Cultivos Tropicales Vol. 44, No. 2, abril-junio, 2023, ISSN: 1819-4087
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Artículo original

Efecto de un fungicida sistémico en el crecimiento presimbiótico de Rhizophagus irregularis var. INCAM 11, in vitro

 

iDMartha de la Caridad Arocha-Rodríguez*✉:marocharodríguez@gmail.com

iDEduardo J. Pérez-Ortega

iDKalyanne Fernández-Suárez


Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700

 

*Autor para correspondencia: marocharodríguez@gmail.com

RESUMEN

Los fungicidas se utilizan ampliamente en los sistemas de cultivo actuales para controlar o eliminar los fitopatógenos fúngicos. Sin embargo, estos productos químicos pueden afectar a los microorganismos autóctonos del suelo, incluidos los que promueven el crecimiento vegetal, como los hongos micorrízicos arbusculares (HMA). Teniendo en cuenta lo anterior, el presente estudio se propuso determinar el efecto de diferentes concentraciones del fungicida sistémico Previcur energy 84 sl en el estadio presimbiótico de Rhizophagus irregularis (INCAM 11), en condiciones de cultivo in vitro. Para ello, se evaluó en el medio de cultivo SRM (Strullu y Romand Modificado), el porcentaje de germinación, el crecimiento del tubo germinativo, así como sus porcentajes de incremento y decremento, al estudiar cuatro concentraciones del fungicida Previcur (0,1; 1; 10 y 100 mg L-1). Se observó que, a la concentración de 10 mg L-1 este fungicida tiene un efecto estimulador en la germinación y en el crecimiento del tubo germinativo del hongo. El presente trabajo constituye la primera evidencia en Cuba sobre el efecto de un fungicida sistémico en el estadío presimbiótico de un hongo micorrízico arbuscular, in vitro.

Palabras clave: 
germinación de esporas, medio de cultivo, micorrizas y pesticidas

Recibido: 23/7/2021; Aceptado: 09/10/2021

Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Contribución de los autores: Conceptualización: Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez, Eduardo Pérez-Ortega y Kalyanne Fernández-Suárez. Investigación: Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez. Supervisión: Eduardo Pérez-Ortega y Kalyanne Fernández-Suárez. Escritura del borrador inicial: Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez y Eduardo Pérez-Ortega. Escritura y edición final: Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez, Eduardo Pérez-Ortega y Kalyanne Fernández-Suárez. Curación de los datos: Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

 

Los hongos micorrizógenos arbusculares (Phyllum Glomeromycota) son parte integral de numerosos ecosistemas y se consideran particularmente ventajosos, debido a que se asocian en simbiosis con la mayoría de las plantas vasculares estudiadas (11. Alguacil M del M, Torres MP, Montesinos-Navarro A, Roldán A. Soil Characteristics Driving Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Semiarid Mediterranean Soils. Applied and Environmental Microbiology. 2016;82(11):3348-56. doi:10.1128/AEM.03982-15 ). Dichos hongos son biótrofos obligados, por lo que no pueden completar su ciclo de vida en ausencia de una planta hospedante (22. Lanfranco L, Fiorilli V, Gutjahr C. Partner communication and role of nutrients in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 2018;220(4):1031-46. doi:https://doi.org/10.1111/nph.15230 ); de ahí que la diferenciación de una micorriza funcional sea un proceso complejo que demanda la participación de ambos organismos (33. Cozzolino V, Di Meo V, Monda H, Spaccini R, Piccolo A. The molecular characteristics of compost affect plant growth, arbuscular mycorrhizal fungi, and soil microbial community composition. Biology and Fertility of Soils. 2016;52(1):15-29. doi:10.1007/s00374-015-1046-8 ).

Por otra parte, en la agricultura moderna, la protección de los cultivos frente al ataque de organismos patógenos se realiza, fundamentalmente, con agroquímicos que pueden aplicarse de forma directa en determinadas etapas del cultivo, mediante el tratamiento de las semillas o aplicados al suelo. Entre estos se encuentran los fungicidas que se utilizan ampliamente para controlar o eliminar fitopatógenos fúngicos. Sin embargo, estos productos también afectan a otros hongos autóctonos del suelo, incluidos los que promueven el crecimiento vegetal, como los HMA (44. Hage-Ahmed K, Rosner K, Steinkellner S. Arbuscular mycorrhizal fungi and their response to pesticides. Pest Management Science. 2019;75(3):583-90. doi:https://doi.org/10.1002/ps.5220 ). El uso intensivo de productos químicos, sobre todo fungicidas y fertilizantes, constituye una de las causas principales de la reducción de la diversidad en los suelos, incluyendo los HMA (55. Lamichhane JR, You MP, Laudinot V, Barbetti MJ, Aubertot J-N. Revisiting Sustainability of Fungicide Seed Treatments for Field Crops. Plant Disease. 2019;104(3):610-23. doi:10.1094/PDIS-06-19-1157-FE ,66. Battini F, Cristani C, Giovannetti M, Agnolucci M. Multifunctionality and diversity of culturable bacterial communities strictly associated with spores of the plant beneficial symbiont Rhizophagus intraradices. Microbiological Research. 2016;183:68-79. doi:10.1016/j.micres.2015.11.012 ). Sin embargo, estudios recientes informan que la aplicación de fungicidas también puede tener un efecto positivo en el establecimiento micorrízico; lo cual depende de su modo de acción y de la especie de HMA involucrada.

Teniendo en cuenta el escaso conocimiento que existe sobre el efecto de los fungicidas sobre los HMA en condiciones in vitro y que el empleo de estos hongos como biofertilizantes es cada vez más frecuente en diferentes sistemas de producción agrícola, la presente investigación tiene como objetivo de trabajo evaluar el efecto de diferentes concentraciones (0,1; 1; 10 y 100 mg L-1) del fungicida sistémico Previcur energy 84 sl en el estadio presimbiótico de Rhizophagus irregularis (INCAM 11), en condiciones in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

 

La investigación se realizó entre los años 2017 y 2018, en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), perteneciente al Ministerio de Educación Superior y ubicado en el municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque.

Material biológico

 

Se empleó como inóculo el HMA Rhizophagus irregularis (Blaszk., Wubet, Renker & Buscot) C. Walker & A. Schüßler (INCAM 11), procedente del cepario del INCA. El inóculo poseía una concentración promedio de 25 esporas g-1 de suelo fresco.

El medio de cultivo utilizado fue SRM (Strullu y Romand Modificado) (77. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia. 1998;90(4):579-85. doi:10.1080/00275514.1998.12026946 ). El medio estaba compuesto por (g L-1): Macroelementos-MgSO4.7H2O-73.9, KNO3-7.6, KCl-6.5, KH2PO4-0.41; Ca (NO3).2.4H2O-35.9; NaFeEDTA-0.16; Microelementos-MnSO4.4H2O-1.225, CuSO4.5H2O-1.1, ZnSO4.7H2O-0.14, H3BO3-0.925, Na2MoO4.2H2O-0.12, (NH4) 6Mo7O24.4H2O-1.7; Vitaminas (g L-1)-Pantotenato de calcio-0.09, Biotina-0.0001, Ácido nicotínico-0.1, Piridoxina-0.09, Tiamina-0.1 y Cianocobalamina-0.04; Sacarosa-10. Se ajustó el pH a 7,5; antes de adicionar 4 g L-1 de Gellam Gum. El medio se esterilizó a 121 ºC durante 15 min.

Efecto de diferentes concentraciones del fungicida sistémico Previcur energy 84sl en el estadio presimbiótico de Rhizophagus irregularis (INCAM 11), en condiciones in vitro

 

Con el objetivo de evaluar el efecto de un fungicida sistémico en el crecimiento presimbiótico in vitro de INCAM 11 se realizó este experimento, utilizando el fungicida comercial Previcur energy 84 sl, cuyo componente activo es: propyl 3-(dimetilamino) propilcarbamato 53 %, etilhidrogenofosfonato 31 % e ingredientes inertes 16 % (88. Hernández-Dorrego A, Mestre-Parés J. Evaluation of some fungicides on mycorrhizal symbiosis between two Glomus species from commercial inocula and Allium porrum L. seedlings. Spanish Journal of Agricultural Research. 2010;8(1):43-50. doi:10.5424/sjar/201008S1-1222 ).

Se utilizó como propágulo esporas agrupadas en racimos. Estas se extrajeron del suelo, utilizando la técnica de tamizado húmedo, decantado y posterior extracción a través del centrifugado de una solución de sacarosa+Tween 80 a 2000 rpm durante cinco minutos, según Gerdemann y Nicolson (99. Gerdemann JW, Nicolson TH. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological society. 1963;46(2):235-44.); modificado por Herrera et al. (1010. Herrera RA, Ferrer RL, Furrazola E, Orozco MO. Estrategia de funcionamiento de las micorrizas VA en un bosque tropical. Biodiversidad en Iberoamérica. Ecosistemas, Evolución y Procesos sociales.(Eds. Maximina Monasterio) programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo. Subprograma XII, Diversidad Biológica, Mérida. 1995;). Posteriormente, fueron desinfectadas utilizando la metodología de Cranenbrouck et al. (1111. Cranenbrouck S, Voets L, Bivort C, Renard L, Strullu D-G, Declerck S. Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi with Root Organs. In: Declerck S, Fortin JA, Strullu D-G, editors. In Vitro Culture of Mycorrhizas [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer; 2005 [cited 05/10/2021]. p. 341-75. doi:10.1007/3-540-27331-X_18 ), modificada por Perera et al. (1212. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en ).

De los propágulos extraídos se seleccionaron esporas agrupadas en ramilletes, se colocaron sobre una membrana (0,44 μm de diámetro de poro) y se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente, se añadió Cloramina T 2 % (m/v) y dos gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Seguidamente, los propágulos se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se trataron con una solución de antibióticos (sulfato de estreptomicina (0,02 %) (m/v) y sulfato de gentamicina (0,01 %) (m/v), durante 10 minutos, previamente esterilizada con ayuda de un filtro miliporo (tipo HA, 4,0 cm de diámetro y 0,22 μm de poro). Por último, la membrana con los propágulos fue transferida a la misma solución antibiótica, previamente filtrada en placa Petri estéril (90 mm diámetro) durante 24 horas (1212. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en ).

Transcurrido este tiempo, se inocularon cinco propágulos por placa Petri de 90 mm de diámetro que contenían medio SRM (Strullu y Romand Modificado) (77. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia. 1998;90(4):579-85. doi:10.1080/00275514.1998.12026946 ). Se ajustó el pH del medio de cultivo a 7,5 (1313. Arocha-Rodríguez M de la C, Pérez-Ortega E, Fernández-Suárez K, Haesaert G. Efecto del pH del medio de cultivo en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200008&script=sci_arttext&tlng=pt ). Luego de esterilizar el medio de cultivo a 121 ºC durante 15 minutos, se añadió el fungicida sistémico comercial Previcur energy 84 sl en cuatro concentraciones (0,1; 1; 10 y 100 mg L-1). Se utilizaron diez placas por cada una de las concentraciones del fungicida. Para la realización del experimento se utilizó un diseño completamente aleatorizado.

Se determinó el porcentaje de germinación de las esporas de la cepa INCAM 11. Se realizó una dinámica de crecimiento del tubo germinativo, a partir del momento en que se observó crecimiento, con origen en el esporóforo o en la hifa de sustentación. Las mediciones se realizaron desde la base de la nueva hifa hasta su ápice, cada siete días, durante un mes y se empleó un micrómetro acoplado a un estereomicroscopio (NOVEL N-800M, Nanjing Jiangnan Novel Optics Co., Ltd; China, 40X). Se calculó el porcentaje de incremento de la variable longitud del tubo germinativo, respecto al control no tratado con el fungicida.

Análisis Estadístico

 

Una vez comprobada la normalidad, se calculó el intervalo de confianza de las medias al 95 % de probabilidad, atendiendo al número de repeticiones y la reproducibilidad de los datos. Se empleó el programa SPSS versión 19 (1414. Gray CD, Kinnear PR. IBM SPSS Statistics 19 Made Simple. Psychology Press; 2012. 688 p.) para el procesamiento estadístico de los datos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

En este experimento se estudiaron cuatro concentraciones del fungicida sistémico Previcur sobre el crecimiento in vitro de R. irregularis, en medio SRM a pH 7,5. Se escogió este valor de pH teniendo en cuenta que 7,5 resultó ser en el que mejor se desarrolló el estadio presimbiótico de esta cepa (Figura 1).

Las barras representan las medias de 10 placas conteniendo 5 propágulos cada una
Figura 1.  Efecto de la aplicación al medio de cultivo SRM de diferentes concentraciones del fungicida Previcur en la germinación de esporas de la especie Rhizophagus irregularis (INCAM 11), durante 28 días

Al analizar el comportamiento de la variable puede apreciarse que, los mayores valores de porcentaje de germinación se alcanzaron al aplicar la concentración de 10 mg L-1 del fungicida, diferenciándose significativamente del resto de los tratamientos. Por otra parte, al analizar el efecto de las concentraciones 0,1 mg L-1 y 1 mg L-1 del fungicida sistémico en la germinación de INCAM 11, no se encontraron diferencias estadísticas entre estas y el control, pero sí con la concentración de 100 mg L-1, la cual presentó los menores valores de porcentaje de germinación (Figura 1).

En la Figura 2 se observa que hubo incremento en la longitud del tubo germinativo a lo largo del tiempo, apreciable en todos los tratamientos estudiados. Durante las tres primeras semanas del experimento no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos; sin embargo, en la cuarta semana, los valores de la variable comenzaron a dispersarse, siendo mayor la longitud de los tubos germinativos de las esporas que fueron tratadas con la concentración de 10 mg L-1 del fungicida Previcur.

Las barras representan los intervalos de confianza de la media de tratamientos para p≤ 0,05 (n=10)
Figura 2.  Dinámica del crecimiento del tubo germinativo de propágulos de la especie Rhizophagus irregularis (INCAM 11), inoculados en medio SRM durante 4 semanas, con diferentes concentraciones del fungicida Previcur (0,1; 1; 10; 100 mg L-1)

En la Figura 3 puede apreciarse que en la concentración de 10 mg L-1 el porcentaje de incremento de esta variable, con respecto al testigo sin tratar, fue de 50 %. En el caso de la concentración de 0,1 y 1 mg L-1, solo alcanzaron el 10 % de incremento, sin diferencias significativas entre sí, excepto la concentración de 100 mg L-1, la cual decreció un 10 % respecto al control.

Es evidente que la aplicación al medio de cultivo SRM del fungicida Previcur estimula, significativamente, el crecimiento de las hifas de germinación de R. irregularis.

Las barras representan los intervalos de confianza de la media de tratamientos para p ≤ 0,05 (n=10)
Figura 3.  Porcentajes de incremento y decremento de la longitud del tubo germinativo de propágulos de Rhizophagus irregularis (INCAM 11), inoculados en medio SRM con diferentes concentraciones del fungicida Previcur (0,1; 1; 10; 100 mg L-1), respecto al testigo, calculados al finalizar el experimento

Estos resultados in vitro guardan relación con investigaciones realizadas anteriormente (1515. de Novais CB, Avio L, Giovannetti M, de Faria SM, Siqueira JO, Sbrana C. Interconnectedness, length and viability of arbuscular mycorrhizal mycelium as affected by selected herbicides and fungicides. Applied Soil Ecology. 2019;143:144-52. doi:10.1016/j.apsoil.2019.06.013 ), donde se informó acerca del efecto estimulador de algunos fungicidas sistémicos en el porcentaje de germinación, el crecimiento del tubo germinativo y la colonización de la raíz de Glomus intraradices a concentraciones comprendidas entre 0,1 y 10 mg L-1. Otros estudios también han mostrado que los fungicidas sistémicos pueden estimular o inhibir el funcionamiento micorrizíco, según la concentración utilizada del ingrediente activo (1616. Samarbakhsh S, Rejali F, Ardakani MR, Nejad FP, Miransari M. The combined effects of fungicides and arbuscular mycorrhiza on corn (Zea mays L.) growth and yield under field conditions. Journal of Biological Sciences. 2009;9(4):372-6. ).

Es interesante destacar que en todas las concentraciones estudiadas se observó germinación y crecimiento hifal de las esporas de Rhizophagus irregularis, lo cual indica que no hubo un efecto inhibitorio sobre estas variables, aun cuando sus valores fueron inferiores a la concentración de 100 mg L-1. Esto podría explicarse sobre la base de que la toxicidad de Previcur, al ser aplicado, incluso a mayores concentraciones (100 mg L-1), no impide las reacciones que se desencadenan para el desarrollo del micelio en el medio de cultivo empleado.

Aunque las investigaciones in vitro en este sentido son escasas, se han encontrado informes que indican que algunos fungicidas sistémicos, como Metalaxil, pueden causar un aumento en la germinación y la longitud del micelio de esporas de HMA in vitro (1717. Rose MT, Cavagnaro TR, Scanlan CA, Rose TJ, Vancov T, Kimber S, et al. Impact of Herbicides on Soil Biology and Function. In: Sparks DL, editor. Advances in Agronomy [Internet]. Academic Press; 2016 [cited 05/10/2021]. p. 133-220. (Advances in Agronomy; vol. 136). doi:10.1016/bs.agron.2015.11.005 ). Esta información coincide con lo encontrado en este estudio, en el que Previcur, de igual modo de acción que Metalaxil, estimuló el crecimiento del tubo germinativo de la cepa INCAM 11, en la concentración de 10 mg L-1 (Figura 4).

A: sin fungicida y B: con fungicida. C: esporas de INCAM 11 tratadas con Previcur a igual concentración, semana 4Fotos tomadas al estereomicroscopio (NOVEL N-800M, Nanjing Jiangnan Novel Optics Co., Ltd; China, 40X)
Figura 4.  Hifas de germinación (HG) de esporas de INCAM 11 tratadas o no con Previcur a una concentración de 10 mg L-1

En la literatura consultada también se ha informado de algunos fungicidas sistémicos que presentan diferentes efectos, según la especie de HMA empleada. Por ejemplo, el fungicida Fenhexamida, presenta un efecto fungistático a concentraciones superiores de 20 mg L-1, al ser aplicado al medio de cultivo y reducir la germinación de esporas de Rhizophagus irregularis y afectar el crecimiento, la arquitectura y la fisiología del micelio extrarradical (1818. Zocco D, Fontaine J, Lozanova E, Renard L, Bivort C, Durand R, et al. Effects of two sterol biosynthesis inhibitor fungicides (fenpropimorph and fenhexamid) on the development of an arbuscular mycorrhizal fungus. Mycological Research. 2008;112(5):592-601. doi:10.1016/j.mycres.2007.11.010 ,1919. Zocco D, Van Aarle IM, Oger E, Lanfranco L, Declerck S. Fenpropimorph and fenhexamid impact phosphorus translocation by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2011;21(5):363-74. doi:10.1007/s00572-010-0344-0 ). Sin embargo, el mismo fungicida a una concentración similar a la del presente estudio (10 mg L−1) no afecta la germinación, ni la formación de anastomosis de las hifas de Funneliformis mosseae en medio de cultivo SRM, in vitro (2020. Rivera-Becerril F, van Tuinen D, Chatagnier O, Rouard N, Béguet J, Kuszala C, et al. Impact of a pesticide cocktail (fenhexamid, folpel, deltamethrin) on the abundance of Glomeromycota in two agricultural soils. Science of The Total Environment. 2017;577:84-93. doi:10.1016/j.scitotenv.2016.10.098 ).

Según estudios in vitro (2020. Rivera-Becerril F, van Tuinen D, Chatagnier O, Rouard N, Béguet J, Kuszala C, et al. Impact of a pesticide cocktail (fenhexamid, folpel, deltamethrin) on the abundance of Glomeromycota in two agricultural soils. Science of The Total Environment. 2017;577:84-93. doi:10.1016/j.scitotenv.2016.10.098 ,2121. Buysens C, Dupré de Boulois H, Declerck S. Do fungicides used to control Rhizoctonia solani impact the non-target arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis? Mycorrhiza. 2015;25(4):277-88. doi:10.1007/s00572-014-0610-7 ), algunos fungicidas sistémicos, al ser empleados en el medio de cultivo SRM y en presencia de la cepa Rhizophagus irregularis y Funneliformis mosseae, probados incluso a concentraciones superiores a las de este estudio (200 mg L1), mostraron un efecto positivo en los HMA. Aunque hay muy poca literatura disponible sobre los efectos directos de los fungicidas en HMA en estas condiciones experimentales de cultivo monoxénico, de ahí la novedad e importancia de esta investigación, se puede apreciar, según estos resultados, que el efecto de algunos fungicidas sistémicos depende, fundamentalmente, de la concentración del fungicida y de la especie de HMA en estudio.

Resultados similares a los de este trabajo fueron encontrados por otros investigadores (2222. Lekberg Y, Wagner V, Rummel A, McLeod M, Ramsey PW. Strong indirect herbicide effects on mycorrhizal associations through plant community shifts and secondary invasions. Ecological Applications. 2017;27(8):2359-68. doi:https://doi.org/10.1002/eap.1613 ), quienes observaron, en condiciones in vitro, que el fungicida Myclobutanil, en un rango de concentración de 0,2 mg L-1 a 20 mg L-1, no afectó la biomasa, ni la viabilidad de las hifas de R. irregularis. Los resultados de este experimento están respaldados por datos obtenidos en campo, en los que la colonización de HMA se redujo solo cuando Myclobutanil produjo cambios en la fisiología de la planta huésped.

Por otra parte, en ausencia de una planta huésped, los productos químicos que contienen Clorotolurón no parecen tener ningún efecto sobre la germinación de esporas de HMA (44. Hage-Ahmed K, Rosner K, Steinkellner S. Arbuscular mycorrhizal fungi and their response to pesticides. Pest Management Science. 2019;75(3):583-90. doi:https://doi.org/10.1002/ps.5220 ); mientras que los que contienen Bifenox y Mecoprop, Ioxinil y Clopiralida inhiben la germinación de las esporas en concentraciones bajas, pero estimulan la germinación en concentraciones consideradas altas. Estos resultados se corresponden con el efecto de Previcur en la cepa INCAM 11 estimulando su germinación y el crecimiento del tubo germinativo a una concentración de 10 mg L-1.

También, se conoce que algunos fungicidas como Azoxistrobina, Flutolanil, Pencicuron y sus respectivas formulaciones (Amistar, Monarch y Monceren), tienen determinado impacto sobre el crecimiento del tubo germinativo de R. irregularis. Estos productos químicos al ser aplicados a concentraciones de 0,1; 1; 10 y 100 mg L-1 en condiciones de cultivo in vitro, mostraron una respuesta diferenciada en el crecimiento del tubo germinativo y en la germinación de las esporas, de tal forma que a concentraciones de 0,1 y 1 mg L-1 se observó un incremento de estas variables, mientras que a 10 y 100 mg L-1 se presentó inhibición. Así mismo, se presentaron diferencias en el porcentaje de germinación dependiendo del producto empleado (Azoxistrobina y Amistar 77 y 63 %, respecto a los tratamientos con Flutolanil, Pencicuron 58 y 44 %) (2121. Buysens C, Dupré de Boulois H, Declerck S. Do fungicides used to control Rhizoctonia solani impact the non-target arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis? Mycorrhiza. 2015;25(4):277-88. doi:10.1007/s00572-014-0610-7 ).

Los resultados de esta investigación muestran como el fungicida Previcur tiene un efecto estimulador sobre la cepa INCAM 11 a una concentración de 10 mg L−1. Cabe señalar que en el medio de cultivo SRM, solo se empleó el producto químico y se inoculó la especie de HMA Rhizophagus irregularis, manifestándose un efecto directo de este fungicida sobre el HMA.

CONCLUSIONES

 

La concentración de 10 mg L-1 del fungicida sistémico Previcur energy 84 sl tuvo un efecto positivo, estimulando la germinación y el crecimiento del tubo germinativo de Rhizophagus irregularis, en condiciones de cultivo in vitro.

BIBLIOGRAFÍA

 

1. Alguacil M del M, Torres MP, Montesinos-Navarro A, Roldán A. Soil Characteristics Driving Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Semiarid Mediterranean Soils. Applied and Environmental Microbiology. 2016;82(11):3348-56. doi:10.1128/AEM.03982-15

2. Lanfranco L, Fiorilli V, Gutjahr C. Partner communication and role of nutrients in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 2018;220(4):1031-46. doi:https://doi.org/10.1111/nph.15230

3. Cozzolino V, Di Meo V, Monda H, Spaccini R, Piccolo A. The molecular characteristics of compost affect plant growth, arbuscular mycorrhizal fungi, and soil microbial community composition. Biology and Fertility of Soils. 2016;52(1):15-29. doi:10.1007/s00374-015-1046-8

4. Hage-Ahmed K, Rosner K, Steinkellner S. Arbuscular mycorrhizal fungi and their response to pesticides. Pest Management Science. 2019;75(3):583-90. doi:https://doi.org/10.1002/ps.5220

5. Lamichhane JR, You MP, Laudinot V, Barbetti MJ, Aubertot J-N. Revisiting Sustainability of Fungicide Seed Treatments for Field Crops. Plant Disease. 2019;104(3):610-23. doi:10.1094/PDIS-06-19-1157-FE

6. Battini F, Cristani C, Giovannetti M, Agnolucci M. Multifunctionality and diversity of culturable bacterial communities strictly associated with spores of the plant beneficial symbiont Rhizophagus intraradices. Microbiological Research. 2016;183:68-79. doi:10.1016/j.micres.2015.11.012

7. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia. 1998;90(4):579-85. doi:10.1080/00275514.1998.12026946

8. Hernández-Dorrego A, Mestre-Parés J. Evaluation of some fungicides on mycorrhizal symbiosis between two Glomus species from commercial inocula and Allium porrum L. seedlings. Spanish Journal of Agricultural Research. 2010;8(1):43-50. doi:10.5424/sjar/201008S1-1222

9. Gerdemann JW, Nicolson TH. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological society. 1963;46(2):235-44.

10. Herrera RA, Ferrer RL, Furrazola E, Orozco MO. Estrategia de funcionamiento de las micorrizas VA en un bosque tropical. Biodiversidad en Iberoamérica. Ecosistemas, Evolución y Procesos sociales.(Eds. Maximina Monasterio) programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo. Subprograma XII, Diversidad Biológica, Mérida. 1995;

11. Cranenbrouck S, Voets L, Bivort C, Renard L, Strullu D-G, Declerck S. Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi with Root Organs. In: Declerck S, Fortin JA, Strullu D-G, editors. In Vitro Culture of Mycorrhizas [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer; 2005 [cited 05/10/2021]. p. 341-75. doi:10.1007/3-540-27331-X_18

12. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en

13. Arocha-Rodríguez M de la C, Pérez-Ortega E, Fernández-Suárez K, Haesaert G. Efecto del pH del medio de cultivo en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200008&script=sci_arttext&tlng=pt

14. Gray CD, Kinnear PR. IBM SPSS Statistics 19 Made Simple. Psychology Press; 2012. 688 p.

15. de Novais CB, Avio L, Giovannetti M, de Faria SM, Siqueira JO, Sbrana C. Interconnectedness, length and viability of arbuscular mycorrhizal mycelium as affected by selected herbicides and fungicides. Applied Soil Ecology. 2019;143:144-52. doi:10.1016/j.apsoil.2019.06.013

16. Samarbakhsh S, Rejali F, Ardakani MR, Nejad FP, Miransari M. The combined effects of fungicides and arbuscular mycorrhiza on corn (Zea mays L.) growth and yield under field conditions. Journal of Biological Sciences. 2009;9(4):372-6.

17. Rose MT, Cavagnaro TR, Scanlan CA, Rose TJ, Vancov T, Kimber S, et al. Impact of Herbicides on Soil Biology and Function. In: Sparks DL, editor. Advances in Agronomy [Internet]. Academic Press; 2016 [cited 05/10/2021]. p. 133-220. (Advances in Agronomy; vol. 136). doi:10.1016/bs.agron.2015.11.005

18. Zocco D, Fontaine J, Lozanova E, Renard L, Bivort C, Durand R, et al. Effects of two sterol biosynthesis inhibitor fungicides (fenpropimorph and fenhexamid) on the development of an arbuscular mycorrhizal fungus. Mycological Research. 2008;112(5):592-601. doi:10.1016/j.mycres.2007.11.010

19. Zocco D, Van Aarle IM, Oger E, Lanfranco L, Declerck S. Fenpropimorph and fenhexamid impact phosphorus translocation by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2011;21(5):363-74. doi:10.1007/s00572-010-0344-0

20. Rivera-Becerril F, van Tuinen D, Chatagnier O, Rouard N, Béguet J, Kuszala C, et al. Impact of a pesticide cocktail (fenhexamid, folpel, deltamethrin) on the abundance of Glomeromycota in two agricultural soils. Science of The Total Environment. 2017;577:84-93. doi:10.1016/j.scitotenv.2016.10.098

21. Buysens C, Dupré de Boulois H, Declerck S. Do fungicides used to control Rhizoctonia solani impact the non-target arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis? Mycorrhiza. 2015;25(4):277-88. doi:10.1007/s00572-014-0610-7

22. Lekberg Y, Wagner V, Rummel A, McLeod M, Ramsey PW. Strong indirect herbicide effects on mycorrhizal associations through plant community shifts and secondary invasions. Ecological Applications. 2017;27(8):2359-68. doi:https://doi.org/10.1002/eap.1613

Cultivos Tropicales Vol. 44, No. 2, abril-junio, 2023, ISSN: 1819-4087
 
Original article

Effect of systemic fungicide on the presymbiotic growth of Rhizophagus irregularis (INCAM 11), in vitro

 

iDMartha de la Caridad Arocha-Rodríguez*✉:marocharodríguez@gmail.com

iDEduardo J. Pérez-Ortega

iDKalyanne Fernández-Suárez


Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700

 

*Author for correspondence: marocharodríguez@gmail.com

ABSTRACT

Fungicides are widely used in current culture systems to control or eliminate fungal plant pathogens. However, these chemicals can affect indigenous soil microorganisms, including those that promote plant growth, such as arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). Considering the above exposed, the present study set out to determine the effect of different concentrations of the systemic fungicide Previcur energy 84 sl on the presymbiotic stage of Rhizophagus irregularis (INCAM 11), under in vitro culture conditions. Modified Strullu and Romand culture medium (SRM) was employed to evaluate percentage of germination, growth of germinating tube, as well as its percentages of increase and decrease, when studying four concentrations of the Previcur Fungicide (0,1; 1; 10 and 100 mg L-1). At 10 mg -1 a stimulating effect on germination and on the growth of the germ tube of the fungus. The present work constitutes the first evidence on the effect of a systemic fungicide in the presimbiotic stage of mycorrhizal fungus on in vitro conditions reported in Cuba.

Key words: 
mycorrhizas, germination of spores, culture medium, pesticides

INTRODUCTION

 

Arbuscular mycorrhizal fungi (Phyllum Glomeromycota) are an integral part of numerous ecosystems and are considered particularly advantageous because they are associated in symbiosis with most of the vascular plants studied (11. Alguacil M del M, Torres MP, Montesinos-Navarro A, Roldán A. Soil Characteristics Driving Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Semiarid Mediterranean Soils. Applied and Environmental Microbiology. 2016;82(11):3348-56. doi:10.1128/AEM.03982-15 ). These fungi are obligate biotrophs, so they cannot complete their life cycle in the absence of a host plant (22. Lanfranco L, Fiorilli V, Gutjahr C. Partner communication and role of nutrients in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 2018;220(4):1031-46. doi:https://doi.org/10.1111/nph.15230 ); hence, the differentiation of a functional mycorrhiza is a complex process that demands the participation of both organisms (33. Cozzolino V, Di Meo V, Monda H, Spaccini R, Piccolo A. The molecular characteristics of compost affect plant growth, arbuscular mycorrhizal fungi, and soil microbial community composition. Biology and Fertility of Soils. 2016;52(1):15-29. doi:10.1007/s00374-015-1046-8 ).

On the other hand, in modern agriculture, crop protection against the attack of pathogenic organisms is mainly carried out with agrochemicals, which can be applied directly at certain stages of the crop, through seed treatment or applied to the soil. These include fungicides, which are widely used to control or eliminate fungal plant pathogens. However, these products also affect other fungi indigenous to the soil, including those that promote plant growth, such as AMF (44. Hage-Ahmed K, Rosner K, Steinkellner S. Arbuscular mycorrhizal fungi and their response to pesticides. Pest Management Science. 2019;75(3):583-90. doi:https://doi.org/10.1002/ps.5220 ). The intensive use of chemicals, especially fungicides and fertilizers, is one of the main causes of the reduction of diversity in soils, including AMF (55. Lamichhane JR, You MP, Laudinot V, Barbetti MJ, Aubertot J-N. Revisiting Sustainability of Fungicide Seed Treatments for Field Crops. Plant Disease. 2019;104(3):610-23. doi:10.1094/PDIS-06-19-1157-FE ,66. Battini F, Cristani C, Giovannetti M, Agnolucci M. Multifunctionality and diversity of culturable bacterial communities strictly associated with spores of the plant beneficial symbiont Rhizophagus intraradices. Microbiological Research. 2016;183:68-79. doi:10.1016/j.micres.2015.11.012 ). However, recent studies report that the application of fungicides can also have a positive effect on mycorrhizal establishment; this depends on their mode of action and the AMF species involved.

Considering the scarce knowledge on the effect of fungicides on AMF under in vitro conditions and that the use of these fungi as biofertilizers is becoming more and more frequent in different agricultural production systems, the present research has the objective of evaluating the effect of different concentrations (0.1, 1, 10 and 100 mg L-1) of the systemic fungicide Previcur energy 84 sl on the pre-symbiotic stage of Rhizophagus irregularis (INCAM 11), under in vitro conditions.

MATERIALS AND METHODS

 

The research was conducted between 2017 and 2018, at the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), belonging to the Ministry of Higher Education and located in the municipality San José de las Lajas, Mayabeque province.

Biological material

 

The inoculum used was the AMF Rhizophagus irregularis (Blaszk., Wubet, Renker & Buscot) C. Walker & A. Schüßler (INCAM 11), from the INCA stock. The inoculum had an average concentration of 25 spores g-1 of fresh soil.

SRM (Strullu and Romand Modified) culture medium (77. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia. 1998;90(4):579-85. doi:10.1080/00275514.1998.12026946 ). The medium was composed of (g L-1): macroelements-MgSO4.7H2O-73.9, KNO3-7.6, KCl-6.5, KH2PO4-0.41; Ca (NO3).2.4H2O-35.9; NaFeEDTA-0.16; microelements-MnSO4.4H2O-1.225, CuSO4.5H2O-1.1, ZnSO4.7H2O-0. 14, H3BO3-0.925, Na2MoO4.2H2O-0.12, (NH4) 6Mo7O24.4H2O-1.7; Vitamins (g L-1)-Calcium pantothenate-0.09, Biotin-0.0001, Nicotinic acid-0.1, Pyridoxine-0.09, Thiamin-0.1 and Cyanocobalamin-0.04; Sucrose-10. The pH was adjusted to 7.5; before adding 4 g L-1 of Gellam Gum. The medium was sterilized at 121 ºC for 15 min.

Effect of different concentrations of the systemic fungicide Previcur energy 84sl on the pre-symbiotic stage of Rhizophagus irregularis (INCAM 11), under in vitro conditions

 

In order to evaluate the effect of a systemic fungicide on the in vitro presymbiotic growth of INCAM 11, this experiment was carried out using the commercial fungicide Previcur energy 84 sl, whose active component is: propyl 3-(dimethylamino) propylcarbamate 53 %, ethylhydrogen phosphonate 31 % and inert ingredients 16 % (88. Hernández-Dorrego A, Mestre-Parés J. Evaluation of some fungicides on mycorrhizal symbiosis between two Glomus species from commercial inocula and Allium porrum L. seedlings. Spanish Journal of Agricultural Research. 2010;8(1):43-50. doi:10.5424/sjar/201008S1-1222 ).

Spores grouped in clusters were used as propagules. These were extracted from the soil, using the technique of wet sieving and decantation and subsequent extraction through centrifugation of a sucrose+Tween 80 solution at 2000 rpm for five minutes, according to Gerdemann and Nicolson (99. Gerdemann JW, Nicolson TH. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological society. 1963;46(2):235-44.); modified by Herrera et al. (1010. Herrera RA, Ferrer RL, Furrazola E, Orozco MO. Estrategia de funcionamiento de las micorrizas VA en un bosque tropical. Biodiversidad en Iberoamérica. Ecosistemas, Evolución y Procesos sociales.(Eds. Maximina Monasterio) programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo. Subprograma XII, Diversidad Biológica, Mérida. 1995;). Subsequently, they were disinfected using the methodology of some authors (1111. Cranenbrouck S, Voets L, Bivort C, Renard L, Strullu D-G, Declerck S. Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi with Root Organs. In: Declerck S, Fortin JA, Strullu D-G, editors. In Vitro Culture of Mycorrhizas [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer; 2005 [cited 05/10/2021]. p. 341-75. doi:10.1007/3-540-27331-X_18 ), modified by others (1212. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en ).

From the extracted propagules, spores grouped in clusters were selected, placed on a membrane (0.44 μm pore diameter) and washed three times with sterile distilled water. Subsequently, Chloramine T 2 % (m/v) and two drops of Tween 20 were added for 10 minutes. Next, the propagules were washed three times with sterile distilled water and treated with an antibiotic solution (streptomycin sulfate (0.02 %) (m/v) and gentamicin sulfate (0.01 %) (m/v), for 10 minutes, previously sterilized with the aid of a millipore filter (type HA, 4.0 cm diameter and 0.22 μm pore size). Finally, the membrane with the propagules was transferred to the same antibiotic solution, previously filtered in a sterile Petri dish (90 mm diameter) for 24 hours (1212. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en ).

From the extracted propagules, spores grouped in clusters were selected, placed on a membrane (0.44 μm pore diameter) and washed three times with sterile distilled water. Subsequently, Chloramine T 2 % (m/v) and two drops of Tween 20 were added for 10 minutes. Next, the propagules were washed three times with sterile distilled water and treated with an antibiotic solution (streptomycin sulfate (0.02 %) (m/v) and gentamicin sulfate (0.01 %) (m/v), for 10 minutes, previously sterilized with the aid of a millipore filter (type HA, 4.0 cm diameter and 0.22 μm pore size). Finally, the membrane with the propagules was transferred to the same antibiotic solution, previously filtered in a sterile Petri dish (90 mm diameter) for 24 hours (1212. Perera-García SS, Fernández-Suárez K, Pérez-Ortega EJ. Germinación y crecimiento de propágulos de Rhizoglomus sp. in vitro. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200005&script=sci_arttext&tlng=en ).

After this time, five propagules per 90 mm diameter Petri dish containing SRM medium (Strullu and Romand Modified) were inoculated (77. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia. 1998;90(4):579-85. doi:10.1080/00275514.1998.12026946 ). The pH of the culture medium was adjusted to 7.5 (1313. Arocha-Rodríguez M de la C, Pérez-Ortega E, Fernández-Suárez K, Haesaert G. Efecto del pH del medio de cultivo en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare. Cultivos Tropicales [Internet]. 2019;40(2). Available from: scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-59362019000200008&script=sci_arttext&tlng=pt ). After sterilizing the culture medium at 121 °C for 15 min, the commercial systemic fungicide Previcur energy 84 sl was added at four concentrations (0.1; 1; 1; 10 and 100 mg L-1). Ten plates were used for each of the fungicide concentrations. A completely randomized design was used for the experiment.

The percentage germination of the spores of strain INCAM 11 was determined. The dynamics of germ tube growth was determined from the moment at which growth was observed, with origin in the sporophore or in the sustentation hyphae. Measurements were taken from the base of the new hypha to its apex, every seven days for one month and a micrometer coupled to a stereomicroscope (NOVEL N-800M, Nanjing Jiangnan Novel Optics Co., Ltd; China, 40X) was used. The percentage increase in the variable germ tube length was calculated with respect to the control not treated with the fungicide.

Statistical Analysis

 

Once normality was verified, the confidence interval of the means was calculated at 95 % probability, taking into account the number of repetitions and the reproducibility of the data. SPSS version 19 (1414. Gray CD, Kinnear PR. IBM SPSS Statistics 19 Made Simple. Psychology Press; 2012. 688 p.) was used for statistical processing of the data.

RESULTS AND DISCUSSION

 

In this experiment, four concentrations of the systemic fungicide Previcur were studied on the in vitro growth of R. irregularis in SRM medium at pH 7.5. This pH value was chosen taking into account that 7.5 was found to be the pH at which the presymbiotic stage of this strain developed best (Figure 1).

Bars represent the means of 10 plates containing 5 propagules each
Figure 1.  Effect of applying different concentrations of the fungicide Previcur to the SRM culture medium on the germination of spores of Rhizophagus irregularis species (INCAM 11) for 28 days

When analyzing the behavior of this variable, it can be seen that the highest germination percentage values were reached when applying the 10 mg L-1 concentration of the fungicide, which was significantly different from the rest of the treatments. On the other hand, when analyzing the effect of the 0.1 mg L-1 and 1 mg L-1 concentrations of the systemic fungicide on the germination of INCAM 11, no statistical differences were found between these and the control, but with the 100 mg L-1 concentration, which presented the lowest germination percentage values (Figure 1).

Figure 2 shows that there was an increase in the length of the germinative tube over time, appreciable in all the treatments studied. During the first three weeks of the experiment, no significant differences were observed among the treatments; however, in the fourth week the values of the variable began to disperse, with the length of the germinative tubes of spores treated with the 10 mg L-1 concentration of the Previcur fungicide being greater.

Bars represent the confidence intervals of the mean of treatments for p≤ 0.05 (n=10)
Figure 2.  Dynamics of germ tube growth of propagules of Rhizophagus irregularis species (INCAM 11) inoculated on SRM medium for 4 weeks, with different concentrations of the fungicide Previcur (0.1; 1; 10; 100 mg L-1)

Figure 3 shows that in the concentration of 10 mg L-1 the percentage increase of this variable, with respect to the untreated control, was 50 %. In the case of the 0.1 and 1 mg L-1 concentrations, they only reached a 10 % increase, with no significant differences between them, except for the 100 mg L-1 concentration, which decreased by 10 % with respect to the control.

It is evident that the application of Previcur fungicide to the SRM culture medium significantly stimulates the growth of germinating hyphae of R. irregularis.

Bars represent the confidence intervals of the mean of treatments for p ≤ 0.05 (n=10)
Figure 3.  Percentage increase and decrease in germ tube length of Rhizophagus irregularis (INCAM 11) propagules inoculated on SRM medium with different concentrations of the fungicide Previcur (0.1; 1; 10; 100 mg L-1), with respect to the control, calculated at the end of the experiment

These in vitro results are related to previous research (1515. de Novais CB, Avio L, Giovannetti M, de Faria SM, Siqueira JO, Sbrana C. Interconnectedness, length and viability of arbuscular mycorrhizal mycelium as affected by selected herbicides and fungicides. Applied Soil Ecology. 2019;143:144-52. doi:10.1016/j.apsoil.2019.06.013 ), where the stimulatory effect of some systemic fungicides on the germination percentage, germ tube growth and root colonization of Glomus intraradices was reported at concentrations between 0.1 and 10 mg L-1. Other studies have also shown that systemic fungicides can stimulate or inhibit mycorrhizal functioning, depending on the active ingredient concentration used (1616. Samarbakhsh S, Rejali F, Ardakani MR, Nejad FP, Miransari M. The combined effects of fungicides and arbuscular mycorrhiza on corn (Zea mays L.) growth and yield under field conditions. Journal of Biological Sciences. 2009;9(4):372-6. ).

Interestingly, germination and hyphal growth of Rhizophagus irregularis spores were observed at all concentrations studied, indicating that there was no inhibitory effect on these variables, even when their values were lower than the concentration of 100 mg L-1. This could be explained on the basis that the toxicity of Previcur, when applied, even at higher concentrations (100 mg L-1), does not prevent the reactions that are triggered for mycelial development in the culture medium used.

Although in vitro research in this regard is scarce, reports have been found indicating that some systemic fungicides such as Metalaxyl can cause an increase in germination and mycelial length of AMF spores in vitro (1717. Rose MT, Cavagnaro TR, Scanlan CA, Rose TJ, Vancov T, Kimber S, et al. Impact of Herbicides on Soil Biology and Function. In: Sparks DL, editor. Advances in Agronomy [Internet]. Academic Press; 2016 [cited 05/10/2021]. p. 133-220. (Advances in Agronomy; vol. 136). doi:10.1016/bs.agron.2015.11.005 ). This information coincides with what was found in this study, in which Previcur, with the same mode of action as Metalaxyl, stimulated germ tube growth of INCAM strain 11 at the 10 mg L-1 concentration (Figure 4).

A: without fungicide and B: with fungicide. C: INCAM 11 spores treated with Previcur at equal concentration, week 4. Photos taken under a stereomicroscope (NOVEL N-800M, Nanjing Jiangnan Novel Optics Co., Ltd.; China, 40X)
Figure 4.  Germination hyphae (GH) of INCAM 11 spores treated or not with Previcur at a concentration of 10 mg L-1

In the literature consulted, some systemic fungicides have also been reported to have different effects, depending on the AMF species used. For example, the fungicide Fenhexamide, presents a fungistatic effect at concentrations higher than 20 mg L-1, when applied to the culture medium by reducing the germination of Rhizophagus irregularis spores and affecting the growth, architecture and physiology of the extraradical mycelium (1818. Zocco D, Fontaine J, Lozanova E, Renard L, Bivort C, Durand R, et al. Effects of two sterol biosynthesis inhibitor fungicides (fenpropimorph and fenhexamid) on the development of an arbuscular mycorrhizal fungus. Mycological Research. 2008;112(5):592-601. doi:10.1016/j.mycres.2007.11.010 ,1919. Zocco D, Van Aarle IM, Oger E, Lanfranco L, Declerck S. Fenpropimorph and fenhexamid impact phosphorus translocation by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 2011;21(5):363-74. doi:10.1007/s00572-010-0344-0 ). However, the same fungicide at a concentration similar to that of the present study (10 mg L-1) does not affect germination, nor the anastomosis formation of Funneliformis mosseae hyphae in SRM culture medium, in vitro (2020. Rivera-Becerril F, van Tuinen D, Chatagnier O, Rouard N, Béguet J, Kuszala C, et al. Impact of a pesticide cocktail (fenhexamid, folpel, deltamethrin) on the abundance of Glomeromycota in two agricultural soils. Science of The Total Environment. 2017;577:84-93. doi:10.1016/j.scitotenv.2016.10.098 ).

According to in vitro studies (2020. Rivera-Becerril F, van Tuinen D, Chatagnier O, Rouard N, Béguet J, Kuszala C, et al. Impact of a pesticide cocktail (fenhexamid, folpel, deltamethrin) on the abundance of Glomeromycota in two agricultural soils. Science of The Total Environment. 2017;577:84-93. doi:10.1016/j.scitotenv.2016.10.098 ,2121. Buysens C, Dupré de Boulois H, Declerck S. Do fungicides used to control Rhizoctonia solani impact the non-target arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis? Mycorrhiza. 2015;25(4):277-88. doi:10.1007/s00572-014-0610-7 ), some systemic fungicides, when used in SRM culture medium and in the presence of Rhizophagus irregularis and Funneliformis mosseae strain, tested even at higher concentrations than in this study (200 mg L-1), showed a positive effect on AMF. Although there is very little literature available on the direct effects of fungicides on AMF under these experimental conditions of monoxenic culture, hence the novelty and importance of this research, it can be appreciated, according to these results, which the effect of some systemic fungicides depends fundamentally on the concentration of the fungicide and the species of AMF under study.

Similar results to those of this work were found by other researchers (2222. Lekberg Y, Wagner V, Rummel A, McLeod M, Ramsey PW. Strong indirect herbicide effects on mycorrhizal associations through plant community shifts and secondary invasions. Ecological Applications. 2017;27(8):2359-68. doi:https://doi.org/10.1002/eap.1613 ), who observed, under in vitro conditions, that the fungicide Myclobutanil in a concentration range of 0.2 mg L-1 to 20 mg L-1, did not affect the biomass, nor the viability of R. irregularis hyphae. The results of this experiment are supported by data obtained in the field, in which AMF colonization was reduced only when Myclobutanil produced changes in host plant physiology.

On the other hand, in the absence of a host plant, chemicals containing Chlorotoluron appear to have no effect on AMF spore germination (44. Hage-Ahmed K, Rosner K, Steinkellner S. Arbuscular mycorrhizal fungi and their response to pesticides. Pest Management Science. 2019;75(3):583-90. doi:https://doi.org/10.1002/ps.5220 ), whereas those containing Bifenox and Mecoprop, Ioxynil, and Clopyralid inhibit spore germination at low concentrations, but stimulate germination at concentrations considered high. These results correspond with the effect of Previcur on INCAM 11 strain stimulating its germination and germ tube growth at a concentration of 10 mg L-1.

The results of this research show how Previcur fungicide has a stimulatory effect on INCAM 11 strain at a concentration of 10 mg L-1. It should be noted that in the SRM culture medium, only the chemical was used in the culture medium and the AMF species Rhizophagus irregularis was inoculated, showing a direct effect of this fungicide on AMF.

CONCLUSIONS

 

The 10 mg L -1 concentration of the systemic fungicide Previcur energy 84 sl had a positive effect, stimulating germination and germ tube growth of Rhizophagus irregularis under in vitro culture conditions.