estas condiciones se exacerban la concentración de especies reactivas del oxígeno (ERO) como el peróxido de hidrógeno, el anión superóxido y el potente anión hidroxilo, que oxidan numerosas macromoléculas importantes como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos (2929. Cao Y, Luo Q, Tian Y, Meng F. Physiological and proteomic analyses of the drought stress response in Amygdalus Mira (Koehne) Yü et Lu roots. BMC plant biology [Internet]. 2017;17(1):1-16. Available from: https://link.springer.com/article/10.1186/s12870-017-1000-z ,3030. Zhang C, Shi S. Physiological and proteomic responses of contrasting alfalfa (Medicago sativa L.) varieties to PEG-induced osmotic stress. Frontiers in plant science [Internet]. 2018;9:242. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00242/full ). Esto provoca modificaciones estructurales y funcionales en estos compuestos lo cual afecta numerosos procesos metabólicos, la homeostasia celular y el crecimiento de la plántula (3131. Ahanger MA, Tomar NS, Tittal M, Argal S, Agarwal RM. Plant growth under water/salt stress: ROS production; antioxidants and significance of added potassium under such conditions. Physiology and Molecular Biology of Plants [Internet]. 2017;23(4):731-44. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s12298-017-0462-7 ).

Los valores correspondientes a la relación raíz/parte aérea mostraron un aumento en los tratamientos con polietilenglicol: control (0,83), 3 % (0,86), 6 % (1,18) y 9 % (2,24). Valores superiores de PEG inhibieron el crecimiento del brote. El incremento en la relación raíz/parte aérea indica que el agente osmótico tuvo un efecto positivo sobre el crecimiento de la raíz en comparación con las estructuras aéreas, lo que puede significar un mecanismo de supervivencia en condiciones de estrés hídrico. Un aumento en la relación raíz/parte aérea en presencia de estrés osmótico inducido por PEG también se observó en Phaseolus vulgaris L. (2828. Sanchez-Reinoso AD, Ligarreto-Moreno GA, Restrepo-Diaz H. Physiological and biochemical responses of common bush bean to drought. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca [Internet]. 2018;46(2):393-401. Available from: https://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/article/view/10965 ), Glycine max L. (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ), Triticum aestivum L. (3232. Robin AHK, Matthew C, Uddin MJ, Bayazid KN. Salinity-induced reduction in root surface area and changes in major root and shoot traits at the phytomer level in wheat. Journal of experimental botany [Internet]. 2016;67(12):3719-29. Available from: https://academic.oup.com/jxb/article/67/12/3719/2884943?login=true ,3333. Hannan A, Hassan L, Hoque MN, Tahjib-Ul-Arif M, Robin AHK. Increasing new root length reflects survival mechanism of rice (Oryza sativa L.) genotypes under PEG-induced osmotic stress. Plant Breeding and Biotechnology [Internet]. 2020;8(1):46-57. Available from: https://www.plantbreedbio.org/journal/view.html?volume=8&number=1&spage=46&year=2020 ) y puede considerarse un indicador de tolerancia al déficit hídrico (3434. Polania J, Rao IM, Cajiao C, Rivera M, Raatz B, Beebe S. Physiological traits associated with drought resistance in Andean and Mesoamerican genotypes of common bean Phaseolus vulgaris L.). Euphytica [Internet]. 2016;210(1):17-29. Available from: https://repo.mel.cgiar.org/handle/20.500.11766/6881 ).

El efecto del polietilenglicol sobre el desarrollo de hojas verdaderas en plántulas de frijol se muestra en la Tabla 2. El tratamiento 3 % de PEG disminuyó en un 55 % el porcentaje de plántulas con hojas verdaderas con relación al control, mientras que en presencia de 6 % del agente osmótico solamente el 18 % de las plántulas desarrollaron estructuras fotosintéticas y con una menor superficie, en comparación con las hojas de los tratamientos control y 3 % de PEG.

En concentraciones superiores del polímero hubo una inhibición completa de la formación de hojas verdaderas.

El efecto negativo del estrés hídrico sobre el número de hojas en las plantas de frijol se refirió con anterioridad por otros autores (3535. Sánchez-Blanco MJ, Álvarez S, Navarro A, Bañón S. Changes in leaf water relations, gas exchange, growth and flowering quality in potted geranium plants irrigated with different water regimes. Journal of plant physiology [Internet]. 2009;166(5):467-76. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0176161708002083 ). El estrés osmótico inhibe considerablemente los procesos de división y alargamiento celular, los cuales influyen de manera significativa en el número y volumen celular y en consecuencia, en la formación y crecimiento de nuevas estructuras foliares. En trabajos similares se observó una reducción en el área foliar de las plántulas de P. vulgaris cv. ‘ICA Piajo’ con la aplicación de PEG-6000 en concentraciones superiores a 6 % del agente estresante (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ).

El valor de germinación de las plántulas de frijol germinadas en presencia de polietilenglicol, disminuyó significativamente en concentraciones iguales o superiores a 9 % (Figura 3). En los tratamientos 9, 12 y 15 % del agente osmótico la reducción fue del 66,0; 73,5 y 96,8 %, respectivamente, con relación al control; mientras que en los tratamientos 0, 3 y 6 % de PEG no se observaron diferencias.

Estos resultados coinciden con los obtenidos en P. vulgaris cv. ‘ICA Pijao’, donde se observó una reducción significativa de la germinación y el vigor de las plántulas en condiciones de estrés hídrico inducido por PEG-6000 en concentraciones superiores a 14 % (2424. García LR, Leiva-Mora M, Pérez AC, Collado R, Martínez IP, Veitía N, et al. Efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. cv.‘ICA Pijao.’ Biotecnología Vegetal [Internet]. 2015;15(4). Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/502 ). En estudios similares realizados con Vigna unguiclata L., se observó una reducción en varios indicadores como el vigor y la germinación media diaria, en plántulas germinadas en condiciones de estrés hídrico inducido por PEG-4000 (3636. Jain C, Saxena R. Varietal differences against PEG induced drought stress in cowpea. Octa Journal of Environmental Research [Internet]. 2016;4(1):58-62. Available from: http://sciencebeingjournal.com/octa-journal-environmental-research/varietal-differences-against-peginduced-drought-stress-cowpea ).

Indicadores bioquímicos

El contenido de carbohidratos solubles totales, azúcares reductores y proteínas solubles totales, en raíces y parte aérea de las plántulas germinadas en diferentes concentraciones de polietilenglicol se muestran en la Tabla 3. Con relación a la concentración de carbohidratos solubles, se observó un mayor contenido de estos compuestos en la raíz en los tratamientos 6 y 9 % de PEG, en comparación con el control y el resto de los tratamientos donde se obtuvieron valores similares. En la parte aérea no hubo diferencias entre el control y 3 % de PEG; sin embargo, se observaron valores inferiores en los tratamientos 6, 9 y 12 % en relación con el control.

El contenido más elevado de azúcares reductores en las raíces se obtuvo en las plántulas germinadas con 6 % de polietilenglicol, seguido de los tratamientos con 3 y 9 % del agente osmótico sin diferencias entre estos pero superiores al control. Los valores más bajos se obtuvieron con 12 % de PEG en el medio. En la parte aérea, los tratamientos con 3 y 6 % de PEG mostraron contenidos de azúcares reductores superiores al control, mientras que los valores más bajos se obtuvieron con 9 y 12 % de PEG en ese orden.

El polietilenglicol afectó el contenido de proteínas en raíces y parte aérea de manera diferente. La parte aérea mostró una mayor sensibilidad que las raíces, ya que el contenido proteico disminuyó en la concentración más baja de PEG evaluada (3 %) con relación al control y al resto de los tratamientos. En el caso de las raíces no hubo diferencias entre el control y los tratamientos 3 y 6% de polietilenglicol, mientras que en concentraciones superiores (9 y 12 %) del agente osmótico se obtuvieron valores inferiores sin diferencias significativas entre estos.

La reducción en el contenido de carbohidratos puede estar relacionada con la degradación de estos compuestos en monosacáridos y la oxidación de los mismos para la obtención de ATP, para su uso en el mantenimiento de las funciones metabólicas en condiciones de estrés hídrico (energía de mantenimiento).

El aumento en el contenido de azúcares reductores en concentraciones bajas y medias de PEG (3 y 6 %) en las raíces y en la parte aérea de las plántulas, puede estar relacionado con un aumento de la actividad α-amilasa en los tejidos del vegetal. Una respuesta similar se observó en plántulas de Sorghum bicolor L. germinadas en condiciones de estrés hídrico inducido por PEG-6000 (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ). El aumento en el contenido de azúcares reductores en presencia de PEG-6000 también se evidenció en plántulas de alfalfa (Medicago sativa L.), una especie que crece adecuadamente en zonas afectadas por la sequía (3030. Zhang C, Shi S. Physiological and proteomic responses of contrasting alfalfa (Medicago sativa L.) varieties to PEG-induced osmotic stress. Frontiers in plant science [Internet]. 2018;9:242. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00242/full ).

El incremento en la concentración de azúcares reductores puede estar relacionado con un mecanismo fisiológico para compensar la diferencia de potencial hídrico entre los tejidos del vegetal y el medio externo; ya que los azúcares reductores son compuestos osmóticamente activos que disminuyen el potencial de soluto e hídrico de las células, lo que permite retener y/o absorber agua en condiciones de sequía fisiológica y el osmoacondicionamiento de los tejidos del vegetal.

La disminución en el contenido de azúcares reductores en los tratamientos con concentraciones elevadas de PEG, puede estar relacionado con la inactivación de la enzima α-amilasa que tiene la función catalítica de hidrolizar las moléculas de almidón. En estudios similares se observó una correlación positiva entre la actividad de la α-amilasa y las concentraciones de azúcares reductores en semillas de Zea mays L. tratadas con PEG-6000 (3737. Li WU, Zhang X, Ashraf U, Mo Z, Suo H, Li G. Dynamics of seed germination, seedling growth and physiological responses of sweet corn under peg-induced water stress. Pakstan Journal of Botanical [Internet]. 2017;49(2):639-46. Available from: https://www.pakbs.org/pjbot/PDFs/49(2)/33.pdf ). Por otra parte, la disminución en el contenido de azúcares reductores también puede estar asociada con una mayor utilización de estos compuestos, debido a un aumento de la respiración en estas plántulas (3838. Yasseen B, Al-Thani R, Alhady F, Abbas R. Soluble sugars in plants under stress at the arabian gulf Region: possible roles of microorganisms. J Plant Biochem Physiol [Internet]. 2018;6(224):2. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Bassam-Yasseen/publication/36208420_An_analysis_of_the_effects_of_salinity_on_leaf_growth_in_Mexican_ wheats/links/5cf31158a6fdcc8475fcea22/An-analysis-of-the-effects-of-salinity-on-leaf-growth-inMexican-wheats.pdf ). Esto permite el desarrollo de procesos vitales como el recambio celular y la síntesis de proteínas, enzimas y otros compuestos que participan en la respuesta antiestrés.

La disminución en el contenido proteico puede estar relacionada con afectaciones en la maquinaria de biosíntesis de proteínas, así como en procesos fundamentales como la respiración celular, ya que una disminución en la tasa respiratoria representa una menor disponibilidad de energía metabólica para los procesos de biosíntesis. Esto concuerda con la reducción observada en el contenido de azúcares reductores en los tratamientos con las concentraciones más elevadas de polietilenglicol. Además, una disminución en el proceso de respiración celular implica una menor concentración de ácidos orgánicos derivados del ciclo de Krebs, que pueden servir de base para la síntesis de aminoácidos que se utilizan en la biosíntesis de proteínas.

El contenido de polifenoles solubles en las plántulas sometidas a estrés hídrico se muestra en la Figura 4. En las raíces los valores disminuyeron con el aumento de la concentración de PEG. Este resultado puede estar relacionado con una reducción en la actividad de enzimas que participan en la ruta biosintética de los polifenoles, en especial de la fenilalanina amonioliasa que tiene una función central en el metabolismo de estos compuestos. El contenido de polifenoles en la parte aérea mostró una mayor estabilidad con valores similares entre el control y los tratamientos 3; 6 y 9 % de PEG y solo disminuyó en 12 % de PEG.

Estos resultados están en correspondencia con los observados en otras especies como Solanum lycopersicum sp. (3939. Florido Bacallao M, Bao Fundora L. Tolerancia a estrés por déficit hídrico en tomate (Solanum lycopersicum L.). Cultivos tropicales [Internet]. 2014;35(3):70-88. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362014000300008 ), Sorghum bicolor (L.) Moench (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ) y Ocimum basilicum L. (2727. Ojeda-Silvera CM, Murillo-Amador B, Nieto-Garibay A, Troyo-Diéguez E, Ruíz-Espinoza FH, GarcíaHernández JL. Emergencia y crecimiento de plántulas de variedades de albahaca (Ocimum basilicum L.) sometidas a estrés hídrico. Ecosistemas y recursos agropecuarios [Internet]. 2015;2(5):151-61. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-90282015000200003 ). La estabilidad en los contenidos de estos compuestos en la parte aérea, puede constituir un mecanismo de defensa antioxidante asociado con la síntesis de polifenoles y el movimiento de los fenoles solubles hacia los tejidos superiores de la planta, donde se evidenció una mayor susceptibilidad al estrés hídrico. En las plantas, los polifenoles pueden tener una función importante dentro del sistema antioxidante. Estos compuestos disminuyen la producción de especies reactivas del oxígeno, al reducir la velocidad de la reacción de Fenton mediante la cual se forman ERO al reaccionar el peróxido de hidrógeno con metales de transición. Esto se debe a que los compuestos fenólicos tienen la capacidad de donar electrones a la enzima guayacol peroxidasa para la eliminación del peróxido de hidrógeno, y por otra parte, pueden también quelatar metales tóxicos (4040. Rice-Evans C, Miller N, Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in plant science [Internet]. 1997;2(4):152-9. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1360138597010182 ,4141. Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC, Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology [Internet]. 2002;177(1):67-80. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0300483X02001968 ).

Plant material

Certified bean seeds of cultivar 'Delicias 364' supplied by the Provincial Seed Company from Jovellanos municipality, Matanzas province were used.

Germination test

The germination test was carried out in Petri dishes of 9 cm in diameter. Seeds (10 per Petri dish) were placed on filter paper moistened with different concentrations (3, 6, 9, 9, 12, 15 and 18 %) of polyethylene glycol6000 (PEG-6000) and a control treatment, which did not receive the osmotically active compound. Four Petri dishes per treatment (PEG concentrations) were used. The stressor (PEG) was applied at a rate of three times the mass of the dry substrate. The germination process was evaluated daily for seven days and the results were expressed as percentage of normal seedlings. Petri dishes were placed in a growth room at a temperature of 25 ± 2 °C, with a photoperiod of 16 h (35 µmol m^-2s^-1).

Germination value

The number of germinated and non-germinated seeds was evaluated daily during the seven days of the germination trial. With the data obtained, the germination value (GV) was calculated using the formula of Djavanshir and Pourbeik (1313. Djavanshir K, Pourbeik H. Germination value-a new formula. Silvae genetica [Internet]. 1976;25(2):79-83. Available from: https://www.thuenen.de/media/institute/fg/PDF/Silvae_Genetica/1976/Vol._25_Heft_2/25_2_79.pdf ):

where:

Ved = daily emergence rate, calculated as the percentage of cumulative emergence divided by the number of days since the test starting.

N = frequency or Ved number calculated during the test.

Ef = percentage of seedling emergence at the end of the seven-day test.

Peak emergence

It was determined by maximum percentage of emergence in the same day (EP) (1414. Murillo Gamboa O. Variación en parámetros de germinación de una población natural de Alnus acuminata de Guatemala. 1998; Available from: https://repositorio.catie.ac.cr/bitstream/handle/11554/6916/A7182e.pdf?sequence=1 ).

Root/ aerial part ratio

It was determined by the ratio of root length (cm) to aerial part length (cm).

Morphological indicators

The following indicators were evaluated: root, hypocotyl and epicotyl length and presence (percentage) of true leaves. Length data were obtained with the use of a millimeter paper and expressed in centimeters.

Biochemical indicators

Extraction and quantification of proteins, total soluble carbohydrates and reducing sugars were performed on roots and aerial part of seedlings at the end of the germination trial. The plant material was cold macerated with sodium phosphate buffer solution 50 mmol L^-1, pH 7.0 and in a 25 %:75 % ratio. The homogenate was centrifuged at 10 000 rpm and the supernatant was collected and stored at -20 °C until the time of determinations.

Total soluble protein content

The protein content was determined colorimetrically by the method described by Lowry (1515. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry [Internet]. 1951;193:265-75. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14907713/ ), using bovine serum albumin as a standard. The absorbance values were obtained at 750 nm and the concentrations (mg mL^-1) were determined using the standard curve.

Total soluble carbohydrate content

The carbohydrate content of the samples was determined colorimetrically by the phenol-sulfuric method (1616. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers P t, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry [Internet]. 1956;28(3):350-6. Available from: https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac60111a017 ). D-glucose was used as the standard sugar and the absorbance was determined at 490 nm. Concentrations were determined from the standard curve and expressed in mg mL^-1.

Reducing sugar content

The content of reducing sugars was quantified by the dinitrosalisylic acid method and D-glucose (Sigma) was used as the standard sugar (1717. Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry [Internet]. 1959;31(3):426-8. Available from: https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac60147a030 ). The absorbance values were obtained at a wavelength of 456 nm and the concentration was expressed in mg L from the standard curve.

Soluble phenol content

The extraction of soluble phenols was carried out by Friend's method (1818. Gurr SI, McPherson J, Bowles DJ. Lignin and associated phenolic acids in cell walls. Molecular plant pathology and practical approach. 1992;3:62.). 0.1 g of the plant material was macerated in 1.0 mL of methanol and shaken vigorously. The sample was centrifuged at 12 000 rpm for 10 min and the supernatant was collected for the determination of soluble phenols. Chlorogenic acid (0.05 mol L^-1) was used as a standard to determine the concentration of phenols and absorbance values were obtained at 725 nm.

All spectrophotometric measurements described were performed on a UV/VIS Ultrospec 2000 spectrophotometer (Pharmacia Biotech, Sweden).

Experimental design and statistical analysis

A completely randomized design with four replicates was used. For biochemical analyses, five samples were taken per treatment, while for the evaluation of morphological and physiological parameters, 10 seedlings were analyzed.

For the statistical analysis of the experimental data, the SPSS version 18.0 statistical package was used. Normality and homogeneity of variance were tested using the Shapiro-Wilk test and Levene's test, respectively. With the data that met the assumptions of normality and homogeneity of variance, an analysis of variance and Duncan's multiple range test was applied for a confidence level of 95 %. In the case where these assumptions were not met, a non-parametric analysis was performed using the Kruskal Wallis and Mann Whitney tests (p<0.05).

The comparison between the percentages of seedlings with true leaves between treatments was carried out by means of an analysis of proportions using the CompaProp program version 3.01 on Windows (1919. Castillo Duvergel Y, Miranda I. COMPAPROP: Sistema para comparación de proporciones múltiples. Revista de Protección Vegetal [Internet]. 2014;29(3):231-4. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522014000300013&script=sci_arttext&tlng=pt ).

Germination

Polyethylene glycol affected the germination percentage of Phaseolus vulgaris L. cv. 'Delicias 364' (Figure 1). At low concentrations (3 and 6 %) of the osmotic agent, percentages higher than 90 % were obtained from the second day of the experiment. At higher polymer contents (9, 12 and 15 %) the germination percentage decreased significantly with values of 76.7, 73.3 and 20.0 %, respectively, while 18 % of the polymer caused total inhibition of germination.

The presence of polyethylene glycol at high concentrations also caused a decrease in the germination rate as a function of peak emergence (Table 1). In the control, 3 and 6 % PEG treatments, the highest germination percentage (peak day) was observed on the second day. At higher concentrations of the osmotic agent (9, 12 and 15 %) a delay of the germination process was observed and a maximum germination on the fourth day of the experiment.

The negative effect of polyethylene glycol on germination may be related to a decrease in the imbibition process of seeds, due to the highly hydrophilic character of the polymer that causes a decrease in the osmotic and hydric potential of the medium (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ). Imbibition is essential for the germination initiation, since the water entry allows the hydration of enzymes and respiratory substrates that activate metabolic processes in the embryo and endosperm of the seed. Among these processes are those of enzymatic hydrolysis that allow the use of food reserves for embryo growth. In addition, a decrease in the imbibition process affects dioxygen input and aerobic respiration, which reduces the metabolic energy required to meet the high cost of germination (2121. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology 4th ed Sinauer Sunderland [Internet]. MA; 2006. Available from: https://www.scirp.org/(S(351jmbntvnsjt1aadkozje))/reference/referencespapers.aspx?referenceid=717115 ).

These results coincide with those reported by other authors who have demonstrated the negative effect of polyethylene glycol-induced water stress on germination and early growth of fabaceae such as Phaseolus vulgaris L. (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ) and Vigna radiata L. (1212. Imtiaz AA, Shahriar SA, Baque MA, Eaty MNK, Falguni MR. Screening of Mungbean Genotypes under Polyethylene Glycol (PEG) Induced Drought Stress Condition. Annual Research & Review in Biology [Internet]. 2020;1-12. Available from: https://www.journalarrb.com/index.php/ARRB/article/view/30184 ), as well as other economically important non-legume species such as Sorghum bicolor (L.) Moench (55. Rezende RKS, Masetto TE, Oba GC, Jesus MV. Germination of sweet Sorghum seeds in different water potentials. American Journal of Plant Sciences [Internet]. 2017;8(12):3062. Available from: https://www.scirp.org/html/9-2603419_80311.htm?pagespeed=noscript ), Brassica napus L. (44. Channaoui S, El Kahkahi R, Charafi J, Mazouz H, El Fechtali M, Nabloussi A. Germination and seedling growth of a set of rapeseed (Brassica napus) varieties under drought stress conditions. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology [Internet]. 2017;2(1):238696. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Hamid-Mazouz/publication/314235482_Germination_and_Seedling_Growth_of_a_Set_of_Rapeseed_Brassica_napus_Varieties_under_Drought_Stress_Conditions/links/58bd64b2aca27261e52d6acf/Germinationand-Seedling-Growth-of-a-Set-of-Rapeseed-Brassica-napus-Varieties-under-Drought-StressConditions.pdf ) and Triticum aestivum L. (2323. Ghosh S, Shahed MA, Robin AHK. Polyethylene glycol induced osmotic stress affects germination and seedling establishment of wheat genotypes. Plant Breeding and Biotechnology [Internet]. 2020;8(2):174-85. Available from: https://www.plantbreedbio.org/journal/view.html?doi=10.9787/PBB.2020.8.2.174 ).

Morphological and physiological indicators

Polyethylene glycol significantly decreased root growth at all concentrations studied (Figure 2). Treatments 6, 9 and 12 % PEG decreased root length by 69.8; 77.6 and 90.4 %, respectively, compared to the control treatment. The concentration of the osmotic agent (15 %) completely inhibited root development. Similarly, the hypocotyl showed a significant reduction of growth in the presence of polyethylene glycol and a greater sensitivity in relation to the root, since at 12 % PEG the growth of this organ was completely inhibited. In relation to the epicotyl, the PEG presence at low concentration (3 %) significantly reduced growth in relation to the control. Higher contents of the polymer in the medium totally inhibited its growth.

These results coincide with those reported by other authors who observed a decrease in root and aerial growth of seedlings of Phaseolus vulgaris L. (22. Moliehi R, Mateboho M, Motlatsi M. Screening of common bean cultivars (Phaseolus vulgaris L.) for drought tolerance. Global J. Agril. Res [Internet]. 2017;5(4):20-9. Available from: https://www.eajournals.org/journals/global-journal-of-agricultural-research-gjar/vol-5-issue-4november-2017/screening-common-bean-cultivars-phaseolus-vulgaris-l-drought-tolerance-1/ ,2424. García LR, Leiva-Mora M, Pérez AC, Collado R, Martínez IP, Veitía N, et al. Efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. cv.‘ICA Pijao.’ Biotecnología Vegetal [Internet]. 2015;15(4). Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/502 ), Vigna unguiculata cv. 'BRS Tumucumaque' (2525. Ferreira ACT, Felito RA, ROCHA A, CARVALHO MACD, Yamashita OM. Water and salt stresses on germination of cowpea (Vigna unguiculata cv. BRS Tumucumaque) SEEDS 1. Revista Caatinga [Internet]. 2017;30:1009-16. Available from: https://www.scielo.br/j/rcaat/a/h7XW96tcPgM6gvcRryPMCVC/?lang=en&format=html ), Glycine max (L.) Merr. (2626. Pavli OI, Foti C, Skoufogianni G, Karastergiou G, Panagou A, Khah EM. PEG-Induced Drought Stress During Germination Effects on Soybean Germplasm. Agricultural Research & Technology: Open Access Journal [Internet]. 2020;23(5):70-80. Available from: https://juniperpublishers.com/artoaj/ARTOAJ.MS.ID.556250.php ), Brassica napus L. (44. Channaoui S, El Kahkahi R, Charafi J, Mazouz H, El Fechtali M, Nabloussi A. Germination and seedling growth of a set of rapeseed (Brassica napus) varieties under drought stress conditions. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology [Internet]. 2017;2(1):238696. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Hamid-Mazouz/publication/314235482_Germination_and_Seedling_Growth_of_a_Set_of_Rapeseed_Brassica_napus_Varieties_under_Drought_Stress_Conditions/links/58bd64b2aca27261e52d6acf/Germinationand-Seedling-Growth-of-a-Set-of-Rapeseed-Brassica-napus-Varieties-under-Drought-StressConditions.pdf ) and Ocimum basilicum L. (2727. Ojeda-Silvera CM, Murillo-Amador B, Nieto-Garibay A, Troyo-Diéguez E, Ruíz-Espinoza FH, GarcíaHernández JL. Emergencia y crecimiento de plántulas de variedades de albahaca (Ocimum basilicum L.) sometidas a estrés hídrico. Ecosistemas y recursos agropecuarios [Internet]. 2015;2(5):151-61. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-90282015000200003 ) in the presence of PEG6000. However, the work showed that there were different levels of tolerance to the osmotic agent due to genotypic differences among the species and varieties evaluated.

The decrease in root length and aerial part of the seedlings may be related to osmotic stress of tissues in the stressor presence. Under conditions of low water potential, water leaves plant cells to compensate for the difference in osmotic potential between the plant tissues and the medium. This in turn causes a decrease in the turgor pressure required for cell expansion and growth (2828. Sanchez-Reinoso AD, Ligarreto-Moreno GA, Restrepo-Diaz H. Physiological and biochemical responses of common bush bean to drought. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca [Internet]. 2018;46(2):393-401. Available from: https://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/article/view/10965 ). Another factor that could affect seedling growth is related to oxidative stress generated under osmotic stress conditions (2929. Cao Y, Luo Q, Tian Y, Meng F. Physiological and proteomic analyses of the drought stress response in Amygdalus Mira (Koehne) Yü et Lu roots. BMC plant biology [Internet]. 2017;17(1):1-16. Available from: https://link.springer.com/article/10.1186/s12870-017-1000-z ). Under these conditions, the concentration of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide, superoxide anion, and the potent hydroxyl anion are exacerbated, which oxidize numerous important macromolecules such as nucleic acids, proteins, and lipids (2929. Cao Y, Luo Q, Tian Y, Meng F. Physiological and proteomic analyses of the drought stress response in Amygdalus Mira (Koehne) Yü et Lu roots. BMC plant biology [Internet]. 2017;17(1):1-16. Available from: https://link.springer.com/article/10.1186/s12870-017-1000-z ,3030. Zhang C, Shi S. Physiological and proteomic responses of contrasting alfalfa (Medicago sativa L.) varieties to PEG-induced osmotic stress. Frontiers in plant science [Internet]. 2018;9:242. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00242/full ). This causes structural and functional modifications in these compounds which affect numerous metabolic processes, cell homeostasis and seedling growth (3131. Ahanger MA, Tomar NS, Tittal M, Argal S, Agarwal RM. Plant growth under water/salt stress: ROS production; antioxidants and significance of added potassium under such conditions. Physiology and Molecular Biology of Plants [Internet]. 2017;23(4):731-44. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s12298-017-0462-7 ).

The values corresponding to the root to aerial part ratio showed an increase in the polyethylene glycol treatments: control (0.83), 3 % (0.86), 6 % (1.18) and 9 % (2.24). Higher PEG values inhibited shoot growth. The increase in root to aerial part ratio indicates that the osmotic agent had a positive effect on root growth compared to aerial structures, which may signify a survival mechanism under water stress conditions. An increase in root to aerial part ratio in the presence of PEG-induced osmotic stress was also observed in Phaseolus vulgaris L. (2828. Sanchez-Reinoso AD, Ligarreto-Moreno GA, Restrepo-Diaz H. Physiological and biochemical responses of common bush bean to drought. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca [Internet]. 2018;46(2):393-401. Available from: https://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/article/view/10965 ), Glycine max L. (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ), Triticum aestivum L. (3232. Robin AHK, Matthew C, Uddin MJ, Bayazid KN. Salinity-induced reduction in root surface area and changes in major root and shoot traits at the phytomer level in wheat. Journal of experimental botany [Internet]. 2016;67(12):3719-29. Available from: https://academic.oup.com/jxb/article/67/12/3719/2884943?login=true ,3333. Hannan A, Hassan L, Hoque MN, Tahjib-Ul-Arif M, Robin AHK. Increasing new root length reflects survival mechanism of rice (Oryza sativa L.) genotypes under PEG-induced osmotic stress. Plant Breeding and Biotechnology [Internet]. 2020;8(1):46-57. Available from: https://www.plantbreedbio.org/journal/view.html?volume=8&number=1&spage=46&year=2020 ) and can be considered an indicator of tolerance to water deficit (3434. Polania J, Rao IM, Cajiao C, Rivera M, Raatz B, Beebe S. Physiological traits associated with drought resistance in Andean and Mesoamerican genotypes of common bean Phaseolus vulgaris L.). Euphytica [Internet]. 2016;210(1):17-29. Available from: https://repo.mel.cgiar.org/handle/20.500.11766/6881 ).

The polyethylene glycol effect on true leaf development in bean seedlings is shown in Table 2. The 3 % PEG treatment decreased by 55 % the percentage of seedlings with true leaves in relation to the control, while in the presence of 6 % of the osmotic agent only 18 % of seedlings developed photosynthetic structures and with a smaller surface area, compared to the leaves of the control and 3 % PEG treatments. At higher concentrations of the polymer there was a complete inhibition of true leaf formation.

The negative effect of water stress on the number of leaves in bean plants has been previously reported by other authors (3535. Sánchez-Blanco MJ, Álvarez S, Navarro A, Bañón S. Changes in leaf water relations, gas exchange, growth and flowering quality in potted geranium plants irrigated with different water regimes. Journal of plant physiology [Internet]. 2009;166(5):467-76. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0176161708002083 ). Osmotic stress considerably inhibits the processes of cell division and elongation, which significantly influence cell number and volume, and consequently, the formation and growth of new leaf structures. In similar studies, a reduction in the leaf area of P. vulgaris cv. 'ICA Piajo' seedlings was observed with the application of PEG-6000 at concentrations higher than 6 % of the stress agent (2222. Reyes-Matamoros J, Martínez-Moreno D, Rueda-Luna R, Rodríguez-Ramírez T. Efecto del estrés hídrico en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero. Revista Iberoamericana de Ciencias [Internet]. 2014;1(2):191-203. Available from: http://www.reibci.org/publicados/2014/julio/2200132.pdf ).

The germination value of bean seedlings germinated in the presence of polyethylene glycol decreased significantly at concentrations equal to or higher than 9 % (Figure 3). In treatments 9, 12 and 15 % of the osmotic agent, the reduction was 66.0, 73.5 and 96.8 %, respectively, in relation to the control; while in treatments 0, 3 and 6 % of PEG, no differences were observed.

These results coincide with those obtained in P. vulgaris cv. 'ICA Pijao', where a significant reduction in germination and vigor of seedlings was observed under conditions of hydric stress induced by PEG-6000 in concentrations higher than 14 % (2424. García LR, Leiva-Mora M, Pérez AC, Collado R, Martínez IP, Veitía N, et al. Efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. cv.‘ICA Pijao.’ Biotecnología Vegetal [Internet]. 2015;15(4). Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/502 ). In similar studies carried out with Vigna unguiclata L., a reduction in several indicators such as vigor and mean daily germination was observed in seedlings germinated under PEG-4000-induced water stress conditions (3636. Jain C, Saxena R. Varietal differences against PEG induced drought stress in cowpea. Octa Journal of Environmental Research [Internet]. 2016;4(1):58-62. Available from: http://sciencebeingjournal.com/octa-journal-environmental-research/varietal-differences-against-peginduced-drought-stress-cowpea ).

Biochemical indicators

The contents of total soluble carbohydrates, reducing sugars and total soluble proteins in roots and aerial part of germinated seedlings at different concentrations of polyethylene glycol are shown in Table 3. With regard to the concentration of soluble carbohydrates, a higher content of these compounds was observed in the root in treatments 6 and 9 % PEG, compared to the control and the rest of the treatments where similar values were obtained. In the aerial part, there were no differences between the control and 3% PEG; however, lower values were observed in treatments 6, 9 and 12 % in relation to the control.

The highest content of reducing sugars in the roots was obtained in the germinated seedlings with 6 % polyethylene glycol, followed by treatments with 3 and 9 % of the osmotic agent without differences between them, but higher than the control. The lowest values were obtained with 12 % PEG in the medium. In the aerial part, the treatments with 3 and 6 % PEG showed higher reducing sugar contents than the control, while the lowest values were obtained with 9 and 12 % PEG in that order.

Polyethylene glycol affected the protein content in roots and aerial part differently. The aerial part showed greater sensitivity than the roots, since the protein content decreased at the lowest concentration of PEG evaluated (3 %) in relation to the control and the rest of treatments. In the case of roots, there were no differences between the control and the treatments 3 and 6 % polyethylene glycol, while at higher concentrations (9 and 12 %) of the osmotic agent, lower values were obtained without significant differences between them.

The reduction in carbohydrate content may be related to the degradation of these compounds into monosaccharides and their oxidation to obtain ATP for use in the maintenance of metabolic functions under conditions of water stress (maintenance energy).

The increase in the content of reducing sugars at low and medium PEG concentrations (3 and 6 %) in roots and aerial part of seedlings may be related to an increase in α-amylase activity in plant tissues. A similar response was observed in Sorghum bicolor L. seedlings germinated under PEG-6000-induced water stress conditions (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ). The increase in reducing sugar content in the presence of PEG-6000 was also evidenced in seedlings of alfalfa (Medicago sativa L.), a species that grows well in drought-affected areas (3030. Zhang C, Shi S. Physiological and proteomic responses of contrasting alfalfa (Medicago sativa L.) varieties to PEG-induced osmotic stress. Frontiers in plant science [Internet]. 2018;9:242. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00242/full ).

The increase in the concentration of reducing sugars may be related to a physiological mechanism to compensate for the difference in water potential between plant tissues and the external environment; since reducing sugars are osmotically active compounds that decrease the solute and water potential of the cells, which allows the retention and/or absorption of water under physiological drought conditions and the osmoconditioning of plant tissues.

The decrease in the content of reducing sugars in treatments with high PEG concentrations may be related to the inactivation of the enzyme α-amylase, which has the catalytic function of hydrolyzing starch molecules. In similar studies, a positive correlation was observed between α-amylase activity and reducing sugar concentrations in Zea mays L. seeds treated with PEG-6000 (3737. Li WU, Zhang X, Ashraf U, Mo Z, Suo H, Li G. Dynamics of seed germination, seedling growth and physiological responses of sweet corn under peg-induced water stress. Pakstan Journal of Botanical [Internet]. 2017;49(2):639-46. Available from: https://www.pakbs.org/pjbot/PDFs/49(2)/33.pdf ). On the other hand, the decrease in the content of reducing sugars may also be associated with a higher utilization of these compounds, due to an increase in respiration in these seedlings (3838. Yasseen B, Al-Thani R, Alhady F, Abbas R. Soluble sugars in plants under stress at the arabian gulf Region: possible roles of microorganisms. J Plant Biochem Physiol [Internet]. 2018;6(224):2. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Bassam-Yasseen/publication/36208420_An_analysis_of_the_effects_of_salinity_on_leaf_growth_in_Mexican_ wheats/links/5cf31158a6fdcc8475fcea22/An-analysis-of-the-effects-of-salinity-on-leaf-growth-inMexican-wheats.pdf ). This allows the development of vital processes such as cell turnover and the synthesis of proteins, enzymes, and other compounds involved in the antistress response.

The decrease in protein content may be related to affectations in the protein biosynthesis machinery, as well as in fundamental processes such as cellular respiration, since a decrease in the respiratory rate represents a lower availability of metabolic energy for biosynthetic processes. This is consistent with the observed reduction in reducing sugar content in treatments with the highest concentrations of polyethylene glycol. In addition, a decrease in the cellular respiration process implies a lower concentration of organic acids derived from the Krebs cycle, which can serve as a basis for the synthesis of amino acids used in protein biosynthesis. The content of soluble polyphenols in the seedlings subjected to water stress is shown in Figure 4. In roots the values decreased with increasing PEG concentration. This result may be related to a reduction in the activity of enzymes involved in the biosynthetic pathway of polyphenols, especially phenylalanine ammoniolase, which plays a central role in the metabolism of these compounds. The polyphenol content in the aerial part showed greater stability with similar values between the control and treatments 3; 6 and 9 % PEG and only decreased by 12 % PEG.

These results are in correspondence with those observed in other species such as Solanum lycopersicum sp. (3939. Florido Bacallao M, Bao Fundora L. Tolerancia a estrés por déficit hídrico en tomate (Solanum lycopersicum L.). Cultivos tropicales [Internet]. 2014;35(3):70-88. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362014000300008 ), Sorghum bicolor (L.) Moench (2020. Pérez-Hernández Y, Navarro-Boulandier M, Rojas-Sánchez L, Fuentes-Alfonso L, Sosa-del Castillo M. Efecto del estrés hídrico en la germinación de semillas de Sorghum bicolor (L.) Moench cv. UDG-110. Pastos y Forrajes [Internet]. 2018;41(4):243-52. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942018000400002&script=sci_arttext&tlng=pt ) and Ocimum basilicum L. (2727. Ojeda-Silvera CM, Murillo-Amador B, Nieto-Garibay A, Troyo-Diéguez E, Ruíz-Espinoza FH, GarcíaHernández JL. Emergencia y crecimiento de plántulas de variedades de albahaca (Ocimum basilicum L.) sometidas a estrés hídrico. Ecosistemas y recursos agropecuarios [Internet]. 2015;2(5):151-61. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-90282015000200003 ). The stability in contents of these compounds in the aerial part may constitute an antioxidant defense mechanism associated with the synthesis of polyphenols and the movement of soluble phenols to the upper tissues of the plant, where a greater susceptibility to water stress was evidenced. In plants, polyphenols may play an important role in the antioxidant system. These compounds decrease the production of reactive oxygen species by reducing the rate of the Fenton reaction by which ROS are formed when hydrogen peroxide reacts with transition metals. This is because phenolic compounds have the ability to donate electrons to the enzyme guaiac peroxidase for the elimination of hydrogen peroxide, and on the other hand, they can also chelate toxic metals (4040. Rice-Evans C, Miller N, Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in plant science [Internet]. 1997;2(4):152-9. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1360138597010182 ,4141. Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC, Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology [Internet]. 2002;177(1):67-80. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0300483X02001968 ).