Material vegetal

Plantas de Dioscorea cayenensis subsp rotundata Poir var. ‘Blanco de Guinea’, fueron mantenidas y multiplicadas in vitro a partir de segmentos nodales, cultivados en el medio de cultivo, que contiene las sales y vitaminas MS (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.) 4,41 g L^-1, 6-benzilaminopurine 0,05 mg L^-1, ácido naftalenacético 0,02 mg L^-1, ácido ascórbico 25 mg L^-1, sacarosa 30 g L^-1 y Gelrite^® 2,4 g L^-1.

Efecto del tipo de explante

Con el propósito de inducir la formación de callos con estructuras embriogénicas, se determinó el efecto de diferentes tipos de explantes (segmentos nodales, segmentos de raíz y hojas inmaduras colocadas sobre el medio de cultivo en posición adaxial/abaxial), procedentes de plantas in vitro de ñame 'Blanco de Guinea' cultivadas durante cinco semanas.

Los diferentes tipos de explantes fueron colocados en un medio de cultivo con las sales completas incluido las vitaminas MS (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.) 4,41g L^-1; sacarosa 30 g L^-1, ácido ascórbico 25mg L^-1, Picloram 1,0 mg L^-1, pH 5,8 y Gelrite^® 2,4 g L^-1.

Para determinar el inicio de la formación de callos, se realizaron observaciones semanales con un microscopio estereoscópico (Olympus, 10x) y se evaluó el color y consistencia de los callos; el porcentaje de formación de los callos se determinó a los 30 días de cultivo.

Efecto de la concentración de Picloram

Posteriormente, se utilizó el mejor tipo de explante determinado en el experimento anterior cultivado en diferentes concentraciones de Picloram (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L^-1) incluido un tratamiento control sin regulador del crecimiento.

Se utilizaron 25 réplicas por tratamiento y se colocaron en frascos de vidrio que contenían 10 mL de medio de cultivo durante cuatro semanas de cultivo. Estas fueron colocadas en condiciones de oscuridad a una temperatura de 25±2 °C, a los 30 días de cultivo

Análisis estadístico

Para verificar si los datos cumplían con los supuestos de normalidad de los datos, se utilizó la prueba de Shapiro Wilks y para la homogeneidad de varianza la prueba de Kolmogorov-Smirnov.

El porcentaje de formación de callos (%) por tipo de explante se determinó según la expresión matemática: % FC=Total de explante con callo/Total de explantes x 100.

Las variables cualitativas se analizaron mediante estadística descriptiva y los datos expresados en porcentaje, mediante un análisis de comparación de proporciones con el paquete estadístico CompraPro.

Efecto del tipo de explante

En todos los explantes cultivados con Picloram 1,0 mg L^-1, se observó fenolización del tejido vegetal y engrosamiento de la yema axilar de los segmentos nodales, a partir de la segunda semana de cultivo (Figura 1).

Posteriormente, hubo una abundante proliferación de callos de color blanco y con estructuras nodulares, consistencia compacta y friables (Figura 1A); cuando se emplearon hojas inmaduras, estas se encorvaron y formaron callos en los bordes del explante y en la nervadura principal del limbo foliar (Figura 1B); en tanto, en los segmentos de raíces hubo una escasa formación de callos con tendencia a la formación de embriones somáticos aislados y de manera directa (Figura 1C).

Los callos de color blanco observados en la presente investigación, son comparables con los descritos por otros autores, que hicieron referencia a la presencia de callos no embriogénicos semejante a motas de algodón en Dioscorea rotundata (55. Manoharan R,Nath J,Tripathi L. Plant regeneration from axillary bud derived callus in white yam (Dioscorea rotundata). PlantCellTissOrganCult. 2016;123(3):481-97. doi: 10.1007/s11240-016-1017-2 ). En otros estudios se han descrito callos de apariencia cristalina y filamentosa, en algunos casos, asociados con masas pro-embriogénicas, los cuales estaban conformados por células no embriogénicas de forma alargada, desprovistas de núcleo y poco contenido citoplasmático (77. Polanco H, Díaz LC, Carmona OE, Durango E, Beltrán JD, Suárez IE. Efecto del genotipo, tipo de explante y el Picloram en la inducción de la embriogénesis somática en Dioscorea rotundata. En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 37-55. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.).

Los explantes mostraron respuestas diferenciales a la formación de callo en presencia de Picloram 1,0 mg L^-1. La mayor respuesta se obtuvo en alrededor de la mitad de los segmentos nodales explantes empleados, con diferencias estadísticas significativas en comparación con los valores obtenidos en el resto de los tipos de explantes empleados (Figura 2).

Se observaron diferencias según la orientación abaxial y adaxial de las hojas sobre el medio de cultivo. En el lado adaxial de las hojas no ocurrió la formación de callos; por el contrario, el lado abaxial de las hojas y los segmentos de raíces respondieron con porcentajes inferiores al 7,0 % de formación de callos y sin diferencias estadísticas significativas entre estos tipos de explantes (Figura 2).

La respuesta observada a partir de los segmentos de raíces, difiere de lo informado en la literatura científica (1111. Rodríguez D, López J, Montano N, Rayas A, Basail M, Beovides Y,et al. Formación de callos con estructuras embriogénicas en Dioscorea rotundata Poir cv. 'Blanco de Guinea'. Biotecnología Vegetal. 2014;14(3):185-88. Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/81/452.), donde no se observó callogénesis en este tipo de explante y el mismo genotipo, pero con 2,0 mg L^-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético.

Además, pudiera estar relacionado con que las raíces son el principal sitio de síntesis de citoquininas en las plantas (1313. Suárez L, Hernández MM. Efecto del Pectimorf^® en el cultivo de ápices de plantas in vitro de yuca (Manihot esculenta Crantz), clones `CMC-40´ y `Señorita´. CultivosTropicales. 2015;36(4):55-62. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362015000400007&lng=es&tlng=es.), y cuya concentración endógena al interactuar con la auxina adicionada al medio de cultivo, propició un balance hormonal adecuado para la ocurrencia de la embriogénesis somática.

Las diferencias en la respuesta de las hojas según su orientación sobre el medio de cultivo, pudiera estar ligado a la presencia de diferentes tipos de células en la epidermis de ambos lados de las hojas.Un estudio realizado sobre las diferencias en la arquitectura foliar de tres especies, Dioscorea sp., D. glomerulata y D. haumanii, reveló que todas presentan epidermis adaxial con células isodiamétricas de paredes rectas a curvas; la epidermis abaxial presenta abundantes estomas y células isodiamétricas excepto en Dioscorea sp., donde las células eran rectangulares (1414. Asesor PN, Albornoz PL,Bulacio E. Evidencias del origen de una posible nueva entidad de Dioscorea (Dioscoreaceae) de las Sierras de Calilegua, Jujuy (Argentina). Un enfoque morfo-anatómico. Lilloa. 2019;56(2):1-17. doi:10.30550/j.lil/2019.56.2/1 ).

En tanto, se ha informado sobre la embriogénesis somática en D. rotundata var. 'Blanco de Guinea' al utilizar los explantes hojas con peciolos obtenidas de plantas in vitro. A las dos semanas se observó la formación de masas proembriogénicas con la mayor presencia en el tratamiento 1,0 mg L^-1 de Picloram; el uso de sacarosa, incrementó el desarrollo de los embriones somáticos y favoreció la conversión a planta (1515. Suárez IE, Torres LA,Lizt R. SomaticEmbryogenesis in Yam (Dioscorea rotundata). Revista Facultad Nacional de Agronomía, Medellín. 2011;64(2):6037-42. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304-28472011000200001&lng=en&tlng=en.).

Los segmentos nodales mostraron una mejor respuesta para la formación de callo, este resultado puede ser debido a que, al encontrarse la yema axilar en el segmento nodal, hay mayor cantidad de sustancias de reserva y de tejido meristemático, por tanto, al añadir el Picloram estimuló el proceso de formación de callos, ya que las auxinas tienen acción sobre la elongación celular, expansión de los tejidos, división celular y formación de raíces adventicias.

Los resultados con empleo de los segmentos nodales son comparables con los obtenidos por otros investigadores en esta misma especie (77. Polanco H, Díaz LC, Carmona OE, Durango E, Beltrán JD, Suárez IE. Efecto del genotipo, tipo de explante y el Picloram en la inducción de la embriogénesis somática en Dioscorea rotundata. En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 37-55. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.), pero con el uso de otro tipo de explante, quienes utilizaron hojas con peciolo y obtuvieron más de un 66% de formación de callos bajo el efecto del Picloram 2,0 mg L^-1 en D. rotundata var. 'Alemán'.

Estos resultados indican la necesidad de seleccionar adecuadamente el tipo de explante, para la inducción de callo y la embriogénesis somática, particularmente en especies de plantas monocotiledóneas, donde las células se diferencian rápidamente, seguida de la pérdida de la capacidad mitótica y morfogenética.

Efecto de la concentración de Picloram

Los explantes de segmentos nodales cultivados en diversas concentraciones de Picloram, mostraron respuestas diferenciales a la formación de callo, con diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos. En todos los tratamientos se evidenció formación de estructuras callos, excepto en el tratamiento control que no incluyó la presencia del regulador de crecimiento. A medida que se incrementó la concentración de la auxina, aumentó la formación de callos hasta alcanzar la mayor respuesta con 2,0 mg L^-1 de Picloram (Tabla 1).

En la máxima concentración de Picloram, se observaron masas embriogénicas de color amarillo (Figura 3A y B), así como embriones somáticos en etapa globular, que fueron separados con facilidad al no existir conexión vascular con el tejido materno (Figura 3C).

Estos resultados difieren de los obtenidos por otros autores (1616. Belarmino MM, Gonzales JR. Somatic embryogenesis and plant regeneration in purple food yam (Dioscorea alata L.). Annals of Tropical Research. 2008;30(2):22-33. doi:10.32945/atr3022.2008.), donde abordan que el empleo de 2,4-D, ANA y Picloram (1,0 mg L^-1), indujo la formación de callos en los explantes hojas y peciolos; sin embargo, para los segmentos nodales de D. alata variedades 'Kinampay y 'VU-2', después de seis semanas en la oscuridad, se comportó de manera similar, logrando un 78% de formación de callos, mientras que en peciolos y hojas los callos eran de consistencia blanda y con más del 50% de su área necrosada, debido a los compuestos fenólicos exudados de las zonas de los cortes.

Los resultados de la presente investigación contrastan con los publicados previamente, donde al utilizar mayores concentraciones de Picloram 9,0 mg L^-1, se obtuvieron resultados inferiores al 43 % en brotes axilares (55. Manoharan R,Nath J,Tripathi L. Plant regeneration from axillary bud derived callus in white yam (Dioscorea rotundata). PlantCellTissOrganCult. 2016;123(3):481-97. doi: 10.1007/s11240-016-1017-2 ). Por tal razón, se plantea que, en algunas especies vegetales, se requiere combinar el Picloram con otras auxinas como 2,4-D para inducir la formación de callos embriogénicos (1717. Hernández E. Embriogénesis somática in vitro y aclimatación deplántulas obtenidas por organogénesis directa en Heliconia spp. [Tesis Doctoral]. [México]: Institución de Enseñanza e Investigación en Ciencias Agrícolas; 2013. 139 p. Available from: https://1library.co/document/nzw521lz-embriogenesis-somatica-aclimatacion-plantulas-obtenidas-organogenesis-directa-heliconia.html.).

El Picloram se ha empleado con éxito para la inducción de callos embriogénicos friables en cultivos de raíces y tubérculos, especialmente yuca (Manihot esculenta), boniato (Ipomoea batatas) y ñame (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.,1616. Belarmino MM, Gonzales JR. Somatic embryogenesis and plant regeneration in purple food yam (Dioscorea alata L.). Annals of Tropical Research. 2008;30(2):22-33. doi:10.32945/atr3022.2008.). En este sentido, se demostró que es posible inducir masas pro-embriogénicas en ñame espino, con un porcentaje superior al 90 %, a partir de hojas con pecíolo bajo el efecto de una concentración de 2 mg L^-1 de Picloram (1818. Torres MP, Durango E. Tolerancia al estrés salino en plantas de ñame espino (Dioscorea rotundata Poir). En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 73-94. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.).

Sin embargo, los resultados obtenidos en el presente experimento demuestran el papel imprescindible que desempeña el Picloram en la formación de callos, obteniéndose los mejores resultados en los explantes procedentes de segmentos nodales.

Plant material

Plants of Dioscorea cayenensis subsp rotundata Poir 'Guinea white', were maintained and multiplied in vitro from nodal segments, grown on the culture medium, containing the salts and vitamins MS (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.) 4.41g L^-1, 6-benzylaminopurine 0.05 mg L^-1, naphthaleneacetic acid 0.02 mg L^-1, ascorbic acid 25 mg L^-1, sucrose 30 g L^-1 and Gelrite 2.4 g L^-1.

Effect of explant type

With the purpose of inducing the formation of callus with embryogenic structures, the effect of different types of explants (nodal segments, root segments and immature leaves placed on the culture medium in adaxial/abaxial position), coming from in vitro 'Blanco de Guinea' yam plants grown for five weeks, was determined.

The different types of explants were placed in a culture medium with complete salts including vitamins MS (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.) 4.41 g L^-1; sucrose 30 g L^-1, ascorbic acid 25 mg L^-1, Picloram 1.0 mg L^-1, pH 5.8 and Gelrite^® 2.4 g L^-1.

To determine the onset of callus formation, weekly observations were made with a stereoscopic microscope (Olympus, 10x) and the color and consistency of the callus was evaluated; the percentage of callus formation was determined after 30 days of culture.

Effect of Picloram concentration

Subsequently, the best type of explant determined in the previous experiment grown in different concentrations of Picloram (0.5; 1.0; 1.5; 2.0mg L^-1) including a control treatment without growth regulator was used.

Twenty-five replicates per treatment were used and placed in glass flasks containing 10 mL of culture medium for four weeks of culture. These were placed in dark conditions at a temperature of 25±2 °C. At 30 days of culture, the number of explants with embryogenic callus formation (%) was determined.

Statistical analysis

To verify whether the data complied with the assumptions of normality of the data, the Shapiro Wilks test was used and for homogeneity of variance the Kolmogorov-Smirnov test was used.

The percentage of callus formation (%) by explant type was determined according to the mathematical expression: % FC=Total explants with callus/Total explants X 100.

Qualitative variables were analyzed using descriptive statistics and data expressed as percentages were analyzed using a comparison of proportions analysis with the CompraPro statistical package.

Effect of explant type

In all explants grown with Picloram 1.0 mg L^-1, phenolization of the plant tissue and thickening of the axillary bud of the nodal segments were observed from the second week of culture (Figure 1).

Subsequently, there was an abundant proliferation of white callus with nodular structures, compact and friable consistency (Figure 1A); when immature leaves were used, they curved and formed callus on the explant edges and on the main rib of the leaf blade (Figure 1B); meanwhile, in the root segments there was scarce callus formation with a tendency to the formation of isolated somatic embryos and in a direct way (Figure 1C).

The white callus observed in the present investigation, are comparable with those described by other authors, who made reference to the presence of non embryogenic callus similar to cotton specks in Dioscorea rotundata (55. Manoharan R,Nath J,Tripathi L. Plant regeneration from axillary bud derived callus in white yam (Dioscorea rotundata). PlantCellTissOrganCult. 2016;123(3):481-97. doi: 10.1007/s11240-016-1017-2 ), in other studies have been described callus of crystalline and filamentous appearance, in some cases associated with pro-embryogenic masses, which were formed by non embryogenic cells of elongated form, devoid of nucleus and little cytoplasmatic content (77. Polanco H, Díaz LC, Carmona OE, Durango E, Beltrán JD, Suárez IE. Efecto del genotipo, tipo de explante y el Picloram en la inducción de la embriogénesis somática en Dioscorea rotundata. En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 37-55. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.).

The explants showed differential responses to callus formation in the presence of Picloram 1.0 mg L^-1. The highest response was obtained in about half of the explant nodal segments used, with significant statistical differences compared to the values obtained in the rest of the explant types used (Figure 2).

Differences were observed according to the abaxial and adaxial orientation of the leaves on the culture medium. No callus formation occurred on the adaxial side of the leaves; on the other hand, the abaxial side of the leaves and the root segments responded with percentages lower than 7.0 % of callus formation and without significant statistical differences between these types of explants (Figure 2).

The response observed from root segments differs from that reported in the scientific literature (1111. Rodríguez D, López J, Montano N, Rayas A, Basail M, Beovides Y,et al. Formación de callos con estructuras embriogénicas en Dioscorea rotundata Poir cv. 'Blanco de Guinea'. Biotecnología Vegetal. 2014;14(3):185-88. Available from: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/81/452.), where callogenesis was not observed in this type of explant and the same genotype but with 2.0 mg L^-1 of 2.4-dichlorophenoxyacetic acid.

In addition, it could be related to the fact that roots are the main site of cytokinin synthesis in plants (1313. Suárez L, Hernández MM. Efecto del Pectimorf^® en el cultivo de ápices de plantas in vitro de yuca (Manihot esculenta Crantz), clones `CMC-40´ y `Señorita´. CultivosTropicales. 2015;36(4):55-62. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362015000400007&lng=es&tlng=es.), and whose endogenous concentration when interacting with the auxin added to the culture medium, propitiated an adequate hormonal balance for the occurrence of somatic embryogenesis.

The differences in the response of the leaves according to their orientation on the culture medium could be linked to the presence of different types of cells in the epidermis of both sides of the leaves. A study on the differences in leaf architecture of three species, Dioscorea sp, D. glomerulatay D. haumanii, revealed that all have adaxial epidermis with isodiametric cells with straight to curved walls; the abaxial epidermis has abundant stomata and isodiametric cells except in Dioscorea sp. where the cells were rectangular (1414. Asesor PN, Albornoz PL,Bulacio E. Evidencias del origen de una posible nueva entidad de Dioscorea (Dioscoreaceae) de las Sierras de Calilegua, Jujuy (Argentina). Un enfoque morfo-anatómico. Lilloa. 2019;56(2):1-17. doi:10.30550/j.lil/2019.56.2/1 ).

Meanwhile, somatic embryogenesis has been reported in D. rotundata var. 'Blanco de Guinea' using explants of leaves with petioles obtained from plants in vitro. At two weeks, the formation of proembryogenic masses was observed with the highest presence in the 1.0 mg L^-1 picloram treatment; the use of sucrose increased the development of somatic embryos and favored conversion to plant (1515. Suárez IE, Torres LA,Lizt R. SomaticEmbryogenesis in Yam (Dioscorea rotundata). Revista Facultad Nacional de Agronomía, Medellín. 2011;64(2):6037-42. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304-28472011000200001&lng=en&tlng=en.).

The nodal segments showed a better response for callus formation, this result may be due to the fact that, when the axillary bud is in the nodal segment, there is a greater quantity of reserve substances and meristematic tissue, therefore, when adding Picloram it stimulated the callus formation process, since auxins have action on cellular elongation, tissue expansion, cellular division and formation of adventitious roots.

The results with the use of nodal segments are comparable with those obtained by other researchers in this same species (77. Polanco H, Díaz LC, Carmona OE, Durango E, Beltrán JD, Suárez IE. Efecto del genotipo, tipo de explante y el Picloram en la inducción de la embriogénesis somática en Dioscorea rotundata. En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 37-55. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.), but with the use of another type of explant, who used leaves with petiole and obtained more than 66 % callus formation under the effect of Picloram 2.0mg ^L-1 in D. rotundata cultivar Aleman.

These results indicate the need for proper selection of explant type for callus induction and somatic embryogenesis, particularly in monocotyledonous plant species, where cells differentiate rapidly, followed by loss of mitotic and morphogenetic capacity.

Effect of Picloram concentration

Explants from nodal segments grown in various concentrations of Picloram showed differential responses to callus formation, with significant statistical differences among treatments. Callus structure formation was evident in all treatments, except in the control treatment that did not include the presence of the growth regulator. As auxin concentration increased, callus formation increased until the greatest response was achieved with 2.0 mg L^-1 Picloram (Table 1).

At the maximum concentration of Picloram, yellow embryogenic masses were observed (Figure 3AB), as well as somatic embryos in globular stage, which were easily separated since there was no vascular connection with the maternal tissue (Figure 3C).

These results differ from those obtained by other authors (1616. Belarmino MM, Gonzales JR. Somatic embryogenesis and plant regeneration in purple food yam (Dioscorea alata L.). Annals of Tropical Research. 2008;30(2):22-33. doi:10.32945/atr3022.2008.), where they state that the use of 2,4-D, ANA and Picloram (1.0 mg L^-1), induced the formation of callus in explants leaves and petioles; however, for the nodal segments of D. alata varieties 'Kinampay and 'VU-2' after six weeks in the dark behaved similarly, achieving 78 % callus formation, while in petioles and leaves the callus were of soft consistency and with more than 50 % of their area necrotic, due to the phenolic compounds exuded from the cut areas.

The results of the present investigation contrast with those previously published, where when using higher concentrations of Picloram 9.0 mg L^-1, results lower than 43 % were obtained in axillary buds (55. Manoharan R,Nath J,Tripathi L. Plant regeneration from axillary bud derived callus in white yam (Dioscorea rotundata). PlantCellTissOrganCult. 2016;123(3):481-97. doi: 10.1007/s11240-016-1017-2 ). For this reason, it is suggested that in some plant species, it is required to combine Picloram with other auxins such as 2,4-D to induce the formation of embryogenic callus (1717. Hernández E. Embriogénesis somática in vitro y aclimatación deplántulas obtenidas por organogénesis directa en Heliconia spp. [Tesis Doctoral]. [México]: Institución de Enseñanza e Investigación en Ciencias Agrícolas; 2013. 139 p. Available from: https://1library.co/document/nzw521lz-embriogenesis-somatica-aclimatacion-plantulas-obtenidas-organogenesis-directa-heliconia.html.).

Picloram has been successfully used for the induction of friable embryogenic callus in root and tuber crops, especially cassava (Manihot esculenta), sweet potato (Ipomoea batatas) and yam (1212. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.,1616. Belarmino MM, Gonzales JR. Somatic embryogenesis and plant regeneration in purple food yam (Dioscorea alata L.). Annals of Tropical Research. 2008;30(2):22-33. doi:10.32945/atr3022.2008.). In this sense, it was demonstrated that it is possible to induce pro-embryogenic masses in hawthorn yam, with a percentage higher than 90 %, from leaves with petiole under the effect of a concentration 2 mg L^-1 of Picloram (1818. Torres MP, Durango E. Tolerancia al estrés salino en plantas de ñame espino (Dioscorea rotundata Poir). En: Durango ED, de Hoyos KM, Gomezcaceres LC, Polanco H, Beltrán JD, Suárez IE, et al., editores. Biotecnología aplicada al sector agropecuario en el departamento de Sucre. Núcleo Innovación y desarrollo de productos biotecnológicos (bioinsumos, bioproductos, bioprocesos) y biorremediación. CECAR; 2019. p. 73-94. Available from: https://es.scribd.com/document/435485944/Biotecnologia-Aplicada-Al-Sector-Agropecuario-en-El-Departamento-de-Sucre.).

However, the results obtained in the present experiment demonstrate the essential role played by Picloram in callus formation, the best results being obtained in explants from nodal segments.