INTRODUCCIÓN

Además de la nutrición de las plantas, la simbiosis micorrízica arbuscular afecta, de forma positiva, la capacidad de estas para superar los estreses biótico y abiótico, de forma tal que comúnmente mejoran la tolerancia a las condiciones ambientales desfavorables y la resistencia a los patógenos (11. Rivero J, Gamir J, Aroca R, Pozo MJ, Flors V. Metabolic transition in mycorrhizal tomato roots. Frontiers in Microbiology [Internet]. 2015 [cited 05/07/2022]; doi:10.3389/fmicb.2015.00598 ). El establecimiento y el mantenimiento de la asociación requieren un alto grado de coordinación entre ambos socios y un control bidireccional (planta-hongos) del intercambio justo de recursos entre simbiontes (22. Lanfranco L, Bonfante P, Genre A. The Mutualistic Interaction between Plants and Arbuscular Mycorrhizal Fungi. Microbiology Spectrum. 2016;1-20. doi:10.1128/microbiolspec.FUNK-0012-2016 ). De hecho, se ha propuesto una regulación precisa de los niveles hormonales como un mecanismo central en la regulación de la interacción (33. Pozo MJ, López-Ráez JA, Azcón-Aguilar C, García-Garrido JM. Phytohormones as integrators of environmental signals in the regulation of mycorrhizal symbioses. New Phytologist. 2015;205(4):1431-6. doi:https://doi.org/10.1111/nph.13252 ).

Los hongos micorrizógenos arbusculares (HMA) no solo son microorganismos edáficos, sino que el micelio extraradical, que es la estructura más abundante y que se encarga de la absorción de los nutrientes y el agua, entre otros efectos, se encuentra en el suelo. Incluso dentro de la simbiosis es inusual porque el grueso de las estructuras se encuentra en el suelo y no dentro del hospedero; por tanto, no es de extrañar la importancia que tienen las condiciones edáficas en el funcionamiento micorrízico (44. Helgason T, Fitter AH. Natural selection and the evolutionary ecology of the arbuscular mycorrhizal fungi (Phylum Glomeromycota). Journal of Experimental Botany. 2009;60(9):2465-80. doi:10.1093/jxb/erp144 ). Aunque no hay una especificidad de socio estricta en la simbiosis micorrízica arbuscular (MA), el resultado de las interacciones que se establecen depende de los socios que interactúan y las condiciones ambientales (55. Smith FA, Smith SE. How harmonious are arbuscular mycorrhizal symbioses? Inconsistent concepts reflect different mindsets as well as results. The New Phytologist. 2015;205(4):1381-4.). En este sentido, el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) ha propuesto un sistema de recomendación de cepas eficientes en términos de nutrición y ecoservicios, basado, fundamentalmente, en el tipo de suelo y su fertilidad asociada (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.).

Este sistema tiene como objetivo maximizar los efectos de estos hongos, con la consecuente disminución de la aplicación de fertilizantes y un máximo de rendimiento, derivado de los ecoservicios de esta simbiosis. En el mismo se incluye el pH como determinante de la maximización de los efectos, el cual está asociado a los niveles de Ca²⁺ y Mg²⁺, de forma tal que estos también pudieran asociarse con la respuesta efectiva de las cepas.

Por otra parte, las plagas de las plantas deben ser manejadas para mantener la calidad y la abundancia de alimentos. Para ello se han utilizado diferentes enfoques con el fin de prevenir y mitigar el efecto de las plagas (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ). En el marco de la agricultura actual, el uso de los HMA ha cobrado una importancia vital, no solo por su contribución al desarrollo y nutrición de las plantas, sino también por los efectos como agentes antiestrés que estos microorganismos tienen, tanto en los estreses bióticos como abióticos (88. Lanfranco L, Fiorilli V, Gutjahr C. Partner communication and role of nutrients in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 2018;220(4):1031-46. doi:https://doi.org/10.1111/nph.15230 ). En este sentido, el uso de HMA como agentes antiestrés contra enfermedades ha cobrado un interés cada vez más creciente. Se han propuesto diferentes mecanismos por los cuales estos hongos son capaces de inducir protección en sus hospedantes vegetales, entre los que se incluyen mejoras en la nutrición, cambios en los exudados radicales, inducción de mecanismos activos de defensa e incluso, traslocación de señales utilizando la red hifal para inducir mecanismos defensivos en las plantas de la vecindad, con el fin de que esta respuesta pueda prevenir el desarrollo y el establecimiento del patógeno (99. Venturi V, Keel C. Signaling in the Rhizosphere. Trends in Plant Science. 2016;21(3):187-98. doi:10.1016/j.tplants.2016.01.005 ).

Diferentes autores han hecho énfasis en el hecho de que el establecimiento y la eficiencia simbiótica de estos microorganismos están influenciados por el ambiente edáfico, específicamente por la fertilidad del suelo y su pH (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.,1010. Herrera-Peraza RA, Hamel C, Fernández F, Ferrer RL, Furrazola E. Soil-strain compatibility: the key to effective use of arbuscular mycorrhizal inoculants? | SpringerLink. 2011;21:183-193.).

Este trabajo tuvo como objetivo dilucidar en qué medida el pH del suelo puede influenciar la eficiencia simbiótica y, por tanto, el efecto de bioprotección ejercido por tres cepas de HMA.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal: Se empleó frijol (Phaseolus vulgaris L.) de la variedad Preto Estrela, cedida por el grupo de semillas de EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, en Portugués) Agrobiología.

Condiciones experimentales: A partir de un suelo Argissolo rojo-amarillento (1111. Wendland-Ferreira A. Comunicación personal EMBRAPA [Internet]. 2020 [19/07/2022]. Available from: https://www.embrapa.br/agencia-de-informacao-tecnologica/inicial ), que corresponde a un Acrisol Rhodic Santi según World Reference Base con pH-H₂O de 4,94 y contenidos de Ca²⁺ y Mg²⁺ intercambiables de 0,17 y 0,05 cmol_cd^-1, se procedió a preparar tres condiciones de pH (5,5; 6,5 y 7,2) con CaCO₃ y se ajustó a concentraciones similares de Ca²⁺ y Mg²⁺ en los tres pHs de 1,63 y 0,26 cmol_cd^-1 utilizando CaSO₄ y MgSO₄. Con el procedimiento descrito se eliminó el posible enmascaramiento que ocasionan cantidades variables de Ca²⁺ y Mg²⁺ en los diferentes tratamientos y que impide establecer el efecto del pH.

Hongos micorrízicos arbusculares (HMA): Se utilizaron las cepas de HMA Rhizophagus irregularis (Blaszk, Wubet, Renker & Buscot) Walker & Shüβler (INCAM-11, DAOM-711363) y Glomus cubense (Y. Rodr. & Dalpé) (INCAM-4, DAOM-241198), procedentes de la colección del Laboratorio de Micorrizas del INCA, San José de las Lajas, Mayabeque, que se encontraban conservadas en una solución protegida osmóticamente (1212. Fernández F, Dell’Amico J, Pérez Y. Inoculante micorrizógeno líquido. Oficina Cubana de la Propiedad Industrial. 2009;23479.). También se usó la cepa Rizophagus clarus (Nicol. & Schenck) Walker & Shüβler (A5, CNPAB) proveniente del Biological Resource Center Johanna Döbereiner (CRB-JD) EMBRAPA Agrobiología, Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil, conservadas en sustrato a 4 ºC cuyo título era de 75 esporas g^-1 de sustrato y que se aplicó en el nicho de siembra a razón de 1 g. Esta cepa es aislada de los suelos de Brasil y, por tanto, está adaptada a las condiciones de acidez de los suelos de esta zona.

La inoculación con HMA se realizó en la siembra y en la emergencia de las plantas para Rhizophagus irregularis y Glomus cubense empleando un inóculo líquido a razón de 60 esporas mL^-1 y en el nicho de siembra para Rhizophagus clarum, a razón de 1 g de inoculante sólido con un contenido de esporas de 75 esporas por g de suelo.

Se utilizaron macetas de 1 kg con una planta por maceta, a las cuales se les adicionó semanalmente solución de Hoagland ajustada a una concentración de fósforo, equivalente a un cuarto de la solución inicial (1/4 P equivale a 0,204 g L^-1), para mantener un suministro de nutrientes que permitieran el correcto desarrollo del cultivo, así como alcanzar una micorrización efectiva.

Las plantas se desarrollaron en condiciones semicontroladas de temperatura (24 ºC±2 ºC), humedad relativa (80-85 %) y fotoperíodo natural (14 horas luz-10 horas oscuridad). Los experimentos se ejecutaron en condiciones de invernadero en las aéreas de EMBRAPA Agrobiología, Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil.

Los tratamientos establecidos se pueden observar en la Tabla 1.

Patógeno: Se utilizó como patógeno Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli mantenido en PDA y cedido por el laboratorio de fitopatógenos de EMBRAPA Brasilia, Brasil. El inóculo del fitopatógeno se obtuvo a partir de colonias crecidas por 15 días en placas Petri de 90x14 mm, contentivas del medio de esporulación para frijol (Agar 15 g; dextrosa 20 g; hojas de frijol 200 g y completar con agua destilada a 1000 mL pH 5,9) (1111. Wendland-Ferreira A. Comunicación personal EMBRAPA [Internet]. 2020 [19/07/2022]. Available from: https://www.embrapa.br/agencia-de-informacao-tecnologica/inicial ) y se realizó un inóculo mixto con las razas 149 y 151 que son las de mayor incidencia en las condiciones de Brasil. A las placas se les añadió 20 mL de agua destilada estéril y se colectó el micelio con una espátula de Drigalski. Se ajustó la concentración a 10⁵ esporas mL^-1 por conteo en cámara de Neubauer. La inoculación se realizó en plantas de 21 días de edad, aplicándose el patógeno por aspersión en la zona de la raíz a razón de 5 mL planta^-1.

Se desarrolló un experimento de parcela dividida en la que cada parcela correspondió a un pH con ocho tratamientos para cada parcela, que consistieron en la inoculación simple de cada cepa de HMA y un testigo sin inocular combinados con la inoculación o no del patógeno, según Tabla 1. Se utilizaron ocho macetas por tratamiento con tres plantas cada uno. Las plantas inoculadas con Fusarium oxysporum se mantuvieron separadas de las no inoculadas. Posterior a la inoculación del patógeno, a los 21 días de emergidas las plantas, estas se mantuvieron en cámara húmeda cerradas con nylon por 48 horas. En todos los tratamientos se evaluaron diariamente los síntomas y signos de la enfermedad, contando como día cero el momento en que las plantas fueron inoculadas y hasta el día cinco que correspondió a plantas de 25 días después de la germinación. En cada momento se evaluó el porcentaje de necrosis foliar por hoja, calculándose el promedio de las mediciones en todas las hojas de cada planta. La severidad de los daños se evaluó mediante la medición del grado de marchitez en cada planta (1313. Pozo MJ, Cordier C, Dumas‐Gaudot E, Gianinazzi S, Barea JM, Azcón‐Aguilar C. Localized versus systemic effect of arbuscular mycorrhizal fungi on defence responses to Phytophthora infection in tomato plants. Journal of Experimental Botany. 2002;53(368):525-34. doi:10.1093/jexbot/53.368.525 ). Durante cada evaluación se realizó el muestreo destructivo de las plantas de una maceta para determinar la frecuencia e intensidad de la colonización micorrízica, así como la extracción de proteínas totales para evaluar actividad enzimática de peroxidasas.

Determinación de la ocupación fúngica: Se conformó una muestra de un pool de raíces correspondientes a tres plantas/tratamiento que se secaron a 70 °C y se tiñeron con tinta al 5 % en ácido acético al 2 % (1414. Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots†. Physiologia Plantarum. 2005;125(4):393-404. doi:https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2005.00564.x ). Se evaluaron la frecuencia de colonización por el método de los interceptos (1515. Giovannetti M, Mosse B. An Evaluation of Techniques for Measuring Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Infection in Roots. The New Phytologist. 1980;84(3):489-500.) y la intensidad de la colonización (D.V) mediante el método descrito (1616. Trouvelot A, Kough JL, Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthode d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In 1986 [cited 11/07/2022]. p. 217-21. Available from: http://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=getRecordDetail&idt=8758731 ).

Extracción de enzimas y determinación de Peroxidasas: Las muestras de raíces y hojas se maceraron en nitrógeno líquido de forma independiente y se homogenizaron en proporción 1:2 (g mL^-1), con solución amortiguadora de extracción (acetato de sodio, 0,1 M, pH 5,2; que contenía 5 g de polivinilpirrolidona y 0,05 g de β- mercaptoetanol, en 100 mL de solución de extracción). El homogenato se agitó en zaranda durante 45 minutos, en baño de hielo, luego se filtró a través de gasa y se centrifugó a 14 000 x G, a 4 °C durante 25 minutos, en centrífuga refrigerada. El sobrenadante se almacenó a -80 °C hasta su uso, para las determinaciones de concentración de proteínas totales y la actividad enzimática peroxidasa. La concentración de proteínas se determinó por el método descrito por Bradford (1717. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976;72(1):248-54. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3 ).

Actividad peroxidasa (PRX) (Clasificación enzimática (E.C) 1.11.1.7): Se realizó según el método continúo descrito (1818. Heitefuß R, Williams PH. Oxidative enzymes. In: HEITEFUSS, R., and P. H. WILLIAMS. In: Physiological Plant Pathology [Internet]. New York: Springer Science & Business Media; 2012. p. 617-27. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=hfLuCAAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA1&dq=Oxidative+enzymes.+In:+HEITEFUSS,+R.,+and+P.+H.+WILLIAMS+(eds.).+Physiological+Plant+Pathology.+Encyclopedia+of+Plant+Pathology&ots=fu0GAetnMC&sig=pBM1iYFG95tlKKzYoQXrcb4q7UQ#v=onepage&q&f=false ). La velocidad de oxidación del guayacol se determinó en espectrofotómetro (Ultrospec Plus Spectrophotometer, Pharmacia LKB), registrándose los valores de absorbancia a 470 nm. Se tomó la variación de la absorbancia, durante dos minutos a intervalos de 10 segundos. La actividad enzimática se expresó como μmoles de producto formado min^-1 mL^-1 de enzima.

Posteriormente se calculó la actividad específica, a partir de la relación de la actividad enzimática y la concentracion de proteínas de cada muestra.

Análisis estadístico de los datos: Se usaron técnicas paramétricas y no paramétricas en función de la variable analizada. La severidad de la enfermedad producida por el patógeno se presenta según la siguiente fórmula % de plantas sanas=100-% de marchitez detectada, para visualizar una dinámica de severidad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Una de las premisas que se establecen para que los hongos micorrízicos ejerzan su efecto es que deben estar establecidos y con suficientes estructuras fúngicas que les permitan ejercer su acción (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ). En este sentido, la Figura 1 representa los niveles de intensidad de la colonización que incluyen, no solo la presencia o ausencia del hongo en la raíz como en el caso de la frecuencia o colonización, sino también la cantidad de estructuras fúngicas que se detectan como un mejor indicativo del funcionamiento de la simbiosis (1515. Giovannetti M, Mosse B. An Evaluation of Techniques for Measuring Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Infection in Roots. The New Phytologist. 1980;84(3):489-500.,1919. Sun-Xue G, Tang M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 2012;90:1073-83. doi:10.1139/b2012-084 ).

La cepa cedida por el grupo de EMBRAPA Agrobiología presentó la mayor intensidad micorrízica en el pH más ácido, mientras que en el pH de 6,5 la mayor ocupación se encontró con la inoculación de G. cubense, seguida por la inoculación de R. irregulare y con un comportamiento inferior de la cepa R. clarus. En el pH 7,2 los comportamientos de R. irregulare y G. cubense fueron muy similares y superiores al obtenido al inocular R. clarus, Los resultados que se han alcanzado en Cuba sobre manejo de inoculantes micorrízicos, incluyen la utilización de cepas eficientes de carácter generalista, cuya condición de eficiencia es dependiente del pH del suelo o sustrato en que se vaya a desarrollar el cultivo inoculado (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). La cepa G. cubense/INCAM-4 se recomienda para utilizar en suelos cuyos pH-H₂O fluctúan entre 5,8 y 7,2.; mientras que la cepa R. irregulare/INCAM-11 se recomienda para pH entre 7 y 8, con una zona de solapamiento o transición de la eficiencia de ambas cepas entre pH 7 y 7,2. Los resultados de este trabajo corroboran los criterios ya descritos por diferentes autores (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.) y permiten incluir este tipo de suelo de origen brasilero, que como se observa, cambia la cepa eficiente en función del pH, con lo cual se incrementan los tipos de suelos en que se cumplen y no quedan circunscritos a los suelos cubanos. En el caso de la cepa R. clarus es una cepa aislada de suelos de Brasil, recomendada para inocular diversos cultivos en los suelos más ácidos de este país y, por tanto, que presentara la mayor efectividad en el pH ácido.

Es de señalar que trabajos de comparación de efectividad de las cepas INCAM con varias especies de gramíneas forrajeras y en diversos suelos, realizados anteriormente (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.), demostraron un cambio de efectividad de las cepas por tipo de suelo y explicable por los cambios en el pH, aunque las altas correlaciones en condiciones naturales entre el pH y los contenidos de Ca y Mg en los suelos enmascararon el referido efecto.

Los HMA se adaptan a un amplio espectro de condiciones edáficas que están relacionadas con su ocurrencia, desarrollo y eficacia (2121. Kanwal S, Bano A, Malik RN. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in phytoremediation of heavy metals and effects on growth and biochemical activities of wheat (Triticum aestivum L.) plants in Zn contaminated soils. African Journal of Biotechnology. 2016;15(20):872-83. doi:10.4314/ajb.v15i20 ) e influyen en el funcionamiento de la simbiosis micorrízica sujeta a la interacción de varios factores edáficos (44. Helgason T, Fitter AH. Natural selection and the evolutionary ecology of the arbuscular mycorrhizal fungi (Phylum Glomeromycota). Journal of Experimental Botany. 2009;60(9):2465-80. doi:10.1093/jxb/erp144 ), con especial énfasis en el pH (2222. Chaudhary VB, O’Dell TE, Rillig MC, Johnson NC. Multiscale patterns of arbuscular mycorrhizal fungal abundance and diversity in semiarid shrublands. Fungal Ecology. 2014;12:32-43. doi:10.1016/j.funeco.2014.06.003 ). El pH es considerado una de las propiedades químicas más importantes del suelo (2323. Alguacil M del M, Torres MP, Montesinos-Navarro A, Roldán A. Soil Characteristics Driving Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Semiarid Mediterranean Soils. Applied and Environmental Microbiology. 2016;82(11):3348-56. doi:10.1128/AEM.03982-15 ), debido al efecto que ejerce, tanto sobre las características físicas, químicas y biológicas de éste, como también sobre el rendimiento de los cultivos. Esta variable puede determinar, desde el punto de vista biológico, el tipo de organismo que se desarrolle sobre un suelo, debido a su gran influencia sobre la disponibilidad de nutrientes. Al respecto, se afirma que los hongos y el grupo de bacterias actinomicetos constituyen los dos grandes grupos de microorganismos del suelo y el predominio de uno u otro grupo depende de las condiciones locales, especialmente del pH y del contenido de humedad (2424. Wild A. Condiciones del suelo y desarrollo de las plantas según Russell. In: La población microbiana del suelo. Mur di-Prensa. Madrid, España: Ed. Mundi-Prensa; 1992. p. 471-94.). Entre estos microorganismos se encuentran los hongos micorrízicos arbusculares, los cuales viven en simbiosis mutualista con alrededor del 95 % de las especies del reino vegetal (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.).

Se considera que la condición de acidez del suelo, expresada a través de su pH, se encuentra vinculada al funcionamiento de los HMA (2525. Igiehon NO, Babalola OO. Below-ground-above-ground Plant-microbial Interactions: Focusing on Soybean, Rhizobacteria and Mycorrhizal Fungi. The Open Microbiology Journal. 2018;12:261-79. doi:10.2174/1874285801812010261 ). Actualmente son explicables los efectos del pH sobre la disponibilidad de nutrientes, la regulación de procesos de intercambio iónico y la diversidad de microorganismos asociados a la micorrizosfera (2626. Jamiołkowska A, Księżniak A, Gałązka A, Hetman B, Kopacki M, Skwaryło-Bednarz B. Impact of abiotic factors on development of the community of arbuscular mycorrhizal fungi in the soil: a review. International Agrophysics. 2018;32(1):133-40. doi:10.1515/intag-2016-0090 ,2727. Bücking H, Kafle A. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Nitrogen Uptake of Plants: Current Knowledge and Research Gaps. Agronomy. 2015;5(4):587-612. doi:10.3390/agronomy5040587 ). Además se han informado otros efectos más directos sobre la germinación y la esporulación (2525. Igiehon NO, Babalola OO. Below-ground-above-ground Plant-microbial Interactions: Focusing on Soybean, Rhizobacteria and Mycorrhizal Fungi. The Open Microbiology Journal. 2018;12:261-79. doi:10.2174/1874285801812010261 ). No obstante, se considera que aún no está suficientemente claro cuál es el mecanismo que explica y condiciona los cambios en funcionamiento y efectividad de estas cepas con el pH del suelo.

Las Figuras 2 y 3 presentan los niveles de protección ejercidos por las diferentes cepas en los pHs usados en el experimento y la actividad específica de peroxidasas detectadas.

Las plantas que no fueron inoculadas con el patógeno no presentaron daños en las hojas y sin diferencias significativas entre dichos tratamientos. En los tratamientos inoculados con las cepas de F. oxysporum, si bien en todos los pH se encontraron daños en las plantas, independientemente de la inoculación de una u otra cepa de HMA, aunque en estos últimos los daños fueron mucho menores, variando el referido efecto de bioprotección alcanzado con cada cepa con el pH.

La magnitud del efecto de bioprotección que originó cada cepa de HMA en un determinado pH se asoció con el grado de intensidad fúngica que alcanzó dicha cepa en ese mismo pH (Figura 1), de forma tal que en cada pH la cepa o cepas con mayor intensidad de colonización presentaron, a la vez, el mayor efecto de bioprotección. Por tanto, los resultados indicaron que el efecto de bioprotección se asoció con el grado de efectividad o funcionamiento micorrízico que presentó cada cepa, el cual fue dependiente del pH.

Es de destacar la alta relación entre el efecto de bioprotección que presentaron las cepas INCAM4 e INCAM11 y la recomendación de cepas HMA eficientes en función del pH como criterio para su inoculación (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). Los resultados también indicaron el valor agregado que presenta la utilización de estas cepas como base para la conformación de los inoculantes, ya que no solo alcanzaron un alto funcionamiento micorrízico y los beneficios comúnmente asociados a este (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.), sino también un mayor efecto de bioprotección.

El efecto de bioprotección relacionado con el funcionamiento micorrízico ha estado asociado a la inducción de mecanismos defensivos de las plantas y dentro de estos mecanismos las peroxidasas han sido una de la PR-proteínas vinculadas (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ,2828. Choudhary KK, Chaudhary N, Agrawal S, Agrawal M. Reactive Oxygen Species in Plants: Boon Or Bane - Revisiting the Role of ROS. In: Reactive oxygen species: generation, damage and quenching in plants during stress. In: Singh V.P. Wiley, Hoboken. NJ, USA: John Wiley & Sons; 2017.). En la Figura 3 se aprecia que en cualquiera de los pH en los tratamientos que no recibieron el patógeno, se encontraron niveles basales de actividad PRX que no difirieron entre sí, bien fueran inoculadas con cepas de HMA o el control.

Sin embargo, en presencia del patógeno, en todos los casos, la inducción enzimática fue superior. En el caso de las plantas micorrizadas se encontraron diferencias significativas entre las inducciones de peroxidasas ocasionadas por las cepas de HMA y dependiente este efecto del pH. En cada pH, la cepa que originó los mayores valores de la inducción de peroxidasas, fue la que ocasionó el mayor efecto de bioprotección y, al mismo tiempo, alcanzó la mayor intensidad fúngica.

Los mecanismos inducidos por los HMA para atenuar el daño oxidativo y proteger la función de la célula vegetal abarcan a una serie de mecanismos de tolerancia activados por estos hongos como mejoras en la nutrición y la toma de agua, la modulación y la expresión de genes que están relacionados con la señalización y, por tanto, la respuesta al estrés (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ). El funcionamiento de estos hongos, sin embargo, está mediado por las condiciones edáficas entre las que el pH destaca como un elemento importante ya que esta propiedad química del suelo determina en muchos casos la eficiencia del endófito, el porcentaje de germinación de las esporas y el desarrollo de las micorrizas arbusculares (2929. Ouzounidou G, Skiada V, Papadopoulou KK, Stamatis N, Kavvadias V, Eleftheriadis E, et al. Effects of soil pH and arbuscular mycorrhiza (AM) inoculation on growth and chemical composition of chia (Salvia hispanica L.) leaves. Brazilian Journal of Botany. 2015;38(3):487-95. doi:10.1007/s40415-015-0166-6 ,3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ).

La acidez del suelo limita la productividad de las plantas, inhibe la elongación de la raíz y reduce la solubilidad del fósforo (P). Es por este motivo que algunas especies de HMA pueden verse afectadas por esta condición de acidez, como la mayoría de las especies de Glomus (3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ). La relación que se establece entre los rangos de pH del suelo y el efecto de la colonización micorrizógena es verdaderamente complejo, dependiendo no sólo de la especie micótica, sino también del tipo de suelo, la forma en que se encuentran los nutrientes (fundamentalmente P y N y otros elementos como Cu, Zn, Mo, B, etc.) y en menor medida de la especie de planta sobre la que se desarrolla (2727. Bücking H, Kafle A. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Nitrogen Uptake of Plants: Current Knowledge and Research Gaps. Agronomy. 2015;5(4):587-612. doi:10.3390/agronomy5040587 ).

Las cepas que componen el biofertilizante EcoMic^® producido en Cuba y de las cuales, dos formaron parte de este estudio, se pueden clasificar según Opik (3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ), como generalistas con los cultivos y específicas con el pH del suelo (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). En este sentido, la eficiencia de las cepas está maximizada en las condiciones en las que desempeña su mejor función, no solo en la toma de nutrientes y agua (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.,3131. Gilbert L, Johnson D. Chapter Four - Plant-Plant Communication Through Common Mycorrhizal Networks. In: Becard G, editor. Advances in Botanical Research [Internet]. Academic Press; 2017 [cited 19/07/2022]. p. 83-97. (How Plants Communicate with their Biotic Environment; vol. 82). doi:10.1016/bs.abr.2016.09.001 ,3232. Lambers H, Albornoz F, Kotula L, Laliberté E, Ranathunge K, Teste FP, et al. How belowground interactions contribute to the coexistence of mycorrhizal and non-mycorrhizal species in severely phosphorus-impoverished hyperdiverse ecosystems. Plant and Soil. 2018;424(1):11-33. doi:10.1007/s11104-017-3427-2 ), sino también en cuanto a los mecanismos de protección que inducen en las plantas y que se demuestran aquí en la inducción de peroxidasas, que se revierte en una protección de las membranas biológicas (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ,2828. Choudhary KK, Chaudhary N, Agrawal S, Agrawal M. Reactive Oxygen Species in Plants: Boon Or Bane - Revisiting the Role of ROS. In: Reactive oxygen species: generation, damage and quenching in plants during stress. In: Singh V.P. Wiley, Hoboken. NJ, USA: John Wiley & Sons; 2017.). Esta resultó siempre mejor en la cepa que funcionó en el pH para la cual se recomienda, con lo cual deja claro que, en nuestro caso, la bioprotección es un atributo más de la efectividad de la simbiosis.

CONCLUSIÓN

La inoculación de cepas eficientes de HMA produce un significativo efecto de bioprotección que se asocia directamente con la inducción de peroxidasas y ambos son consecuencia del grado de funcionamiento micorrízico que alcanzan las diferentes cepas. Este último, depende del pH del suelo en que se desarrollan las plantas micorrizadas. Al menos con las cepas estudiadas el efecto de bioprotección no se asocia a una cepa “per se” y es otro atributo de la efectividad del funcionamiento micorrízico.

INTRODUCTION

In addition to plant nutrition, arbuscular mycorrhizal symbiosis positively affects the ability of plants to overcome biotic and abiotic stresses, thereby commonly improving tolerance to unfavorable environmental conditions and resistance to pathogens (11. Rivero J, Gamir J, Aroca R, Pozo MJ, Flors V. Metabolic transition in mycorrhizal tomato roots. Frontiers in Microbiology [Internet]. 2015 [cited 05/07/2022]; doi:10.3389/fmicb.2015.00598 ). The establishment and maintenance of the association requires a high degree of coordination between both partners and a bidirectional (plant-fungus) control of the fair exchange of resources between symbionts (22. Lanfranco L, Bonfante P, Genre A. The Mutualistic Interaction between Plants and Arbuscular Mycorrhizal Fungi. Microbiology Spectrum. 2016;1-20. doi:10.1128/microbiolspec.FUNK-0012-2016 ). In fact, precise regulation of hormone levels has been proposed as a central mechanism in regulating the interaction (33. Pozo MJ, López-Ráez JA, Azcón-Aguilar C, García-Garrido JM. Phytohormones as integrators of environmental signals in the regulation of mycorrhizal symbioses. New Phytologist. 2015;205(4):1431-6. doi:https://doi.org/10.1111/nph.13252 ).

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are not only edaphic microorganisms, but the extraradical mycelium, which is the most abundant structure and is responsible for nutrient and water uptake, among other effects, is found in the soil. Even within the symbiosis it is unusual because the bulk of the structures are found in the soil and not within the host; therefore, then edaphic conditions in mycorrhizal functioning is important (44. Helgason T, Fitter AH. Natural selection and the evolutionary ecology of the arbuscular mycorrhizal fungi (Phylum Glomeromycota). Journal of Experimental Botany. 2009;60(9):2465-80. doi:10.1093/jxb/erp144 ). Although there is no strict partner specificity in arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis, the outcome of the interactions that are established depends on the interacting partners and environmental conditions (55. Smith FA, Smith SE. How harmonious are arbuscular mycorrhizal symbioses? Inconsistent concepts reflect different mindsets as well as results. The New Phytologist. 2015;205(4):1381-4.). In this sense, the National Institute of Agricultural Sciences (INCA) has proposed a system for recommending efficient strains in terms of nutrition and ecoservices, based, fundamentally, on the type of soil and its associated fertility (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.).

This system aims to maximize the effects of these fungi, with a consequent decrease in fertilizer application and maximum yield, derived from the ecoservices of this symbiosis. It includes pH as a determinant of the maximization of the effects, which is associated with Ca²⁺ and Mg²⁺ levels, so that these could also be associated with the effective response of the strains.

On the other hand, plant pests must be managed to maintain food quality and abundance. To this end, different approaches have been used to prevent and mitigate the effect of pests (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ). In the framework of current agriculture, AMF use has become vitally important, not only because of their contribution to plant development and nutrition, but also because of effects as anti-stress agents that these microorganisms have, both on biotic and abiotic stresses (88. Lanfranco L, Fiorilli V, Gutjahr C. Partner communication and role of nutrients in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 2018;220(4):1031-46. doi:https://doi.org/10.1111/nph.15230 ). In this sense, AMF use as anti-stress agents against diseases has gained increasing interest. Different mechanisms have been proposed by which these fungi are able to induce protection in their plant hosts, including improvements in nutrition, changes in radical exudates, induction of active defense mechanisms, and even translocation of signals using the hyphal network to induce defensive mechanisms in neighboring plants, so that this response can prevent the development and establishment of the pathogen (99. Venturi V, Keel C. Signaling in the Rhizosphere. Trends in Plant Science. 2016;21(3):187-98. doi:10.1016/j.tplants.2016.01.005 ).

Different authors have emphasized the fact that the establishment and symbiotic efficiency of these microorganisms are influenced by the edaphic environment, specifically by soil fertility and pH (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.,1010. Herrera-Peraza RA, Hamel C, Fernández F, Ferrer RL, Furrazola E. Soil-strain compatibility: the key to effective use of arbuscular mycorrhizal inoculants? | SpringerLink. 2011;21:183-193.).

This work aimed to elucidate to what extent soil pH can influence the symbiotic efficiency and, therefore, the bioprotection effect exerted by three AMF strains.

MATERIALS AND METHODS

Plant material: Beans (Phaseolus vulgaris L.) of the Preto Estrela variety were used, provided by the seed group of EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, in Portuguese) Agrobiology.

Experimental conditions: Starting from a red-yellowish Argissolo soil (1111. Wendland-Ferreira A. Comunicación personal EMBRAPA [Internet]. 2020 [19/07/2022]. Available from: https://www.embrapa.br/agencia-de-informacao-tecnologica/inicial ), which corresponds to an Acrisol Rhodic Santi according to World Reference Base with pH-H₂O of 4.94 and exchangeable Ca²⁺ and Mg²⁺ contents of 0.17 and 0.05 cmolcd^-1, it was proceeded to prepare three pH conditions (5.5; 6.5 and 7.2) with CaCO₃ and adjusted to similar Ca²⁺ and Mg²⁺ concentrations at the three pHs of 1.63 and 0.26 cmolcd^-1 using CaSO₄ and MgSO₄. With the procedure described, the possible masking caused by varying amounts of Ca²⁺ and Mg²⁺ in the different treatments, which prevents establishing the effect of pH, was eliminated.

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF): The AMF strains Rhizophagus irregularis (Blaszk, Wubet, Renker & Buscot) Walker & Shüβler (INCAM-11, DAOM-711363) and Glomus cubense (Y. Rodr. & Dalpé) (INCAM-4, DAOM-241198), from the collection of the Mycorrhizae Laboratory from INCA, San José de las Lajas, Mayabeque, which were preserved in an osmotically protected solution (1212. Fernández F, Dell’Amico J, Pérez Y. Inoculante micorrizógeno líquido. Oficina Cubana de la Propiedad Industrial. 2009;23479.). Rizophagus clarus (Nicol. & Schenck) Walker & Shüβler strain (A5, CNPAB) from the Biological Resource Center Johanna Döbereiner (CRB-JD) EMBRAPA Agrobiology, Seropédica, Rio de Janeiro, Brazil, preserved in substrate at 4 ºC whose titer was 75 spores g^-1 of substrate and which was applied in the planting niche at 1 g rate, was also used. This strain is isolated from the soils of Brazil and, therefore, is adapted to the acidic conditions of soils in this area.

Inoculation with AMF was performed at planting and plant emergence for Rhizophagus irregularis and Glomus cubense using a liquid inoculum at a rate of 60 spores mL^-1 and in the planting niche for Rhizophagus clarum, at a rate of 1 g of solid inoculum with a spore content of 75 spores per g of soil.

The pots were 1 kg pots with one plant per pot, to which Hoagland's solution adjusted to a phosphorus concentration equivalent to a quarter of the initial solution (1/4 P equals 0.204 g L^-1) was added weekly, to maintain a supply of nutrients that would allow the correct development of the crop, as well as to achieve effective mycorrhization.

Plants were grown under semi-controlled conditions of temperature (24 ºC ±2 ºC), relative humidity (80-85 %) and natural photoperiod (14 hours light-10 hours’ dark). The experiments were carried out under greenhouse conditions at EMBRAPA Agrobiologia, Seropédica, Rio de Janeiro, Brazil.

The treatments established are shown in Table 1.

Pathogen: The pathogen used was Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli maintained in PDA and provided by the phytopathogen laboratory of EMBRAPA Brasilia, Brazil. The phytopathogen inoculum was obtained from colonies grown for 15 days in Petri dishes of 90x14 mm, containing the sporulation medium for beans (Agar 15 g; dextrose 20 g; bean leaves 200 g and complete with distilled water at 1000 mL pH 5.9) (1111. Wendland-Ferreira A. Comunicación personal EMBRAPA [Internet]. 2020 [19/07/2022]. Available from: https://www.embrapa.br/agencia-de-informacao-tecnologica/inicial ) and a mixed inoculum was made with races 149 and 151, which are those with the highest incidence in Brazilian conditions. To the plates, 20 mL of sterile distilled water was added and the mycelium was collected with a Drigalski spatula. The concentration was adjusted to 105 spores mL^-1 by counting in a Neubauer chamber. Inoculation was carried out on 21-day-old plants, applying the pathogen by spraying in the root zone at a rate of 5 mL plant^-1.

A split-plot experiment was developed in which each plot corresponded to a pH with eight treatments for each plot, consisting of a single inoculation of each AMF strain and an uninoculated control combined with inoculation or not of the pathogen, according to Table 1. Eight pots per treatment with three plants each were used. Plants inoculated with Fusarium oxysporum were kept separate from non-inoculated plants.

After inoculation with the pathogen, 21 days after the plants emerged, they were kept in a humid chamber closed with nylon for 48 hours. In all treatments, symptoms and signs of the disease were evaluated daily, counting as day zero the moment the plants were inoculated and up to day five, which corresponded to plants 25 days after germination. At each moment, the percentage of leaf necrosis per leaf was evaluated, calculating the average of the measurements on all the leaves of each plant. The severity of the damage was evaluated by measuring the degree of wilting on each plant, according to the scale of Pozo and collaborators (1313. Pozo MJ, Cordier C, Dumas‐Gaudot E, Gianinazzi S, Barea JM, Azcón‐Aguilar C. Localized versus systemic effect of arbuscular mycorrhizal fungi on defence responses to Phytophthora infection in tomato plants. Journal of Experimental Botany. 2002;53(368):525-34. doi:10.1093/jexbot/53.368.525 ). During each evaluation, destructive sampling of plants from a pot was performed to determine the frequency and intensity of mycorrhizal colonization, as well as total protein extraction to evaluate peroxidase enzyme activity.

Determination of fungal occupancy: A pool of roots from three plants/treatment was sampled, dried at 70 °C and stained with 5 % ink in 2 % acetic acid (1414. Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots†. Physiologia Plantarum. 2005;125(4):393-404. doi:https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2005.00564.x ). Colonization frequency was assessed by the intercept method (1515. Giovannetti M, Mosse B. An Evaluation of Techniques for Measuring Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Infection in Roots. The New Phytologist. 1980;84(3):489-500.) and colonization intensity (D. V) by the method described (1616. Trouvelot A, Kough JL, Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthode d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In 1986 [cited 11/07/2022]. p. 217-21. Available from: http://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=getRecordDetail&idt=8758731 ).

Enzyme extraction and Peroxidase determination: Root and leaf samples were macerated in liquid nitrogen independently and homogenized in a 1:2 ratio (g mL^-1), with extraction buffer (sodium acetate, 0.1 M, pH 5.2; containing 5 g polyvinylpyrrolidone and 0.05g β- mercaptoethanol, in 100 mL of extraction solution). The homogenate was shaken in sieve for 45 min, in ice bath, then filtered through gauze and centrifuged at 14 000 x G, at 4 °C for 25 min, in refrigerated centrifuge. The supernatant was stored at -80 °C until use for total protein concentration and peroxidase enzyme activity determinations. Protein concentration was determined by the method described by Bradford (1717. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976;72(1):248-54. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3 ).

Peroxidase activity (PRX) (Enzyme classification (E.C) 1.11.1.7): It was performed according to the continuous method described (1818. Heitefuß R, Williams PH. Oxidative enzymes. In: HEITEFUSS, R., and P. H. WILLIAMS. In: Physiological Plant Pathology [Internet]. New York: Springer Science & Business Media; 2012. p. 617-27. Available from: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=hfLuCAAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA1&dq=Oxidative+enzymes.+In:+HEITEFUSS,+R.,+and+P.+H.+WILLIAMS+(eds.).+Physiological+Plant+Pathology.+Encyclopedia+of+Plant+Pathology&ots=fu0GAetnMC&sig=pBM1iYFG95tlKKzYoQXrcb4q7UQ#v=onepage&q&f=false ). The oxidation rate of guaiacol was determined in spectrophotometer (Ultrospec Plus Spectrophotometer, Pharmacia LKB), registering the absorbance values at 470 nm. The variation of absorbance was taken for two minutes at 10-second intervals. Enzyme activity was expressed as μmoles of product formed min-1 mL^-1 of enzyme.

Subsequently, the specific activity was calculated from the ratio of enzyme activity and protein concentration of each sample.

Statistical analysis of data: Parametric and non-parametric techniques were used according to the variable analyzed. The severity of the disease produced by the pathogen is presented according to the following formula % of healthy plants=100 % wilt detected, to visualize a severity dynamic.

RESULTS AND DISCUSSION

One of the premises established for mycorrhizal fungi to exert their effect is that they must be established and with sufficient fungal structures that allow them to exert their action (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ). In this sense, Figure 1 represents colonization intensity levels that include not only the presence or absence of the fungus in the root as in the case of frequency or colonization, but also the amount of fungal structures that are detected as a better indication of the functioning of the symbiosis (1515. Giovannetti M, Mosse B. An Evaluation of Techniques for Measuring Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Infection in Roots. The New Phytologist. 1980;84(3):489-500.,1919. Sun-Xue G, Tang M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 2012;90:1073-83. doi:10.1139/b2012-084 ).

The strain provided by the EMBRAPA Agrobiology group presented the highest mycorrhizal intensity at the most acidic pH, while at pH 6.5 the highest occupancy was found with the inoculation of G. cubense, followed by the inoculation of R. irregulare and with a lower performance of the R. clarus strain. At pH 7.2 the behaviors of R. irregulare and G. cubense were very similar and superior to those obtained when inoculating R. clarus. Results that have been achieved in Cuba on the management of mycorrhizal inoculants include the use of efficient strains of generalist character, whose efficiency condition is dependent on the pH of the soil or substrate in which the inoculated crop will be developed (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). G. cubense/INCAM-4 strain is recommended for use in soils whose pH-H₂O fluctuates between 5.8 and 7.2; while R. irregulare/INCAM-11 strain is recommended for pH between 7 and 8, with an overlapping or transition zone of efficiency of both strains between pH 7 and 7.2. Results of this work corroborate the criteria already described by different authors (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.) and allow the inclusion of this type of soil of Brazilian origin, which as it is observed, changes the efficient strain as a function of pH, with which the types of soils in which they are fulfilled are increased and are not circumscribed to Cuban soils. In the case of R. clarus strain, it is a strain isolated from Brazilian soils, recommended to inoculate diverse crops in the most acid soils of this country and, therefore, which will present the highest effectiveness in the acid pH.

It should be noted that previous studies comparing the effectiveness of INCAM strains with several species of forage grasses and in different soils showed a change in the effectiveness of the strains by soil type and explained by changes in pH (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.). Although the high correlations in natural conditions between pH and Ca and Mg contents in soils masked the referred effect.

AMF are adapted to a wide spectrum of edaphic conditions that are related to their occurrence, development, and effectiveness (2121. Kanwal S, Bano A, Malik RN. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in phytoremediation of heavy metals and effects on growth and biochemical activities of wheat (Triticum aestivum L.) plants in Zn contaminated soils. African Journal of Biotechnology. 2016;15(20):872-83. doi:10.4314/ajb.v15i20 ) and influence the functioning of the mycorrhizal symbiosis subject to the interaction of several edaphic factors (44. Helgason T, Fitter AH. Natural selection and the evolutionary ecology of the arbuscular mycorrhizal fungi (Phylum Glomeromycota). Journal of Experimental Botany. 2009;60(9):2465-80. doi:10.1093/jxb/erp144 ), with special emphasis on pH (2222. Chaudhary VB, O’Dell TE, Rillig MC, Johnson NC. Multiscale patterns of arbuscular mycorrhizal fungal abundance and diversity in semiarid shrublands. Fungal Ecology. 2014;12:32-43. doi:10.1016/j.funeco.2014.06.003 ). The pH is considered one of the most important chemical properties of the soil (2323. Alguacil M del M, Torres MP, Montesinos-Navarro A, Roldán A. Soil Characteristics Driving Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Semiarid Mediterranean Soils. Applied and Environmental Microbiology. 2016;82(11):3348-56. doi:10.1128/AEM.03982-15 ), due to the effect it has on the physical, chemical and biological characteristics of the soil, as well as on crop yields. This variable can determine, from the biological point of view, the type of organism that develops on a soil, due to its great influence on the availability of nutrients. In this regard, it is stated that fungi and the group of actinomycetes bacteria constitute the two large groups of soil microorganisms, and the predominance of one group or the other depends on local conditions, especially pH and moisture content (2424. Wild A. Condiciones del suelo y desarrollo de las plantas según Russell. In: La población microbiana del suelo. Mur di-Prensa. Madrid, España: Ed. Mundi-Prensa; 1992. p. 471-94.). Among these microorganisms are arbuscular mycorrhizal fungi, which live in mutualistic symbiosis with about 95 % of the species of the plant kingdom (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.).

It is considered that the acidity condition of the soil, expressed through its pH, is linked to the functioning of AMF (2525. Igiehon NO, Babalola OO. Below-ground-above-ground Plant-microbial Interactions: Focusing on Soybean, Rhizobacteria and Mycorrhizal Fungi. The Open Microbiology Journal. 2018;12:261-79. doi:10.2174/1874285801812010261 ). The effects of pH on nutrient availability, the regulation of ion exchange processes, and the diversity of microorganisms associated with the mycorrhizosphere are currently explicable (2626. Jamiołkowska A, Księżniak A, Gałązka A, Hetman B, Kopacki M, Skwaryło-Bednarz B. Impact of abiotic factors on development of the community of arbuscular mycorrhizal fungi in the soil: a review. International Agrophysics. 2018;32(1):133-40. doi:10.1515/intag-2016-0090 ,2727. Bücking H, Kafle A. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Nitrogen Uptake of Plants: Current Knowledge and Research Gaps. Agronomy. 2015;5(4):587-612. doi:10.3390/agronomy5040587 ). In addition, other more direct effects on germination and sporulation have been reported (2525. Igiehon NO, Babalola OO. Below-ground-above-ground Plant-microbial Interactions: Focusing on Soybean, Rhizobacteria and Mycorrhizal Fungi. The Open Microbiology Journal. 2018;12:261-79. doi:10.2174/1874285801812010261 ). However, it is considered that the mechanism that explains and conditions the changes in function and effectiveness of these strains with soil pH is still not sufficiently clear.

Figures 2 and 3 present levels of protection exerted by the different strains at the pHs used in the experiment and the specific activity of peroxidases detected.

Plants that were not inoculated with the pathogen showed no damage to the leaves and no significant differences between treatments. In the treatments inoculated with strains of F. oxysporum, although damage to plants was found at all pH levels, regardless of the inoculation of one or another AMF strain, although in the latter the damage was much less, with the bioprotection effect achieved with each strain varying with pH.

The magnitude of the bioprotection effect produced by each AMF strain at a given pH was associated with the degree of fungal intensity reached by that strain at the same pH (Figure 1), such that at each pH the strain or strains with the highest colonization intensity presented, at the same time, the greatest bioprotection effect. Therefore, results indicated that the bioprotection effect was associated with the degree of effectiveness or mycorrhizal functioning presented by each strain, which was pH-dependent.

It is noteworthy the high relationship between the bioprotection effect presented by INCAM4 and INCAM11 strains and the recommendation of efficient AMF strains as a function of pH as a criterion for their inoculation (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). The results also indicated the benefit of using these strains as the basis for inoculants, since they not only achieved high mycorrhizal performance and the benefits commonly associated with it (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.), but also a greater bioprotection effect.

The bioprotection effect related to mycorrhizal functioning has been associated with the induction of plant defensive mechanisms and within these mechanisms peroxidases have been one of the linked PR-proteins (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ,2828. Choudhary KK, Chaudhary N, Agrawal S, Agrawal M. Reactive Oxygen Species in Plants: Boon Or Bane - Revisiting the Role of ROS. In: Reactive oxygen species: generation, damage and quenching in plants during stress. In: Singh V.P. Wiley, Hoboken. NJ, USA: John Wiley & Sons; 2017.). Figure 3 shows that in any of the pH treatments that did not receive the pathogen, basal levels of PRX activity did not differ from each other, whether inoculated with AMF strains or the control.

However, in the presence of the pathogen, in all cases, enzyme induction was higher. In the case of mycorrhizal plants, significant differences were found between the peroxidase inductions caused by AMF strains and this effect was pH-dependent. At each pH, the strain that produced the highest values of peroxidase induction was the one that caused the greatest bioprotection effect and, at the same time, achieved the highest fungal intensity.

The mechanisms induced by AMF to attenuate oxidative damage and protect plant cell function encompass a number of tolerance mechanisms activated by these fungi such as improvements in nutrition and water uptake, modulation and expression of genes that are related to signaling and thus stress response (7). The functioning of these fungi, however, is mediated by edaphic conditions among which pH stands out as an important element since this chemical property of the soil determines in many cases the efficiency of the endophyte, the percentage of spore germination, and the development of arbuscular mycorrhizae (2929. Ouzounidou G, Skiada V, Papadopoulou KK, Stamatis N, Kavvadias V, Eleftheriadis E, et al. Effects of soil pH and arbuscular mycorrhiza (AM) inoculation on growth and chemical composition of chia (Salvia hispanica L.) leaves. Brazilian Journal of Botany. 2015;38(3):487-95. doi:10.1007/s40415-015-0166-6 ,3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ).

Soil acidity limits plant productivity, inhibits root elongation and reduces phosphorus (P) solubility. It is for this reason that some AMF species may be affected by this acidity condition, such as most Glomus species (3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ). The relationship established between soil pH ranges and the effect of mycorrhizal colonization is truly complex, depending not only on the fungal species, but also on the type of soil, the form in which the nutrients are found (fundamentally P and N and other elements such as Cu, Zn, Mo, B, etc.) and to a lesser extent on the plant species on which it develops (2727. Bücking H, Kafle A. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Nitrogen Uptake of Plants: Current Knowledge and Research Gaps. Agronomy. 2015;5(4):587-612. doi:10.3390/agronomy5040587 ).

Strains that compose the EcoMic^® biofertilizer produced in Cuba, two of which were part of this study, can be classified according to Opik (3030. Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, et al. Global sampling of plant roots expands the described molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2013;23(5):411-30. doi:10.1007/s00572-013-0482-2 ), as generalists with the crops and specific with the pH of the soil (66. Espinosa R, Felix F, Martinez L, Cañizares P, Yakelín R, Ortega E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic (r) en la producción agrícola [Internet]. 2020. INCA. Mayabeque, Cuba; 2020. 155 p.). In this sense, the efficiency of strains is maximized in the conditions in which they perform their best function, not only in the uptake of nutrients and water (2020. Rivera R, González PJ, Hernández A, Martín G, Ruiz L, Fernández K, et al. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. In: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo. 2015.,3131. Gilbert L, Johnson D. Chapter Four - Plant-Plant Communication Through Common Mycorrhizal Networks. In: Becard G, editor. Advances in Botanical Research [Internet]. Academic Press; 2017 [cited 19/07/2022]. p. 83-97. (How Plants Communicate with their Biotic Environment; vol. 82). doi:10.1016/bs.abr.2016.09.001 ,3232. Lambers H, Albornoz F, Kotula L, Laliberté E, Ranathunge K, Teste FP, et al. How belowground interactions contribute to the coexistence of mycorrhizal and non-mycorrhizal species in severely phosphorus-impoverished hyperdiverse ecosystems. Plant and Soil. 2018;424(1):11-33. doi:10.1007/s11104-017-3427-2 ), but also in terms of the protection mechanisms they induce in plants. They are demonstrated here in the induction of peroxidases, which is reversed in a protection of biological membranes (77. Hashem A, Abd_Allah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D. Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Stress Tolerance. In: Egamberdieva D, Ahmad P, editors. Plant Microbiome: Stress Response [Internet]. Singapore: Springer; 2018 [cited 11/07/2022]. p. 81-103. doi:10.1007/978-981-10-5514-0_4 ,2828. Choudhary KK, Chaudhary N, Agrawal S, Agrawal M. Reactive Oxygen Species in Plants: Boon Or Bane - Revisiting the Role of ROS. In: Reactive oxygen species: generation, damage and quenching in plants during stress. In: Singh V.P. Wiley, Hoboken. NJ, USA: John Wiley & Sons; 2017.). This was always better in the strain that worked at the pH for which it is recommended, thus making it clear that, in our case, bioprotection is a further attribute of the effectiveness of the symbiosis.

CONCLUSION

The inoculation of efficient AMF strains produces a significant bioprotection effect that is directly associated with the induction of peroxidases and both are a consequence of the degree of mycorrhizal functioning reached by different strains. The latter depends on the pH of the soil in which the mycorrhizal plants develop. At least with the strains studied, the bioprotection effect is not associated with a strain "per se" and is another attribute of the effectiveness of mycorrhizal functioning.