INTRODUCCIÓN
⌅El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo de gran importancia en la alimentación humana. Su grano es rico en proteínas, aporta micronutrientes, fibra y almidón (11. Ganesan K, Xu B. Polyphenol-Rich Dry Common Beans (Phaseolus vulgaris) and Their Health Benefits. Int J Mol Sci. 2017 Nov 4;18(11):2331. DOI: 10.3390/ijms18112331. PMID: 29113078. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5713300/., 22. Guevara AM, Moya KV, Zeledón JR, Rojas LG, Aguirre CH, Monge HB. Evaluación de propiedades fisicoquímicas del frijol costarricense (Phaseolus vulgaris) como estrategia de diferenciación y valorización. Perspect Rur Nueva Época. 2020 Jun 30;18(35):25-48. DOI: 10.15359/prne.18-35.2. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.revistas.una.ac.cr/index.php/perspectivasrurales/article/view/14787.). Esta leguminosa demanda altas cantidades de nitrógeno, elemento que obtiene, en gran medida, a través de la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) (33. Cantaro-Segura H, Huaringa-Joaquín A, Zúñiga-Dávil D. Efectividad simbiótica de dos cepas de Rhizobium en cuatro variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Perú. Idesia (Arica). 2019 Dec;37(4):73-81. DOI: 10.4067/S0718-34292019000400073. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0718-34292019000400073&lng=es&nrm=iso&tlng=es.,44. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macías R, López-Alcocer E. Eficiencia en fijación biológica de nitrógeno de cepas de Rhizobium recolectadas en frijol cultivado y silvestre. Rev Terra Latinoam. 2020 Oct 11;38(4):841-852. DOI: 10.29312/terralat.38.4.654. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.terralatinoamericana.org.mx/index.php/terra/article/view/654.).
Dentro de los microorganismos que realizan la FBN se encuentran los rizobios, bacterias que tradicionalmente se utilizan como principio activo en la biofertilización de leguminosas. El empleo de biofertilizantes en la práctica agrícola se considera una alternativa viable por sus beneficios ecológicos, económicos y productivos; permite reducir el empleo de fertilizantes minerales (55. Martínez F, García C, Gómez LA, Aguilar Y, Martínez-Viera R, Castellanos N, Riverol M. Manejo sostenible de suelos en la agricultura cubana. Agroecología. 2017;12(1):25-38. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://revistas.um.es/agroecologia/article/view/330321.,66. Buntić AV, Stajković-Srbinović OS, Knežević MM, Kuzmanović ĐŽ, Rasulić NV, Delić DI. Development of liquid rhizobial inoculants and pre-inoculation of alfalfa seeds. Arch Biol Sci. 2019 Jun 4;71(2):379-387. DOI: 10.2298/ABS19023503B. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.serbiosoc.org.rs/arch/index.php/abs/article/view/3503.) e incrementar el rendimiento de cultivos de importancia económica (77. Romero-Arias A, Ruz-Reyes RM, Nápoles-García MC, Gómez-Padilla EJ, Rodríguez-Rodríguez S. Efecto de la aplicación de tres cepas de Bradyrhizobium en el desarrollo morfoagronómico de Glycine max Pastos y Forrajes. 2019;42(4):290-295. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/2691/269162670006/,88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401.).
En Cuba, se producen y comercializan diversos biofertilizantes, entre los que destaca el Azofert®, procedente del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). En particular, Azofert®-F se emplea en el cultivo del frijol, es un inoculante líquido que contiene altas concentraciones de la cepa bacteriana Rhizobium leguminosarum CF1 (CF1) y de inductores de la nodulación, atributo que lo distingue del resto de los inoculantes comerciales a base de rizobios en el país (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.). Su aplicación directa a las semillas de frijol en el momento de la siembra, permite ahorrar entre el 50-70 % del fertilizante nitrogenado (1010. Hernández Salido L, Salido García Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Carib Cienc Soc. 2019 Jan 30. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html.,1111. Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, Nápoles García MC, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) en condiciones de déficit hídrico. Revista Ciencias Agrícolas. 2018;45(4): [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/html/v45n4/body/cag03418.html.).
La ausencia de microorganismos contaminantes, la concentración de células viables y su estado fisiológico, son algunos de los factores que inciden en el desempeño exitoso de los biofertilizantes (1212. Bernabeu P. Caracterización de la colonización y promoción del crecimiento vegetal por Burkholderia tropica en gramíneas [en línea] [Tesis de Doctorado]. Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina; 2017. p. 264. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/59824.). Las normas de calidad que rigen el empleo de estos biopreparados varían en dependencia de las regulaciones vigentes en cada país. Sin embargo, se recomienda, en consenso, una concentración mínima del ingrediente activo de 1 x 109 UFC mL-1 ó g-1, en el momento de su elaboración y de 1 x 108 UFC mL-1 ó g-1, a su vencimiento, con una mínima o nula presencia de microorganismos contaminantes (1313. Izaguirre-Mayoral ML. Biofertilizantes en Iberoamérica: Una Visión Técnica, Científica y Empresarial [en línea]. 1ra ed. Montevideo, Uruguay: Editorial Universitaria; 2007. p. 103. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/Biofertilizantes_en_Iberoam%C3%A9rica.html?id=BrnhtAEACAAJ&redir_esc=y.).
La vida útil de los biofertilizantes es esencial para su comercialización, debido al prolongado tiempo que puede transcurrir entre su producción y la aplicación (1414. Hungria M, Nogueira MA, Campos LJM, Menna P, Brandi F, Ramos YG. Seed pre-inoculation with Bradyrhizobium as time-optimizing option for large-scale soybean cropping systems. Agronomy Journal. 2020;112(6):5222-5236. DOI 10.1002/agj2.20392 [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/agj2.20392.). Por consiguiente, determinar el periodo de efectividad de estos bioproductos, según las capacidades de conservación disponibles, resulta imprescindible para delimitar su tiempo de validez y poder establecer una estrategia de producción y comercialización que satisfaga la demanda en el momento oportuno de las siembras.
Existen pocos estudios en Cuba que abordan la estabilidad microbiológica en el tiempo de inoculantes comerciales líquidos. Los principios activos más empleados en el país son Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal como Azospirillum, Azotobacter y Mesorhizobium (1515. Dibut B, González R, Martínez R. Dimargon, nuevo medio de cultivo para la producción industrial de biopreparados a base de Azotobacter chroococcum. Cultivos Tropicales. 1994;15(1):12-14. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://biblat.unam.mx/es/revista/cultivos-tropicales/articulo/dimargon-nuevo-medio-de-cultivo-para-la-produccion-industrial-de-biopreparados-a-base-de-azotobacter-chroococcum.-1717. Nápoles MC, Velazco A. Utilización del ácido ascórbico como preservante en biopreparados de Azospirillum brasilense. Cultivos Tropicales. 1994;15(2):25-27. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/files/anteriores/1994/2/CT15205.pdf.). En la mayoría de estos estudios, no se logra acceder a los detalles de la investigación desde los buscadores disponibles en internet y, en muchos casos, se restringe el acceso a la información. Solo una investigación previa determinó el efecto de la temperatura en la conservación de un inoculante comercial a base de rizobios para soya (1818. Menéndez C, Trujillo LE, Ramírez R, González-Peña D, Espinosa D, Enríquez GA, Hernández L. Producción de un inoculante líquido de Bradyrhizobium japonicum con alto impacto en la siembra mecanizada de la soya en Cuba. Biotecnología Aplicada. 2014;31(2):111-115. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=51730.). Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la temperatura y el tiempo de conservación en la concentración del principio activo y la actividad biológica del biofertilizante Azofert®-F.
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅Se prepararon pre inóculos en Erlenmeyers de 100 mL de capacidad, que contenían 10 mL del medio de cultivo Bradyfact (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.) estéril. Para ello, se empleó una azada de la cepa CF1 conservada en tubos con medio Levadura-manitol (LM) (1919. Vincent JM. A Manual for the Practical Study of Root-nodule Bacteria [en línea]. 1970. Blackwell Scientific. p. 202. ISBN 978-0-632-06410-6. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/A_Manual_for_the_Practical_Study_of_Root.html?id=dcQcAQAAIAAJ&redir_esc=y.) sólido con rojo Congo. Los frascos se mantuvieron en agitación a 130 rpm y 28 °C, durante 16 h. Posteriormente, se continuó el escalado de la multiplicación de la cepa por fermentación aerobia, en iguales condiciones de incubación. En cada caso se inoculó el 10 % (volumen de inóculo/volumen de medio) hasta obtener un volumen total de 1000 mL del inoculante. El fermentado se formuló con 1000 mL de medio Bradyfact estéril en una relación 1:1.
El formulado (Azofert®-F) se envasó en diez frascos estériles de 240 mL de volumen total, cada uno con 200 mL del producto. Se establecieron dos tratamientos con cinco frascos cada uno. Un tratamiento se almacenó a temperatura refrigerada de 4 °C y el otro a temperatura ambiente promedio de 29±2 °C.
Efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en la concentración de la cepa CF1 en Azofert®-F
⌅El ensayo transcurrió desde octubre de 2017 a febrero de 2018. Se escogieron al azar tres frascos almacenados en cada condición de temperatura y se determinó la pureza microbiológica del inoculante, mediante tinción de Gram. Se utilizó como criterio de distinción las características morfo tintoriales descritas para las bacterias del grupo de los rizobios (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.).
El número de unidades formadoras de colonias (UFC mL-1) de la cepa CF1 se evaluó en el momento de la elaboración de los inoculantes y, cada 30 días, en ambas condiciones de temperatura. Para ello, se realizaron diluciones decimales seriadas del inoculante, las cuales se cultivaron por diseminación en placas con medio LM sólido con rojo Congo. Los cultivos se incubaron a 28 °C por 72 h. El cálculo del número de UFC se realizó mediante la fórmula:
donde:
No. col - número de colonias
d - factor de la dilución
Efecto de la aplicación de Azofert®-F almacenado a diferentes temperaturas y tiempos de conservación en la nodulación, el crecimiento y el contenido de clorofilas de plantas de frijol
⌅Se realizaron ensayos de inoculación en macetas de 973,90 cm3 de volumen total, que contenían 0,2 kg de suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico eútrico (2121. Hernández Jiménez A, Bosch Infante D, Pérez Jiménez JM, Castro Speck N. Clasificación de los suelos de Cuba 2015 [Internet]. 1.a ed. San José de las Lajas (Cuba): Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2015. ISBN 978-959-7023-77-7. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://isbn.cloud/9789597023777/clasificacion-de-los-suelos-de-cuba-2015/.), procedente del área central del INCA. El sustrato se extrajo a una profundidad entre 0-20 cm y su análisis químico se realizó según el manual para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos (2222. Paneque P, Calaña N, Calderón V, Borges B, Hernández G, Caruncho C. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos [Internet]. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2010. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://docplayer.es/13119861-Manual-de-tecnicas-analiticas-para-analisis-de-suelo-foliar-abonos-organicos-y-fertilizantes-quimicos.html.). El suelo tuvo un pH ligeramente ácido, contenido medio de materia orgánica, bajo de Na+ y Mg2+ y altos de K+ y P. El contenido de Ca2+ se correspondió con lo que normalmente se informa para este tipo de suelo (2323. Mesa N, Naranjo G, Cancio R, Martí A, Clemente B, Suárez O. Manual de interpretación de los índices físico-químicos y morfológicos de los suelos cubanos. 2da ed. 1984. p. 136. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/44495794_Manual_de_interpretacion_de_los_indices_fisico-quimicos_y_morfologicos_de_los_suelos_cubanos_Direccion_General_de_Suelos_y_Fertilizantes.) (Tabla 1).
| pH | Materia orgánica (g kg-1) | Na+ | K+ | Ca2+ | Mg2+ | P2O5 (mg kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| cmolc(kg-1) | ||||||
| 6,7 | 34,9 | 0,09 | 0,56 | 14,5 | 1,0 | 218,0 |
pH por potenciometría: relación suelo/solución 1:2,5; materia orgánica mediante colorimetría (Walkley Black); cationes intercambiables Ca2+ y Mg2+(complejometría mediante extracción con NH4Ac a 1 mol L-1 a pH 7); K+ y Na+ por fotometría de llama; P mediante extracción con ácido sulfúrico a 0,1 N, método de Oniani
Se determinó, además, la concentración de posibles rizobios residentes en el sustrato. Para esto, un gramo de suelo se adicionó en 9 mL de agua destilada estéril y se realizaron diluciones decimales seriadas. Una alícuota de 0,1 mL se cultivó en placas con medio LM sólido con rojo Congo y el cultivo se incubó 10 días a 28 °C. El sustrato presentó una concentración de 3 x 103 UFC g suelo-1 de posibles rizobios.
Para evaluar el efecto del formulado en la nodulación y el crecimiento de plantas de frijol, se establecieron dos ensayos en macetas, con cinco plantas por tratamiento cada uno. En el primero, se utilizaron inoculantes con 40 días de conservación a 4 y 29±2 °C, con una concentración bacteriana de 109 y 108 UFC mL-1, respectivamente. En el segundo ensayo se emplearon inoculantes con 120 días de conservación en 4 y 29±2 °C y con una concentración de 108 y 107 UFC mL-1, respectivamente.
Se sembraron dos semillas de frijol por maceta y cada una se inoculó con 200 µL de los inoculantes descritos con anterioridad. Las macetas se colocaron en bandejas con solución nutritiva de Hoagland (2424. Hoagland DR, Arnon DI. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station. 1950. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19500302257.), carente de la solución A (rica en sales de nitrógeno) para así favorecer la FBN. Las plantas se mantuvieron en condiciones controladas a 25±2 °C, 70 % de humedad relativa y fotoperíodo de 16 h luz/8 h oscuridad. Díez días después de la emergencia, se retiró una plántula de cada maceta.
Treinta días después de la siembra, se determinó el número de nódulos totales (u) y el número de nódulos totales efectivos (u). La efectividad de los nódulos se evaluó mediante corte transversal de éstos con escalpelo y observación de la coloración interna. Una coloración roja, rosada o marrón, en el interior de los nódulos se interpretó como efectivos en la FBN (2525. Morote C, Palomino M. Técnicas de aislamiento, identificación, selección de cepas de Rhizobium, Azospirillum y producción de inoculantes. Investigación. 2019;27:175-195. ISSN 1684-0089. DOI 10.51440/unsch.revistainvestigacion.2019.1.119. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/348427975_Tecnicas_de_aislamiento_identificacion_seleccion_de_cepas_de_Rhizobium_Azospirillum_y_produccion_de_inoculantes.). Se evaluó la masa seca de los nódulos totales (g), la masa seca de la parte aérea de las plantas (g) y la masa seca del sistema radical (g) con balanza digital, modelo TE214S (Marca Sartorius). El contenido relativo de clorofilas totales se determinó en el tercer foliolo de abajo hacia arriba (unidades SPAD), con un medidor portátil de clorofila (MINOLTA SPAD 502 Plus).
Diseño y análisis estadístico
⌅Los datos de concentración de la cepa CF1 se analizaron mediante un análisis de varianza de clasificación simple. La prueba de comparación de medias de Tukey para p<0,05 se utilizó para discriminar diferencias entre tratamientos. Los datos se procesaron en el Programa Statgraphics Plus versión 5.1 (2001) y se graficaron en el Programa Microsoft Excel, 2016.
En el ensayo de inoculación en plantas se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado y los resultados se sometieron a un arreglo bifactorial y se tuvieron en cuenta dos factores: temperatura, con los niveles: 4 y 29±2 °C y el tiempo con los niveles: 40 y 120 días. Los datos se sometieron a un test de Between y se procesaron en el programa estadístico SPSS versión 21.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅La conservación de Azofert®-F a 4 °C mantiene concentraciones superiores de la cepa CF1 en el tiempo.
El cultivo de los inoculantes en medio LM sólido mostró la formación de colonias grandes y mucosas que no absorben el colorante rojo Congo. La tinción de Gram permitió observar bacilos Gram negativos, sin endosporas y la ausencia de microorganismos contaminantes. Estas características coinciden con las descritas para la cepa CF1, ingrediente activo del Azofert®-F (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.).
Una preocupación común en la producción de inoculantes es la supervivencia del principio activo, por lo que la concentración de sus células constituye uno de los parámetros de calidad más importantes (2626. Hungria M, Nogueira M. Tecnologias de inoculação da cultura da soja: Mitos, verdades e desafios. Boletim de Pesquisa. 2020. pp. 50-62. ISBN 2176-2902. Disponible en: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/223209/1/SP-17-2020-online-1.pdf.). Este estudio abordó dicha problemática, según las posibilidades de almacenamiento existentes para la conservación del Azofert®-F. Los resultados mostraron que la conservación de Azofert®-F a 4 °C mantuvo concentraciones más elevadas de la cepa CF1 en el tiempo (Figura 1).
La concentración de la cepa CF1 se mantuvo por encima de 1 x 108 UFC mL-1 cuando se conservó a 4 °C durante 150 días, mientras que a 29±2 °C permaneció en esos niveles sólo por 90 días. La conservación de Azofert®-F a 4 °C mostró valores superiores de viabilidad a los obtenidos en el bioproducto conservado a temperatura ambiente a los 30, 120, 150 y 180 días posteriores a su elaboración. En estudios similares, con inoculantes de Sinorhizobium meliloti en el medio de cultivo LM y almacenados a 4 °C, se informa que el número de células viables disminuyó considerablemente después de 90 días (2727. Tarek R, Dayal TR, Kaur BS, Danielle P. Development of Efficient Suspension Formulation of Starch Industry Wastewater Grown Sinorhizobium Meliloti for Agricultural Use. International Journal of Agriculture Innovations and Research. 2014;3(4):1083-1093. Disponible en: https://www.researchgate.net/profile/Tarek-Rouissi/publication/274961111_Development_of_Efficient_Suspension_Formulation_of_Starch_Industry_Wastewater_Grown_Sinorhizobium_Meliloti_for_Agricultural_Use/links/552d98760cf21acb0921786b/Development-of-Efficient-Suspension-Formulation-of-Starch-Industry-Wastewater-Grown-Sinorhizobium-Meliloti-for-Agricultural-Use.pdf.). Esta diferencia en el comportamiento pudo deberse a las diferencias entre las cepas y al medio de cultivo que se empleó en su multiplicación para ambas investigaciones. El medio de cultivo que se utiliza en la producción de Azofert® (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.) es un medio rico en nutrientes que difiere de la composición química del medio LM (2828. Nápoles MC, Martínez J, Costales D, Gómez G. Efecto de diferentes medios de cultivo. Cultivos Tropicales. 2006;27(1):35-38. ISSN 0258-5936. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/1932/193215885006.pdf.).
La cepa CF1 en el inoculante disminuyó su concentración en una unidad logarítmica a los 30, 120 y 180 días de conservación a temperatura ambiente. Otras investigaciones con inoculantes líquidos de Bradyrhizobium japonicum mostraron este mismo comportamiento a los 30 y 180 días de conservación a 27-29 °C (2929. Cozzi JG, Benintende BG, Pacheco Basurco JC. Nuevo inoculante liquido para semillas de soja (Glycine max). Rev. Facultad de Agronomía. 1996;16:127-132. Disponible en: http://ri.agro.uba.ar/files/download/revista/facultadagronomia/1996cozzijg.pdf.). Al final del ensayo, a los 180 días a temperatura ambiente, la cepa CF1 en Azofert®-F mostró valores de concentración celular de 106 UFC mL-1. A diferencia de otros autores que informaron que cepas de Pseudomonas a 28±2 °C no sobrevivieron en el inoculante luego de 150 días de conservación (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.).
Los resultados muestran que la temperatura y el tiempo afectan la estabilidad microbiológica de Azofert®-F. Se conoce que la temperatura, el tipo de formulación y el tiempo de almacenamiento tienen un efecto significativo en la viabilidad celular del ingrediente activo de los inoculantes (3131. Infante EJG. Modelo factorial para el control de calidad de biofertilizantes de importancia agrícola. 2017; p. 40. Disponible en: https://repository.libertadores.edu.co/bitstream/handle/11371/1318/gonzalezedgar2017.pdf?sequence=1.). Temperaturas bajas enlentecen procesos fisiológicos de la célula bacteriana y su envejecimiento (3232. Freire J, Sato M. Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana de Microbiología. 1999;41(1):35-42. Disponible en: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=YTaaAAAAIAAJ&oi=fnd&pg=PA35&ots=eivT_nsYnh&sig=YmqeEdfnGuskQ3w-iL7Fb_GlyAU#v=onepage&q&f=false.), mientras que temperaturas próximas a 30 °C aumentan el consumo de los nutrientes del medio por la bacteria, lo que provoca el agotamiento más acelerado de estos y con ello la disminución de la viabilidad celular (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).
Conocer la vida útil del bioproducto Azofert®-F, en las condiciones de almacenamiento disponibles en el país, permite establecer una estrategia de producción que cubra la mayor demanda posible del producto, con disponibilidad suficiente en el momento de la siembra del frijol en Cuba.
La temperatura y el tiempo de conservación influyen en la actividad biológica de Azofert®-F en plantas de frijol, cultivar Tazumal
Pocos estudios evalúan el efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en la actividad biológica de los inoculantes a base de Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal. Esta constituye la primera investigación en Cuba que aborda esta temática en un inoculante comercial para el frijol, uno de los cultivos más importantes para los cubanos.
El análisis de los datos provenientes del ensayo de inoculación, en condiciones controladas, mostró que hubo interacción entre los factores temperatura y tiempo en las variables masa seca de nódulos, raíces y parte aérea de las plantas de frijol. En el resto de las variables no hubo interacción entre ambos factores (Tabla 2).
| Origen | Número de nódulos totales (u) | Número de nódulos efectivos totales (u) | Masa seca de nódulos totales (g) | Masa seca de raíces (g) | Masa seca parte aérea (g) | Contenido relativo de clorofilas totales (SPAD) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Modelo corregido | 0,152 | 0,079 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,002 |
| Intersección | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| a Temperatura | 0,106 | 0,051 | 0,002 | 0,007 | 0,027 | 0,236 |
| b Tiempo | 0,511 | 0,282 | 0,000 | 0,003 | 0,000 | 0,000 |
| cTemperatura-Tiempo | 0,123 | 0,136 | 0,001* | 0,007* | 0,025* | 0,634 |
aFactor Temperatura con dos niveles: 4 °C y 29±2 °C; bFactor tiempo con dos niveles: 40 y 120 días; cEfecto combinado de los factores Temperatura y Tiempo; (*) Interacción entre los factores
Las plantas que se trataron con los inóculos bacterianos que poseían 40 días de conservación a 29±2 °C, manifestaron los resultados más favorables en la masa seca de nódulos, lo que indica un mayor contenido de bacteroides establecidos en ellos. La masa seca de raíz y parte aérea, se favoreció con la aplicación de inoculantes conservados durante 40 días a 4 °C (Tabla 3). Es lógico que en el menor tiempo evaluado se encuentre la mayor actividad, ello se corresponde con los mayores valores de concentración celular hallados en los inoculantes: de 108 y 109 UFC mL-1, respectivamente.
| Tratamientos | Masa seca nodular (g) | Masa seca de raíces (g) | Masa seca parte aérea (g) | |
|---|---|---|---|---|
| Temperatura (°C) | Tiempo (días) | |||
| 4 | 40 | 0,033 ± 0,006 b | 1,23 ± 0,32 a | 1,08 ± 0,05 a |
| 120 | 0,022 ± 0,002 b | 0,18 ± 0,02 b | 0,40 ± 0,05 c | |
| 29±2 | 40 | 0,074 ± 0,006 a | 0,24 ± 0,02 b | 0,82 ± 0,05 b |
| 120 | 0,019 ± 0,005 b | 0,17 ± 0,02 b | 0,40 ± 0,04 c | |
| Esx | 0,008 | 0,22 | 0,07 | |
Los datos muestran las medias + error estándar de la media. Letras iguales en la misma columna muestran diferencias significativas (Tukey HSD p<0,05, n=5)
Otras investigaciones informan que no se afecta la masa seca radical y de la parte aérea de plantas de arveja (Pisum sativum L.) y soya (Glycine max (L.), cuando se tratan con inoculantes a base de rizobios que se conservaron por 15, 60, 120 y 180 días a 4 y 28±2 °C, y que posean una concentración de células de 108 UFC mL-1 al momento de la inoculación de las semillas (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).
Por otra parte, los resultados mostraron que hubo una influencia del factor temperatura en el número de nódulos efectivos y del factor tiempo en el contenido relativo de clorofilas totales (Tabla 4).
| Tratamientos | Número de nódulos totales (u) | Número de nódulos efectivos (u) | Contenido relativo de clorofilas totales (SPAD) |
|---|---|---|---|
| Temperatura (°C) | |||
| 4 | 31,1 ± 3,6 a | 29,1 ± 3,8 a | 27,6 ± 1,4 a |
| 29±2 | 23,2 ± 3,1 a | 19,8 ± 2,6 b | 29,1 ± 1,2 a |
| Tiempo (días) | |||
| 40 | 25,6 ± 2,1 a | 22,0 ± 1,7 a | 31,3 ± 0,9 a |
| 120 | 28,7 ± 4,6 a | 26,9 ± 4,7 a | 25,4 ± 0,8 b |
Los datos muestran las medias + error estándar de la media. Letras iguales en la misma columna muestran diferencias significativas (Tukey HSD p<0,05, n=5)
La inoculación de Azofert®-F cuando se conservó a 4 °C provocó mayor número de nódulos efectivos en las plantas. Además, el empleo de los inoculantes que se conservaron por 40 días potenció el contenido relativo de clorofilas totales. Investigaciones previas mostraron similar efecto de Azofert®-F en el cultivar Cubacueto 25-9, a los siete días de su elaboración (34Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, García C, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) sometidas a dos regímenes de riego. Centro Agrícola. 2018;45(4):20-26. ISBN 0253-5785. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-57852018000400020.). Por lo tanto, esta investigación sugiere que el producto es capaz de mantener su actividad biológica en plantas 40 días después de su elaboración (Tabla 4).
La temperatura de conservación ni el tiempo de almacenamiento de los inoculantes influyeron en la formación de nódulos en las plantas de frijol, lo que pudiera deberse a que la capacidad de la cepa CF1 para establecer simbiosis con las plantas de frijol se mantuvo por un período de, al menos, 120 días en ambas condiciones. Estudios previos, con inoculantes a base de rizobios que se almacenaron a 4 y 28±2 °C por 15, 60, 120 y 180 días, muestran un comportamiento similar en los cultivos de arveja y soya (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).
Otras investigaciones indican que la aplicación de inoculantes de Bradyrhizobium que se conservaron durante 180 días a 4 °C provocaron un incremento en el número de nódulos efectivos en plantas de soya respecto a aquellas donde se emplearon inóculos conservados a 29±2 °C (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.). Además, inoculantes de Pseudomonas fluorescens que se mantuvieron por un período de 180 días a 28±2 °C promovieron el crecimiento de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) y disminuyeron el marchitamiento de las hojas por Fusarium (3535. Department of Agricultural Microbiology, College of Agriculture, Bheemarayangudi, University of Agricultural Sciences, Raichur, 584104 (Karnataka) y Biradar BJP. Role of Polymeric Additives in Formulation, Shelf-life and Bioefficacy of Liquid Inoculant of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;6(4):123-133. ISSN 23207051. DOI 10.18782/2320-7051.6822. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a16.php.).
El efecto positivo de la aplicación de Azofert®-F, conservado por 40 días, en el contenido de clorofilas se correspondió con los mejores resultados en la masa seca nodular y la masa seca de la parte aérea de las plantas de frijol (Tabla 3). En ese momento, el inoculante presentó una concentración elevada de la cepa CF1 (108-109 UFC mL-1). Una mayor concentración de la cepa en el inoculante propicia un mayor número de células en contacto con las raíces y, por lo tanto, se incrementarían los sitios de infección, la formación de los nódulos y el establecimiento de los bacteroides, lo que incrementa la masa nodular. Un incremento de la nodulación efectiva en la FBN permite un mayor aporte de nitrógeno (3636. Koskey G, Mburu SW, Njeru EM, Kimiti JM, Ombori O, Maingi JM. Potential of Native Rhizobia in Enhancing Nitrogen Fixation and Yields of Climbing Beans (Phaseolus vulgaris) in Contrasting Environments of Eastern Kenya. Frontiers in Plant Science. 2017;8:443. ISSN 1664-462X. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.00443.), lo que conllevaría al incremento de los pigmentos fotosintéticos y de la biomasa aérea. Estas evidencias se corroboraron en investigaciones previas con frijol caupí (Vigna unguiculata L.), frijol común, soya y canavalia (Canavalia ensiformis) (88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401., 1111. Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, Nápoles García MC, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) en condiciones de déficit hídrico. Revista Ciencias Agrícolas. 2018;45(4): [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/html/v45n4/body/cag03418.html., 3737. Sauvu-Jonasse C, Nápoles-García M, Falcón-Rodríguez A, Lamz-Piedra A, Ruiz-Sánchez M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3). ISSN 0258-5936. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1556., 3838. Alonso GMM, Aguilar YT, Forte IH, Nualles MV, Araujo E da S. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de 15N y diferencia de N total. Cultivos Tropicales. 2017;38(1):122-130. ISSN 1819-4087. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193250540016.).
CONCLUSIONES
⌅-
Se demostró que el inoculante Azofert®-F pudiera conservarse a 4 y 29±2 °C, por 150 y 90 días, respectivamente; sin necesidad de preservantes en su formación y que hasta los 120 días de conservación no afecta la formación de nódulos en las plantas de frijol. Estas evidencias permitirían establecer una estrategia de producción y comercialización del inoculante con calidad adecuada durante todo el año, que asegure cubrir las demandas del producto, fundamentalmente en la época de siembra.