INTRODUCCIÓN

El uso indiscriminado de fertilizantes minerales en la agricultura ha ocasionado daños a los diferentes ecosistemas. La erosión de los suelos y la contaminación de aguas superficiales y subterráneas por nitratos, constituyen evidencias del mal manejo de los fertilizantes en la actividad agrícola. Esto constituye una problemática para la salud de todos los seres vivos que habitan en dichos ecosistemas (11. Campoverde León, K. D. (2019). Evaluación de cambios ambientales sobre el balance de carbono y nitrógeno en el suelo. 53 p.). En este sentido, el empleo de biofertilizantes en la práctica agrícola se considera una alternativa viable, al ser un recurso económico y ecológicamente sano; y porque permite reducir el empleo de fertilizantes minerales (22. Martínez F, García C, Gómez LA, Aguilar Y, Martínez-Viera R, Castellanos N, et al. Manejo sostenible de suelos en la agricultura cubana. Agroecología. 2017;12(1):38-25. ) e incrementar el rendimiento de los cultivos (33. Ortega M, Shagarodsky T, Dibut BL, Ríos Y, Tejeda G y Gómez LA. Influencia de la interacción entre el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.) y la inoculación con cepas seleccionadas de Mesorhizobium spp. Cultivos Tropicales. 2016;37(1):27-20. ISSN 0258-5936.-66. Zuffo AM, Steiner F, Busch A y Zoz T. Response of early soybean cultivars to nitrogen fertilization associated with Bradyrhizobium japonicum inoculation. Pesquisa Agropecuária Tropical. 2018;48(4):446-436. ISSN 1517-6398. doi: http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632018v4852637 ).

Diversos microorganismos, los denominados Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal, constituyen el principio activo en los biofertilizantes. Entre estos, se encuentran los rizobios, bacterias diazotróficas que se han estudiado, fundamentalmente, por la asociación simbiótica que establecen con las plantas leguminosas. Este grupo bacteriano logra satisfacer entre el 50-100 % de las necesidades nitrogenadas de los cultivos de interés agrícola (66. Zuffo AM, Steiner F, Busch A y Zoz T. Response of early soybean cultivars to nitrogen fertilization associated with Bradyrhizobium japonicum inoculation. Pesquisa Agropecuária Tropical. 2018;48(4):446-436. ISSN 1517-6398. doi: http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632018v4852637 ).

Se han desarrollado y aplicado inoculantes a base de estas bacterias en los sistemas de producción agrícola. Tales bioproductos contienen altas concentraciones de bacterias y la aplicación directa a las semillas, en dosis bajas (200 mL de inoculante por cada 50 kg de semillas) en el momento de la siembra (77. CENATOX. Centro Nacional de Toxicología. Dictamen Toxicológico del Azofert-F^®; 2016. 4 p.), permite ahorrar entre el 50-70 % del fertilizante químico en frijol (Phaseolus vulgaris L.) (88. Estrada W, Chávez L, Jerez E, Nápoles MC, Sosa A, Cordoví C, et al. Efecto del Azofert^® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de déficit hídrico. Centro Agrícola. 2017;44(3):42-36. ISSN: 2072-2001.,99. Hernández L y Salido Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Caribeña de Ciencias Sociales, (enero) [Internet]. 2019 [cited 2019 Oct 30]; ISSN: 2254-7630. Available from: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html ) y hasta el 100 % en soya (Glycine max L.) (1010. Sauvu C, Nápoles MC, Rodríguez AB, Lamz A, Ruiz M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3): 02. ISSN: 0258-5936.).

Dentro de los biofertilizantes que se emplean ampliamente en Cuba para las leguminosas, se encuentra el Azofert^®. En la actualidad, este bioproducto es un inoculante líquido que se distingue del resto de los biofertilizantes nacionales por contener elevadas concentraciones de factores de nodulación, señal determinante en la simbiosis rizobio-leguminosa (1111. Nápoles MC, Cabrera JC, Onderwater R, Wattiez R, Hernández I, Martínez L, et al. Señales producidas por Rhizobium leguminosarum en la interacción con frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Cultivos Tropicales. 2016;37(2):44-37. ISSN: 0258-5936.,1212. Nápoles MC, Cabrera JC, Wegria G, Onderwater R, Wattiez R, Hernández I, et al. Inducción de señales en la interacción Mesorhizobium cicerii-Cicer arietinum L. Cultivos Tropicales. 2018; 39(2): 107-101. ISSN: 0258-5936.). Azofert^®, elaborado y comercializado en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), posee tres productos registrados: Azofert^®-S (para soya), Azofert^®-F (para frijol) y Azofert^®-Can (para Canavalia ensiformis L.), los cuales han sido validados con éxito en diferentes condiciones edafoclimáticas, pues incrementaron la nodulación, el crecimiento y los rendimientos de estos cultivos (1010. Sauvu C, Nápoles MC, Rodríguez AB, Lamz A, Ruiz M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3): 02. ISSN: 0258-5936.,1313. Rodríguez AB, González-Peña D, Nápoles MC, Morales D, Núñez M, Cartaya O, et al. Oligosacarinas como bioestimulantes para la agricultura cubana. Anales de la Academia de Ciencias de Cuba. 2020;11(1): 852 p. ISSN: 2304.,1414. Martín GM, Tamayo Y, Hernández I, Varela M y da Silva E. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de 15N y diferencia de N total. Cultivos Tropicales. 2017;38(1):130-122. ISSN: 0258-5936.).

Sin embargo, en numerosas ocasiones, tras la aplicación de inoculantes en el campo, no se observa un efecto positivo en el crecimiento y rendimiento de los cultivos. Este comportamiento se ha atribuido, entre otros factores, a las bajas concentraciones y desfavorables condiciones fisiológicas de las células bacterianas presentes en los inoculantes (1515. Bashan Y, de Bashan LE y Prabhu SR. Superior polymeric formulations and emerging innovative products of bacterial inoculants for sustainable agriculture and the environment. In Agriculturally important microorganisms. In: Singh H, Sarma B, Keswani C. (eds). Springer, Singapore; 2016. 15-46 p. Print ISBN 978-981-10-2575-4. doi https://doi.org/10.1007/978-981-10-2576-1_2 -1717. Chávez-Díaz IF, Zelaya LX, Cruz CI, Rojas E, Ruíz S y de los Santos S. Consideraciones sobre el uso de biofertilizantes como alternativa agro-biotecnológica sostenible para la seguridad alimentaria en México. Revista mexicana de ciencias agrícolas. 2020;11(6):1436-1423. ISSN: 2007-0934.).

Teniendo en cuenta lo anterior, se ha establecido que la concentración de los microorganismos que componen estos productos es uno de los parámetros de calidad más importantes a tener en cuenta, ya que determina el éxito de la colonización y el establecimiento posterior de la simbiosis entre ambos organismos (1818. Nápoles MC, Gutiérrez A y Corbera J. Medio de cultivo para Bradyrhizobium japonicum. Biopreparado resultante. Cuba; Patente de Invención No. 22 797, OCPI, 2002.). Las concentraciones requeridas de rizobios en el inoculante varían en todo el mundo. Se considera como un criterio común, poseer una concentración mínima en el orden de 10⁸ UFC mL^-1 ó g^-1 y una contaminación mínima o nula (1919. Izaguirre-Mayoral ML, Labandera C y Sanjuán J. Biofertilizantes en Iberoamérica: una visión técnica, científica y empresarial. 1^ra ed. Montevideo, Uruguay: Imprenta Denad Internacional S.A; 2007. 100 p.). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la viabilidad en el tiempo de las cepas de rizobios que forman parte de los biofertilizantes Azofert^®-F y Azofert^®-S.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en la Planta de producción de Biofertilizantes, del Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Se evaluó la viabilidad de las cepas Rhizobium leguminusarum CF1 (CF1) y Bradyrhizobium elkanii ICA 8001 (ICA 8001), procedentes de los ceparios del Instituto de Suelos y del INCA, respectivamente. Dichas cepas constituyen la fracción activa de los biofertilizantes Azofert^®-F y Azofert^®-S, producidos y comercializados por el INCA, para la inoculación en los cultivos de frijol y soya (2020. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 002/2017, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 041. La Habana. Cuba; 2017.,2121. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 004/2005, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 033. La Habana. Cuba; 2013.).

Colonias aisladas de las cepas CF1 e ICA 8001, previamente cultivadas en placas Petri con medio Levadura-manitol sólido, con rojo Congo, a 28 °C durante tres y siete días, respectivamente, se multiplicaron en Erlenmeyers de 100 mL de capacidad, que contenían 20 mL del medio de cultivo Bradyfact (1818. Nápoles MC, Gutiérrez A y Corbera J. Medio de cultivo para Bradyrhizobium japonicum. Biopreparado resultante. Cuba; Patente de Invención No. 22 797, OCPI, 2002.) estéril. Los frascos se mantuvieron en condiciones de agitación a 130 rpm y 28 °C, durante 16 horas para la cepa CF1 y 72 horas para la cepa ICA 8001. A partir de estos pre-inóculos, se realizó el escalado de multiplicación de las cepas por fermentación aerobia, en iguales condiciones de temperatura e incubación, hasta un volumen total de 2000 mL. Se envasaron 200 mL de cada inóculo en frascos estériles de 240 mL y se establecieron dos tratamientos, en cada uno de ellos; el primero, se conservó a 4 °C y, el segundo, a temperatura ambiente promedio de 32 °C. Se determinó la calidad microbiológica de los inoculantes, para lo cual se tuvo en cuenta la pureza y la concentración de células viables de las cepas CF1 e ICA 8001 en los inoculantes.

La pureza de los cultivos se verificó mediante la Tinción de Gram, al inicio y al final del experimento. Se tuvo en cuenta las características morfológicas, la respuesta a la tinción y la presencia de endoesporas en las células de ambas cepas bacterianas. Además, se determinó la presencia de microorganismos contaminantes en el inoculante (2222. Norris DO y Dates RA. Legume bacteriology Tropical Pasteur Reserch. Principles and Methods. C. A. B. Bill, 1976. vol 51; p. 174-134.).

Para determinar la concentración de las cepas CF1 e ICA 8001 viables se tomaron tres muestras. A partir de estas, se realizaron diluciones decimales seriadas, de las que se cultivaron 0,1 mL en placas con medio levadura-manitol sólido (2323. Vincent JM. A manual for the practical study of the root-nodule bacteria. In: International Programme Handbook. No. 15. England: Oxford. Blackwele scientific publications; 1970. 164 p. ISBN 978-0-632-06410-6.). Las placas se incubaron a 30 °C durante tres días para la cepa CF1 y siete días para la cepa ICA 8001. Se cuantificó el número de colonias por placa y se determinó el número de UFC mL^-1, según la expresión:

Donde:

No. col: número de colonias

d: factor de dilución

Estas evaluaciones se llevaron a cabo hasta que la concentración de las cepas en los inoculantes fuera inferior a 10⁸ UFC mL^-1. En el biofertilizante Azofert^®-F, conservado a ambas temperaturas, las evaluaciones se realizaron cada siete días durante los primeros 42 días y, posteriormente, se realizaron cada 21 días, mientras que en Azofert^®-S de muestreó cada 30 días.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La conservación adecuada de los inoculantes, después de su elaboración, constituye un aspecto importante para preservar la calidad microbiológica de los mismos y, con ello, su comercialización y efectividad en el campo. El principal parámetro para medir la vida útil de los inoculantes es un adecuado número de células viables aptas para adaptarse y sobrevivir en el medio, una vez inoculadas sobre las semillas (1919. Izaguirre-Mayoral ML, Labandera C y Sanjuán J. Biofertilizantes en Iberoamérica: una visión técnica, científica y empresarial. 1^ra ed. Montevideo, Uruguay: Imprenta Denad Internacional S.A; 2007. 100 p.). Es por ello, que en esta investigación fue de gran interés realizar un estudio desde el punto de vista microbiológico de dos biofertilizantes cubanos Azofert^®-F y Azofert^®-S.

La tinción de Gram permitió observar bacilos Gram negativos y sin endoesporas, lo que concuerda con las características morfológicas que se plantea en el registro de los inoculantes Azofert^®-F y Azofert^®-S, elaborados a base de cepas de rizobios de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium (2020. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 002/2017, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 041. La Habana. Cuba; 2017.,2121. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 004/2005, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 033. La Habana. Cuba; 2013.). En ninguno de los dos inoculantes se observó la presencia de microorganismos con otra morfología y respuesta a la tinción.

La viabilidad de la cepa CF1 en Azofert^®-F, conservado en las diferentes temperaturas, se muestra en la Figura 1.

Los resultados mostraron que la concentración de la cepa CF1 se mantuvo en 1 x 10⁸ UFC mL^-1, valores que se consideran óptimos para su empleo, hasta los 126 días a 4 °C. Sin embargo, esta concentración bacteriana se mantuvo en solo 28 días en aquellos inoculantes que se mantuvieron a 32 °C. Ambos tratamientos se diferenciaron, significativamente, entre sí, a los 35 días de conservación, a favor de los mantenidos a temperatura refrigerada.

En estudios similares, se ha informado de la conservación a 5 y 28 °C de dos cepas de Bradyrizobium japonicum, en los cuales una de estas permaneció tres veces más tiempo viable (180 días) que la otra (60 días), al mantenerse a 5 °C. Además, en este estudio se constató que las evaluaciones que se realizaron a los inoculantes conservados a temperatura ambiente mostraron el descenso en una unidad logarítmica, a partir de los 30 días, para una de las cepas de Bradyrhizobium que se estudiaron (2525. Cozzi JG y Benintende GB y Pacheco JC. Nuevo inoculante líquido para semillas de soja (Glycine max). Revista de la Facultad de Agronomía. 1996;16(1/2):132-127.).

Por otra parte, la viabilidad de la cepa ICA 8001 en el inoculante para soya Azofert^®-S, en diferentes temperaturas de almacenamiento, se muestra en la Figura 2.

En los primeros 30 días de evaluación, la viabilidad celular no mostró diferencias significativas entre los tratamientos. A partir de este momento, la conservación a 4 °C afectó de manera positiva el número de células en el inoculante, pues mantuvo durante 280 días, valores aceptables para la aplicación del inoculante en campo. Los inoculantes conservados a 32 °C mostraron valores de viabilidad apropiados para su empleo, sólo hasta los primeros 60 días. A partir de ese momento, la concentración celular disminuyó a valores no adecuados para su uso.

A diferencia de los resultados obtenidos en este estudio, otros autores han informado que la concentración de Azospirillum brasiliense en el inoculante líquido conservado a 4 °C no supera los 60 días (2626. Cortés-Patiño SA y Bonilla RR. Polymers selection for a liquid inoculant of Azospirillum brasilense based on the Arrhenius thermodynamic model. African Journal of Biotechnology. 2015;14(33):2553-2547. ISSN: 1684-5315. doi: 10.5897/AJB2015.14777 ).

La temperatura (2626. Cortés-Patiño SA y Bonilla RR. Polymers selection for a liquid inoculant of Azospirillum brasilense based on the Arrhenius thermodynamic model. African Journal of Biotechnology. 2015;14(33):2553-2547. ISSN: 1684-5315. doi: 10.5897/AJB2015.14777 ,2727. González EJ. Modelo factorial para el control de calidad de biofertilizantes de importancia agrícola. [Bogotá]; 2017. 40 p.), la especie bacteriana y la formulación, son algunos de los factores que más influyen en el mantenimiento de la concentración celular del agente activo de los inoculantes (2828. Tittabutr P, Payakapong W, Teaumroong N, Singleton PW y Boonkerd N. Growth, survival and field performance of bradyrhizobial liquid inoculant formulations with polymeric additives. Science Asia. 2007;33(1):77-69. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2007.33.069.). Los rizobios presentan una temperatura óptima para su crecimiento de 30 °C (2929. Caballero PC, Ferreira RA y Nakayama HD. Caracterización morfológica de aislados nativos de Bradyrhizobium sp. y tolerancia a condiciones de estrés [Internet]. Revista Científica de la Juventud. 2019 [cited 2019 November 1];(1):120-111. Available from: https://www.juventud.gov.py/ojs/index.php/snj1/article/view/10 ,3030. Bécquer CJ, Galdo Y, Mirabal A y Quintana M. Rizobios aislados de leguminosas forrajeras de un ecosistema ganadero árido de Holguín, Cuba. Tolerancia a estrés abiótico y producción de catalasa (Fase II) [Internet]. Cuban Journal of Agricultural Science. 2017 [cited 2019 November 1];51(1):127-117. Available from: http://www.cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/692 ). A estas temperaturas se favorece el consumo de los nutrientes del medio (3131. Estrada GA, Bonilla RR y Diván VL. Efecto de diferentes temperaturas de almacenamiento sobre la calidad de bioinoculantes turbosos. Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 2009;10(2):213-205. ISSN: 0122-8706.), lo que provoca el agotamiento más acelerado de estos, con la consecuente disminución de la viabilidad bacteriana (3232. Castro AM. Bacteriología médica basada en problemas. 2da ed. México, Editorial: El Manual Moderno S.A.; 2014. 327 p. ISBN: 6074484090, 9786074484090.). Esto pudiera explicar, en alguna medida, la rápida disminución de la viabilidad en los inoculantes almacenados a temperatura ambiente.

A temperaturas entre 4 y 6 °C, el período de almacenamiento de los rizobios aumenta, por la reducción de la actividad metabólica de las células (3333. Freire JRJ y Sato ML. Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana de Microbiología-México. 1999; 41(1):42-35.). La conservación de microorganismos a estas temperaturas permite una alta supervivencia bacteriana, estabilidad celular y pureza en los cultivos (3434. Sarmiento Y, Cárdenas DM y Hazel A. Evaluation of the stability of Trichoderma sp. and Azotobacter sp. preserved by different methods. Revista Colombiana de Biotecnología. 2013; 15(1):158-150. ISSN: 0123-3475.). Esto pudiera explicar la sobrevivencia por más tiempo de las cepas CF1 e ICA 8001 cuando se conservaron a 4 °C.

En los estudios realizados en esta investigación, se emplearon dos cepas pertenecientes al grupo de los rizobios, conservadas en el mismo medio de cultivo y temperaturas. Sin embargo, se comportaron diferentes en condiciones de conservación semejantes. La especie (genotipo) al que pertenece un microorganismo constituye uno de los factores que explicaría este comportamiento. Estudios anteriores demostraron que la velocidad de multiplicación de cepas de Rhizobium sp es varias veces superior a la cepa ICA 8001 (3535. Hernández I y Nápoles MC. Efecto de diferentes fuentes de carbono sobre el crecimiento de un aislado de rizobio. Cultivos Tropicales. 2018; 39(3): 90-87. ISSN: 0258-5936.), con un máximo de multiplicación celular a las 24 y 55 horas, respectivamente. Además, se ha comprobado que los rizobios del género Rhizobium, presentan un tiempo de vida media más corto que las especies de crecimiento lento (Bradyrhizobium), durante su almacenamiento (2828. Tittabutr P, Payakapong W, Teaumroong N, Singleton PW y Boonkerd N. Growth, survival and field performance of bradyrhizobial liquid inoculant formulations with polymeric additives. Science Asia. 2007;33(1):77-69. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2007.33.069.).

Independientemente de que en este estudio se constató un efecto positivo de la refrigeración en la viabilidad celular, se evidenció una disminución de la concentración de las cepas bacterianas en el tiempo. Durante el ciclo de vida de los microorganismos, éstos transitan por diversas fases con características diferentes, donde pueden o no encontrar las condiciones para su crecimiento y división celular. El envejecimiento del cultivo, por ejemplo, provoca la acumulación de compuestos tóxicos en el medio de cultivo y el agotamiento de los nutrientes existentes (3232. Castro AM. Bacteriología médica basada en problemas. 2da ed. México, Editorial: El Manual Moderno S.A.; 2014. 327 p. ISBN: 6074484090, 9786074484090.), lo que provoca una disminución del agente activo en los inoculantes. De ahí, la importancia de desarrollar formulaciones donde se empleen conservantes apropiados que incrementen la vida útil de estos productos.

CONCLUSIONES

La temperatura de conservación constituye un factor que influye en la viabilidad y la concentración del ingrediente activo de los biofertilizantes Azofert^®-F y Azofert^®-S. La conservación de estos productos a 4 °C mantiene por más tiempo un orden de 10⁸ UFC mL^-1 de las cepas Rhizobium leguminusarum CF1 y Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, concentración que se considera adecuada para su empleo en el campo. Estos resultados permiten establecer una estrategia productiva de los inoculantes, según las condiciones de temperatura disponibles.

RECOMENDACIONES

Teniendo en cuenta estos resultados, es imprescindible realizar estudios de formulaciones con agentes que permitan preservar, por más tiempo, altas concentraciones del ingrediente activo de estos productos, incrementando así su vida útil.

INTRODUCTION

The indiscriminate use of mineral fertilizers in agriculture has caused damage to different ecosystems. Soil erosion and nitrate contamination of surface and groundwater are evidence of the poor management of fertilizers in agriculture. This constitutes a problem for the health of all living beings that inhabit these ecosystems (11. Campoverde León, K. D. (2019). Evaluación de cambios ambientales sobre el balance de carbono y nitrógeno en el suelo. 53 p.). In this sense, the use of biofertilizers in agricultural practice is considered a viable alternative, as it is an economical and ecologically sound resource; and because it allows the use of mineral fertilizers to be reduced (22. Martínez F, García C, Gómez LA, Aguilar Y, Martínez-Viera R, Castellanos N, et al. Manejo sostenible de suelos en la agricultura cubana. Agroecología. 2017;12(1):38-25. ) and crop yields to be increased (33. Ortega M, Shagarodsky T, Dibut BL, Ríos Y, Tejeda G y Gómez LA. Influencia de la interacción entre el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.) y la inoculación con cepas seleccionadas de Mesorhizobium spp. Cultivos Tropicales. 2016;37(1):27-20. ISSN 0258-5936.-66. Zuffo AM, Steiner F, Busch A y Zoz T. Response of early soybean cultivars to nitrogen fertilization associated with Bradyrhizobium japonicum inoculation. Pesquisa Agropecuária Tropical. 2018;48(4):446-436. ISSN 1517-6398. doi: http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632018v4852637 ).

Various microorganisms called Plant Growth Promoting Rhizobacteria are the active ingredient in biofertilizers. Among them are rhizobia, diazotrophic bacteria that have been studied mainly because of the symbiotic association they establish with leguminous plants. This bacterial group is able to satisfy 50-100 % of the nitrogen needs of crops of agricultural interest (66. Zuffo AM, Steiner F, Busch A y Zoz T. Response of early soybean cultivars to nitrogen fertilization associated with Bradyrhizobium japonicum inoculation. Pesquisa Agropecuária Tropical. 2018;48(4):446-436. ISSN 1517-6398. doi: http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632018v4852637 ).

Inoculants based on these bacteria have been developed and applied in agricultural production systems. Such byproducts contain high concentrations of bacteria and the direct application of low doses (200 mL of inoculant per 50 kg seeds) to seeds at the time of sowing (77. CENATOX. Centro Nacional de Toxicología. Dictamen Toxicológico del Azofert-F^®; 2016. 4 p.) saves between 50-70 % of chemical fertilizer in beans (Phaseolus vulgaris L.) (88. Estrada W, Chávez L, Jerez E, Nápoles MC, Sosa A, Cordoví C, et al. Efecto del Azofert^® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de déficit hídrico. Centro Agrícola. 2017;44(3):42-36. ISSN: 2072-2001.,99. Hernández L y Salido Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Caribeña de Ciencias Sociales, (enero) [Internet]. 2019 [cited 2019 Oct 30]; ISSN: 2254-7630. Available from: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html ) and up to 100 % in soybeans (Glycine max L.) (1010. Sauvu C, Nápoles MC, Rodríguez AB, Lamz A, Ruiz M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3): 02. ISSN: 0258-5936.).

Among the biofertilizers that are widely used in Cuba for leguminous plants is Azofert^®. This byproduct is currently a liquid inoculant that differs from other national biofertilizers in that it contains high concentrations of nodulation factors, a decisive sign in the rhizobium-legume symbiosis (1111. Nápoles MC, Cabrera JC, Onderwater R, Wattiez R, Hernández I, Martínez L, et al. Señales producidas por Rhizobium leguminosarum en la interacción con frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Cultivos Tropicales. 2016;37(2):44-37. ISSN: 0258-5936.,1212. Nápoles MC, Cabrera JC, Wegria G, Onderwater R, Wattiez R, Hernández I, et al. Inducción de señales en la interacción Mesorhizobium cicerii-Cicer arietinum L. Cultivos Tropicales. 2018; 39(2): 107-101. ISSN: 0258-5936.). Azofert^®, produced and marketed at the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), has three registered products: Azofert^®-S (for soybean), Azofert^®-F (for bean) and Azofert^®-Can (for Canavalia ensiformis), which have been successfully validated in different soil and climatic conditions as they increased nodulation, growth and yields of these crops (1010. Sauvu C, Nápoles MC, Rodríguez AB, Lamz A, Ruiz M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3): 02. ISSN: 0258-5936.,1313. Rodríguez AB, González-Peña D, Nápoles MC, Morales D, Núñez M, Cartaya O, et al. Oligosacarinas como bioestimulantes para la agricultura cubana. Anales de la Academia de Ciencias de Cuba. 2020;11(1): 852 p. ISSN: 2304.,1414. Martín GM, Tamayo Y, Hernández I, Varela M y da Silva E. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de 15N y diferencia de N total. Cultivos Tropicales. 2017;38(1):130-122. ISSN: 0258-5936.).

However, in many cases, after the application of inoculants in the field, a positive effect on crop growth and yield is not observed. This behavior has been attributed, among other factors, to low concentrations and unfavorable physiological conditions of the bacterial cells present in the inoculants (1515. Bashan Y, de Bashan LE y Prabhu SR. Superior polymeric formulations and emerging innovative products of bacterial inoculants for sustainable agriculture and the environment. In Agriculturally important microorganisms. In: Singh H, Sarma B, Keswani C. (eds). Springer, Singapore; 2016. 15-46 p. Print ISBN 978-981-10-2575-4. doi https://doi.org/10.1007/978-981-10-2576-1_2 -1717. Chávez-Díaz IF, Zelaya LX, Cruz CI, Rojas E, Ruíz S y de los Santos S. Consideraciones sobre el uso de biofertilizantes como alternativa agro-biotecnológica sostenible para la seguridad alimentaria en México. Revista mexicana de ciencias agrícolas. 2020;11(6):1436-1423. ISSN: 2007-0934.).

In view of the above, it has been established that the concentration of the micro-organisms that make up these products is one of the most important quality parameters, as it determines the colonization success and the subsequent establishment of the symbiosis between the two organisms (1818. Nápoles MC, Gutiérrez A y Corbera J. Medio de cultivo para Bradyrhizobium japonicum. Biopreparado resultante. Cuba; Patente de Invención No. 22 797, OCPI, 2002.). The required concentrations of rhizobia in the inoculant vary around the world. A common criterion is considered to be a minimum concentration in the order of 108 CFU mL^-1 or g^-1 and minimal or no contamination (1919. Izaguirre-Mayoral ML, Labandera C y Sanjuán J. Biofertilizantes en Iberoamérica: una visión técnica, científica y empresarial. 1^ra ed. Montevideo, Uruguay: Imprenta Denad Internacional S.A; 2007. 100 p.). The objective of the present work was to evaluate the viability over time of the rhizobial strains that form part of Azofert^®-F and Azofert^®-S biofertilizers.

MATERIALS AND METHODS

The study was carried out at the Biofertilizer Production Plant of the Plant Physiology and Biochemistry Department of INCA. The viability of Rhizobium leguminusarum CF1 (CF1) and Bradyrhizobium elkanii ICA 8001 (ICA 8001) strains from the Soil Institute's and INCA's strains, respectively, was evaluated. These strains constitute the active fraction of Azofert^®-F and Azofert^®-S biofertilizers, produced and marketed by INCA, for inoculation of bean and soybean crops (2020. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 002/2017, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 041. La Habana. Cuba; 2017.,2121. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 004/2005, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 033. La Habana. Cuba; 2013.).

Colonies isolated from strains CF1 and ICA 8001, previously grown on Petri dishes with solid yeast-mannitol medium with Congo red at 28 °C for three and seven days, respectively, were multiplied in 100 mL capacity Erlenmeyers containing 20 mL of sterile Bradyfact culture medium (1818. Nápoles MC, Gutiérrez A y Corbera J. Medio de cultivo para Bradyrhizobium japonicum. Biopreparado resultante. Cuba; Patente de Invención No. 22 797, OCPI, 2002.). The flasks were kept under shaking conditions at 130 rpm and 28 °C for 16 hours for strain CF1 and 72 hours for strain ICA 8001. From these pre-inocula, the multiplication of the strains by aerobic fermentation was scaled up under the same temperature and incubation conditions to a total volume of 2000 mL. 200 mL of each inoculum were packed in sterile 240 mL bottles and two treatments were established in each of them, the first one was kept at 4 °C and the second one at an average room temperature of 32 °C. The microbiological quality of the inoculants was determined, taking into account the purity and concentration of viable cells of CF1 and ICA 8001 strains in the inoculants.

Culture purity was verified by Gram staining at the beginning and at the end of the experiment. The morphological characteristics, the response to staining and the presence of endospores in the cells of both bacterial strains were taken into account. In addition, the presence of contaminating micro-organisms in the inoculum was determined (2222. Norris DO y Dates RA. Legume bacteriology Tropical Pasteur Reserch. Principles and Methods. C. A. B. Bill, 1976. vol 51; p. 174-134.).

To determine the concentration of viable CF1 and ICA 8001 strains, three samples were taken. From these, serial decimal dilutions were made from which 0,1 mL were grown on plates with solid yeast-mannitol medium (2323. Vincent JM. A manual for the practical study of the root-nodule bacteria. In: International Programme Handbook. No. 15. England: Oxford. Blackwele scientific publications; 1970. 164 p. ISBN 978-0-632-06410-6.). Plates were incubated at 30 °C for three days for strain CF1 and seven days for strain ICA 8001. The number of colonies per plate was quantified and the number of CFU mL^-1 was determined according to the expression:

Where:

No. col: number of colonies

d: dilution factor

These evaluations were carried out until the concentration of the strains in the inoculants was below 10⁸ CFU mL^-1. In the biofertilizers Azofert^®-F, conserved at both temperatures, the evaluations were carried out every seven days during the first 42 days and then every 21 days, while in Azofert^®-S it was sampled every 30 days.

RESULTS AND DISCUSSION

Proper preservation of inoculants after processing is an important aspect to preserve the microbiological quality of inoculants and thus their marketability and effectiveness in the field. The main parameter for measuring the shelf life of inoculants is an adequate number of viable cells capable of adapting and surviving in the medium once inoculated on the seeds (1919. Izaguirre-Mayoral ML, Labandera C y Sanjuán J. Biofertilizantes en Iberoamérica: una visión técnica, científica y empresarial. 1^ra ed. Montevideo, Uruguay: Imprenta Denad Internacional S.A; 2007. 100 p.). For this reason, in this research it was of great interest to carry out a study from the microbiological point of view of two Cuban biofertilizers, Azofert^®-F and Azofert^®-S.

Gram staining allowed the observation of Gram-negative bacilli without endospores, which is in agreement with the morphological characteristics of the inoculants Azofert^®-F and Azofert^®-S, made from rhizobial strains of the genera Rhizobium and Bradyrhizobium (2020. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 002/2017, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 041. La Habana. Cuba; 2017.,2121. MINAG, Ministerio de la Agricultura. Registro Central de Fertilizantes, departamento de fertilizantes. Certificado de registro No. 004/2005, inscripto en el libro primero, tomo I, folio 033. La Habana. Cuba; 2013.). In neither of the two inoculants was the presence of microorganisms with other morphology and response to staining observed.

The strain CF1 viability in Azofert^®-F, preserved at the different temperatures, is shown in Figure 1.

The results showed that strain CF1 concentration was maintained at 1 x 10⁸ CFU mL^-1, which is considered optimal for its use, for up to 126 days at 4 °C. However, this bacterial concentration was maintained in only 28 days in those inoculants that were kept at 32 °C. Both treatments differed significantly from each other after 35 days of storage in favor of those kept at refrigerated temperature.

In similar studies, two strains of Bradyrizobium japonicum have been reported to be stored at 5 and 28 °C, where one strain remained three times longer viable (180 days) than the other (60 days) when kept at 5 °C. In addition, this study found that evaluations of inoculants kept at room temperature showed a decrease of one logarithmic unit after 30 days for one of the Bradyrhizobium strains studied (2525. Cozzi JG y Benintende GB y Pacheco JC. Nuevo inoculante líquido para semillas de soja (Glycine max). Revista de la Facultad de Agronomía. 1996;16(1/2):132-127.).

On the other hand, the viability of strain ICA 8001 in the soybean inoculant Azofert^®-S, at different storage temperatures, is shown in figure 2.

In the first 30 days of evaluation, cell viability did not show significant differences between treatments. From this moment on, storage at 4 °C positively affected the number of cells in the inoculant, as it maintained, for 280 days, acceptable values for the application of the inoculant in the field. Inoculants stored at 32 °C showed viability values suitable for use only up to the first 60 days. After that time, the cell concentration decreased to values not suitable for use.

In contrast to the results obtained in this study, other authors have reported that the concentration of Azospirillum brasiliense in the liquid inoculant preserved at 4 °C does not exceed 60 days (2626. Cortés-Patiño SA y Bonilla RR. Polymers selection for a liquid inoculant of Azospirillum brasilense based on the Arrhenius thermodynamic model. African Journal of Biotechnology. 2015;14(33):2553-2547. ISSN: 1684-5315. doi: 10.5897/AJB2015.14777 ).

Temperature (2626. Cortés-Patiño SA y Bonilla RR. Polymers selection for a liquid inoculant of Azospirillum brasilense based on the Arrhenius thermodynamic model. African Journal of Biotechnology. 2015;14(33):2553-2547. ISSN: 1684-5315. doi: 10.5897/AJB2015.14777 ,2727. González EJ. Modelo factorial para el control de calidad de biofertilizantes de importancia agrícola. [Bogotá]; 2017. 40 p.), bacterial species and formulation are some of the factors that most influence the maintenance of the cell concentration of the active agent in inoculants (2828. Tittabutr P, Payakapong W, Teaumroong N, Singleton PW y Boonkerd N. Growth, survival and field performance of bradyrhizobial liquid inoculant formulations with polymeric additives. Science Asia. 2007;33(1):77-69. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2007.33.069.). Rhizobia have an optimum growth temperature of 30 °C (2929. Caballero PC, Ferreira RA y Nakayama HD. Caracterización morfológica de aislados nativos de Bradyrhizobium sp. y tolerancia a condiciones de estrés [Internet]. Revista Científica de la Juventud. 2019 [cited 2019 November 1];(1):120-111. Available from: https://www.juventud.gov.py/ojs/index.php/snj1/article/view/10 ,3030. Bécquer CJ, Galdo Y, Mirabal A y Quintana M. Rizobios aislados de leguminosas forrajeras de un ecosistema ganadero árido de Holguín, Cuba. Tolerancia a estrés abiótico y producción de catalasa (Fase II) [Internet]. Cuban Journal of Agricultural Science. 2017 [cited 2019 November 1];51(1):127-117. Available from: http://www.cjascience.com/index.php/CJAS/article/view/692 ). At these temperatures, the consumption of nutrients in the medium is favored (3131. Estrada GA, Bonilla RR y Diván VL. Efecto de diferentes temperaturas de almacenamiento sobre la calidad de bioinoculantes turbosos. Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 2009;10(2):213-205. ISSN: 0122-8706.), leading to a more accelerated depletion of nutrients, with a consequent decrease in bacterial viability (3232. Castro AM. Bacteriología médica basada en problemas. 2da ed. México, Editorial: El Manual Moderno S.A.; 2014. 327 p. ISBN: 6074484090, 9786074484090.). This may explain, to some extent, the rapid decline in viability in inoculants stored at room temperature.

At temperatures between 4 and 6 °C, the storage period of rhizobia increases, due to the reduced metabolic activity of the cells (3333. Freire JRJ y Sato ML. Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana de Microbiología-México. 1999; 41(1):42-35.). The preservation of micro-organisms at these temperatures allows high bacterial survival, cell stability and purity of the cultures (3434. Sarmiento Y, Cárdenas DM y Hazel A. Evaluation of the stability of Trichoderma sp. and Azotobacter sp. preserved by different methods. Revista Colombiana de Biotecnología. 2013; 15(1):158-150. ISSN: 0123-3475.). This could explain the longer survival of strains CF1 and ICA 8001 when stored at 4 °C.

In the studies conducted in this investigation, two strains belonging to the rhizobial group were used, preserved in the same culture medium and at the same temperatures. However, they behaved differently under similar preservation conditions. The species (genotype) to which a micro-organism belongs is one of the factors that could explain this behavior. Previous studies have shown that the multiplication rate of Rhizobium sp. strains is several times higher than that of ICA strain 8001 (3535. Hernández I y Nápoles MC. Efecto de diferentes fuentes de carbono sobre el crecimiento de un aislado de rizobio. Cultivos Tropicales. 2018; 39(3): 90-87. ISSN: 0258-5936.), with a maximum cell multiplication at 24 and 55 hours, respectively. Furthermore, it has been shown that rhizobia of the genus Rhizobium have a shorter half-life than slow-growing species (Bradyrhizobium) during storage (2828. Tittabutr P, Payakapong W, Teaumroong N, Singleton PW y Boonkerd N. Growth, survival and field performance of bradyrhizobial liquid inoculant formulations with polymeric additives. Science Asia. 2007;33(1):77-69. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2007.33.069.).

Although this study showed a positive effect of refrigeration on cell viability, there was evidence of a decrease in the concentration of bacterial strains over time. During the life cycle of micro-organisms, they pass through various phases with different characteristics, where they may or may not find the conditions for growth and cell division. Ageing of the culture, for example, leads to the accumulation of toxic compounds in the culture medium and the depletion of existing nutrients (3232. Castro AM. Bacteriología médica basada en problemas. 2da ed. México, Editorial: El Manual Moderno S.A.; 2014. 327 p. ISBN: 6074484090, 9786074484090.), resulting in a decrease of the active agent in the inoculants. Hence the importance of developing formulations where appropriate preservatives are used to increase the shelf life of these products.

CONCLUSIONS

The storage temperature is a factor influencing the viability and concentration of the active ingredient of the Azofert^®-F and Azofert^®-S biofertilizers. The storage of these products at 4 °C maintains for a longer time an order of 10⁸ CFU mL^-1 of the strains Rhizobium leguminusarum CF1 and Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, a concentration that is considered adequate for use in the field. These results allow the establishment of a productive strategy for inoculants, according to temperature conditions available.

RECOMMENDATIONS

Taking into account these results, it is essential to carry out studies on formulations with agents that allow the preservation of high concentrations of the active ingredient of these products for a longer period of time, thus increasing their shelf life.