Introducción

Desde que se iniciaron las actividades agrícolas, hace más de 10 000 años, el hombre ha manipulado la estructura genética de las plantas y animales, a través de numerosos ciclos de selección de los individuos mejores adaptados. Lo anterior ha traído consigo que la mayoría de las plantas que hoy en día se cultivan, sean distintas de sus antepasados silvestres (11. Berger J, Pushpavalli R, Ludwig C, Parsons S, Basdemir F, Whisson K. Wild and domestic differences in plant development and responses to water deficit in Cicer. Frontiers in Genetics [Internet]. 2020;11. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7746823/ ).

Actualmente, los objetivos de los mejoradores, en comparación con nuestros agricultores antepasados, siguen teniendo la misma misión; es decir, producir cultivos con mayor rendimiento, más resistentes y de mejor adaptación a las distintas localidades.

Uno de los principales requisitos para comenzar un programa de mejora es contar con la variabilidad genética necesaria para identificar genotipos potenciales para su uso como progenitores. Numerosos factores favorecen la diversidad genética, tales como: la reproducción sexual; las mutaciones; el flujo genético y, por supuesto, la acción del hombre mediante la selección artificial e hibridación (22. Carrodeguas-Gonzalez A, Orozco AZ. Bases para la mejora genética en Gerbera hybrida. Repertorio Científico [Internet]. 2020;23(2):51-62. Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/view/3000 ,33. Orozco AZ, Gonzalez AC. Factores importantes como base para el mejoramiento genético en el cultivo de la piña (Anannas comosus var. comosus). Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/download/2998/4274?inline=1 ).

Después de generar variabilidad genética, el siguiente paso es discriminar entre la variabilidad, con el fin de identificar y seleccionar individuos con características deseables para desarrollar nuevos cultivares potenciales, a eso le llamamos selección artificial. En la naturaleza, la selección natural se encarga de favorecer en las especies los genotipos más adaptados al ambiente. En la mejora genética, ocurre lo mismo, pero en este caso el mejorador es el encargado de seleccionar los genotipos que muestren mayor rendimiento o beneficios. En los primeros años del mejoramiento genético, la selección consistía en la observación del comportamiento de las plantas y la posterior elección de las que presentaran mejores atributos, lo anterior se apoyaba con distintos elementos de biología, matemática y estadística. Con el paso del tiempo y el avance de la tecnología, surgieron un gran número de técnicas que facilitan el trabajo de selección.

Los fitomejoradores convencionales, con el objetivo de ahorrar recursos y tiempo, planifican cuidadosamente los cruzamientos para generar la mayor variabilidad posible (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ); por tanto, es relevante determinar la dirección de los cruzamientos; o sea, qué variedades o líneas van a ser utilizadas como padre o como madre. Las variedades que van a ser utilizadas como donadoras de polen deben contar con polen de alta calidad y viabilidad, parámetros que se evalúan con estudios de viabilidad de polen (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Asímismo, se debe saber el momento adecuado para realizar las polinizaciones y que el polen pueda germinar en el estigma del progenitor femenino, lo que hace necesario los estudios de receptividad estigmática (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160).

Otro de los factores de gran importancia en la selección es el conocimiento sobre el número cromosómico, debido a que diferencias en la ploidía pueden evitar la reproducción sexual y, por tanto, la obtención de semillas. Aunque no siempre es así, en algunos casos sí puede ocurrir la fertilización y obtenerse genotipos de otros niveles de ploidía con un comportamiento diferencial en cuanto al carácter que se evalúa. Los estudios de cariotipo pueden realizarse por la disciplina conocida como citogenética, que se divide en citogenética clásica cuando se analizan los cromosomas bajo microscopio mediante tinciones o citogenética molecular, cuando se aplican diferentes métodos de la biología molecular (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Debido a lo antes expuesto, el objetivo de esta revisión es exponer las técnicas basadas en estudios citológicos y citogenéticos que son factibles para la selección de parentales, durante la etapa de pre-mejoramiento.

Aspectos relacionados con la calidad y la viabilidad del polen

Uno de los pasos fundamentales en un programa de mejora es determinar qué variedades o especies se van a utilizar como donadoras de polen, lo que convierte en un parámetro de gran importancia, la medida de la calidad del polen de los posibles parentales (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). En cuestión de ahorro de tiempo y recursos, no es recomendable utilizar polen de individuos que presenten baja viabilidad polínica (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ).

Dicho lo anterior, los estudios encaminados a estudiar la calidad y la viabilidad son necesarios para asegurar el éxito de las hibridaciones e incrementar la eficiencia, sobre todo en las condiciones del trópico cálido y húmedo, donde la viabilidad se puede ver fuertemente afectada por condiciones ambientales (88. González ME, Estévez A, Castillo J, Salomón J, Moré O, Hernández MM. La Calidad del polen: requisito indispensable del mejoramiento tradicional de la papa en Cuba. Revista Latinoamericana de la Papa. 2002;13(1):75-94.). Además de la importancia de estos estudios en el mejoramiento genético, también pueden ser muy útiles para determinar parámetros fisiológicos, como vigor del polen durante el almacenamiento, capacidad de germinación después de la exposición a determinadas condiciones, estudiar su interacción con el estigma y fertilidad y determinar la dispersión y flujo de genes (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ).

La viabilidad del polen es un parámetro fuertemente influenciado por condiciones ambientales como la temperatura, el grado de humedad, la composición de la atmósfera y la presión parcial de oxígeno y por diversos factores internos como: la duración de la microsporogénesis; la variabilidad genética interespecífica o el metabolismo; el número y la funcionalidad de los núcleos; la protección y la exposición dentro de las anteras; la humedad relativa y la temperatura al momento de la dispersión (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ,99. Nikkanen T, Aronen T, Häggman H, Venäläinen M. Variation in pollen viability among Picea abies genotypes-potential for unequal paternal success. Theoretical and applied genetics [Internet]. 2000;101(4):511-8. Available from: https://www.researchgate.net/publication/226790123_Variation_in_pollen_viability_among_Picea_abiesgenotypes_-_potential_for_unequal_paternal_success -1111. Davarynejad GH, Szabó Z, Nyeki J, Szabó T. Phenological stages, pollen production level, pollen viability and in vitro germination capability of some sour cherry cultivars. Asian Journal of Plant Sciences. 2008; ).

Existen diferentes técnicas para medir la viabilidad del ponen, las cuales se clasifican en métodos in vivo e in vitro. Los métodos in vivo son mucho más exactos y fiables, pero los más utilizados son los métodos in vitro, porque son más sencillos y rápidos de realizar (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ). La elección de un método u otro dependerá de la especie objeto de estudio y de los objetivos finales de la investigación. Debido a lo explicado anteriormente muchos estudios tuvieron como objetivo distinguir los métodos más apropiados para estimar viabilidad del polen. Tal es el caso de un estudio realizado en polen de trigo (1313. Impe D, Reitz J, Köpnick C, Rolletschek H, Börner A, Senula A, et al. Assessment of pollen viability for wheat. Frontiers in plant science [Internet]. 2020;10:1588. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.01588/full ); en dicho experimento, la tinción de Alexander no pudo discriminar entre polen fresco viable y polen no viable. La germinación in vitro del polen fue menor, en comparación con la viabilidad del polen evaluada por DAF y la citometría de flujo. Por tanto, es recomendable optar por un enfoque combinado de germinación in vitro con DAF o citometría de flujo, para analizar correctamente el potencial de germinación y la viabilidad del polen para el caso del trigo.

En otro estudio realizado, se compararon los métodos de cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) y germinación in vitro para medir la viabilidad de polen de Cistus creticus L. y C. monspeliensis (1414. Zampino D, Duro A, Sciandrello S, Parafati L, Restuccia C. Pollen viability and endophytic yeast species of Cistus creticus and C. monspeliensis. Plant Biosystems-An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology [Internet]. 2021;155(2):384-93. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/11263504.2020.1753844 ). Se obtuvieron diferencias significativas entre ambas pruebas y se llegó a la conclusión de que es más apropiada la prueba de germinación in vitro para el caso de estas especies. Los resultados anteriores indican que el primer caso para estimar la viabilidad del polen en una especie, es determinar cuál es el método más adecuado porque puede ser diferente en cada investigación.

Técnicas para estimar la viabilidad del polen

El método más preciso, hasta el momento, para determinar viabilidad del polen, es la germinación in vivo, mediante el cual se evalúa la elongación del tubo polínico para llevar a cabo su función como polinizador y el número de semillas producidas, en relación con la viabilidad del polen; sin embargo, es necesario esperar la formación de las semillas, lo cual ralentiza el ensayo y puede ser un problema cuando se requiere una evaluación rápida (1515. Shivanna KR, Johri BM. The angiosperm pollen: structure and function [Internet]. New Delhi: Wiley Eastern; 1985. Available from: https://www.worldcat.org/title/angiosperm-pollen-structure-andfunction/oclc/13158693 ).

Entre los métodos in vitro más utilizados para evaluar la calidad del polen se encuentran las técnicas de tinción para observar el contenido citoplasmático (carmín acético, orceína acética, fármaco Alexander), los test enzimáticos (bencidina, sales de tetrazolio) y los métodos combinados que permiten determinar la integridad de la membrana plasmática y la presencia de actividad enzimática (reacción fluorocromática mediante diacetato de fluoresceína, DAF) y por último las pruebas de germinabilidad (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ).

Las pruebas de germinabilidad in vitro implican inducir la formación del tubo polínico en un medio artificial, lo cual es un indicio de viabilidad porque revela el estado de las membranas, núcleos y la tasa de conversión de las reservas (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Sin embargo, la germinación in vitro depende del genotipo, condiciones ambientales, madurez del polen, composición y pH del medio. Por las razones antes expuestas es necesario determinar las condiciones óptimas para la germinación del polen de cada especie (1616. Garduño-Tamayo NA, Núñez-Colín CA, Pecina-Quintero V, Montero-Tavera V, Montes-García N, González-Chavira MM, et al. Desarrollo de un método eficiente para la germinación in vitro de polen de sorgo. Tropical and subtropical agroecosystems [Internet]. 2011;14(3):901-6. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-04622011000300025&script=sci_arttext ). Los medios de cultivos en condición líquida y sólida, enriquecidos con sacarosa, calcio o boro son componentes de importancia para la germinación, por lo cual, los ensayos a diferentes concentraciones de estos nutrientes son relevantes para la ejecución de pruebas de viabilidad (1717. Marini GV, Arenas RO, Togno LS. Efecto de los medios de cultivo sobre la germinación in vitro de granos de polen en poblaciones de Cucurbita máxima. Horticultura Argentina [Internet]. 2010;29(70):18-21. Available from: https://www.horticulturaar.com.ar/es/articulos/efecto-de-los-medios-de-cultivo-sobre-lagerminacion-in-vitro-de-granos-de-polen-en-poblaciones-de-cucurbita-maxima.html ).

Con el objetivo de facilitar a los investigadores la elección de los componentes del medio de cultivo, investigadores de la universidad de Regensburg, Alemania, realizaron un compendio que incluye 1572 recetas de medios de cultivo utilizados con éxito para germinar granos de polen o producir tubos polínicos en 816 especies que representan 412 géneros y 114 familias (tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas) (1818. Tushabe D, Rosbakh S. A compendium of in vitro germination media for pollen research. Frontiers in Plant Science [Internet]. 2021;1412. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.709945/full ). Entre los 110 componentes registrados de las diferentes recetas, los más comunes son: sacarosa (89 % de las especies), H₃BO₃ (77 %), Ca²⁺ (59 %), Mg²⁺ (44 %) y K⁺ (39 %).

Técnicas de tinción para determinar viabilidad polínica

Los métodos de tinción detectan la presencia de citoplasma, integridad de la membrana plasmática o actividad enzimática (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). La mayoría se basan en la afinidad de las células por determinados colorantes y, generalmente, sobreestiman la viabilidad o escasamente determinan el poder germinativo real de los granos de polen o la capacidad de extensión de los tubos polínicos, pero a su vez, son rápidos y factibles de desarrollar cuando se realizan muchos cruzamientos (1919. Buiza J del VI, Ramírez YC. Durability of the Pollen Germinative Capacity in Aloe Vera (L.) Burm. f. and A. Saponaria Haw. 2006; Available from: https://tspace.library.utoronto.ca/handle/1807/45368 ,2020. Burke IC, Wilcut JW, Allen NS. Viability and in vitro germination of johnsongrass (Sorghum halepense) pollen. Weed technology [Internet]. 2007;21(1):23-9. Available from: https://www.cambridge.org/core/journals/weed-technology/article/abs/viability-and-in-vitro-germinationof-johnsongrass-sorghum-halepense-pollen/C1F1C8F18E70CD2F3CF2280AD92CCD3C ). A continuación, se exponen las técnicas de tinción más utilizadas para estimar la viabilidad del polen:

Carmín acético: esta prueba mide la integridad del citoplasma; es decir, los granos de polen se colorean de color rojo cuando la membrana citoplasmática se encuentra íntegra y los granos de polen sin teñir se consideran no viables (2121. Lata S, Sharma G, Garg S, Mishra G. Pollen Viability, Germination and Stigma Receptivity Studies in different Strawberry cultivars. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Suman-Lata-5/publication/343341468_Article2/links/5f240f6d458515b729f5f447/Article2.pdf ,2222. Srinivasan S, Gaur PM. Genetics and characterization of an open flower mutant in chickpea. Journal of Heredity [Internet]. 2012;103(2):297-302. Available from: https://academic.oup.com/jhered/article/103/2/297/885695?login=true ). El acetocarmín sobrestima la viabilidad del polen, pero da información adicional de la morfología nuclear. En un estudio realizado en ocho accesiones de pimiento en la Universidad Federal do Piauí, Brasil, el método con una concentración del reactivo del 2 % resultó ser eficaz (2323. De Jesus L, Silva RNO, Gomes MDC, Valente SDS, Gomes RLF, Lopes ADA, et al. Efficiency of colorimetric tests to determine pollen viability in peppers. Revista Brasileira De Agropecuária Sustentável (RBAS) [Internet]. 2018;8(2):77-82. Available from: https://pdfs.semanticscholar.org/f7ac/d829ac6180ca3a8cc93bdd99ffd293f48b5f.pdf ).

Tinción Alexander: este método permite diferenciar el polen abortado del polen viable. Dentro de los componentes de esta solución, el colorante verde de malaquita tiñe específicamente la pared celular, mientras el ácido fucsínico penetra las células vivas y colorea el citoplasma de rojo (Figura 1). El polen abortado aparece de color verde, ya que sólo retiene su pared celular, al tiempo que los granos de polen viables presentan además una coloración rojiza en su interior (2424. Alexander MP. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. Stain technology [Internet]. 1969;44(3):117-22. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10520296909063335 ). El método resultó ser eficiente al estimar la viabilidad del polen en 11 especies silvestres de Passiflora, con una concentración del reactivo del 2 % (2525. Ferreira M dos S, Soares TL, Costa EMR, Silva RL da, Jesus ON de, Junghans TG, et al. Optimization of culture medium for the in vitro germination and histochemical analysis of Passiflora spp. pollen grains. 2021; Available from: https://pubag.nal.usda.gov/catalog/7408515 ).

Tripán azul: esta prueba se basa en el hecho de que cuando la membrana plasmática de la célula está intacta, el colorante no puede introducirse al citoplasma; por tanto, los granos viables no se tiñen, mientras que los no viables se colorean de azul-violeta intenso, porque el colorante sí penetra, uniéndose a las proteínas presentes dentro de la célula. Generalmente esta tinción ha sido utilizada en estudios de viabilidad de células cultivadas (2626. Gratao PL, Pompeu GB, Capaldi FR, Vitorello VA, Lea PJ, Azevedo RA. Antioxidant response of Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 cells to cadmium and nickel stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture [Internet]. 2008;94(1):73-83. Available from: https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/48839097/Antioxidant_response_of_Nicotiana_tabacu20160914-745-zl4c97.pdf?1473881523=&response-contentdisposition=inline%3B+filename%3DAntioxidant_response_of_Nicotiana_tabacu.pdf&Expires=1637822170&Signature=BcXvIIkpxJwynB8O2aFPf~fyVk8LeFHrzJKyTDouGcRdq4zzpxRWYy2Xg8jSfEoFg2jkkO5tSViPJLwLLfpLv9j6qNwlMhbt7hc2fsTf1LLsK33Te38jedreDP-Yq7J-FH-d~UrCVud39qX8m59~1cN1BA1SEy3lSszEjNuMEHLMEDYapFXokEjciBCIC0IbbkeBX4rqwG1LXtZZVCygRUM1OYbXG6hZRNRbr3l0nwx8Kw573fAmdVLFZrt6B7k9bJGdohIYa~ZVGepY1mercYM7Mq2D9bDdiHAeDFzuio6kjFmc1i9eisvjk5kR1UT1TKq3Y7CeWv6zTVub~0KBnA__&Key-PairId=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA ) y recientemente ha sido aplicada para la viabilidad polínica. Este método fue aplicado para estimar la viabilidad del polen en diferentes cultivares de olivo, los autores reportaron una correlación significativa entre germinabilidad y este test de viabilidad, lo que indica que es adecuado en el caso de esta especie (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ).

Técnicas para comprobar actividad enzimática en el polen

Las técnicas que se exponen a continuación permiten detectar la existencia de actividad enzimática en el polen, mediante cambios de coloración en las células:

Sal de tetrazolium: este método se basa en el uso del compuesto (cloruro de 2, 3, 5,-trifenil-tetrazolio), el cual, en los procesos de reducción de las células vivas, toma el hidrógeno liberado por las enzimas deshidrogenasas y forma una sustancia roja, estable y no difusible, el trifenil-formazan. Por tanto, el polen viable que tiene actividad deshidrogenasa se tiñe de color rojo, mientras que el no viable no logra teñirse (2727. Moore RP. Handbook on tetrazolium testing. In International Seed Testing Association Zurich; 1985. Available from: https://www.seedtest.org/en/handbooks-_content---1--3422.html ). Este método fue utilizado para analizar los efectos de las bajas temperaturas de almacenamiento sobre la calidad del polen obtenido de cuatro cultivares de cereza dulce, mostrando resultados satisfactorios con una concentración del reactivo del 1 % (2828. Özcan A. Effect of Low-temperature storage on sweet cherry (Prunus avium L.) pollen quality. HortScience [Internet]. 2020;55(2):258-60. Available from: https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/55/2/article-p258.xml ).

Parafenilendiamina: esta prueba utiliza como reactivo la parafenilendiamina (p-fenilendiamina) y se basa en la detección de la presencia de peroxidasas (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Los granos de polen que se tiñen de color café oscuro son considerados viables, los de color café claro, no viables. Se recomienda para futuros trabajos, realizar una cartilla donde se relacione el color de los granos de polen con el porcentaje de germinación obtenido en una muestra determinada, ya que la coloración puede variar con el tiempo de almacenamiento, según los resultados obtenidos por García en Nothofagus nervosa (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ).

Métodos combinados para determinar la integridad de la membrana plasmática y la presencia de actividad enzimática

Los métodos combinados estiman la viabilidad polínica comprobando la integridad de la membrana y la presencia de actividad enzimática en el citoplasma, al mismo tiempo. A continuación, se exponen las técnicas más utilizadas:

Reacción fluorocromática mediante DAF: este método es uno de los más utilizados en estudios de viabilidad del polen. El DAF es un éster apolar, lo que le permite atravesar la membrana citoplasmática. Una vez dentro de la célula, el éster es hidrolizado por enzimas esterasas que se encuentran en el citoplasma y deja libre un fluorocromo, que cuando se excita con una longitud de onda adecuada (490 nm), emite fluorescencia de color verde brillante. Como el fluorocromo es polar, no puede salir a través de la membrana citoplasmática y queda retenido en las células que poseen la membrana citoplasmática intacta. Como consecuencia, sólo los granos de polen con niveles de actividad esterasa adecuados y con la membrana citoplasmática íntegra, mostrarán fluorescencia verdosa, indicativa de que estos granos son viables (2929. Heslop‐Harrison Y, Reger BJ, Heslop‐Harrison J. The pollen‐stigma interaction in the grasses. 6. The stigma (‘silk’) of Zea mays L. as host to the pollens of </i>Sorghum bicolor</i> (L.) Moench and Pennisetum americanum (L.) Leeke. Acta Botanica Neerlandica [Internet]. 1984;33(2):205-27. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1438-8677.1984.tb01799.x ). Este método fue aplicado con éxito para estimar la viabilidad del polen en Flaveria bidentis y F. haumanii en Santiago del Estero (Argentina) (3030. Páez V de los A, Andrada AR, Sobrero MT, Chaila S. Caracterización citológica en Flaveria bidentis y F. haumanii (Asteraceae). Acta botánica mexicana [Internet]. 2020;(127). Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S0187-71512020000100109&script=sci_abstract&tlng=pt ).

Reacción de diacetato de fluoresceína (FCR): esta prueba funciona muy parecido al DAF. Los granos de polen son montados en diacetato de fluoresceína, que es un compuesto apolar que, igual al DAF, penetra rápidamente en el citoplasma polínico y es hidrolizado por esterasas, dejando libre la fluoresceína polar y fluorescente (3131. Passarelli LM. Relación entre la germinación del polen" in vitro", reacción fluorocromática y tinción con azul de algodón en lactofenol, en dos especies de Solanum sec. Cyphomandropsis. Publicación Electrónica de la Asociación Paleontológica Argentina [Internet]. 1999;6(1). Available from: https://www.peapaleontologica.org.ar/index.php/peapa/article/view/209 ).

Aspectos de Biología Floral de importancia para la mejora genética de plantas

Para el mejoramiento genético clásico, basado en la selección de individuos superiores y cruzamientos dirigidos, es importante conocer aspectos de la biología floral de la especie vegetal estudiada. Para obtener éxito en las fecundaciones, no solo es necesario estimar la calidad del polen de la especie que se utiliza como progenitor masculino, sino también en qué momento el estigma del progenitor femenino se encuentra receptivo, para lo cual se realizan estudios de receptividad estigmática. Asimismo, es necesario conocer si existe autoincompatibilidad en la especie que se trabaja, en caso de que se requiera hacer auto-polinizaciones para obtener líneas puras. Para lo anterior son necesarios los estudios del crecimiento del tubo polínico, para conocer el lugar en que ocurre la autoincompatibilidad y buscar la manera de evadir esta barrera.

Receptividad estigmática

La receptividad estigmática refleja la capacidad del estigma para recibir el polen, permitiendo que se adhiera, se hidrate y finalmente germine (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160). La polinización consiste en la transferencia de polen desde los órganos sexuales masculinos a los órganos sexuales femeninos, pero para que este proceso ocurra, la transferencia del polen al estigma debe suceder durante el periodo en que el estigma se encuentre receptivo, en caso contrario, el polen no puede adherirse y no puede germinar (3232. Kearns CA, Inouye DW. Techniques for pollination biologists. [Internet]. University press of Colorado; 1993. Available from: https://upcolorado.com/university-press-of-colorado/item/1694-techniques-for-pollinationbiologists ,3333. Márquez Guzmán J. Biología de angiospermas [Internet]. [cited 24/11/2021]. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Jorge-Meave/publication/281348069_Vegetacion_caracterizacion_y_factores_que_determinan_su_distribucion/links/55edabb908ae0af8ee187ea9/Vegetacion-caracterizacion-y-factores-que-determinan-su-distribucion.pdf ).

En la naturaleza; generalmente, una vez que las flores abren, el estigma se encuentra receptivo, pero en el caso del mejoramiento genético, muchas veces prevalece la necesidad de realizar las polinizaciones dirigidas en estados de pimpollo. Lo anterior se hace con el objetivo de realizar la polinización en el mismo momento de la castración, evitando la contaminación con granos de polen ajenos al que se utiliza como parental (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160). En la madurez floral, cuando los estigmas están listos para la polinización, estos se caracterizan por tener gran actividad de enzimas peroxidasas; por ello, con la finalidad de determinar la receptividad del estigma, se utiliza peróxido de hidrógeno para comprobar la presencia de enzimas cuando se produce burbujeo (3434. Yang R, Wang J, Gao W, Jiang Y, Su J, Sun D, et al. Research on the reproductive biological characteristics of Amomum villosum Lour. and Amomum longiligulare TL Wu. Plos one [Internet]. 2021;16(8):e0250335. Available from: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0250335 ) (Figura 2). Existe un criterio de puntuación para convertir la receptividad estigmática en una variable cuantitativa y así hallar la receptividad promedio por día evaluado, para lo cual se propusieron cuatro niveles de burbujeo (3535. Bazo I, Espejo R, Palomino C, Flores M, Chang M, López C, et al. Estudios de biología floral, reproductiva y visitantes florales en el" Loche" de Lambayeque (Cucurbita moschata DUCHESNE). Ecología Aplicada [Internet]. 2018;17(2):191-205. Available from: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-22162018000200007 ).

La receptividad estigmática puede verse afectada por condiciones ambientales, como la temperatura, aplicación de productos químicos y la nutrición de las plantas, aunque generalmente, en los estudios encaminados a este tema, la parte masculina ha sido la que más atención ha recibido. Se ha comprobado que, en condiciones de campo, la temperatura, a través de su efecto sobre la receptividad estigmática, afecta al periodo efectivo de polinización y al cuajado en varias especies frutales, como el albaricoquero (3636. Burgos L, Egea J, Dicenta F. Effective pollination period in apricot (Prunus armeniaca L.) varieties. Annals of Applied Biology [Internet]. 1991;119(3):533-9. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.1991.tb04892.x ,3737. Egea J, Burgos L, Garcia JE, Egea L. Stigma receptivity and style performance in several apricot cultivars. Journal of Horticultural science [Internet]. 1991;66(1):19-25. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00221589.1991.11516120 ) o kiwi (3838. González MV, Coque M, Herrero M. Stigmatic receptivity limits the effective pollination period in kiwifruit. Journal of the American Society for Horticultural Science [Internet]. 1995;120(2):199-202. Available from: https://journals.ashs.org/jashs/view/journals/jashs/120/2/article-p199.xml ). En el melocotonero se demostró que en condiciones controladas la temperatura tuvo una gran influencia en la duración de la receptividad estigmática, la cual disminuye con el aumento de esta. La pérdida de receptividad estigmática se manifestó en tres procesos consecutivos: adherencia del polen al estigma, germinación y penetración en el tejido transmisor. La pérdida de estas capacidades es paulatina, primero se pierde la capacidad de penetrar el tejido transmisor; de segundo, la germinación y finalmente la adherencia del polen al estigma (3939. Hedhly A, Hormaza JI, Herrero M. Efecto de la temperatura sobre la duración de la receptividad estigmática en melocotonero (Prunus persica L. Batsch). 2000; Available from: https://www.aida-itea.org/aidaitea/files/jornadas/2000/comunicaciones/2000_FyF_01.pdf ).

Sistemas de incompatibilidad en las Plantas

En la mejora genética tradicional es fundamental contar con líneas puras para realizar híbridos uniformes; sin embargo, el desarrollo de líneas puras demanda realizar autopolinizaciones, para inducir un cambio en la frecuencia alélica y lograr la homocigosis. Según lo anterior, se asume que todas las especies vegetales pueden ser capaces de autopolinizarse; sin embargo, la realidad no es así, pues la autoincompatibilidad está presente en más de la mitad de las especies de Angiospermas. En el caso de las plantas autógamas, la obtención de líneas puras es fácil, debido a que la autopolinización ocurre a gran medida; no obstante, se plantea que tienen, a polinización abierta, un 5 % de alogamia. En las plantas alógamas producto a los mecanismos de autoincompatibilidad, muchas veces se dificulta la autopolinización (4040. Cropano C, Place I, Manzanares C, Do Canto J, Lübberstedt T, Studer B, et al. Characterisation and practical use of self-compatibility in outcrossing grass species. Annals of Botany [Internet]. 2021; Available from: https://www.research-collection.ethz.ch/bitstream/handle/20.500.11850/483774/1/mcab043.pdf ).

Los mejoradores recurren a diversas técnicas como la polinización entre plantas hermanas (full sibs) o medias hermanas (half sibs), retrocruces o inducción de variabilidad, realizando diseños dialélicos con diversas especies compatibles y, si lo anterior no resulta exitoso, es entonces cuando se recurre a técnicas biotecnológicas para superar barreras de auto-incompatibilidad pre o poscigóticas, inducción de haploides, entre otras.

La autopolinización no es posible, en muchas especies vegetales, debido a un mecanismo conocido como autoincompatibilidad. Este mecanismo asegura la variabilidad genética, evitando la depresión por endogamia y promoviendo la polinización cruzada, por lo que su efectividad asegura el éxito de la evolución de las especies (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ). Como parte de la evolución, para promover la polinización cruzada, varias especies hermafroditas desarrollaron adaptaciones morfológicas como; por ejemplo, la separación espacial del pistilo y los estambres (hercogamia) y fisiológicas, como la maduración diferencial de los órganos reproductivos (dicogamia). Estas modificaciones evitan, en gran medida, la autofecundación y promueven la polinización cruzada, pero aún existe la posibilidad de flujo génico, a través del polen con los padres o con otros individuos de la progenie. Para evitar dicho suceso, un gran número de especies desarrollaron un mecanismo genético-bioquímico de reconocimiento del polen, conocido como sistema de incompatibilidad sexual (AI), el cual se define como la incapacidad de una planta hermafrodita fértil para producir cigotos después de la autopolinización (4040. Cropano C, Place I, Manzanares C, Do Canto J, Lübberstedt T, Studer B, et al. Characterisation and practical use of self-compatibility in outcrossing grass species. Annals of Botany [Internet]. 2021; Available from: https://www.research-collection.ethz.ch/bitstream/handle/20.500.11850/483774/1/mcab043.pdf ).

Clasificación de los sistemas de incompatibilidad

Los sistemas de incompatibilidad han sido clasificados en función del genotipo que la determina, si está determinada por el genotipo haploide del polen, se le llama incompatibilidad gametofítica; si en cambio, es por el genotipo diploide de la planta que le da origen al polen, se le denomina incompatibilidad esporofítica (4242. Herrera S, Lora J, Hormaza JI, Rodrigo J. Determination of Self-and Inter-(in) compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. JoVE (Journal of Visualized Experiments) [Internet]. 2020;(160):e60241. Available from: https://www.jove.com/es/t/60241/determination-self-inter-compatibility-relationships-apricot ). La autoincompatibilidad puede expresarse en el estigma, el estilo o en el ovario de la flor, debido a una acumulación de calosa en la punta de los tubos polínicos y, por tanto, se impide la elongación de los tubos polínicos en algún punto de su trayectoria hasta la oosfera. Esa acumulación de calosa permite diferenciar tubos polínicos compatibles e incompatibles (4343. Herrero M, Dickinson HG. Pollen tube development in Petunia hybrida following compatible and incompatible intraspecific matings. Journal of Cell Science [Internet]. 1981;47(1):365-83. Available from: https://journals.biologists.com/jcs/article/47/1/365/59007/Pollen-tube-development-in-Petunia-hybrida ,4444. Lush WM, Clarke AE. Observations of pollen tube growth in Nicotiana alata and their implications for the mechanism of self-incompatibility. Sexual Plant Reproduction [Internet]. 1997;10(1):27-35. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Observations-of-pollen-tube-growth-in-Nicotiana-and-LushClarke/4a4e2414aa590e6e0c6d06482e14b645a1e162aa ). En el caso de la incompatibilidad gametofítica, la interrupción del crecimiento del tubo polínico ocurre en el estilo, mientras que en la esporofítica ocurre generalmente en el estigma (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ). Existe un tercer tipo de autoincompatibilidad poco estudiado que se presenta en el ovario, conocido como autoincompatibilidad de acción tardía, que se produce por la inhibición de los tubos polínicos antes de que alcancen los óvulos, inhibición de la fecundación, rechazo post-cigótico e inhibición en el óvulo (4545. Seavey SR, Bawa KS. Late-acting self-incompatibility in angiosperms. The Botanical Review [Internet]. 1986;52(2):195-219. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/BF02861001 ).

Realizar estudios de autoincompatibilidad le permiten al mejorador economizar tiempo y recursos, por cuanto puede saber cuál ruta tomar al momento de avanzar la selección de las generaciones segregantes.

Se realizaron estudios de incompatibilidad en Olea europea, con el objetivo de explicar cómo ocurre la autofecundación de algunas variedades, a pesar de ser una especie con altos grados de autoincompatibilidad. Los autores sugieren que algunos determinantes de la autoincompatibilidad en el tubo polínico y el estigma son inestables y se degradan, lo que permite que los tubos polínicos puedan llegar al óvulo y fecundarlo. Con lo anterior queda explicado que la autoincompatibilidad puede que no sea absoluta y, por tanto, pueda ocurrir cierto grado de auto-fertilización (4646. Stasiak A, Latocha P, Bieniasz M. Effect of genetically diverse pollen on pollination, pollen tube overgrow, fruit set and morphology of kiwiberry (Actinidia arguta). Agronomy [Internet]. 2021;11(9):1814. Available from: https://www.mdpi.com/2073-4395/11/9/1814 ).

Aparte de la incompatibilidad intraespecífica descrita anteriormente, existe otro mecanismo conocido como incompatibilidad interespecífica, donde el polen es rechazado por la gran disimilitud genética entre la especie donante y la especie receptora (4747. Wheeler MJ, Franklin‐Tong VE, Franklin FCH. The molecular and genetic basis of pollen-pistil interactions. New Phytologist [Internet]. 2001;151(3):565-84. Available from: https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.0028-646x.2001.00229.x ). Muchas veces esto ocurre porque el polen no puede nutrirse de la matriz extracelular del tejido materno (1616. Garduño-Tamayo NA, Núñez-Colín CA, Pecina-Quintero V, Montero-Tavera V, Montes-García N, González-Chavira MM, et al. Desarrollo de un método eficiente para la germinación in vitro de polen de sorgo. Tropical and subtropical agroecosystems [Internet]. 2011;14(3):901-6. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-04622011000300025&script=sci_arttext ) y los nutrientes propios de este no son suficientes para generar todas las sustancias necesarias para el crecimiento del tubo hasta los óvulos (2929. Heslop‐Harrison Y, Reger BJ, Heslop‐Harrison J. The pollen‐stigma interaction in the grasses. 6. The stigma (‘silk’) of Zea mays L. as host to the pollens of </i>Sorghum bicolor</i> (L.) Moench and Pennisetum americanum (L.) Leeke. Acta Botanica Neerlandica [Internet]. 1984;33(2):205-27. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1438-8677.1984.tb01799.x ). Este proceso muchas veces imposibilita la hibridación, lo que hace necesario saber en qué momento se genera la interrupción del crecimiento del tubo polínico para poder tomar decisiones. Este tipo de incompatibilidad se ha estudiado en Solanaceae, donde el cese del crecimiento del tubo polínico ocurre a lo largo del estilo (4444. Lush WM, Clarke AE. Observations of pollen tube growth in Nicotiana alata and their implications for the mechanism of self-incompatibility. Sexual Plant Reproduction [Internet]. 1997;10(1):27-35. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Observations-of-pollen-tube-growth-in-Nicotiana-and-LushClarke/4a4e2414aa590e6e0c6d06482e14b645a1e162aa ), como ocurre en la autoincompatibilidad gametofítica (4848. Liedl BE, Anderson NO. Reproductive barriers: identification, uses and circumvention. Plant Breed Rev [Internet]. 1993;11:11-154. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=by8K32RdKmYC&oi=fnd&pg=PA11&dq=Reproductive+barriers:+Identification,+uses+and+circumvention&ots=R0TFVM4DV-&sig=OgUQ3u8T0CZaiRN63RwCGV8cGPA#v=onepage&q=Reproductive%20barriers%3A%20Identifiation%2C%20uses%20and%20circumvention&f=false ); por tanto, es lógico pensar que ambos procesos de reconocimiento podrían ser similares (4949. Milicia VJ, Coviella MA, Facciuto G, Soto MS. Relación tubo polínico/pistilo en cruzamientos interespecíficos en el género Nierembergia (Solanaceae). Chilean Journal of Agricultural & Animal Sciences [Internet]. 2015;31(1):53-60. Available from: http://revistas.udec.cl/index.php/chjaas/article/view/6247 ). Se realizó un estudio en Nierembergia de cruzamientos interespecíficos, en el cual se detectó diferentes patrones de incompatibilidad pre-cigótica. Los estudios de la relación estigma-polen/estilo-tubo polínico demostraron que la incompatibilidad interespecífica se manifiesta por la inhibición del crecimiento del tubo polínico, en diferentes niveles del estilo. En ningún caso se encontraron signos de incompatibilidad a nivel del estigma (4949. Milicia VJ, Coviella MA, Facciuto G, Soto MS. Relación tubo polínico/pistilo en cruzamientos interespecíficos en el género Nierembergia (Solanaceae). Chilean Journal of Agricultural & Animal Sciences [Internet]. 2015;31(1):53-60. Available from: http://revistas.udec.cl/index.php/chjaas/article/view/6247 ).

Para observar el desarrollo del tubo polínico se colectan pistilos en intervalos de un día después de la autopolinización o polinización cruzada, hasta más menos cuatro días después de la polinización. La técnica consiste en teñir los pistilos con azul de anilina, ya que este compuesto reacciona con la calosa del polen y, por tanto, se puede ver el recorrido del tubo polínico, a través del estilo en un microscopio de fluorescencia. Para analizar en qué parte del pistilo ocurre la interrupción del tubo polínico, se divide el pistilo en cuatro partes: estigma, primera mitad del estilo, segunda mitad del estilo y ovario (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ). En la Figura 3 se puede observar el crecimiento del tubo polínico en Alstroemeria en el estilo y el ovario.

Estudios citogenéticos para el cariotipado de especies vegetales

El cariotipado consiste en el estudio de la estructura del genoma que incluye el número cromosómico y, con ello, el nivel de ploidía, el análisis de la morfología de los cromosomas (tamaño absoluto y relativo, posición del centrómero, la ubicación y el número de satélites (5050. Sun W, Wang H, Wu R, Sun H, Li Z. Karyomorphology of three endemic plants (Brassicaceae: Euclidieae and Arabideae) from the Qinghai-Tibet Plateau and its significance. Plant Diversity [Internet].2020;42(3):135-41. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468265920300196 ). A la hora de seleccionar parentales para los cruzamientos en un programa de mejora, es importante tener conocimiento sobre el número cromosómico. Si se trata de cultivares con diferencias en este, puede que la reproducción sexual se vea afectada y, por tanto, sea imposible la obtención de semillas.

El número cromosómico puede ser muy variable, incluso dentro de cultivares de una misma especie, como afirma un estudio realizado en morera, donde se encontraron variedades aneuploides y diploides en Morus indica (5151. Venkatesh KH. Studies on Basic Chromosome Number, Ploidy Level, Chromosomal Association and Configuration and Meiotic Behavior in Mulberry (Morus Spp.). In: Cytogenetics-Classical and Molecular Strategies for Analysing Heredity Material [Internet]. IntechOpen; 2021. Available from: https://www.intechopen.com/chapters/76236 ). Se puede dar el fenómeno de poliploidía y, por tanto, pueden surgir nuevos números básicos que no tengan relación directa con los ancestrales, debido a nuevas reestructuraciones o hibridación entre poliploides con distintos números básicos. Además, es difícil deducir diferencias en la ploidía sin un análisis citogenético, porque variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios en el fenotipo (5252. Poggio L, González G, Ferrari M, García A, Wulff A, Greizerstein E, et al. Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Biotecnología y mejoramiento vegetal II. Argentina: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) [Internet]. 2010;379-80. Available from: https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/BiotecnologiayMejoramientovegetalII.pdf ). Estudios de cariotipo pueden realizarse por la disciplina conocida como citogenética, la cual trata sobre la estructura y el comportamiento de los cromosomas, así como de las implicaciones genéticas derivadas de su estudio (5353. Flavell RB. Perspective: 50 years of plant chromosome biology. Plant Physiology [Internet]. 2021;185(3):731-53. Available from: https://academic.oup.com/plphys/article/185/3/731/6144805?login=true ). En los últimos 20 años, los estudios citogenéticos se han enfocado en la estructura y la evolución del genoma de diferentes especies vegetales, tanto silvestres como cultivadas (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). Mediante análisis citogenéticos se genera conocimiento básico sobre el número y la forma de los cromosomas para subsecuentes estudios enfocados al aprovechamiento de la diversidad biológica, con fines para el mejoramiento (5454. Alcántar Vázquez JP. La poliploidía y su importancia evolutiva. REPOSITORIO NACIONAL CONACYT [Internet]. 2014; Available from: http://repositorio.utm.mx/handle/123456789/310 ). Este tipo de estudios se realizó en diversos cultivos como Triticum aestivum (5555. Jiao Z, Zhu X, Li H, Liu Z, Huang X, Wu N, et al. Cytological and molecular characterizations of a novel 2A nullisomic line derived from a widely-grown wheat cultivar Zhoumai 18 conferring male sterility. PeerJ [Internet]. 2020;8:e10275. Available from: https://peerj.com/articles/10275/ ), Dipteryx alata (5656. Antunes AM, Targueta CP, Castro AA, Souza G, Soares TN, Telles MPC. Genome size and chromosome number of Dipteryx alata (Leguminosae): a model candidate for comparative genomics in Papilionoideae. Available from: https://www.geneticsmr.com/sites/default/files/articles/year2020/vol19-3/pdf/gmr18640_-_genome-size-and-chromosome-number-dipteryx-alata-leguminosae-model-candidate-comparative.pdf ) e Hibiscus rosa-sinensis (5757. Celinna M, Miranda PA, Rachma I, Salamah A. Chromosome analysis of Hibiscus rosa-sinensis using CHIAS IV software. In: IOP Conference Series: Earth and Environmental Science [Internet]. IOP Publishing; 2020. p. 012004. Available from: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/524/1/012004/meta ).

La citogenética se divide en citogenética clásica y molecular. La primera incluye los estudios citológicos en los cuales se analizan los cromosomas bajo microscopio, durante la metafase de la mitosis o meiosis.

La citogenética molecular podría considerarse la fusión entre la citogenética clásica y la biología molecular. Esta disciplina agrupa un conjunto de técnicas que aplican diferentes métodos de la biología molecular, directamente sobre preparaciones citológicas, tales como tejidos, células, cromosomas y fibras de ADN (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Citogenética clásica

La citogenética clásica consiste en observar en un miscroscopio las características cromosómicas en células que se encuentren en la metafase de la mitosis o la meiosis. Con dicho objetivo se utilizan células de la raíz, en el caso de que se quiera analizar mitosis o gametos en el caso de meiosis.

Determinación del número cromosómico durante la mitosis

El ciclo celular comprende cuatro fases secuenciales ordenadas, que distinguen temporalmente la replicación del material genético de la segregación de cromosomas duplicados en dos células hijas. Las fases G1 y G2 son denominadas como "huecos", por la palabra en inglés "gaps", porque en el núcleo de la célula en estas etapas no ocurren procesos muy visibles. Sin embargo, las células están muy activas realmente, ya que están creciendo y se están preparando para la división. La fase S se refiere a la síntesis, en la que el ADN es copiado o replicado y la fase M a la mitosis (5858. Van’t Hof J. Control points within the cell cycle. The cell division cycle in plants [Internet]. 1985;1-13. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=Mqk8AAAAIAAJ&oi=fnd&pg=PA11IA2&dq=Control+points+within+the+cell+cycle.+In+Bryant+JA,+Francis+D,+editors.+The+Cell+Division+Cycle+in+Plants&ots=IG0C_x_qUt&sig=4kjuUZ7d0uSl1Apfw096oN-EUfU#v=onepage&q=Control%20points%20within%20the%20cell%20cycle.%20In%20Bryant%20JA%2C%20Francis%20D%2C%20editors.%20The%20Cell%20Division%20Cycle%20in%20Plants&ots=IG0C_x_qUt&sig=4kjuUZ7d0uSl1Apfw096oN-EUfU#v=onepage&q=Control%20points%20within%20the%20cell%20cycle.%20In%20Bryant%20JA%2C%20Francis%20D%2C%20editors.%20The%20Cell%20Division%20Cycle%20in%20Plants&f=false ). En la Figura 4 se pueden observar las diferentes fases del ciclo celular.

La mitosis se divide en cinco fases: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Durante la metafase los cromosomas se hayan dispuestos hacia la placa ecuatorial y es el momento adecuado para el conteo de cromosomas (5959. Ojea N. Biología: conceptos básicos [Internet]. 1a ed.-Santa Fe: Ediciones UNL, 2020; 2020. Available from: https://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8443/handle/11185/5549 ). En la Figura 5 se pueden observar las diferentes fases de la mitosis en un tejido meristemático de Altroemeria, en un experimento desarrollado por los autores en el Instituto de floricultura de Argentina, donde en la metafase los cromosomas son perfectamente visibles.

En los primeros estudios de cariotipado, los citólogos, con el fin de observar los cromosomas bajo el microscopio óptico, fijaban los tejidos meristemáticos en bloques de parafina y después realizaban cortes al micrómetro. En su momento, esta tecnología ofreció buenos resultados, hasta el surgimiento de la técnica del aplastado de puntas de raíz conocido como “squash” (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

Los cromosomas se encuentran en las células de todos los organismos, pero son visibles cuando estas se encuentran en división mitótica o meiótica. En caso de que se desee analizar el número cromosómico durante la mitosis, se deben utilizar tejidos meristemáticos que se caracterizan por poseer células en constante división, con núcleos grandes (6161. Roth I. Anatomía de las plantas superiores. 1966.). Los tejidos meristemáticos más utilizados por los citólogos, son los que se encuentran en la zona apical de la raíz (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

El primer paso a tener en cuenta para la determinación del número cromosómico, mediante la observación de la mitosis, es determinar la hora más adecuada para el tratamiento previo de las raíces (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.). Con este fin, se realiza un experimento para encontrar cuando se encuentra un mayor número de células metafásicas, lo cual puede ser diferente en cada localidad, debido a las condiciones ambientales (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ). Para tal fin, Valladolid, propuso fijar las raíces en la mezcla alcohol absoluto: ácido acético glacial (3:1) a diferentes horas del día, macerar y teñir las muestras para observarlas bajo el microscopio óptico y posteriormente anotar la frecuencia de interfases, profases, metafases y telofases por cada hora de colección (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

Posteriormente se procede al pretratamiento que consiste en poner en contacto la punta de la raíz con sustancias denominadas inhibidores de mitosis (Colchicina, 8-hidroxiquinolina, 1-bromonaftaleno, bajas temperaturas positivas, etc.) para obtener un mayor número de células metafásicas en el meristemo. La metafase es la etapa de la mitosis, donde los cromosomas alcanzan su máximo grado de condensación y se encuentran individualizados; por tanto, es muy fácil contarlos y caracterizarlos. Los inhibidores de mitosis evitan que se forme el huso acromático y las células no pasan a la anafase, la siguiente etapa de la mitosis (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.,6363. Darnell JE, Lodish HF, Baltimore D. Molecular cell biology [Internet]. 2nd ed. New York: Scientific American Books : Distributed by W.H. Freeman; 1990. 1105 p. Available from: https://www.goodreads.com/book/show/2721146-molecular-cell-biology ).

Los inhibidores de la mitosis también han sido utilizados para inducir poliploides con características novedosas. En un estudio llevado a cabo en Impatiens walleriana, la aplicación de colchicina al 0,05 %, produjo la mayor eficiencia de inducción tetraploide; por lo tanto, esta concentración sería un buen punto de partida para inducir tetraploides en el futuro (6464. Wang W, He Y, Cao Z, Deng Z. Induction of tetraploids in impatiens (Impatiens walleriana) and characterization of their changes in morphology and resistance to downy mildew. HortScience [Internet]. 2018;53(7):925-31. Available from: https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/53/7/articlep925.xml ). En otro estudio, se evaluó el efecto de otro inhibidor de la mitosis, la orizalina en I. walleriana y resultó ser muy efectivo para la inducción de tetraploidía (6565. Ghanbari MA, Jowkar A, Salehi H, Zarei M. Effects of polyploidization on petal characteristics and optical properties of Impatiens walleriana (Hook.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) [Internet]. 2019;138(2):299-310. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-019-01625-3 ). En ambos experimentos, las plantas tetraploides exhibieron mayor área foliar, grosor de la hoja, ancho de ovario, longitud del polen y tamaño de los estomas y mostraron disminuciones en la altura, la densidad de las células protectoras de los estomas y el número de flores.

El siguiente paso consiste en la fijación para poder interrumpir rápidamente los procesos vitales de la muestra para conservar la estructura de las células (6666. Sharma A, Sharma A. Chromosome Techniques - 3rd Edition [Internet]. 2014. [cited 25/11/2021]. Available from: https://www.elsevier.com/books/chromosome-techniques/sharma/978-0-408-70942-2 ). Después se utilizan agentes químicos o tratamientos enzimáticos (celulasas y pectinasas) para eliminar la pared celular de las células y dispersarlas. Posteriormente se tiñen los cromosomas para que sean visibles al microscopio óptico. Con dicho objetivo se utilizan tintes básicos, debido a la naturaleza ácida de la cromatina. Una vez que las células han sido teñidas, se procede al aplastado o squash, para que los cromosomas se dispersen y se sitúen en un mismo plano. Por último, se observa la muestra bajo un microscopio óptico (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.). En la Figura 6 se pueden observar los diferentes pasos para la observación de los cromosomas en metafase.

A pesar del avance de la tecnología y el surgimiento de nuevas técnicas para el cariotipado, aún el conteo cromosómico durante la mitosis se realiza en numerosos cultivos. Por ejemplo, se determinó el número cromosómico de 14 especies de Iris, mediante citogenética clásica en Korea (6767. Choi B, Weiss-Schneeweiss H, Temsch EM, So S, Myeong H-H, Jang T-S. Genome size and chromosome number evolution in Korean Iris L. species (Iridaceae Juss.). Plants [Internet]. 2020;9(10):1284. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/9/10/1284 ).

Determinación del número cromosómico en meiosis

En las plantas superiores, la meiosis solo tiene lugar en las células madres de los granos de polen ubicados en el microsporófilo (gimnospermas) o en la antera (angiospermas) y en las células madres de las megásporas que se encuentran en el óvulo (gimnospermas y angiospermas). Al igual que en la mitosis, para analizar el número cromosómico durante la meiosis, se realiza durante la metafase I o la metafase II. Si se realiza durante esta última es importante tener en cuenta que el número cromosómico se encuentra reducido a la mitad (6868. Megías M, Molist P, Pombal M. Atlas de histología animal y vegetal. Tejidos vegetales: Conducción. Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud. Universidad de Vigo. 14pp [Internet]. 2017; Available from: https://pepm-sal.infd.edu.ar/sitio/wp-content/uploads/2020/04/atlas-celula-01introduccion.pdf ) (Figura 7).

Estudios del comportamiento cromosómico durante la meiosis pueden detectar anormalidades en los cromosomas que afectan la fertilidad de la planta. Por ejemplo, se desarrolló un estudio en tres especies del género Capsicum, donde se observaron diferentes anomalías meióticas, que pueden interrumpir el proceso de división celular creando diferentes números cromosómicos y disminuyendo la fertilidad del polen. Se observaron las siguientes variaciones del número de cromosomas: 2n=2x=24, 2n=2x=26, 2n=4x=48 a 2n=6x=72 (6969. Souza-Macedo V de, García-Dávila MA, Castro GR de, Garzón-Bautista YM, Caetano CM. Cytogenetic evaluation of chili (Capsicum spp., Solanaceae) genotypes cultivated in Valle del Cauca, Colombia. Acta Agronómica [Internet]. 2017;66(4):612-7. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-28122017000400612 ).

Citogenética molecular para el análisis cromosómico

Como se había comentado anteriormente, para el desarrollo de un programa de mejora genética, un paso clave es la caracterización cariotípica de los cultivares que van a ser utilizados como progenitores. Actualmente en los laboratorios bien equipados se pueden realizar técnicas mucho más factibles que la citogenética clásica, como son: la citometría de flujo, hibridación fluorescente in situ (FISH) e hibridación genómica in situ (GISH) (22. Carrodeguas-Gonzalez A, Orozco AZ. Bases para la mejora genética en Gerbera hybrida. Repertorio Científico [Internet]. 2020;23(2):51-62. Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/view/3000 ).

Estas técnicas se agrupan en una disciplina conocida como citogenética molecular, la cual se define como la fusión entre la citogenética clásica y la biología molecular (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Citometría de flujo para el estudio cromosómico

La citometría de flujo es una herramienta potente para el análisis del contenido de ADN nuclear (en sus valores relativos o absolutos) de células vegetales (7070. Heller FO. DNA-MEASUREMENT OF VICIA-FABA L WITH PULSE CYTOPHOTOMETRY. Berichte Der Deutschen Botanischen Gesellschaft. 1973;86(5-9):437-41.). Consiste en analizar partículas que fluyen en una suspensión líquida, debido a las propiedades ópticas (dispersión de la luz y fluorescencia) (7171. Dolezel J. Application of flow cytometry for the study of plant genomes. Journal of applied Genetics [Internet]. 1997;38(3). Available from: http://yadda.icm.edu.pl/yadda/element/bwmeta1.element.agroarticle-65186f6b-a55c-4ced-b381-357e1716f2a5 ). Desde los años 80 ha aumentado de manera exponencial, el espectro de aplicaciones de la citometría de flujo análisis del genoma vegetal; por tanto, constituye una técnica rutinaria utilizada en numerosos laboratorios de todo el mundo (7272. Loureiro JCM. Flow cytometric approaches to study plant genomes [Internet]. Universidade de Aveiro (Portugal); 2007. Available from: https://www.proquest.com/openview/3f8407d8f62e907a61eb6266a5ca4dbe/1?pqorigsite=gscholar&cbl=2026366 ). La citometría de flujo permite saber la cantidad de núcleos, previamente aislados y marcados con un fluorocromo, existentes en cada fase del ciclo celular (G0/G1, S y G2/M). Primeramente, las medidas de fluorescencia de los núcleos son expresadas en una escala arbitraria, después se compara con la fluorescencia de núcleos aislados de un estándar de referencia con tamaño de genoma conocido para estimar el contenido de ADN nuclear de un determinado individuo o tejido (7272. Loureiro JCM. Flow cytometric approaches to study plant genomes [Internet]. Universidade de Aveiro (Portugal); 2007. Available from: https://www.proquest.com/openview/3f8407d8f62e907a61eb6266a5ca4dbe/1?pqorigsite=gscholar&cbl=2026366 ).

Esta técnica fue utilizada para determinar la ploidía de una colección de germoplasma del CIAT (Colombia) de pastos tropicales de los géneros Brachiaria, Megathyrus y Panicum. De esta forma se determinó el modo de reproducción de las accesiones analizadas, para así elegir a los parentales masculinos y femeninos en un programa de cruzamientos (7373. Tomaszewska P, Pellny TK, Hernández LM, Mitchell RA, Castiblanco V, de Vega JJ, et al. Flow cytometrybased determination of ploidy from dried leaf specimens in genomically complex collections of the tropical forage grass Urochloa s. l. bioRxiv [Internet]. 2021; Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.26.437252v1.abstract ). Por otra parte, fue estimado el contenido de ADN nuclear y el nivel de ploidía de 19 accessions de Gagnepainia godefroyi y G. harmandii en Tailandia, mediante citometría de flujo (7474. Moonkaew P, Nopporncharoenkul N, Jenjittikul T, Umpunjun P. Cytogenetic and pollen identification of genus Gagnepainia (Zingiberaceae) in Thailand. Comparative cytogenetics [Internet]. 2020;14(1):11. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6971126/ ).

FISH (Hibridación fluorescente in situ) para la caracterización cromosómica

FISH, a diferencia de las técnicas citogenéticas convencionales, se basa en reacciones moleculares específicas entre el ADN cromosómico y otra secuencia cualquiera denominada ‘sonda’. El principio de esta técnica consiste en la hibridación de sondas de ADN, previamente marcadas con un fluorocromo específico, directamente sobre el ADN cromosómico, aprovechando la homología existente entre éstas. Para la detección de tales sondas los preparados cromosómicos se exponen a la luz ultravioleta, lo cual provoca la excitación de los electrones de la molécula fluorescente, que se caracteriza por una emisión de rayos, cuya longitud de onda varía, según el tipo de fluorocromo empleado.

La adaptación de protocolos de FISH en un número cada vez mayor de especies vegetales ha abierto nuevas posibilidades para el estudio de los genomas vegetales (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). Por ejemplo, mediante esta técnica, se realizó, por primera vez, una caracterización citogenómica de veinte accesiones que cubren ocho especies del género Hedysarum, para evaluar la diversidad genética y cariotipado (7575. Yurkevich OY, Samatadze TE, Selyutina IY, Romashkina SI, Zoshchuk SA, Amosova AV, et al. Molecular Cytogenetics of Eurasian Species of the Genus Hedysarum L.(Fabaceae). Plants [Internet]. 2021;10(1):89. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/10/1/89).

Una de las modificaciones de FISH se denomina hibridación genómica in situ (GISH, por genomic in situ hybridization), la cual permite colorear, diferencialmente, los cromosomas de distintos ancestros (en el caso de una especie) o de genomas parentales (en el caso de un híbrido) (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). Recientemente GISH en combinación con FISH fue aplicada para el estudio de la estructura cromosómica en Medicago sativa, producto a que esta especie posee cromosomas muy pequeños, lo que dificulta su estudio mediante citogenética clásica (7676. Falistocco E. Insight into the Chromosome Structure of the Cultivated Tetraploid Alfalfa (Medicago sativa subsp. sativa L.) by a Combined Use of GISH and FISH Techniques. Plants [Internet]. 2020;9(4):542. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/9/4/542 ). Otra de las variantes de la técnica se denomina Hibridación Genómica Comparativa o CGH (por comparative genome hybridization), en la cual se utiliza el ADN genómico de una especie patrón (por ejemplo, Arabidopsis) que se usa como sonda para hibridizarlo sobre los cromosomas de otra especie, lo cual permite analizar el cariotipo de una especie dada con un enfoque molecular, sin necesidad de utilizar secuencias específicas que son difíciles de obtener. Esta hibridación cruzada genera una serie de bandas sobre los cromosomas de la especie estudiada, las cuales corresponden a regiones genómicas conservadas (por lo general, secuencias repetitivas) entre las dos especies (7777. Ali HB, Lysak MA, Schubert I. Genomic in situ hybridization in plants with small genomes is feasible and elucidates the chromosomal parentage in interspecific Arabidopsis hybrids. Genome [Internet]. 2004;47(5):954-60. Available from: https://cdnsciencepub.com/doi/abs/10.1139/g04-041 ,7878. Zúñiga Orozco A, Carrodeguas González A. Echeveria (Crassulaceae): Potencial para la mejora genética como ornamental. Avances en Investigacion Agropecuaria [Internet]. 2021;25(3). Available from: https://web.a.ebscohost.com/abstract?direct=true&profile=ehost&scope=site&authtype=crawler&jrnl=01887890&AN=152784811&h=GAcr%2fP99pQ1turyHWas7Eodczrf6DxIaMO0fOtGBXyAUt8ppeGQGcJex9Ehjusv3wAeCx520PXn9ZgtHc63VYg%3d%3d&crl=c&resultNs=AdminWebAuth&resultLocal=ErrCrlNotAuth&crlhashurl=login.aspx%3fdirect%3dtrue%26profile%3dehost%26scope%3dsite%26authtype%3dcrawler%26jrnl%3d01887890%26AN%3d152784811 ). Por ejemplo, esta técnica fue recientemente utilizada para estudiar la estructura cromosómica de dos especies del género Carex, y comprobar la hipótesis taxonómica de orígenes híbridos en Carex salina y C. ramenskii (7979. Nowak MD, Pedersen ATM, Brysting AK, Schrøder-Nielsen A, Elven R, Bjorå CS. Testing hypotheses of hybrid origins for two seashore species of Carex section Phacocystis (Cyperaceae). Botanical Journal of the Linnean Society [Internet]. 2020;194(1):100-17. Available from: https://academic.oup.com/botlinnean/article/194/1/100/5856095?login=true ).

Conclusiones

Introduction

Since the beginning of agricultural activities more than 10 000 years ago, man has manipulated the genetic structure of plants and animals through numerous cycles of selection of the best adapted individuals. As a result, most of the plants cultivated today are different from their wild ancestors (11. Berger J, Pushpavalli R, Ludwig C, Parsons S, Basdemir F, Whisson K. Wild and domestic differences in plant development and responses to water deficit in Cicer. Frontiers in Genetics [Internet]. 2020;11. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7746823/ ).

Today, the objectives of breeders, compared to our farmers' ancestors, still have the same mission, i.e., to produce crops with higher yields, more resistant and better adapted to different locations.

One of the main requirements for starting a breeding program is to have the genetic variability needed to identify potential genotypes for use as parents. Numerous factors favor genetic diversity, such as: sexual reproduction; mutations; gene flow and, of course, human action through artificial selection and hybridization (22. Carrodeguas-Gonzalez A, Orozco AZ. Bases para la mejora genética en Gerbera hybrida. Repertorio Científico [Internet]. 2020;23(2):51-62. Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/view/3000 ,33. Orozco AZ, Gonzalez AC. Factores importantes como base para el mejoramiento genético en el cultivo de la piña (Anannas comosus var. comosus). Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/download/2998/4274?inline=1 ).

After generating genetic variability, the next step is to discriminate among the variability in order to identify and select individuals with desirable characteristics to develop new potential cultivars, which we call artificial selection. In nature, natural selection is responsible for favoring genotypes most adapted to the environment in the species. In breeding, the same thing happens, but in this case the breeder is in charge of selecting the genotypes that show the highest yield or benefits.

In early years of genetic breeding, selection consisted on the observation of plant behavior and the subsequent selection of those with the best attributes, supported by different elements of biology, mathematics and statistics. With the advance of technology, a large number of techniques have emerged to facilitate selection work. Conventional plant breeders, in order to save resources and time, carefully plan the crosses to generate the greatest possible variability (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ). It is important to determine the direction of the crosses; that is, which varieties or lines will be used as father or mother. Varieties that are going to be used as pollen donors must have high quality pollen and viability, parameters that are evaluated with pollen viability studies (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Likewise, it is necessary to know the adequate moment to carry out the pollination and that the pollen can germinate in the stigma of the female parent, which makes necessary stigmatic receptivity studies (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160).

Another factor of great importance in selection is the knowledge of the chromosomal number, because differences in ploidy can prevent sexual reproduction and, therefore, the obtaining of seeds. Although this is not always the case, in some cases fertilization can occur and genotypes of other ploidy levels can be obtained with differential behavior in terms of the trait being evaluated. Karyotype studies can be performed by the discipline known as cytogenetics, which is divided into classical cytogenetic when chromosomes are analyzed under the microscope by means of staining or molecular one, when different molecular biology methods are applied (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Due to the above, the aim of this review is to expose techniques based on cytological and cytogenetic studies that are feasible for the selection of parents, during the pre-breeding stage.

Aspects related to pollen quality and viability

One of the fundamental steps in a breeding program is to determine which varieties or species will be used as pollen donors, which makes a parameter of great importance, the measurement of the pollen quality of possible parents (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). In order to save time and resources, it is not advisable to use pollen from individuals with low pollen viability (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ).

Having said this, studies aimed at studying quality and viability are necessary to ensure the success of hybridizations and increase efficiency, especially in conditions of the hot and humid tropics, where viability can be strongly affected by environmental conditions (88. González ME, Estévez A, Castillo J, Salomón J, Moré O, Hernández MM. La Calidad del polen: requisito indispensable del mejoramiento tradicional de la papa en Cuba. Revista Latinoamericana de la Papa. 2002;13(1):75-94.). In addition to the importance of these studies in genetic improvement, they can also be very useful to determine physiological parameters, such as pollen vigor during storage, germination capacity after exposure to certain conditions, study its interaction with the stigma and fertility, and determine dispersion and gene flow (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ).

Pollen viability is a parameter strongly influenced by environmental conditions such as temperature, humidity, atmospheric composition and oxygen partial pressure, and by several internal factors such as: duration of microsporogenesis; interspecific genetic variability or metabolism; number and functionality of the nuclei; protection and exposure within the anthers; relative humidity and temperature at the time of dispersal (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ,99. Nikkanen T, Aronen T, Häggman H, Venäläinen M. Variation in pollen viability among Picea abies genotypes-potential for unequal paternal success. Theoretical and applied genetics [Internet]. 2000;101(4):511-8. Available from: https://www.researchgate.net/publication/226790123_Variation_in_pollen_viability_among_Picea_abiesgenotypes_-_potential_for_unequal_paternal_success -1111. Davarynejad GH, Szabó Z, Nyeki J, Szabó T. Phenological stages, pollen production level, pollen viability and in vitro germination capability of some sour cherry cultivars. Asian Journal of Plant Sciences. 2008; ). There are different techniques to measure the ovule viability, which are classified into in vivo and in vitro methods. In vivo methods are much more accurate and reliable, but in vitro ones are the most widely used because they are simpler and faster to perform (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ). The choice of one method or another will depend on species under study and the final objectives of the research. Due to the above, many studies aimed to distinguish the most appropriate methods to estimate pollen viability. Such is the case of a study performed on wheat pollen (1313. Impe D, Reitz J, Köpnick C, Rolletschek H, Börner A, Senula A, et al. Assessment of pollen viability for wheat. Frontiers in plant science [Internet]. 2020;10:1588. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.01588/full ). In this experiment, Alexander's staining could not discriminate between viable fresh pollen and non-viable pollen. In vitro pollen germination was lower compared to pollen viability assessed by FDA and flow cytometry. Therefore, it is advisable to opt for a combined approach of in vitro germination with FDA or flow cytometry to correctly analyze germination potential and pollen viability for wheat.

In another study, triphenyl tetrazolium chloride (TTC) and in vitro germination methods were compared to measure pollen viability of Cistus creticus L. and C. monspeliensis (1414. Zampino D, Duro A, Sciandrello S, Parafati L, Restuccia C. Pollen viability and endophytic yeast species of Cistus creticus and C. monspeliensis. Plant Biosystems-An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology [Internet]. 2021;155(2):384-93. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/11263504.2020.1753844 ). Significant differences were obtained between the two tests and it was concluded that the in vitro germination test is more appropriate for these species. The above results indicate that the first case to estimate the pollen viability in a species is to determine that the most appropriate method because it can be different in each investigation.

Techniques for estimating pollen viability

The most accurate method, so far, to determine pollen viability, is in vivo germination, through which the pollen tube elongation is evaluated to carry out its function as pollinator and the number of seeds produced, in relation to the pollen viability; however, it is necessary to wait for the formation of seeds, which slows down the test and can be a problem when a quick evaluation is required (1515. Shivanna KR, Johri BM. The angiosperm pollen: structure and function [Internet]. New Delhi: Wiley Eastern; 1985. Available from: https://www.worldcat.org/title/angiosperm-pollen-structure-andfunction/oclc/13158693 ).

Among the most commonly used in vitro methods to evaluate pollen quality are staining techniques to observe the cytoplasmic content (acetic carmine, acetic orcein, Alexander drug), enzymatic tests (benzidine, tetrazolium salts) and combined methods that allow determining the integrity of the plasma membrane and the presence of enzymatic activity (fluorochromatic reaction using fluorescein diacetate, FDA) and finally germinability tests (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ).

In vitro germinability tests involve inducing pollen tube formation in an artificial medium, which is an indication of viability because it reveals the state of membranes, nuclei and the conversion rate of reserves (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). However, in vitro germination depends on the genotype, environmental conditions, pollen maturity, composition and pH of the medium. For the above reasons, it is necessary to determine the optimal conditions for pollen germination of each species (1616. Garduño-Tamayo NA, Núñez-Colín CA, Pecina-Quintero V, Montero-Tavera V, Montes-García N, González-Chavira MM, et al. Desarrollo de un método eficiente para la germinación in vitro de polen de sorgo. Tropical and subtropical agroecosystems [Internet]. 2011;14(3):901-6. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-04622011000300025&script=sci_arttext ). Culture media in liquid and solid condition, enriched with sucrose, calcium or boron are important components for germination, therefore, tests at different concentrations of these nutrients are relevant for the execution of viability tests (1717. Marini GV, Arenas RO, Togno LS. Efecto de los medios de cultivo sobre la germinación in vitro de granos de polen en poblaciones de Cucurbita máxima. Horticultura Argentina [Internet]. 2010;29(70):18-21. Available from: https://www.horticulturaar.com.ar/es/articulos/efecto-de-los-medios-de-cultivo-sobre-lagerminacion-in-vitro-de-granos-de-polen-en-poblaciones-de-cucurbita-maxima.html ).

In order to facilitate researchers' choice of culture medium components, researchers at the University of Regensburg, Germany, compiled a compendium including 1572 recipes for culture media successfully used to germinate pollen grains or produce pollen tubes in 816 species representing 412 genera and 114 families (both monocotyledons and dicotyledons) (1818. Tushabe D, Rosbakh S. A compendium of in vitro germination media for pollen research. Frontiers in Plant Science [Internet]. 2021;1412. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.709945/full ). Among the 110 components recorded from different recipes, the most common are: sucrose (89 % of species), H₃BO₃ (77 %), Ca²⁺ (59 %), Mg²⁺ (44 %) and K⁺ (39 %).

Staining techniques to determine pollen viability

Staining methods detect the presence of cytoplasm, plasma membrane integrity or enzyme activity (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Most of them are based on the affinity of cells for certain dyes and generally overestimate viability or poorly determine the real germination power of pollen grains or the extension capacity of pollen tubes, but they are fast and feasible to develop when many crosses are made (1919. Buiza J del VI, Ramírez YC. Durability of the Pollen Germinative Capacity in Aloe Vera (L.) Burm. f. and A. Saponaria Haw. 2006; Available from: https://tspace.library.utoronto.ca/handle/1807/45368 ,2020. Burke IC, Wilcut JW, Allen NS. Viability and in vitro germination of johnsongrass (Sorghum halepense) pollen. Weed technology [Internet]. 2007;21(1):23-9. Available from: https://www.cambridge.org/core/journals/weed-technology/article/abs/viability-and-in-vitro-germinationof-johnsongrass-sorghum-halepense-pollen/C1F1C8F18E70CD2F3CF2280AD92CCD3C ). The following are the most commonly used staining techniques to estimate pollen viability:

Acetic carmine: this test measures the integrity of the cytoplasm; that is, pollen grains are colored red when the cytoplasmic membrane is intact and unstained pollen grains are considered non-viable (2121. Lata S, Sharma G, Garg S, Mishra G. Pollen Viability, Germination and Stigma Receptivity Studies in different Strawberry cultivars. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Suman-Lata-5/publication/343341468_Article2/links/5f240f6d458515b729f5f447/Article2.pdf ,2222. Srinivasan S, Gaur PM. Genetics and characterization of an open flower mutant in chickpea. Journal of Heredity [Internet]. 2012;103(2):297-302. Available from: https://academic.oup.com/jhered/article/103/2/297/885695?login=true ). Acetocharmine overestimates pollen viability, but gives additional information on nuclear morphology. In a study carried out on eight accessions of bell pepper at the Federal University of Piauí, Brazil, the method with 2 % reagent concentration proved to be effective (2323. De Jesus L, Silva RNO, Gomes MDC, Valente SDS, Gomes RLF, Lopes ADA, et al. Efficiency of colorimetric tests to determine pollen viability in peppers. Revista Brasileira De Agropecuária Sustentável (RBAS) [Internet]. 2018;8(2):77-82. Available from: https://pdfs.semanticscholar.org/f7ac/d829ac6180ca3a8cc93bdd99ffd293f48b5f.pdf ).

Alexander staining: this method allows differentiation of non-viable pollen from viable one. Among the components of this solution, malachite green dye specifically stains the cell wall, while fuchsinic acid penetrates living cells and colors the cytoplasm red (Figure 1). Aborted pollen appears green, as it retains only its cell wall, while viable pollen grains also show a reddish coloration inside (2424. Alexander MP. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. Stain technology [Internet]. 1969;44(3):117-22. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10520296909063335 ). The method proved to be efficient in estimating pollen viability in 11 wild Passiflora species, with 2 % reagent concentration (2525. Ferreira M dos S, Soares TL, Costa EMR, Silva RL da, Jesus ON de, Junghans TG, et al. Optimization of culture medium for the in vitro germination and histochemical analysis of Passiflora spp. pollen grains. 2021; Available from: https://pubag.nal.usda.gov/catalog/7408515 ).

Trypan blue: this test is based on the fact that when the plasma membrane of the cell is intact, the dye cannot enter the cytoplasm; therefore, the viable grains are not stained, while the non-viable ones are colored intense blue-violet, because the dye does penetrate, and binding to the proteins present inside the cell. Generally this staining has been used in viability studies of cultured cells (2626. Gratao PL, Pompeu GB, Capaldi FR, Vitorello VA, Lea PJ, Azevedo RA. Antioxidant response of Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 cells to cadmium and nickel stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture [Internet]. 2008;94(1):73-83. Available from: https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/48839097/Antioxidant_response_of_Nicotiana_tabacu20160914-745-zl4c97.pdf?1473881523=&response-contentdisposition=inline%3B+filename%3DAntioxidant_response_of_Nicotiana_tabacu.pdf&Expires=1637822170&Signature=BcXvIIkpxJwynB8O2aFPf~fyVk8LeFHrzJKyTDouGcRdq4zzpxRWYy2Xg8jSfEoFg2jkkO5tSViPJLwLLfpLv9j6qNwlMhbt7hc2fsTf1LLsK33Te38jedreDP-Yq7J-FH-d~UrCVud39qX8m59~1cN1BA1SEy3lSszEjNuMEHLMEDYapFXokEjciBCIC0IbbkeBX4rqwG1LXtZZVCygRUM1OYbXG6hZRNRbr3l0nwx8Kw573fAmdVLFZrt6B7k9bJGdohIYa~ZVGepY1mercYM7Mq2D9bDdiHAeDFzuio6kjFmc1i9eisvjk5kR1UT1TKq3Y7CeWv6zTVub~0KBnA__&Key-PairId=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA ) and has recently been applied to pollen viability. This method was applied to estimate pollen viability in different olive cultivars, and the authors reported a significant correlation between germinability and this viability test, which indicates that it is adequate in the case of this species (1212. Rejón García JD, Suárez C, Alché Ramírez J de D, Castro AJ, Rodríguez García MI. Evaluación de diferentes métodos para estimar la calidad del polen en distintos cultivares de olivo (Olea europaea L.). 2010; Available from: https://gredos.usal.es/handle/10366/120989 ).

Techniques for testing enzyme activity in pollen

The following techniques allow detecting the existence of enzymatic activity in pollen, by means of color changes in cells:

Tetrazolium salt: this method is based on the use of the compound (2, 3, 5,-triphenyl-tetrazolium chloride), which, in the reduction processes of living cells, takes the hydrogen released by dehydrogenase enzymes and forms a red, stable and non-diffusible substance, triphenyl-formazan. Therefore, viable pollen that has dehydrogenase activity stains red, while non-viable pollen fails to stain (2727. Moore RP. Handbook on tetrazolium testing. In International Seed Testing Association Zurich; 1985. Available from: https://www.seedtest.org/en/handbooks-_content---1--3422.html ). This method was used to analyze the effects of low storage temperatures on the quality of pollen obtained from four cultivars of sweet cherry, showing satisfactory results with a concentration of the reagent of 1 % (2828. Özcan A. Effect of Low-temperature storage on sweet cherry (Prunus avium L.) pollen quality. HortScience [Internet]. 2020;55(2):258-60. Available from: https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/55/2/article-p258.xml ).

Para-phenylenediamine: this test uses para-phenylenediamine (p-phenylenediamine) as reagent and is based on the detection of the presence of peroxidases (55. Baba Nitsa M, Balogun ST, Odey FC, Dada KE, Idrisu M, Ugioro O, et al. Evaluation of pollen viability and in vitro pollen germination in relation to different maturity stages of flowers inkola (Cola nitida). GSJ [Internet]. 2020;8(5):516-25. Available from: https://www.globalscientificjournal.com/researchpaper/Evaluation_of_pollen_viability_and_in_vitro_polle n_germination_compared_at_different_maturity_stages_of_Cola_nitida_flowers_.pdf ). Pollen grains that stain dark brown are considered viable, while light brown grains are considered non-viable. It is recommended for future work, to make a primer where the color of the pollen grains is related to the germination percentage obtained in a given sample, since the coloration can vary with storage time, according to the results obtained in Nothofagus nervosa (44. García L, Rivero M, Droppelmann F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque (Valdivia) [Internet]. 2015;36(3):487-96. Available from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0717-92002015000300015&script=sci_arttext ).

Combined methods for determining plasma membrane integrity and the presence of enzyme activity

Combined methods estimate pollen viability by checking membrane integrity and the presence of enzyme activity in the cytoplasm at the same time. The most commonly used techniques are described below: Fluorochromatic reaction using DAF: this method is one of the most widely used in pollen viability studies. DAF is an apolar ester, which allows it to cross the cytoplasmic membrane. Once inside the cell, the ester is hydrolyzed by esterase enzymes found in the cytoplasm and releases a fluorochrome, which when excited at an appropriate wavelength (490 nm), emits bright green fluorescence. Since the fluorochrome is polar, it cannot exit through the cytoplasmic membrane and is retained in cells with an intact cytoplasmic membrane. As a consequence, only pollen grains with adequate levels of esterase activity and with an intact cytoplasmic membrane will show greenish fluorescence, indicating that these grains are viable (2929. Heslop‐Harrison Y, Reger BJ, Heslop‐Harrison J. The pollen‐stigma interaction in the grasses. 6. The stigma (‘silk’) of Zea mays L. as host to the pollens of </i>Sorghum bicolor</i> (L.) Moench and Pennisetum americanum (L.) Leeke. Acta Botanica Neerlandica [Internet]. 1984;33(2):205-27. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1438-8677.1984.tb01799.x ). This method was successfully applied to estimate pollen viability in Flaveria bidentis and F. haumanii in Santiago del Estero (Argentina) (3030. Páez V de los A, Andrada AR, Sobrero MT, Chaila S. Caracterización citológica en Flaveria bidentis y F. haumanii (Asteraceae). Acta botánica mexicana [Internet]. 2020;(127). Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S0187-71512020000100109&script=sci_abstract&tlng=pt ).

Fluorescein diacetate reaction (FDR): this test works much like the FDA. Pollen grains are mounted in fluorescein diacetate, which is an apolar compound that, like FDA, rapidly penetrates the pollen cytoplasm and is hydrolyzed by esterases, leaving the polar and fluorescent fluorescein free (3131. Passarelli LM. Relación entre la germinación del polen" in vitro", reacción fluorocromática y tinción con azul de algodón en lactofenol, en dos especies de Solanum sec. Cyphomandropsis. Publicación Electrónica de la Asociación Paleontológica Argentina [Internet]. 1999;6(1). Available from: https://www.peapaleontologica.org.ar/index.php/peapa/article/view/209 ).

Aspects of floral biology of importance for plant breeding

For classical genetic improvement, based on the selection of superior individuals and directed crosses, it is important to know aspects of the floral biology of plant species under study. In order to obtain successful fertilizations, it is not only necessary to estimate the quality pollen of the species used as male parent, but also at what moment the stigma of the female parent is receptive, for which stigmatic receptivity studies are carried out. Likewise, it is necessary to know if there is self-incompatibility in the species being worked on, in case self-pollinations are required to obtain pure lines. For this purpose, it is necessary to study the growth of the pollen tube, to know the place where self-incompatibility occurs and to find a way to avoid this barrier.

Stigmatic receptivity

Stigmatic receptivity reflects the ability of the stigma to receive pollen, allowing it to adhere, hydrate and finally germinate (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160). Pollination consists of the transfer of pollen from the male sexual organs to the female sexual organs, but for this process to occur, the transfer of pollen to the stigma must occur during the period when the stigma is receptive, otherwise the pollen cannot adhere and cannot germinate (3232. Kearns CA, Inouye DW. Techniques for pollination biologists. [Internet]. University press of Colorado; 1993. Available from: https://upcolorado.com/university-press-of-colorado/item/1694-techniques-for-pollinationbiologists ,3333. Márquez Guzmán J. Biología de angiospermas [Internet]. [cited 24/11/2021]. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Jorge-Meave/publication/281348069_Vegetacion_caracterizacion_y_factores_que_determinan_su_distribucion/links/55edabb908ae0af8ee187ea9/Vegetacion-caracterizacion-y-factores-que-determinan-su-distribucion.pdf ).

In nature; generally, once the flowers open, the stigma is receptive, but in the case of genetic improvement, many times the need to perform directed pollinations in the bud stage prevails. This is done in order to perform pollination at the same time of spaying, avoiding contamination with pollen grains foreign to the one used as parental (66. Shivanna KR, Sawhney V, Lambert RJ. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 1999 [cited 25/11/2021];74(4):474-5. doi:10.1086/394160). At floral maturity, when the stigmas are ready for pollination, these are characterized by having high peroxidase enzyme activity; therefore, in order to determine the receptivity of the stigma, hydrogen peroxide is used to check for the presence of enzymes when bubbling occurs (3434. Yang R, Wang J, Gao W, Jiang Y, Su J, Sun D, et al. Research on the reproductive biological characteristics of Amomum villosum Lour. and Amomum longiligulare TL Wu. Plos one [Internet]. 2021;16(8):e0250335. Available from: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0250335 ) (Figure 2). There is a scoring criterion to convert stigmatic receptivity into a quantitative variable and thus find the average receptivity per day evaluated, for which four levels of bubbling were proposed (3535. Bazo I, Espejo R, Palomino C, Flores M, Chang M, López C, et al. Estudios de biología floral, reproductiva y visitantes florales en el" Loche" de Lambayeque (Cucurbita moschata DUCHESNE). Ecología Aplicada [Internet]. 2018;17(2):191-205. Available from: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-22162018000200007 ).

Stigmatic receptivity can be affected by environmental conditions, such as temperature, chemical application and plant nutrition, although generally, in studies on this subject, the male part has received the most attention. It has been shown that, under field conditions, temperature, through its effect on stigmatic receptivity, affects the effective pollination period and fruit set in several fruit species, such as apricot (3636. Burgos L, Egea J, Dicenta F. Effective pollination period in apricot (Prunus armeniaca L.) varieties. Annals of Applied Biology [Internet]. 1991;119(3):533-9. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.1991.tb04892.x ,3737. Egea J, Burgos L, Garcia JE, Egea L. Stigma receptivity and style performance in several apricot cultivars. Journal of Horticultural science [Internet]. 1991;66(1):19-25. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00221589.1991.11516120 ) or kiwifruit (3838. González MV, Coque M, Herrero M. Stigmatic receptivity limits the effective pollination period in kiwifruit. Journal of the American Society for Horticultural Science [Internet]. 1995;120(2):199-202. Available from: https://journals.ashs.org/jashs/view/journals/jashs/120/2/article-p199.xml ). In peach, it was shown that under controlled conditions temperature had a great influence on the stigmatic receptivity duration which decreases with increasing temperature. The stigmatic receptivity loss was manifested in three consecutive processes: pollen adherence to the stigma, germination and penetration into the transmitting tissue. The loss of these capacities is gradual, first the capacity to penetrate the transmitting tissue is lost; secondly, germination and finally the adherence of pollen to the stigma (3939. Hedhly A, Hormaza JI, Herrero M. Efecto de la temperatura sobre la duración de la receptividad estigmática en melocotonero (Prunus persica L. Batsch). 2000; Available from: https://www.aida-itea.org/aidaitea/files/jornadas/2000/comunicaciones/2000_FyF_01.pdf ).

Plant incompatibility systems

In traditional breeding, it is essential to have pure lines to make uniform hybrids; however, the development of pure lines requires self-pollination to induce a change in allele frequency and achieve homocigosis. According to the above, it is assumed that all plant species can be capable of self-pollination; however, the reality is not so, since self-incompatibility is present in more than half of the Angiosperm species. In the case of self-pollinated plants, obtaining pure lines is easy, because self-pollination occurs to a large extent; however, it is proposed that they have, with open pollination, 5 % of allogamy. In cross-pollinated plants, due to self-incompatibility mechanisms, self-pollination is often difficult (4040. Cropano C, Place I, Manzanares C, Do Canto J, Lübberstedt T, Studer B, et al. Characterisation and practical use of self-compatibility in outcrossing grass species. Annals of Botany [Internet]. 2021; Available from: https://www.research-collection.ethz.ch/bitstream/handle/20.500.11850/483774/1/mcab043.pdf ).

Breeders resort to various techniques such as pollination between full sibs or half sibs, backcrossing or variability induction, making dialelic designs with various compatible species and, if this is not successful, biotechnological techniques are used to overcome pre- or postzygotic self-incompatibility barriers, haploid induction, among others.

Self-pollination is not possible in many plant species due to a mechanism known as self-incompatibility. This mechanism ensures genetic variability, avoiding inbreeding depression and promoting cross-pollination, so its effectiveness ensures the success of species evolution (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ).

As part of evolution, to promote cross-pollination, several hermaphrodite species developed morphological adaptations such as, for example, the spatial separation of the pistil and stamens (hercogamy) and physiological adaptations such as differential maturation of the reproductive organs (dichogamy). These modifications largely prevent self-fertilization and promote cross-pollination, but there is still the possibility of gene flow through pollen to the parents or to other individuals in the progeny. To avoid such an event, a large number of species have developed a genetic-biochemical pollen recognition mechanism known as a sexual incompatibility (SI) system, which is defined as the inability of a fertile hermaphrodite plant to produce zygotes after self-pollination (4040. Cropano C, Place I, Manzanares C, Do Canto J, Lübberstedt T, Studer B, et al. Characterisation and practical use of self-compatibility in outcrossing grass species. Annals of Botany [Internet]. 2021; Available from: https://www.research-collection.ethz.ch/bitstream/handle/20.500.11850/483774/1/mcab043.pdf ).

Classification of incompatibility systems

Incompatibility systems have been classified according to the genotype that determines it; if it is determined by the haploid genotype of the pollen, it is called gametophytic incompatibility; if on the other hand, it is determined by the diploid genotype of the plant that gives origin to the pollen, it is called sporophytic incompatibility (4242. Herrera S, Lora J, Hormaza JI, Rodrigo J. Determination of Self-and Inter-(in) compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. JoVE (Journal of Visualized Experiments) [Internet]. 2020;(160):e60241. Available from: https://www.jove.com/es/t/60241/determination-self-inter-compatibility-relationships-apricot ).

Self-incompatibility can be expressed in the stigma, style or flower ovary, due to an accumulation of callose at the tip of pollen tubes and, therefore, the elongation of pollen tubes is prevented at some point in their trajectory to the oosphere. This accumulation of callose makes it possible to differentiate between compatible and incompatible pollen tubes (4343. Herrero M, Dickinson HG. Pollen tube development in Petunia hybrida following compatible and incompatible intraspecific matings. Journal of Cell Science [Internet]. 1981;47(1):365-83. Available from: https://journals.biologists.com/jcs/article/47/1/365/59007/Pollen-tube-development-in-Petunia-hybrida ,4444. Lush WM, Clarke AE. Observations of pollen tube growth in Nicotiana alata and their implications for the mechanism of self-incompatibility. Sexual Plant Reproduction [Internet]. 1997;10(1):27-35. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Observations-of-pollen-tube-growth-in-Nicotiana-and-LushClarke/4a4e2414aa590e6e0c6d06482e14b645a1e162aa ). In the case of gametophytic incompatibility, the interruption of pollen tube growth occurs in the style, whereas in sporophytic incompatibility it generally occurs in the stigma (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ). There is a third type of poorly studied self-incompatibility that occurs in the ovary, known as late-acting selfincompatibility, which is caused by inhibition of pollen tubes before they reach ovules, inhibition of fertilization, post-zygotic rejection, and inhibition in the ovule (4545. Seavey SR, Bawa KS. Late-acting self-incompatibility in angiosperms. The Botanical Review [Internet]. 1986;52(2):195-219. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/BF02861001 ).

Performing self-incompatibility studies allows the breeder to save time and resources, since it can know which route to take at the moment of advancing the selection of the segregating generations.

Incompatibility studies were carried out in Olea europea, with the aim of explaining how self-fertilization occurs in some varieties, despite being a species with high degrees of self-incompatibility. The authors suggest that some determinants of self-incompatibility in the pollen tube and stigma are unstable and degrade, allowing the pollen tubes to reach the ovule and fertilize it. This explains that self-incompatibility may not be absolute and, therefore, some degree of self-fertilization may occur (4646. Stasiak A, Latocha P, Bieniasz M. Effect of genetically diverse pollen on pollination, pollen tube overgrow, fruit set and morphology of kiwiberry (Actinidia arguta). Agronomy [Internet]. 2021;11(9):1814. Available from: https://www.mdpi.com/2073-4395/11/9/1814 ).

Apart from the intraspecific incompatibility described above, there is another mechanism known as interspecific incompatibility, where pollen is rejected because of the great genetic dissimilarity between the donor and recipient species (4747. Wheeler MJ, Franklin‐Tong VE, Franklin FCH. The molecular and genetic basis of pollen-pistil interactions. New Phytologist [Internet]. 2001;151(3):565-84. Available from: https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.0028-646x.2001.00229.x ). This often occurs because the pollen cannot be nourished by the extracellular matrix of the maternal tissue (1616. Garduño-Tamayo NA, Núñez-Colín CA, Pecina-Quintero V, Montero-Tavera V, Montes-García N, González-Chavira MM, et al. Desarrollo de un método eficiente para la germinación in vitro de polen de sorgo. Tropical and subtropical agroecosystems [Internet]. 2011;14(3):901-6. Available from: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-04622011000300025&script=sci_arttext ) and nutrients of the maternal tissue are not sufficient to generate all the substances necessary for the tube growth to ovules (2929. Heslop‐Harrison Y, Reger BJ, Heslop‐Harrison J. The pollen‐stigma interaction in the grasses. 6. The stigma (‘silk’) of Zea mays L. as host to the pollens of </i>Sorghum bicolor</i> (L.) Moench and Pennisetum americanum (L.) Leeke. Acta Botanica Neerlandica [Internet]. 1984;33(2):205-27. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1438-8677.1984.tb01799.x ). This process often makes hybridization impossible, which makes it necessary to know at what moment the interruption of pollen tube growth is generated in order to be able to make decisions. This type of incompatibility has been studied in Solanaceae, where the cessation of pollen tube growth occurs along the style (4444. Lush WM, Clarke AE. Observations of pollen tube growth in Nicotiana alata and their implications for the mechanism of self-incompatibility. Sexual Plant Reproduction [Internet]. 1997;10(1):27-35. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Observations-of-pollen-tube-growth-in-Nicotiana-and-LushClarke/4a4e2414aa590e6e0c6d06482e14b645a1e162aa ), as occurs in gametophytic self-incompatibility (4848. Liedl BE, Anderson NO. Reproductive barriers: identification, uses and circumvention. Plant Breed Rev [Internet]. 1993;11:11-154. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=by8K32RdKmYC&oi=fnd&pg=PA11&dq=Reproductive+barriers:+Identification,+uses+and+circumvention&ots=R0TFVM4DV-&sig=OgUQ3u8T0CZaiRN63RwCGV8cGPA#v=onepage&q=Reproductive%20barriers%3A%20Identifiation%2C%20uses%20and%20circumvention&f=false ); therefore, it is logical to think that both recognition processes could be similar (4949. Milicia VJ, Coviella MA, Facciuto G, Soto MS. Relación tubo polínico/pistilo en cruzamientos interespecíficos en el género Nierembergia (Solanaceae). Chilean Journal of Agricultural & Animal Sciences [Internet]. 2015;31(1):53-60. Available from: http://revistas.udec.cl/index.php/chjaas/article/view/6247 ).

A study was conducted in Nierembergia of interspecific crosses, in which different patterns of pre-zygotic incompatibility were detected. Studies of the stigma-pollen/style-pollen tube relationship showed that interspecific incompatibility is manifested by inhibition of pollen tube growth at different levels of the style. In no case were signs of incompatibility found at the stigma level (4949. Milicia VJ, Coviella MA, Facciuto G, Soto MS. Relación tubo polínico/pistilo en cruzamientos interespecíficos en el género Nierembergia (Solanaceae). Chilean Journal of Agricultural & Animal Sciences [Internet]. 2015;31(1):53-60. Available from: http://revistas.udec.cl/index.php/chjaas/article/view/6247 ).

To observe the pollen tube development, pistils are collected at intervals of one day after self-pollination or cross-pollination, until at least four days after pollination. The technique consists of staining the pistils with aniline blue, since this compound reacts with the callose in the pollen and, therefore, the path of the pollen tube can be seen through the style under a fluorescence microscope. To analyze in which part of the pistil the interruption of the pollen tube occurs, the pistil is divided into four parts: stigma, first half of the style, second half of the style and ovary (4141. Facciuto GR. Auto-incompatibilidad de acción tardía e hibridación interespecífica en el género Tabebuia AI Gomes ex DC (Bignoniaceae): estudios relacionados con el desarrollo reproductivo [Internet]. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2007. Available from: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/greenstone3/exa/collection/tesis/document/tesis_n4149_Facciuto ). Figure 3 shows the growth of the pollen tube in Alstroemeria in the style and ovary.

Cytogenetic studies for plant species karyotyping

Karyotyping consists of the study of genome structure including chromosome number and thus ploidy level, analysis of chromosome morphology (absolute and relative size, centromere position, location and number of satellites (5050. Sun W, Wang H, Wu R, Sun H, Li Z. Karyomorphology of three endemic plants (Brassicaceae: Euclidieae and Arabideae) from the Qinghai-Tibet Plateau and its significance. Plant Diversity [Internet].2020;42(3):135-41. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468265920300196 ). When selecting parents for crosses in a breeding program, it is important to have knowledge about chromosome number. If cultivars with differences in chromosome number are involved, sexual reproduction may be affected and, therefore, it may be impossible to obtain seed.

Chromosome number can be very variable, even within cultivars of the same species, as was found in a study on mulberry, where aneuploid and diploid varieties were found in Morus indica (5151. Venkatesh KH. Studies on Basic Chromosome Number, Ploidy Level, Chromosomal Association and Configuration and Meiotic Behavior in Mulberry (Morus Spp.). In: Cytogenetics-Classical and Molecular Strategies for Analysing Heredity Material [Internet]. IntechOpen; 2021. Available from: https://www.intechopen.com/chapters/76236 ). The phenomenon of polyploidy can occur and, therefore, new basic numbers can arise that have no direct relationship with the ancestral ones, due to new restructurings or hybridization between polyploids with different basic numbers. Furthermore, it is difficult to deduce differences in ploidy without cytogenetic analysis, because variations in karyotype can occur without noticeable changes in phenotype (5252. Poggio L, González G, Ferrari M, García A, Wulff A, Greizerstein E, et al. Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Biotecnología y mejoramiento vegetal II. Argentina: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) [Internet]. 2010;379-80. Available from: https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/BiotecnologiayMejoramientovegetalII.pdf ).

Karyotype studies can be performed by the discipline known as cytogenetics, which deals with the structure and behavior of chromosomes, as well as the genetic implications derived from their study (5353. Flavell RB. Perspective: 50 years of plant chromosome biology. Plant Physiology [Internet]. 2021;185(3):731-53. Available from: https://academic.oup.com/plphys/article/185/3/731/6144805?login=true ). In the last 20 years, cytogenetic studies have focused on the structure and evolution of the genome of different plant species, both wild and cultivated (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). Cytogenetic analysis generates basic knowledge on the number and shape of chromosomes for subsequent studies focused on the use of biological diversity for breeding purposes (5454. Alcántar Vázquez JP. La poliploidía y su importancia evolutiva. REPOSITORIO NACIONAL CONACYT [Internet]. 2014; Available from: http://repositorio.utm.mx/handle/123456789/310 ). This type of studies was carried out in diverse crops such as Triticum aestivum (5555. Jiao Z, Zhu X, Li H, Liu Z, Huang X, Wu N, et al. Cytological and molecular characterizations of a novel 2A nullisomic line derived from a widely-grown wheat cultivar Zhoumai 18 conferring male sterility. PeerJ [Internet]. 2020;8:e10275. Available from: https://peerj.com/articles/10275/ ), Dipteryx alata (5656. Antunes AM, Targueta CP, Castro AA, Souza G, Soares TN, Telles MPC. Genome size and chromosome number of Dipteryx alata (Leguminosae): a model candidate for comparative genomics in Papilionoideae. Available from: https://www.geneticsmr.com/sites/default/files/articles/year2020/vol19-3/pdf/gmr18640_-_genome-size-and-chromosome-number-dipteryx-alata-leguminosae-model-candidate-comparative.pdf ) and Hibiscus rosa-sinensis (5757. Celinna M, Miranda PA, Rachma I, Salamah A. Chromosome analysis of Hibiscus rosa-sinensis using CHIAS IV software. In: IOP Conference Series: Earth and Environmental Science [Internet]. IOP Publishing; 2020. p. 012004. Available from: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/524/1/012004/meta ).

Cytogenetics is divided into classical and molecular cytogenetics. The former includes cytological studies in which chromosomes are analyzed under the microscope during the metaphase of mitosis or meiosis. Molecular cytogenetics could be considered the fusion between classical cytogenetics and molecular biology. This discipline groups a set of techniques that apply different methods of molecular biology directly on cytological preparations, such as tissues, cells, chromosomes and DNA fibers (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Classical cytogenetics

Classical cytogenetics consists of observing chromosomal characteristics in cells that are in the metaphase of mitosis or meiosis under a microscope. For this purpose, root cells are used in the case of mitosis or gametes in the case of meiosis.

Determination of chromosome number during mitosis

The cell cycle comprises four sequential ordered phases, which temporally distinguish the replication of genetic material from the segregation of duplicated chromosomes into two daughter cells. The G1 and G2 phases are referred to as "gaps", because no highly visible processes occur in the cell nucleus at these stages. However, the cells are actually very active, as they are growing and preparing for division. The S-phase refers to synthesis, in which DNA is copied or replicated, and the M-phase to mitosis (5858. Van’t Hof J. Control points within the cell cycle. The cell division cycle in plants [Internet]. 1985;1-13. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=Mqk8AAAAIAAJ&oi=fnd&pg=PA11IA2&dq=Control+points+within+the+cell+cycle.+In+Bryant+JA,+Francis+D,+editors.+The+Cell+Division+Cycle+in+Plants&ots=IG0C_x_qUt&sig=4kjuUZ7d0uSl1Apfw096oN-EUfU#v=onepage&q=Control%20points%20within%20the%20cell%20cycle.%20In%20Bryant%20JA%2C%20Francis%20D%2C%20editors.%20The%20Cell%20Division%20Cycle%20in%20Plants&ots=IG0C_x_qUt&sig=4kjuUZ7d0uSl1Apfw096oN-EUfU#v=onepage&q=Control%20points%20within%20the%20cell%20cycle.%20In%20Bryant%20JA%2C%20Francis%20D%2C%20editors.%20The%20Cell%20Division%20Cycle%20in%20Plants&f=false ). The different phases of the cell cycle can be seen in Figure 4.

Mitosis is divided into five phases: prophase, prometaphase, metaphase, anaphase and telophase. During metaphase chromosomes are arranged towards the equatorial plate and it is the appropriate moment for chromosome counting (5959. Ojea N. Biología: conceptos básicos [Internet]. 1a ed.-Santa Fe: Ediciones UNL, 2020; 2020. Available from: https://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8443/handle/11185/5549 ). Figure 5 shows the different phases of mitosis in a meristematic tissue of Altroemeria, in an experiment developed by the authors at the Institute of Floriculture of Argentina, where in metaphase the chromosomes are perfectly visible.

In the first karyotyping studies, cytologists, in order to observe chromosomes under the light microscope, fixed the meristematic tissues in kerosene blocks and then made micrometer cuts. At the time, this technology provided good results, until the emergence of the root tip crushing technique known as "squash" (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

Chromosomes are found in cells of all organisms, but are visible when they are undergoing mitotic or meiotic division. If it is desired to analyze the chromosome number during mitosis, meristematic tissues must be used, which are characterized by constantly dividing cells with large nuclei (6161. Roth I. Anatomía de las plantas superiores. 1966.). The meristematic tissues most used by cytologists are those found in the apical zone of the root (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

Firstly to take into account for the determination of the chromosomal number, through the observation of mitosis, is to determine the most appropriate time for the pretreatment of roots (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.). An experiment is carried out to find when a greater number of metaphase cells are found, which can be different in each locality, due to environmental conditions (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ). For this purpose, Valladolid, proposed to fix roots in the mixture absolute alcohol: glacial acetic acid (3:1) at different hours of the day, macerate and stain the samples to observe them under the optical microscope and later note the frequency of interphases, prophases, metaphases and telophases for each hour of collection (6060. Valladolid A, Blas R, Gonzáles R. Introducción al recuento de cromosomas somáticos en raíces andinas. Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003) [Internet]. 2004;95-9. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=L-sz8Eir9IIC&oi=fnd&pg=PA95&dq=.+Introducci%C3%B3n+al+recuento+de+cromosomas+som%C3%A1ticos+en+ra%C3%ADces+andinas.+Ra%C3%ADces+Andinas+contribuciones+al+conocimiento+y+a+la+capacitaci%C3%B3n+I.+Aspectos+generales+y+recursos+gen%C3%A9ticos+de+las+ra%C3%ADces+andinas&ots=ayCJKvv9zD&sig=lIavNBR16dFqfQdw2Mad-G2z7mM&f=false ).

Subsequently, the pretreatment that consists of putting the tip of the root in contact with substances called mitosis inhibitors was proceed (Colchicine, 8-hydroxyquinoline, 1-bromonaphthalene, low positive temperatures, etc.) to obtain a greater number of metaphase cells in the meristem. Metaphase is the mitosis stage, where chromosomes reach their maximum degree of condensation and they are individualized; therefore, it is very easy to count and characterize them. Mitosis inhibitors prevent the achromatic spindle formation and the cells do not pass to anaphase, the next stage of mitosis (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.,6363. Darnell JE, Lodish HF, Baltimore D. Molecular cell biology [Internet]. 2nd ed. New York: Scientific American Books : Distributed by W.H. Freeman; 1990. 1105 p. Available from: https://www.goodreads.com/book/show/2721146-molecular-cell-biology ).

Mitosis inhibitors have also been used to induce polyploids with novel characteristics. In a study conducted in Impatiens walleriana, the application of colchicine at 0.05 % produced the highest tetraploid induction efficiency; therefore, this concentration would be a good starting point for inducing tetraploids in the future (6464. Wang W, He Y, Cao Z, Deng Z. Induction of tetraploids in impatiens (Impatiens walleriana) and characterization of their changes in morphology and resistance to downy mildew. HortScience [Internet]. 2018;53(7):925-31. Available from: https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/53/7/articlep925.xml ). In another study, the effect of another mitosis inhibitor, oryzalin, was evaluated in I. walleriana and proved to be very effective for tetraploidy induction (6565. Ghanbari MA, Jowkar A, Salehi H, Zarei M. Effects of polyploidization on petal characteristics and optical properties of Impatiens walleriana (Hook.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) [Internet]. 2019;138(2):299-310. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-019-01625-3 ). In both experiments, tetraploid plants exhibited greater leaf area, leaf thickness, ovary width, pollen length, and stomatal size and showed decreases in height, stomatal guard cell density, and flower number. The next step consists of fixation in order to rapidly interrupt the vital processes of the sample to preserve cell structure (6666. Sharma A, Sharma A. Chromosome Techniques - 3rd Edition [Internet]. 2014. [cited 25/11/2021]. Available from: https://www.elsevier.com/books/chromosome-techniques/sharma/978-0-408-70942-2 ). Chemical agents or enzymatic treatments (cellulases and pectinases) are then used to remove the cell wall of cells and disperse them. The chromosomes are then stained to make them visible under the light microscope. Basic stains are used for this purpose, due to the acidic nature of chromatin. Once the cells have been stained, they are squashed, so that the chromosomes are dispersed and placed in the same plane. Finally, the sample is observed under an optical microscope (6262. Talledo D, Escobar C, Alleman V. Introducción al análisis cromosómico en vegetales. Lima, Universidad Ricardo Palma. 1993;141.). Figure 6 shows different steps for the observation of chromosomes in metaphase.

Despite the advancement of technology and the emergence of new techniques for karyotyping, chromosome counting during mitosis is still performed in many cultures. For example, the chromosome number of 14 species of Iris was determined by classical cytogenetics in Korea (6767. Choi B, Weiss-Schneeweiss H, Temsch EM, So S, Myeong H-H, Jang T-S. Genome size and chromosome number evolution in Korean Iris L. species (Iridaceae Juss.). Plants [Internet]. 2020;9(10):1284. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/9/10/1284 ).

Determination of chromosome number in meiosis

In higher plants, meiosis takes place only in the mother cells of the pollen grains located in the microsporophyll (gymnosperms) or in the anther (angiosperms) and in the mother cells of megaspores located in the ovule (gymnosperms and angiosperms). As in mitosis, to analyze chromosome number during meiosis, it is performed during metaphase I or metaphase II. If it is performed during metaphase II, it is important to take into account that the chromosome number is reduced by half (6868. Megías M, Molist P, Pombal M. Atlas de histología animal y vegetal. Tejidos vegetales: Conducción. Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud. Universidad de Vigo. 14pp [Internet]. 2017; Available from: https://pepm-sal.infd.edu.ar/sitio/wp-content/uploads/2020/04/atlas-celula-01introduccion.pdf ) (Figure 7).

Studies of chromosomal behavior during meiosis can detect chromosomal abnormalities that affect plant fertility. For example, a study was developed in three species of the genus Capsicum, where different meiotic abnormalities were observed, which can interrupt the process of cell division creating different chromosome numbers and decreasing pollen fertility. The following chromosome number variations were observed: 2n=2x=24, 2n=2x=26, 2n=4x=48 to 2n=6x=72 (6969. Souza-Macedo V de, García-Dávila MA, Castro GR de, Garzón-Bautista YM, Caetano CM. Cytogenetic evaluation of chili (Capsicum spp., Solanaceae) genotypes cultivated in Valle del Cauca, Colombia. Acta Agronómica [Internet]. 2017;66(4):612-7. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-28122017000400612 ).

Molecular cytogenetics for chromosomal analysis

As previously mentioned, for the development of a breeding program, a key step is the karyotypic characterization of cultivars to be used as parents. Currently, in well-equipped laboratories, techniques much more feasible than classical cytogenetics can be performed, such as: flow cytometry, fluorescence in situ hybridization (FISH) and genomic in situ hybridization (GISH) (22. Carrodeguas-Gonzalez A, Orozco AZ. Bases para la mejora genética en Gerbera hybrida. Repertorio Científico [Internet]. 2020;23(2):51-62. Available from: https://revistas.uned.ac.cr/index.php/repertorio/article/view/3000 ). These techniques are grouped in a discipline known as molecular cytogenetics, which is defined as the fusion between classical cytogenetics and molecular biology (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ).

Flow cytometry for chromosomal studies

Flow cytometry is a powerful tool for the analysis of nuclear DNA content (in its relative or absolute values) of plant cells (7070. Heller FO. DNA-MEASUREMENT OF VICIA-FABA L WITH PULSE CYTOPHOTOMETRY. Berichte Der Deutschen Botanischen Gesellschaft. 1973;86(5-9):437-41.). It consists of analyzing particles flowing in a liquid suspension, due to optical properties (light scattering and fluorescence) (7171. Dolezel J. Application of flow cytometry for the study of plant genomes. Journal of applied Genetics [Internet]. 1997;38(3). Available from: http://yadda.icm.edu.pl/yadda/element/bwmeta1.element.agroarticle-65186f6b-a55c-4ced-b381-357e1716f2a5 ). Since the 1980s, application spectrum of flow cytometry for plant genome analysis has increased exponentially and it is now a routine technique used in many laboratories around the world (7272. Loureiro JCM. Flow cytometric approaches to study plant genomes [Internet]. Universidade de Aveiro (Portugal); 2007. Available from: https://www.proquest.com/openview/3f8407d8f62e907a61eb6266a5ca4dbe/1?pqorigsite=gscholar&cbl=2026366 ).

Flow cytometry makes it possible to determine the number of nuclei, previously isolated and labeled with a fluorochrome, present in each phase of the cell cycle (G0/G1, S and G2/M). First, the fluorescence measurements of the nuclei are expressed on an arbitrary scale, then compared with the fluorescence of nuclei isolated from a reference standard with known genome size to estimate the nuclear DNA content of a given individual or tissue (7272. Loureiro JCM. Flow cytometric approaches to study plant genomes [Internet]. Universidade de Aveiro (Portugal); 2007. Available from: https://www.proquest.com/openview/3f8407d8f62e907a61eb6266a5ca4dbe/1?pqorigsite=gscholar&cbl=2026366 ).

This technique was used to determine the ploidy of a CIAT (Colombia) germplasm collection of tropical grasses of the genera Brachiaria, Megathyrus and Panicum. In this way, the reproductive mode of the analyzed accessions was determined in order to select male and female parents in a crossbreeding program (7373. Tomaszewska P, Pellny TK, Hernández LM, Mitchell RA, Castiblanco V, de Vega JJ, et al. Flow cytometrybased determination of ploidy from dried leaf specimens in genomically complex collections of the tropical forage grass Urochloa s. l. bioRxiv [Internet]. 2021; Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.26.437252v1.abstract ). Moreover, the nuclear DNA content and ploidy level of 19 accessions of Gagnepainia godefroyi and G. harmandii in Thailand were estimated by flow cytometry (7474. Moonkaew P, Nopporncharoenkul N, Jenjittikul T, Umpunjun P. Cytogenetic and pollen identification of genus Gagnepainia (Zingiberaceae) in Thailand. Comparative cytogenetics [Internet]. 2020;14(1):11. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6971126/ ).

FISH (fluorescence in situ hybridization) for chromosome characterization

FISH, unlike conventional cytogenetic techniques, is based on specific molecular reactions between chromosomal DNA and any other sequence called a 'sonda probe'. The principle of this technique consists of the hybridization of DNA probes, previously labeled with a specific fluorochrome, directly on the chromosomal DNA, taking advantage of the homology existing between them. For the detection of such probes, the chromosomal preparations are exposed to ultraviolet light, which causes the excitation of the electrons of the fluorescent molecule, which is characterized by an emission of rays, whose wavelength varies, depending on the type of fluorochrome used.

The adaptation of FISH protocols to an increasing number of plant species has opened up new possibilities for the study of plant genomes (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). For example, using this technique, cytogenomic characterization of twenty accessions covering eight species of the genus Hedysarum was performed for the first time to assess genetic diversity and karyotyping (7575. Yurkevich OY, Samatadze TE, Selyutina IY, Romashkina SI, Zoshchuk SA, Amosova AV, et al. Molecular Cytogenetics of Eurasian Species of the Genus Hedysarum L.(Fabaceae). Plants [Internet]. 2021;10(1):89. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/10/1/89).

One of FISH modifications is called genomic in situ hybridization (GISH), which allows differential coloring of chromosomes from different ancestors (in the case of a species) or parental genomes (in the case of a hybrid) (77. Herrera JC. La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales. Agronomía Colombiana [Internet]. 2007;25(1):26-35. Available from: https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/14394 ). Recently, GISH in combination with FISH was applied for the study of chromosome structure in Medicago sativa, due to the fact that this species has very small chromosomes, which makes it difficult to study by means of classical cytogenetics (7676. Falistocco E. Insight into the Chromosome Structure of the Cultivated Tetraploid Alfalfa (Medicago sativa subsp. sativa L.) by a Combined Use of GISH and FISH Techniques. Plants [Internet]. 2020;9(4):542. Available from: https://www.mdpi.com/2223-7747/9/4/542 ).

Another variant of the technique is called Comparative Genome Hybridization or CGH (for comparative genome hybridization), in which the genomic DNA of a standard species (for example, Arabidopsis) is used as a probe to hybridize it on chromosomes of another species, which allows analyzing the karyotype of a given species with a molecular approach, without the need to use specific sequences that are difficult to obtain. This cross-hybridization generates a series of bands on chromosomes of the species studied, which correspond to conserved genomic regions (usually repetitive sequences) between the two species (7777. Ali HB, Lysak MA, Schubert I. Genomic in situ hybridization in plants with small genomes is feasible and elucidates the chromosomal parentage in interspecific Arabidopsis hybrids. Genome [Internet]. 2004;47(5):954-60. Available from: https://cdnsciencepub.com/doi/abs/10.1139/g04-041 ,7878. Zúñiga Orozco A, Carrodeguas González A. Echeveria (Crassulaceae): Potencial para la mejora genética como ornamental. Avances en Investigacion Agropecuaria [Internet]. 2021;25(3). Available from: https://web.a.ebscohost.com/abstract?direct=true&profile=ehost&scope=site&authtype=crawler&jrnl=01887890&AN=152784811&h=GAcr%2fP99pQ1turyHWas7Eodczrf6DxIaMO0fOtGBXyAUt8ppeGQGcJex9Ehjusv3wAeCx520PXn9ZgtHc63VYg%3d%3d&crl=c&resultNs=AdminWebAuth&resultLocal=ErrCrlNotAuth&crlhashurl=login.aspx%3fdirect%3dtrue%26profile%3dehost%26scope%3dsite%26authtype%3dcrawler%26jrnl%3d01887890%26AN%3d152784811 ). For example, this technique was recently used to study the chromosomal structure of two species of the genus Carex, and to test the taxonomic hypothesis of hybrid origins in Carex salina and C. ramenskii (7979. Nowak MD, Pedersen ATM, Brysting AK, Schrøder-Nielsen A, Elven R, Bjorå CS. Testing hypotheses of hybrid origins for two seashore species of Carex section Phacocystis (Cyperaceae). Botanical Journal of the Linnean Society [Internet]. 2020;194(1):100-17. Available from: https://academic.oup.com/botlinnean/article/194/1/100/5856095?login=true ).

Conclusions