Cultivos Tropicales Vol. 45, No. 1, enero-marzo, 2024, ISSN: 1819-4087
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CU-ID: https://cu-id.com/2050/v45n1e01
Artículo Original

Efecto de la temperatura y el tiempo de conservación en la calidad de Azofert®-F

 

iDBelkis Morales Mena*✉:bmorales@inca.edu.cu

iDMaría Caridad Nápoles García

iDIonel Hernández Forte


Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), Carretera a Tapaste, Km 3 1/2, Gaveta postal No.1, CP 32700. San José de las Lajas. Mayabeque, Cuba.

 

*Autor para correspondencia: bmorales@inca.edu.cu

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la temperatura y el tiempo de conservación en la concentración del principio activo y la actividad biológica del biofertilizante Azofert®-F. Inoculantes a base de la cepa Rhizobium leguminosarum CF1 se mantuvieron a 4 y 29±2 °C, para evaluar la pureza y concentración de la cepa cada 30 días durante 180 días. Los datos se procesaron mediante un análisis de varianza de clasificación simple. A los 40 y 120 días de conservación de los inoculantes, se aplicaron en semillas de frijol cultivar Tazumal y se evalúo el número de nódulos y su efectividad, la masa seca de nódulos, raíces y parte aérea y el contenido relativo de clorofilas totales, en condiciones controladas. Se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado y los datos se procesaron mediante un arreglo bifactorial. La cepa Rhizobium leguminosarum CF1 mantuvo una concentración de 108 UFC mL-1, o superior, durante 150 y 90 días, cuando el producto Azofert®-F se conservó a 4 y 29±2 °C, respectivamente. El almacenamiento del producto hasta 120 días, en ambas temperaturas, no afectó el número de nódulos en las plantas de frijol. Sin embargo, la temperatura y el tiempo de almacenamiento del inoculante influyeron en la efectividad de los nódulos formados y en el contenido relativo de clorofilas totales, respectivamente. Esta investigación es la primera que aborda la influencia de la conservación en la eficacia de un inoculante comercial cubano a base de Rhizobium, para el cultivo del frijol.

Palabras clave: 
Rhizobium, biofertilizantes, estabilidad en almacenamiento, frijol

Recibido: 04/1/2022; Aceptado: 14/2/2022

Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Contribución de los autores: Conceptualización- Belkis Morales Mena, María Caridad Nápoles García. Investigación-. Belkis Morales Mena, Ionel Hernández Forte, María Caridad Nápoles García. Metodología y escritura del borrador inicial- Belkis Morales Mena. Supervisión- Ionel Hernández Forte, María Caridad Nápoles García. Escritura, edición final y curación de datos- Belkis Morales Mena, María Caridad Nápoles García, Ionel Hernández Forte.

Conflict of interest: The authors declare that they have no conflict of interest.

Authors' contribution: Conceptualization- Belkis Morales Mena, María Caridad Nápoles García. Research-. Belkis Morales Mena, Ionel Hernández Forte, María Caridad Nápoles García. Methodology and writing of the initial draft- Belkis Morales Mena. Supervision- Ionel Hernández Forte, María Caridad Nápoles García. Writing, final editing and data curation- Belkis Morales Mena, María Caridad Nápoles García, Ionel Hernández Forte.

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

 

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo de gran importancia en la alimentación humana. Su grano es rico en proteínas, aporta micronutrientes, fibra y almidón (11. Ganesan K, Xu B. Polyphenol-Rich Dry Common Beans (Phaseolus vulgaris) and Their Health Benefits. Int J Mol Sci. 2017 Nov 4;18(11):2331. DOI: 10.3390/ijms18112331. PMID: 29113078. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5713300/., 22. Guevara AM, Moya KV, Zeledón JR, Rojas LG, Aguirre CH, Monge HB. Evaluación de propiedades fisicoquímicas del frijol costarricense (Phaseolus vulgaris) como estrategia de diferenciación y valorización. Perspect Rur Nueva Época. 2020 Jun 30;18(35):25-48. DOI: 10.15359/prne.18-35.2. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.revistas.una.ac.cr/index.php/perspectivasrurales/article/view/14787.). Esta leguminosa demanda altas cantidades de nitrógeno, elemento que obtiene, en gran medida, a través de la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) (33. Cantaro-Segura H, Huaringa-Joaquín A, Zúñiga-Dávil D. Efectividad simbiótica de dos cepas de Rhizobium en cuatro variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Perú. Idesia (Arica). 2019 Dec;37(4):73-81. DOI: 10.4067/S0718-34292019000400073. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0718-34292019000400073&lng=es&nrm=iso&tlng=es.,44. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macías R, López-Alcocer E. Eficiencia en fijación biológica de nitrógeno de cepas de Rhizobium recolectadas en frijol cultivado y silvestre. Rev Terra Latinoam. 2020 Oct 11;38(4):841-852. DOI: 10.29312/terralat.38.4.654. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.terralatinoamericana.org.mx/index.php/terra/article/view/654.).

Dentro de los microorganismos que realizan la FBN se encuentran los rizobios, bacterias que tradicionalmente se utilizan como principio activo en la biofertilización de leguminosas. El empleo de biofertilizantes en la práctica agrícola se considera una alternativa viable por sus beneficios ecológicos, económicos y productivos; permite reducir el empleo de fertilizantes minerales (55. Martínez F, García C, Gómez LA, Aguilar Y, Martínez-Viera R, Castellanos N, Riverol M. Manejo sostenible de suelos en la agricultura cubana. Agroecología. 2017;12(1):25-38. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://revistas.um.es/agroecologia/article/view/330321.,66. Buntić AV, Stajković-Srbinović OS, Knežević MM, Kuzmanović ĐŽ, Rasulić NV, Delić DI. Development of liquid rhizobial inoculants and pre-inoculation of alfalfa seeds. Arch Biol Sci. 2019 Jun 4;71(2):379-387. DOI: 10.2298/ABS19023503B. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.serbiosoc.org.rs/arch/index.php/abs/article/view/3503.) e incrementar el rendimiento de cultivos de importancia económica (77. Romero-Arias A, Ruz-Reyes RM, Nápoles-García MC, Gómez-Padilla EJ, Rodríguez-Rodríguez S. Efecto de la aplicación de tres cepas de Bradyrhizobium en el desarrollo morfoagronómico de Glycine max Pastos y Forrajes. 2019;42(4):290-295. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/2691/269162670006/,88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401.).

En Cuba, se producen y comercializan diversos biofertilizantes, entre los que destaca el Azofert®, procedente del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). En particular, Azofert®-F se emplea en el cultivo del frijol, es un inoculante líquido que contiene altas concentraciones de la cepa bacteriana Rhizobium leguminosarum CF1 (CF1) y de inductores de la nodulación, atributo que lo distingue del resto de los inoculantes comerciales a base de rizobios en el país (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.). Su aplicación directa a las semillas de frijol en el momento de la siembra, permite ahorrar entre el 50-70 % del fertilizante nitrogenado (1010. Hernández Salido L, Salido García Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Carib Cienc Soc. 2019 Jan 30. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html.,1111. Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, Nápoles García MC, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) en condiciones de déficit hídrico. Revista Ciencias Agrícolas. 2018;45(4): [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/html/v45n4/body/cag03418.html.).

La ausencia de microorganismos contaminantes, la concentración de células viables y su estado fisiológico, son algunos de los factores que inciden en el desempeño exitoso de los biofertilizantes (1212. Bernabeu P. Caracterización de la colonización y promoción del crecimiento vegetal por Burkholderia tropica en gramíneas [en línea] [Tesis de Doctorado]. Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina; 2017. p. 264. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/59824.). Las normas de calidad que rigen el empleo de estos biopreparados varían en dependencia de las regulaciones vigentes en cada país. Sin embargo, se recomienda, en consenso, una concentración mínima del ingrediente activo de 1 x 109 UFC mL-1 ó g-1, en el momento de su elaboración y de 1 x 108 UFC mL-1 ó g-1, a su vencimiento, con una mínima o nula presencia de microorganismos contaminantes (1313. Izaguirre-Mayoral ML. Biofertilizantes en Iberoamérica: Una Visión Técnica, Científica y Empresarial [en línea]. 1ra ed. Montevideo, Uruguay: Editorial Universitaria; 2007. p. 103. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/Biofertilizantes_en_Iberoam%C3%A9rica.html?id=BrnhtAEACAAJ&redir_esc=y.).

La vida útil de los biofertilizantes es esencial para su comercialización, debido al prolongado tiempo que puede transcurrir entre su producción y la aplicación (1414. Hungria M, Nogueira MA, Campos LJM, Menna P, Brandi F, Ramos YG. Seed pre-inoculation with Bradyrhizobium as time-optimizing option for large-scale soybean cropping systems. Agronomy Journal. 2020;112(6):5222-5236. DOI 10.1002/agj2.20392 [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/agj2.20392.). Por consiguiente, determinar el periodo de efectividad de estos bioproductos, según las capacidades de conservación disponibles, resulta imprescindible para delimitar su tiempo de validez y poder establecer una estrategia de producción y comercialización que satisfaga la demanda en el momento oportuno de las siembras.

Existen pocos estudios en Cuba que abordan la estabilidad microbiológica en el tiempo de inoculantes comerciales líquidos. Los principios activos más empleados en el país son Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal como Azospirillum, Azotobacter y Mesorhizobium (1515. Dibut B, González R, Martínez R. Dimargon, nuevo medio de cultivo para la producción industrial de biopreparados a base de Azotobacter chroococcum. Cultivos Tropicales. 1994;15(1):12-14. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://biblat.unam.mx/es/revista/cultivos-tropicales/articulo/dimargon-nuevo-medio-de-cultivo-para-la-produccion-industrial-de-biopreparados-a-base-de-azotobacter-chroococcum.-1717. Nápoles MC, Velazco A. Utilización del ácido ascórbico como preservante en biopreparados de Azospirillum brasilense. Cultivos Tropicales. 1994;15(2):25-27. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/files/anteriores/1994/2/CT15205.pdf.). En la mayoría de estos estudios, no se logra acceder a los detalles de la investigación desde los buscadores disponibles en internet y, en muchos casos, se restringe el acceso a la información. Solo una investigación previa determinó el efecto de la temperatura en la conservación de un inoculante comercial a base de rizobios para soya (1818. Menéndez C, Trujillo LE, Ramírez R, González-Peña D, Espinosa D, Enríquez GA, Hernández L. Producción de un inoculante líquido de Bradyrhizobium japonicum con alto impacto en la siembra mecanizada de la soya en Cuba. Biotecnología Aplicada. 2014;31(2):111-115. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=51730.). Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la temperatura y el tiempo de conservación en la concentración del principio activo y la actividad biológica del biofertilizante Azofert®-F.

MATERIALES Y MÉTODOS

 

Se prepararon pre inóculos en Erlenmeyers de 100 mL de capacidad, que contenían 10 mL del medio de cultivo Bradyfact (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.) estéril. Para ello, se empleó una azada de la cepa CF1 conservada en tubos con medio Levadura-manitol (LM) (1919. Vincent JM. A Manual for the Practical Study of Root-nodule Bacteria [en línea]. 1970. Blackwell Scientific. p. 202. ISBN 978-0-632-06410-6. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/A_Manual_for_the_Practical_Study_of_Root.html?id=dcQcAQAAIAAJ&redir_esc=y.) sólido con rojo Congo. Los frascos se mantuvieron en agitación a 130 rpm y 28 °C, durante 16 h. Posteriormente, se continuó el escalado de la multiplicación de la cepa por fermentación aerobia, en iguales condiciones de incubación. En cada caso se inoculó el 10 % (volumen de inóculo/volumen de medio) hasta obtener un volumen total de 1000 mL del inoculante. El fermentado se formuló con 1000 mL de medio Bradyfact estéril en una relación 1:1.

El formulado (Azofert®-F) se envasó en diez frascos estériles de 240 mL de volumen total, cada uno con 200 mL del producto. Se establecieron dos tratamientos con cinco frascos cada uno. Un tratamiento se almacenó a temperatura refrigerada de 4 °C y el otro a temperatura ambiente promedio de 29±2 °C.

Efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en la concentración de la cepa CF1 en Azofert®-F

 

El ensayo transcurrió desde octubre de 2017 a febrero de 2018. Se escogieron al azar tres frascos almacenados en cada condición de temperatura y se determinó la pureza microbiológica del inoculante, mediante tinción de Gram. Se utilizó como criterio de distinción las características morfo tintoriales descritas para las bacterias del grupo de los rizobios (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.).

El número de unidades formadoras de colonias (UFC mL-1) de la cepa CF1 se evaluó en el momento de la elaboración de los inoculantes y, cada 30 días, en ambas condiciones de temperatura. Para ello, se realizaron diluciones decimales seriadas del inoculante, las cuales se cultivaron por diseminación en placas con medio LM sólido con rojo Congo. Los cultivos se incubaron a 28 °C por 72 h. El cálculo del número de UFC se realizó mediante la fórmula:

U F C   m L - 1 = N o .   c o l × 10 1 × d  

donde:

No. col - número de colonias

d - factor de la dilución

Efecto de la aplicación de Azofert®-F almacenado a diferentes temperaturas y tiempos de conservación en la nodulación, el crecimiento y el contenido de clorofilas de plantas de frijol

 

Se realizaron ensayos de inoculación en macetas de 973,90 cm3 de volumen total, que contenían 0,2 kg de suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico eútrico (2121. Hernández Jiménez A, Bosch Infante D, Pérez Jiménez JM, Castro Speck N. Clasificación de los suelos de Cuba 2015 [Internet]. 1.a ed. San José de las Lajas (Cuba): Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2015. ISBN 978-959-7023-77-7. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://isbn.cloud/9789597023777/clasificacion-de-los-suelos-de-cuba-2015/.), procedente del área central del INCA. El sustrato se extrajo a una profundidad entre 0-20 cm y su análisis químico se realizó según el manual para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos (2222. Paneque P, Calaña N, Calderón V, Borges B, Hernández G, Caruncho C. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos [Internet]. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2010. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://docplayer.es/13119861-Manual-de-tecnicas-analiticas-para-analisis-de-suelo-foliar-abonos-organicos-y-fertilizantes-quimicos.html.). El suelo tuvo un pH ligeramente ácido, contenido medio de materia orgánica, bajo de Na+ y Mg2+ y altos de K+ y P. El contenido de Ca2+ se correspondió con lo que normalmente se informa para este tipo de suelo (2323. Mesa N, Naranjo G, Cancio R, Martí A, Clemente B, Suárez O. Manual de interpretación de los índices físico-químicos y morfológicos de los suelos cubanos. 2da ed. 1984. p. 136. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/44495794_Manual_de_interpretacion_de_los_indices_fisico-quimicos_y_morfologicos_de_los_suelos_cubanos_Direccion_General_de_Suelos_y_Fertilizantes.) (Tabla 1).

Tabla 1.  Características químicas del sustrato suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico eútrico que se empleó en los ensayos de inoculación
pH Materia orgánica (g kg-1) Na+ K+ Ca2+ Mg2+ P2O5 (mg kg-1)
cmolc(kg-1)
6,7 34,9 0,09 0,56 14,5 1,0 218,0

pH por potenciometría: relación suelo/solución 1:2,5; materia orgánica mediante colorimetría (Walkley Black); cationes intercambiables Ca2+ y Mg2+(complejometría mediante extracción con NH4Ac a 1 mol L-1 a pH 7); K+ y Na+ por fotometría de llama; P mediante extracción con ácido sulfúrico a 0,1 N, método de Oniani

Se determinó, además, la concentración de posibles rizobios residentes en el sustrato. Para esto, un gramo de suelo se adicionó en 9 mL de agua destilada estéril y se realizaron diluciones decimales seriadas. Una alícuota de 0,1 mL se cultivó en placas con medio LM sólido con rojo Congo y el cultivo se incubó 10 días a 28 °C. El sustrato presentó una concentración de 3 x 103 UFC g suelo-1 de posibles rizobios.

Para evaluar el efecto del formulado en la nodulación y el crecimiento de plantas de frijol, se establecieron dos ensayos en macetas, con cinco plantas por tratamiento cada uno. En el primero, se utilizaron inoculantes con 40 días de conservación a 4 y 29±2 °C, con una concentración bacteriana de 109 y 108 UFC mL-1, respectivamente. En el segundo ensayo se emplearon inoculantes con 120 días de conservación en 4 y 29±2 °C y con una concentración de 108 y 107 UFC mL-1, respectivamente.

Se sembraron dos semillas de frijol por maceta y cada una se inoculó con 200 µL de los inoculantes descritos con anterioridad. Las macetas se colocaron en bandejas con solución nutritiva de Hoagland (2424. Hoagland DR, Arnon DI. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station. 1950. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19500302257.), carente de la solución A (rica en sales de nitrógeno) para así favorecer la FBN. Las plantas se mantuvieron en condiciones controladas a 25±2 °C, 70 % de humedad relativa y fotoperíodo de 16 h luz/8 h oscuridad. Díez días después de la emergencia, se retiró una plántula de cada maceta.

Treinta días después de la siembra, se determinó el número de nódulos totales (u) y el número de nódulos totales efectivos (u). La efectividad de los nódulos se evaluó mediante corte transversal de éstos con escalpelo y observación de la coloración interna. Una coloración roja, rosada o marrón, en el interior de los nódulos se interpretó como efectivos en la FBN (2525. Morote C, Palomino M. Técnicas de aislamiento, identificación, selección de cepas de Rhizobium, Azospirillum y producción de inoculantes. Investigación. 2019;27:175-195. ISSN 1684-0089. DOI 10.51440/unsch.revistainvestigacion.2019.1.119. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/348427975_Tecnicas_de_aislamiento_identificacion_seleccion_de_cepas_de_Rhizobium_Azospirillum_y_produccion_de_inoculantes.). Se evaluó la masa seca de los nódulos totales (g), la masa seca de la parte aérea de las plantas (g) y la masa seca del sistema radical (g) con balanza digital, modelo TE214S (Marca Sartorius). El contenido relativo de clorofilas totales se determinó en el tercer foliolo de abajo hacia arriba (unidades SPAD), con un medidor portátil de clorofila (MINOLTA SPAD 502 Plus).

Diseño y análisis estadístico

 

Los datos de concentración de la cepa CF1 se analizaron mediante un análisis de varianza de clasificación simple. La prueba de comparación de medias de Tukey para p<0,05 se utilizó para discriminar diferencias entre tratamientos. Los datos se procesaron en el Programa Statgraphics Plus versión 5.1 (2001) y se graficaron en el Programa Microsoft Excel, 2016.

En el ensayo de inoculación en plantas se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado y los resultados se sometieron a un arreglo bifactorial y se tuvieron en cuenta dos factores: temperatura, con los niveles: 4 y 29±2 °C y el tiempo con los niveles: 40 y 120 días. Los datos se sometieron a un test de Between y se procesaron en el programa estadístico SPSS versión 21.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

La conservación de Azofert®-F a 4 °C mantiene concentraciones superiores de la cepa CF1 en el tiempo.

El cultivo de los inoculantes en medio LM sólido mostró la formación de colonias grandes y mucosas que no absorben el colorante rojo Congo. La tinción de Gram permitió observar bacilos Gram negativos, sin endosporas y la ausencia de microorganismos contaminantes. Estas características coinciden con las descritas para la cepa CF1, ingrediente activo del Azofert®-F (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.).

Una preocupación común en la producción de inoculantes es la supervivencia del principio activo, por lo que la concentración de sus células constituye uno de los parámetros de calidad más importantes (2626. Hungria M, Nogueira M. Tecnologias de inoculação da cultura da soja: Mitos, verdades e desafios. Boletim de Pesquisa. 2020. pp. 50-62. ISBN 2176-2902. Disponible en: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/223209/1/SP-17-2020-online-1.pdf.). Este estudio abordó dicha problemática, según las posibilidades de almacenamiento existentes para la conservación del Azofert®-F. Los resultados mostraron que la conservación de Azofert®-F a 4 °C mantuvo concentraciones más elevadas de la cepa CF1 en el tiempo (Figura 1).

El análisis estadístico se realizó en cada momento de evaluación. Medias con letras iguales no difieren estadísticamente (Tukey p≤0,05, n=3)
Figura 1.  Concentración de la cepa Rhizobium leguminosarum CF1 en el biofertilizante Azofert®-F, almacenado a 4 °C y 29±2 °C, durante 180 días

La concentración de la cepa CF1 se mantuvo por encima de 1 x 108 UFC mL-1 cuando se conservó a 4 °C durante 150 días, mientras que a 29±2 °C permaneció en esos niveles sólo por 90 días. La conservación de Azofert®-F a 4 °C mostró valores superiores de viabilidad a los obtenidos en el bioproducto conservado a temperatura ambiente a los 30, 120, 150 y 180 días posteriores a su elaboración. En estudios similares, con inoculantes de Sinorhizobium meliloti en el medio de cultivo LM y almacenados a 4 °C, se informa que el número de células viables disminuyó considerablemente después de 90 días (2727. Tarek R, Dayal TR, Kaur BS, Danielle P. Development of Efficient Suspension Formulation of Starch Industry Wastewater Grown Sinorhizobium Meliloti for Agricultural Use. International Journal of Agriculture Innovations and Research. 2014;3(4):1083-1093. Disponible en: https://www.researchgate.net/profile/Tarek-Rouissi/publication/274961111_Development_of_Efficient_Suspension_Formulation_of_Starch_Industry_Wastewater_Grown_Sinorhizobium_Meliloti_for_Agricultural_Use/links/552d98760cf21acb0921786b/Development-of-Efficient-Suspension-Formulation-of-Starch-Industry-Wastewater-Grown-Sinorhizobium-Meliloti-for-Agricultural-Use.pdf.). Esta diferencia en el comportamiento pudo deberse a las diferencias entre las cepas y al medio de cultivo que se empleó en su multiplicación para ambas investigaciones. El medio de cultivo que se utiliza en la producción de Azofert® (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.) es un medio rico en nutrientes que difiere de la composición química del medio LM (2828. Nápoles MC, Martínez J, Costales D, Gómez G. Efecto de diferentes medios de cultivo. Cultivos Tropicales. 2006;27(1):35-38. ISSN 0258-5936. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/1932/193215885006.pdf.).

La cepa CF1 en el inoculante disminuyó su concentración en una unidad logarítmica a los 30, 120 y 180 días de conservación a temperatura ambiente. Otras investigaciones con inoculantes líquidos de Bradyrhizobium japonicum mostraron este mismo comportamiento a los 30 y 180 días de conservación a 27-29 °C (2929. Cozzi JG, Benintende BG, Pacheco Basurco JC. Nuevo inoculante liquido para semillas de soja (Glycine max). Rev. Facultad de Agronomía. 1996;16:127-132. Disponible en: http://ri.agro.uba.ar/files/download/revista/facultadagronomia/1996cozzijg.pdf.). Al final del ensayo, a los 180 días a temperatura ambiente, la cepa CF1 en Azofert®-F mostró valores de concentración celular de 106 UFC mL-1. A diferencia de otros autores que informaron que cepas de Pseudomonas a 28±2 °C no sobrevivieron en el inoculante luego de 150 días de conservación (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.).

Los resultados muestran que la temperatura y el tiempo afectan la estabilidad microbiológica de Azofert®-F. Se conoce que la temperatura, el tipo de formulación y el tiempo de almacenamiento tienen un efecto significativo en la viabilidad celular del ingrediente activo de los inoculantes (3131. Infante EJG. Modelo factorial para el control de calidad de biofertilizantes de importancia agrícola. 2017; p. 40. Disponible en: https://repository.libertadores.edu.co/bitstream/handle/11371/1318/gonzalezedgar2017.pdf?sequence=1.). Temperaturas bajas enlentecen procesos fisiológicos de la célula bacteriana y su envejecimiento (3232. Freire J, Sato M. Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana de Microbiología. 1999;41(1):35-42. Disponible en: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=YTaaAAAAIAAJ&oi=fnd&pg=PA35&ots=eivT_nsYnh&sig=YmqeEdfnGuskQ3w-iL7Fb_GlyAU#v=onepage&q&f=false.), mientras que temperaturas próximas a 30 °C aumentan el consumo de los nutrientes del medio por la bacteria, lo que provoca el agotamiento más acelerado de estos y con ello la disminución de la viabilidad celular (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

Conocer la vida útil del bioproducto Azofert®-F, en las condiciones de almacenamiento disponibles en el país, permite establecer una estrategia de producción que cubra la mayor demanda posible del producto, con disponibilidad suficiente en el momento de la siembra del frijol en Cuba.

La temperatura y el tiempo de conservación influyen en la actividad biológica de Azofert®-F en plantas de frijol, cultivar Tazumal

Pocos estudios evalúan el efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en la actividad biológica de los inoculantes a base de Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal. Esta constituye la primera investigación en Cuba que aborda esta temática en un inoculante comercial para el frijol, uno de los cultivos más importantes para los cubanos.

El análisis de los datos provenientes del ensayo de inoculación, en condiciones controladas, mostró que hubo interacción entre los factores temperatura y tiempo en las variables masa seca de nódulos, raíces y parte aérea de las plantas de frijol. En el resto de las variables no hubo interacción entre ambos factores (Tabla 2).

Tabla 2.  Factores y términos de la interacción en el análisis de ANOVA para las variables de nodulación y crecimiento de plantas de frijol cultivar Tazumal, en condiciones controladas
Origen Número de nódulos totales (u) Número de nódulos efectivos totales (u) Masa seca de nódulos totales (g) Masa seca de raíces (g) Masa seca parte aérea (g) Contenido relativo de clorofilas totales (SPAD)
Modelo corregido 0,152 0,079 0,000 0,000 0,000 0,002
Intersección 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
a Temperatura 0,106 0,051 0,002 0,007 0,027 0,236
b Tiempo 0,511 0,282 0,000 0,003 0,000 0,000
cTemperatura-Tiempo 0,123 0,136 0,001* 0,007* 0,025* 0,634

aFactor Temperatura con dos niveles: 4 °C y 29±2 °C; bFactor tiempo con dos niveles: 40 y 120 días; cEfecto combinado de los factores Temperatura y Tiempo; (*) Interacción entre los factores

Las plantas que se trataron con los inóculos bacterianos que poseían 40 días de conservación a 29±2 °C, manifestaron los resultados más favorables en la masa seca de nódulos, lo que indica un mayor contenido de bacteroides establecidos en ellos. La masa seca de raíz y parte aérea, se favoreció con la aplicación de inoculantes conservados durante 40 días a 4 °C (Tabla 3). Es lógico que en el menor tiempo evaluado se encuentre la mayor actividad, ello se corresponde con los mayores valores de concentración celular hallados en los inoculantes: de 108 y 109 UFC mL-1, respectivamente.

Tabla 3.  Efecto de la combinación de los factores Temperatura y Tiempo de conservación del inoculante Azofert®-F sobre las variables de nodulación y crecimiento de las plantas de frijol que mostraron interacción
Tratamientos Masa seca nodular (g) Masa seca de raíces (g) Masa seca parte aérea (g)
Temperatura (°C) Tiempo (días)
4 40 0,033 ± 0,006 b 1,23 ± 0,32 a 1,08 ± 0,05 a
120 0,022 ± 0,002 b 0,18 ± 0,02 b 0,40 ± 0,05 c
29±2 40 0,074 ± 0,006 a 0,24 ± 0,02 b 0,82 ± 0,05 b
120 0,019 ± 0,005 b 0,17 ± 0,02 b 0,40 ± 0,04 c
Esx 0,008 0,22 0,07

Los datos muestran las medias + error estándar de la media. Letras iguales en la misma columna muestran diferencias significativas (Tukey HSD p<0,05, n=5)

Otras investigaciones informan que no se afecta la masa seca radical y de la parte aérea de plantas de arveja (Pisum sativum L.) y soya (Glycine max (L.), cuando se tratan con inoculantes a base de rizobios que se conservaron por 15, 60, 120 y 180 días a 4 y 28±2 °C, y que posean una concentración de células de 108 UFC mL-1 al momento de la inoculación de las semillas (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

Por otra parte, los resultados mostraron que hubo una influencia del factor temperatura en el número de nódulos efectivos y del factor tiempo en el contenido relativo de clorofilas totales (Tabla 4).

Tabla 4.  Efecto independiente de los factores Temperatura y Tiempo de conservación del inoculante Azofert®-F sobre las variables que no mostraron interacción
Tratamientos Número de nódulos totales (u) Número de nódulos efectivos (u) Contenido relativo de clorofilas totales (SPAD)
Temperatura (°C)
4 31,1 ± 3,6 a 29,1 ± 3,8 a 27,6 ± 1,4 a
29±2 23,2 ± 3,1 a 19,8 ± 2,6 b 29,1 ± 1,2 a
Tiempo (días)
40 25,6 ± 2,1 a 22,0 ± 1,7 a 31,3 ± 0,9 a
120 28,7 ± 4,6 a 26,9 ± 4,7 a 25,4 ± 0,8 b

Los datos muestran las medias + error estándar de la media. Letras iguales en la misma columna muestran diferencias significativas (Tukey HSD p<0,05, n=5)

La inoculación de Azofert®-F cuando se conservó a 4 °C provocó mayor número de nódulos efectivos en las plantas. Además, el empleo de los inoculantes que se conservaron por 40 días potenció el contenido relativo de clorofilas totales. Investigaciones previas mostraron similar efecto de Azofert®-F en el cultivar Cubacueto 25-9, a los siete días de su elaboración (34Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, García C, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) sometidas a dos regímenes de riego. Centro Agrícola. 2018;45(4):20-26. ISBN 0253-5785. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-57852018000400020.). Por lo tanto, esta investigación sugiere que el producto es capaz de mantener su actividad biológica en plantas 40 días después de su elaboración (Tabla 4).

La temperatura de conservación ni el tiempo de almacenamiento de los inoculantes influyeron en la formación de nódulos en las plantas de frijol, lo que pudiera deberse a que la capacidad de la cepa CF1 para establecer simbiosis con las plantas de frijol se mantuvo por un período de, al menos, 120 días en ambas condiciones. Estudios previos, con inoculantes a base de rizobios que se almacenaron a 4 y 28±2 °C por 15, 60, 120 y 180 días, muestran un comportamiento similar en los cultivos de arveja y soya (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

Otras investigaciones indican que la aplicación de inoculantes de Bradyrhizobium que se conservaron durante 180 días a 4 °C provocaron un incremento en el número de nódulos efectivos en plantas de soya respecto a aquellas donde se emplearon inóculos conservados a 29±2 °C (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.). Además, inoculantes de Pseudomonas fluorescens que se mantuvieron por un período de 180 días a 28±2 °C promovieron el crecimiento de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) y disminuyeron el marchitamiento de las hojas por Fusarium (3535. Department of Agricultural Microbiology, College of Agriculture, Bheemarayangudi, University of Agricultural Sciences, Raichur, 584104 (Karnataka) y Biradar BJP. Role of Polymeric Additives in Formulation, Shelf-life and Bioefficacy of Liquid Inoculant of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;6(4):123-133. ISSN 23207051. DOI 10.18782/2320-7051.6822. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a16.php.).

El efecto positivo de la aplicación de Azofert®-F, conservado por 40 días, en el contenido de clorofilas se correspondió con los mejores resultados en la masa seca nodular y la masa seca de la parte aérea de las plantas de frijol (Tabla 3). En ese momento, el inoculante presentó una concentración elevada de la cepa CF1 (108-109 UFC mL-1). Una mayor concentración de la cepa en el inoculante propicia un mayor número de células en contacto con las raíces y, por lo tanto, se incrementarían los sitios de infección, la formación de los nódulos y el establecimiento de los bacteroides, lo que incrementa la masa nodular. Un incremento de la nodulación efectiva en la FBN permite un mayor aporte de nitrógeno (3636. Koskey G, Mburu SW, Njeru EM, Kimiti JM, Ombori O, Maingi JM. Potential of Native Rhizobia in Enhancing Nitrogen Fixation and Yields of Climbing Beans (Phaseolus vulgaris) in Contrasting Environments of Eastern Kenya. Frontiers in Plant Science. 2017;8:443. ISSN 1664-462X. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.00443.), lo que conllevaría al incremento de los pigmentos fotosintéticos y de la biomasa aérea. Estas evidencias se corroboraron en investigaciones previas con frijol caupí (Vigna unguiculata L.), frijol común, soya y canavalia (Canavalia ensiformis) (88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401., 1111. Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, Nápoles García MC, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) en condiciones de déficit hídrico. Revista Ciencias Agrícolas. 2018;45(4): [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/html/v45n4/body/cag03418.html., 3737. Sauvu-Jonasse C, Nápoles-García M, Falcón-Rodríguez A, Lamz-Piedra A, Ruiz-Sánchez M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3). ISSN 0258-5936. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1556., 3838. Alonso GMM, Aguilar YT, Forte IH, Nualles MV, Araujo E da S. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de 15N y diferencia de N total. Cultivos Tropicales. 2017;38(1):122-130. ISSN 1819-4087. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193250540016.).

CONCLUSIONES

 
  • Se demostró que el inoculante Azofert®-F pudiera conservarse a 4 y 29±2 °C, por 150 y 90 días, respectivamente; sin necesidad de preservantes en su formación y que hasta los 120 días de conservación no afecta la formación de nódulos en las plantas de frijol. Estas evidencias permitirían establecer una estrategia de producción y comercialización del inoculante con calidad adecuada durante todo el año, que asegure cubrir las demandas del producto, fundamentalmente en la época de siembra.

Cultivos Tropicales Vol. 45, No. 1, enero-marzo, 2024, ISSN: 1819-4087
 
Original Article

Effect of temperature and storage time on the Azofert®-F´s quality

 

iDBelkis MoralesMena*✉:bmorales@inca.edu.cu

iDMaría Caridad Nápoles García

iDIonel Hernández Forte


Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), Carretera a Tapaste, Km 31/2, Gaveta postal No.1, CP 32700. San José de las Lajas. Mayabeque, Cuba.

 

*Author for correspondence: bmorales@inca.edu.cu

ABSTRACT

The objective of this work was to determine the effect of temperature and storage time on the concentration of the active principle and the biological activity of the Azofert®-F biofertilizer. Inoculants with Rhizobium leguminosarum CF1 strain were stored at 4 and 29±2 °C, to determine purity and strain concentration every 30 during 180 days. Data were processed using a simple classification analysis of variance. At 40 and 120 days of conservation of the inoculants, Tazumal cultivar were applied to bean seeds and the number of nodules and their effectiveness, the dry mass of nodules, roots and aerial part and the relative content of total chlorophylls were evaluated, in controlled conditions. A completely randomized experimental design was used and the data were processed using a bifactorial arrangement. Rhizobium leguminosarum CF1 strain maintained a concentration of 108 CFU mL-1 or higher for 150 and 90 days, when Azofert®-F was stored at 4 and 29±2 °C, respectively. Product storage for 120 days at both temperatures did not affect the number of nodules in bean plants. Nevertheless, temperature and inoculant storage time, influenced the effectiveness of formed nodules and the relative content of total chlorophylls, respectively. This research is the firstone about the conservation influence on the efficacy of a Cuban commercial inoculant based on Rhizobium for beans.

Key words: 
Rhizobium, inoculant, microbiological stability, bean

INTRODUCTION

 

The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a crop of great importance in human nutrition. Its grain is rich in protein, provides micronutrients, fiber and starch (11. Ganesan K, Xu B. Polyphenol-Rich Dry Common Beans (Phaseolus vulgaris) and Their Health Benefits. Int J Mol Sci. 2017 Nov 4;18(11):2331. DOI: 10.3390/ijms18112331. PMID: 29113078. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5713300/., 22. Guevara AM, Moya KV, Zeledón JR, Rojas LG, Aguirre CH, Monge HB. Evaluación de propiedades fisicoquímicas del frijol costarricense (Phaseolus vulgaris) como estrategia de diferenciación y valorización. Perspect Rur Nueva Época. 2020 Jun 30;18(35):25-48. DOI: 10.15359/prne.18-35.2. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.revistas.una.ac.cr/index.php/perspectivasrurales/article/view/14787.). This legume demands high amounts of nitrogen, an element that it obtains to a great extent through Biological Nitrogen Fixation (BNF) (33. Cantaro-Segura H, Huaringa-Joaquín A, Zúñiga-Dávil D. Efectividad simbiótica de dos cepas de Rhizobium en cuatro variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Perú. Idesia (Arica). 2019 Dec;37(4):73-81. DOI: 10.4067/S0718-34292019000400073. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0718-34292019000400073&lng=es&nrm=iso&tlng=es., 44. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macías R, López-Alcocer E. Eficiencia en fijación biológica de nitrógeno de cepas de Rhizobium recolectadas en frijol cultivado y silvestre. Rev Terra Latinoam. 2020 Oct 11;38(4):841-852. DOI: 10.29312/terralat.38.4.654. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.terralatinoamericana.org.mx/index.php/terra/article/view/654.).

Among the microorganisms that carry out BNF are rhizobia, bacteria that are traditionally used as an active principle in the biofertilization of legumes. The use of biofertilizers in agricultural practice is considered a viable alternative for its ecological, economic and productive benefits; it allows reducing the use of mineral fertilizers (55. Martínez F, García C, Gómez LA, Aguilar Y, Martínez-Viera R, Castellanos N, Riverol M. Manejo sostenible de suelos en la agricultura cubana. Agroecología. 2017;12(1):25-38. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://revistas.um.es/agroecologia/article/view/330321., 66. Buntić AV, Stajković-Srbinović OS, Knežević MM, Kuzmanović ĐŽ, Rasulić NV, Delić DI. Development of liquid rhizobial inoculants and pre-inoculation of alfalfa seeds. Arch Biol Sci. 2019 Jun 4;71(2):379-387. DOI: 10.2298/ABS19023503B. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.serbiosoc.org.rs/arch/index.php/abs/article/view/3503.) and increasing the yield of economically important crops (77. Romero-Arias A, Ruz-Reyes RM, Nápoles-García MC, Gómez-Padilla EJ, Rodríguez-Rodríguez S. Efecto de la aplicación de tres cepas de Bradyrhizobium en el desarrollo morfoagronómico de Glycine max Pastos y Forrajes. 2019;42(4):290-295. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/2691/269162670006/, 88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401.).

Several biofertilizers are produced and marketed in Cuba, including Azofert® from the National Institute of Agricultural Sciences (INCA). In particular, Azofert®-F is used in the cultivation of beans; it is a liquid inoculant that contains high concentrations of the bacterial strain Rhizobium leguminosarum CF1 (CF1) and nodulation inducers, an attribute that distinguishes it from other commercial inoculants based on rhizobia in the country (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.). Its direct application to bean seeds at the moment of sowing allows saving between 50-70 % of nitrogen fertilizer (1010. Hernández Salido L, Salido García Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Carib Cienc Soc. 2019 Jan 30. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html., 1111. Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, Nápoles García MC, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en el rendimiento de variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) en condiciones de déficit hídrico. Revista Ciencias Agrícolas. 2018;45(4): [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/html/v45n4/body/cag03418.html.).

The absence of contaminating microorganisms, the concentration of viable cells and their physiological state are some of the factors that influence the successful performance of biofertilizers (1212. Bernabeu P. Caracterización de la colonización y promoción del crecimiento vegetal por Burkholderia tropica en gramíneas [en línea] [Tesis de Doctorado]. Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina; 2017. p. 264. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/59824.). Quality standards governing the use of these biopreparations vary depending on the regulations in force in each country. However, a minimum concentration of the active ingredient of 1 x 109 CFU mL-1 or g-1 at the time of preparation and 1 x 108 CFU mL-1 or g-1 at maturity, with minimal or no presence of contaminating microorganisms, is recommended by consensus (1313. Izaguirre-Mayoral ML. Biofertilizantes en Iberoamérica: Una Visión Técnica, Científica y Empresarial [en línea]. 1ra ed. Montevideo, Uruguay: Editorial Universitaria; 2007. p. 103. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/Biofertilizantes_en_Iberoam%C3%A9rica.html?id=BrnhtAEACAAJ&redir_esc=y.).

The shelf life of biofertilizers is essential for their commercialization, due to the long time that can elapse between their production and application (1414. Hungria M, Nogueira MA, Campos LJM, Menna P, Brandi F, Ramos YG. Seed pre-inoculation with Bradyrhizobium as time-optimizing option for large-scale soybean cropping systems. Agronomy Journal. 2020;112(6):5222-5236. DOI 10.1002/agj2.20392 [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/agj2.20392.). Therefore, determining the period of effectiveness of these bioproducts, according to the conservation capacities available, is essential to delimit their validity time and to be able to establish a production and commercialization strategy that satisfies the demand at the opportune moment of sowing.

There are few studies in Cuba that address the microbiological stability over time of liquid commercial inoculants. The active principles most used in the country are Plant Growth Promoting Bacteria such as Azospirillum, Azotobacter and Mesorhizobium (1515. Dibut B, González R, Martínez R. Dimargon, nuevo medio de cultivo para la producción industrial de biopreparados a base de Azotobacter chroococcum. Cultivos Tropicales. 1994;15(1):12-14. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://biblat.unam.mx/es/revista/cultivos-tropicales/articulo/dimargon-nuevo-medio-de-cultivo-para-la-produccion-industrial-de-biopreparados-a-base-de-azotobacter-chroococcum.-1717. Nápoles MC, Velazco A. Utilización del ácido ascórbico como preservante en biopreparados de Azospirillum brasilense. Cultivos Tropicales. 1994;15(2):25-27. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/files/anteriores/1994/2/CT15205.pdf.). In most of these studies it is not possible to access the details of the research from the search engines available on the Internet and in many cases access to the information is restricted. Only one previous study determined the effect of temperature on the conservation of a commercial rhizobia-based inoculant for soybean (1818. Menéndez C, Trujillo LE, Ramírez R, González-Peña D, Espinosa D, Enríquez GA, Hernández L. Producción de un inoculante líquido de Bradyrhizobium japonicum con alto impacto en la siembra mecanizada de la soya en Cuba. Biotecnología Aplicada. 2014;31(2):111-115. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=51730.). Considering the above, the objective of this study was to determine the effect of temperature and storage time on the concentration of the active ingredient and the biological activity of the biofertilizer Azofert®-F.

MATERIALS AND METHODS

 

Pre-inocula were prepared in 100 mL capacity Erlenmeyers containing 10 mL of sterile Bradyfact culture medium (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.). For this purpose, a hoe of strain CF1 preserved in tubes containing solid Yeast-mannitol (LM) medium (1919. Vincent JM. A Manual for the Practical Study of Root-nodule Bacteria [en línea]. 1970. Blackwell Scientific. p. 202. ISBN 978-0-632-06410-6. Disponible en: https://books.google.com.cu/books/about/A_Manual_for_the_Practical_Study_of_Root.html?id=dcQcAQAAIAAJ&redir_esc=y.) with Congo red was used. Flasks were kept in agitation at 130 rpm and 28 °C, for 16 h. Subsequently, the strain multiplication by aerobic fermentation was continued under the same incubation conditions. In each case, 10 % (inoculum volume / medium volume) was inoculated until a total volume of 1000 mL of inoculum was obtained. The fermentant was formulated with 1000 mL of sterile Bradyfact medium in a 1:1 ratio.

The formulation (Azofert®-F) was packaged in ten sterile bottles of 240 mL total volume, each containing 200 mL of the product. Two treatments were established with five vials each. One treatment was stored at a refrigerated temperature of 4 °C and the other at an average room temperature of 29±2 °C.

Effect of temperature and storage time on the strain CF1 concentration in Azofert®-F

 

The trial ran from October 2017 to February 2018. Three flasks stored at each temperature condition were randomly selected and the microbiological purity of the inoculum was determined by Gram staining. The morpho-staining characteristics described for bacteria of the rhizobia group (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.) were used as distinguishing criteria.

The number of colony forming units (CFU mL-1) of strain CF1 was evaluated at the time of inoculant preparation and every 30 days under both temperature conditions. For this purpose, serial decimal dilutions of the inoculant were made and grown by spreading on plates with solid LM medium with Congo red. Cultures were incubated at 28 °C for 72 h. The calculation of the CFU number was performed using the formula:

U F C   m L - 1 = N o .   c o l × 10 1 × d  

where:

col. no. - number of colonies

d - dilution factor

Azofert ®-F application Effect stored at different temperatures and storage times on nodulation, growth and chlorophyll content of bean plants

 

Inoculation trials were carried out in pots of 973.90 cm3 total volume, containing 0.2 kg of typical eutrophic Ferrallitic Red Leached soil (2121. Hernández Jiménez A, Bosch Infante D, Pérez Jiménez JM, Castro Speck N. Clasificación de los suelos de Cuba 2015 [Internet]. 1.a ed. San José de las Lajas (Cuba): Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2015. ISBN 978-959-7023-77-7. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://isbn.cloud/9789597023777/clasificacion-de-los-suelos-de-cuba-2015/.), from the central area of INCA. The substrate was extracted at a depth between 0-20 cm and its chemical analysis was carried out according to the manual for soil analysis, foliar, organic fertilizers and chemical fertilizers (2222. Paneque P, Calaña N, Calderón V, Borges B, Hernández G, Caruncho C. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos [Internet]. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas; 2010. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://docplayer.es/13119861-Manual-de-tecnicas-analiticas-para-analisis-de-suelo-foliar-abonos-organicos-y-fertilizantes-quimicos.html.). The soil had a slightly acid pH, medium organic matter content, low Na+ and Mg2+ and high K+ and P. The Ca2+ content corresponded to what is normally reported for this type of soil (2323. Mesa N, Naranjo G, Cancio R, Martí A, Clemente B, Suárez O. Manual de interpretación de los índices físico-químicos y morfológicos de los suelos cubanos. 2da ed. 1984. p. 136. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/44495794_Manual_de_interpretacion_de_los_indices_fisico-quimicos_y_morfologicos_de_los_suelos_cubanos_Direccion_General_de_Suelos_y_Fertilizantes.) (Table 1).

Table 1.  Some chemical characteristics of the substrate Ferrallitic Red Leached Soil typical eutrophic leachate used in the inoculation trials
pH Organic matter (g kg-1) Na+ K+ Ca2+ Mg2+ P2O5 (mg kg-1)
cmolc (kg-1)
6.7 34.9 0.09 0.56 14.5 1.0 218.0

pH by potentiometry: soil/solution ratio 1:2.5; organic matter by colorimetry (Walkley Black); exchangeable cations Ca2+ and Mg2+(complexometry by extraction with NH4Ac at 1 mol L-1 at pH 7); K+ and Na+ by flame photometry; P by extraction with sulfuric acid at 0.1 N, Oniani's method

The concentration of possible resident rhizobia in the substrate was also determined. For this, one gram of soil was added to 9 mL of sterile distilled water and serial decimal dilutions were performed. An aliquot of 0.1 mL was grown on plates with solid LM medium with Congo red and the culture was incubated for 10 days at 28 °C. The substrate had a concentration of 3 x 103 CFU g soil-1of potential rhizobia.

To evaluate the effect of the formulation on nodulation and growth of bean plants, two pot trials were established, with five plants per treatment each. In the first, inoculants were used with 40 days of storage at 4 and 29±2 °C, with a bacterial concentration of 109 and 108 CFU mL-1, respectively. In the second trial, inoculants with 120 days of conservation at 4 and 29±2 °C and with a concentration of 108 and 107 CFU mL-1, respectively, were used.

Two bean seeds per pot were sown and each pot was inoculated with 200 µL of the inoculants described above. Pots were placed in trays with Hoagland's nutrient solution (2424. Hoagland DR, Arnon DI. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station. 1950. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19500302257.), lacking solution A (rich in nitrogen salts) in order to enhance BNF. The plants were maintained under controlled conditions, at 25±2 °C, 70 % relative humidity and photoperiod of 16 h light/8 h dark. Ten days after emergence, one seedling was removed from each pot.

Thirty days after planting, the number of total nodules (u) and the number of effective total nodules (u) were determined. The effectiveness of the nodules was assessed by cutting the nodules crosswise with a scalpel and observing the internal coloration. A red, pink or brown coloration inside the nodules was interpreted as effective in BNF (2525. Morote C, Palomino M. Técnicas de aislamiento, identificación, selección de cepas de Rhizobium, Azospirillum y producción de inoculantes. Investigación. 2019;27:175-195. ISSN 1684-0089. DOI 10.51440/unsch.revistainvestigacion.2019.1.119. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/348427975_Tecnicas_de_aislamiento_identificacion_seleccion_de_cepas_de_Rhizobium_Azospirillum_y_produccion_de_inoculantes.). The dry mass of the total nodules (g), the dry mass of the aerial part of the plants (g) and the dry mass of the root system (g) were evaluated with a digital balance, model TE214S (Sartorius brand). The relative total chlorophyll content was determined in the third leaflet from bottom to top (SPAD units), with a portable chlorophyll meter (MINOLTA SPAD 502 Plus).

Design and statistical analysis

 

CF1 strain concentration data were analyzed by simple rank analysis of variance. Tukey's mean comparison test for p<0.05 was used to discriminate differences between treatments. Data were processed in Statgraphics Plus Program version 5.1 (2001) and plotted in Microsoft Excel Program, 2016.

In the plant inoculation trial, a completely randomized experimental design was used and the results were subjected to a bifactorial arrangement and two factors were taken into account: temperature, with the levels: 4 and 29±2 °C and time with the levels: 40 and 120 days. The data were subjected to Between's test and processed in the statistical program SPSS version 21.

RESULTS AND DISCUSSION

 

Storage of Azofert®-F at 4 °C maintains higher concentrations of strain CF1 over time.

The culture of the inoculants in solid LM medium showed the formation of large and mucous colonies that do not absorb the Congo red dye. Gram staining allowed observing Gram-negative bacilli, without endospores and the absence of contaminating microorganisms. These characteristics coincide with those described for strain CF1, the active ingredient of Azofert®-F (2020. López-Alcocer JJ, Lépiz-Ildefonso R, González-Eguiarte DR, Rodríguez-Macias R, López-Alcocer E, Olalde-Portugal V. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado. Revista Fitotecnia Mexicana. 2017;40(1):73-81. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/610/61051194009/html/.).

A common concern in the production of inoculants is the survival of the active ingredient, which is why the concentration of its cells is one of the most important quality parameters (2626. Hungria M, Nogueira M. Tecnologias de inoculação da cultura da soja: Mitos, verdades e desafios. Boletim de Pesquisa. 2020. pp. 50-62. ISBN 2176-2902. Disponible en: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/223209/1/SP-17-2020-online-1.pdf.). This study addressed this problem, according to the existing storage possibilities for Azofert®-F preservation. The results showed that the storage of Azofert®-F at 4 °C maintained higher concentrations of the CF1 strain over time (Figure 1).

Statistical analysis was performed at each evaluation time. Means with equal letters do not differ statistically (Tukey p≤0.05, n=3)
Figure 1.  Concentration of Rhizobium leguminosarum CF1 strain in Azofert®-F biofertilizer, stored at 4 °C and 29±2 °C, for 180 days

The concentration of strain CF1 remained above 1 x 108 CFU mL-1 when stored at 4 °C for 150 days, while at 29±2 °C it remained at those levels for only 90 days. Storage of Azofert®-F at 4 °C showed higher viability values than those obtained for the bioproduct stored at room temperature at 30, 120, 150 and 180 days after processing. In similar studies, with inoculants of Sinorhizobium meliloti in LM culture medium and stored at 4 °C, it is reported that the number of viable cells decreased considerably after 90 days (2727. Tarek R, Dayal TR, Kaur BS, Danielle P. Development of Efficient Suspension Formulation of Starch Industry Wastewater Grown Sinorhizobium Meliloti for Agricultural Use. International Journal of Agriculture Innovations and Research. 2014;3(4):1083-1093. Disponible en: https://www.researchgate.net/profile/Tarek-Rouissi/publication/274961111_Development_of_Efficient_Suspension_Formulation_of_Starch_Industry_Wastewater_Grown_Sinorhizobium_Meliloti_for_Agricultural_Use/links/552d98760cf21acb0921786b/Development-of-Efficient-Suspension-Formulation-of-Starch-Industry-Wastewater-Grown-Sinorhizobium-Meliloti-for-Agricultural-Use.pdf.). This difference in behavior could have been due to differences between the strains and the culture medium used in their multiplication for both investigations. The culture medium used in the production of Azofert® (99. Nápoles MC, Gómez G, Costales D. Factores de nodulación. Experiencia en Cuba. Cultivos Tropicales. 2008;29(2):71-80. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/254.) is a nutrient-rich medium that differs from the chemical composition of LM medium (2828. Nápoles MC, Martínez J, Costales D, Gómez G. Efecto de diferentes medios de cultivo. Cultivos Tropicales. 2006;27(1):35-38. ISSN 0258-5936. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/1932/193215885006.pdf.).

Strain CF1 in the inoculant decreased in concentration by one logarithmic unit at 30, 120 and 180 days of storage at room temperature. Other investigations with liquid inoculants of Bradyrhizobium japonicum showed the same behavior at 30 and 180 days of storage at 27-29 °C (2929. Cozzi JG, Benintende BG, Pacheco Basurco JC. Nuevo inoculante liquido para semillas de soja (Glycine max). Rev. Facultad de Agronomía. 1996;16:127-132. Disponible en: http://ri.agro.uba.ar/files/download/revista/facultadagronomia/1996cozzijg.pdf.). At the end of the trial, at 180 days at room temperature, strain CF1 in Azofert®-F showed cell concentration values of 106 CFU mL-1. In contrast to other authors who reported that Pseudomonas strains at 28±2 °C did not survive in the inoculant after 150 days of storage (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.).

The results show that temperature and time affect the microbiological stability of Azofert®-F. Temperature, type of formulation and storage time are known to have a significant effect on the cell viability of the active ingredient of inoculants (3131. Infante EJG. Modelo factorial para el control de calidad de biofertilizantes de importancia agrícola. 2017; p. 40. Disponible en: https://repository.libertadores.edu.co/bitstream/handle/11371/1318/gonzalezedgar2017.pdf?sequence=1.). Low temperatures slow down physiological processes of the bacterial cell and its aging (3232. Freire J, Sato M. Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana de Microbiología. 1999;41(1):35-42. Disponible en: https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=YTaaAAAAIAAJ&oi=fnd&pg=PA35&ots=eivT_nsYnh&sig=YmqeEdfnGuskQ3w-iL7Fb_GlyAU#v=onepage&q&f=false.), while temperatures close to 30 °C increase the consumption of the nutrients of the medium by the bacteria, which causes a more accelerated depletion of these nutrients and thus a decrease in cell viability (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

Knowing the shelf life of the bioproduct Azofert®-F, under the storage conditions available in the country, makes it possible to establish a production strategy that covers the greatest possible demand for the product, with sufficient availability at the time of bean planting in Cuba.

Temperature and storage time influence the biological activity of Azofert®-F in Tazumal cultivar bean plants.

Few studies have evaluated the effect of temperature and storage time on the biological activity of inoculants based on Plant Growth Promoting Bacteria. This is the first research in Cuba that addresses this issue in a commercial inoculant for beans, one of the most important crops for Cubans.

The analysis of the data from the inoculation trial under controlled conditions showed that there was interaction between the factors temperature and time in the variables dry mass of nodules, roots and aerial part of bean plants. For the rest of the variables there was no interaction between the two factors (Table 2).

Table 2.  P value of factors and interaction terms in the ANOVA analysis for the variables of nodulation and plant growth of bean cultivar Tazumal, under controlled condition
Origin Number of total nodules (u) Number of total effective nodules (u) Dry mass of total nodules (g) Dry mass of roots(g) Dry mass of aerial part (g) Relative content of total chlorophylls (SPAD)
Corrected model 0.152 0.079 0.000 0.000 0.000 0.002
Intersection 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
a Temperature 0.106 0.051 0.002 0.007 0.027 0.236
b Time 0.511 0.282 0.000 0.003 0.000 0.000
c Temperature-Time 0.123 0.136 0.001* 0.007* 0.025* 0.634

aTemperature factor with two levels: 4 °C and 29±2 °C

bTime factor with two levels: 40 and 120 days.

cCombined effect of Temperature and Time factors

(*) Interaction between factors

Plants treated with bacterial inoculants that had been stored for 40 days at 29±2 °C showed the most favorable results in the dry mass of nodules, indicating a higher content of bacteroids established in them. The dry mass of root and aerial part was favored with the application of inoculants preserved for 40 days at 4 °C (Table 3). It is logical that the highest activity is found in the shortest time evaluated, which corresponds to the highest cell concentration values found in the inoculants: 108 and 109 CFU mL-1, respectively.

Table 3.  Combination effect of Temperature and Time of inoculant Azofert®-F conservation factors on the variables of nodulation and growth of bean plants that showed interaction
Treatments Nodular dry mass (g) Dry mass of roots (g) Dry mass of aerial part (g)
Temperature (°C) Time (days)
4 40 0.033 ± 0.006 b 1.23 ± 0.32 a 1.08 ± 0.05 a
120 0.022 ± 0.002 b 0.18 ± 0.02 b 0.40 ± 0.05 c
29±2 40 0.074 ± 0.006 a 0.24 ± 0.02 b 0.82 ± 0.05 b
120 0.019 ± 0.005 b 0.17 ± 0.02 b 0.40 ± 0.04 c
Esx 0.008 0.22 0.07

Data show means + standard error of the mean. Equal letters in the same column show significant differences (Tukey HSD p<0.05, n=5)

Other investigations report that the radical and aerial dry mass of pea (Pisum sativum L.) and soybean (Glycine max (L.) plants is not affected, when treated with inoculants based on rhizobia that were conserved for 15, 60, 120 and 180 days at 4 and 28±2 °C, and that have a cell concentration of 108 CFU mL-1 at the moment of inoculation of the seeds (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

On the other hand, results showed that there was an influence of the temperature factor on the number of effective nodules and of the time factor on the relative content of total chlorophylls (Table 4).

Table 4.  Independent effect of Temperature and Storage time of the Azofert®-F inoculant factors on the variables that did not show interaction
Treatments Number of total nodules (u) Number of effective nodules (u) Relative total chlorophyll content (SPAD)
Temperature (°C)
4 31.1 ± 3.6 a 29.1 ± 3.8 a 27.6 ± 1.4 a
29±2 23.2 ± 3.1 a 19.8 ± 2.6 b 29.1 ± 1.2 a
Time (days)
40 25.6 ± 2.1 a 22.0 ± 1.7 a 31.3 ± 0.9 a
120 28.7 ± 4.6 a 26.9 ± 4.7 a 25.4 ± 0.8 b

Data show means + standard error of the mean. Equal letters in the same column show significant differences (Tukey HSD p<0.05, n=5)

Inoculation of Azofert®-F when kept at 4 °C resulted in a higher number of effective nodules in plants. In addition, the use of inoculants that were kept for 40 days enhanced the relative content of total chlorophylls. Previous research showed a similar effect of Azofert®-F on the Cubacueto 25-9 cultivar, seven days after processing (34Estrada Prado W, Chávez Suárez L, Jerez Mompie E, García C, Maceo Ramos YC, Cordoví Domínguez C. Efecto del Azofert® en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) sometidas a dos regímenes de riego. Centro Agrícola. 2018;45(4):20-26. ISBN 0253-5785. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-57852018000400020.). Therefore, this research suggests that the product is able to maintain its biological activity in plants 40 days after processing (Table 4).

Neither the storage temperature nor the storage time of the inoculants influenced the formation of nodules on the bean plants, which could be due to the fact that the ability of strain CF1 to establish symbiosis with the bean plants was maintained for a period of at least 120 days under both conditions. Previous studies, with rhizobia-based inoculants stored at 4 and 28±2 °C for 15, 60, 120 and 180 days, show similar behavior in pea and soybean crops (3333. Moreno Conn LM, Pérez A, Ramírez M, Franco M. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno utilizadas en la elaboración de inoculantes biológicos para arveja (Pisum sativum) y soya (Glycine max). Rev. colomb. biotecnol. 2014;45-56. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752014000200006.).

Other research indicates that the application of Bradyrhizobium inoculants that were stored for 180 days at 4 °C caused an increase in the number of effective nodules in soybean plants with respect to those where inoculants stored at 29±2 °C were used (3030. Praveen Biradar BJ, Santhosh GP. Cell Protectants, Adjuvants, Surfactant and Preservative and their Role in Increasing the Shelf Life of Liquid Inoculant Formulations of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;16(4). Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a15.php.). In addition, inoculants of Pseudomonas fluorescens maintained for a period of 180 days at 28±2 °C promoted the growth of tomato plants (Lycopersicon esculentum, Mill) and decreased the wilting of leaves by Fusarium (3535. Department of Agricultural Microbiology, College of Agriculture, Bheemarayangudi, University of Agricultural Sciences, Raichur, 584104 (Karnataka) y Biradar BJP. Role of Polymeric Additives in Formulation, Shelf-life and Bioefficacy of Liquid Inoculant of Pseudomonas fluorescens. International Journal of Pure & Applied Bioscience. 2018;6(4):123-133. ISSN 23207051. DOI 10.18782/2320-7051.6822. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: http://www.ijpab.com/vol6-iss4a16.php.).

The positive effect of Azofert®-F application preserved for 40 days on chlorophyll content corresponded with the best results on the nodular dry mass and the dry mass of the aerial part of bean plants (Table 3). At that time, the inoculant presented a high concentration of strain CF1 (108-109 CFU mL-1). A higher concentration of the strain in the inoculant leads to a greater number of cells in contact with roots, and therefore, would increase the sites of infection, the formation of nodules and the establishment of bacteroids, which increases the nodular mass. An increase in effective nodulation in the BNF allows a greater nitrogen supply (3636. Koskey G, Mburu SW, Njeru EM, Kimiti JM, Ombori O, Maingi JM. Potential of Native Rhizobia in Enhancing Nitrogen Fixation and Yields of Climbing Beans (Phaseolus vulgaris) in Contrasting Environments of Eastern Kenya. Frontiers in Plant Science. 2017;8:443. ISSN 1664-462X. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.00443.), which would lead to an increase in photosynthetic pigments and aerial biomass. This evidence was corroborated in previous research with cowpea (Vigna unguiculata L.), common bean, soybean, and canavalia (Canavalia ensiformis) (88. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, Sánchez RL, Fernández-Pascual M. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales. 2017;38(4):39-49. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401., 1010. Hernández Salido L, Salido García Y. Influencia de la aplicación de Azofert inoculante a base Rhizobium en el cultivo del fríjol común (Phaseolus vulgaris) VAR. Delicias 364 en finca Juan Sáez. Manatí. Carib Cienc Soc. 2019 Jan 30. [Consultado: 16 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.eumed.net/rev/caribe/2019/01/cultivo-frijol-comun.html., 3737. Sauvu-Jonasse C, Nápoles-García M, Falcón-Rodríguez A, Lamz-Piedra A, Ruiz-Sánchez M. Bioestimulantes en el crecimiento y rendimiento de soya (Glycine max (L.) Merrill). Cultivos Tropicales. 2020;41(3). ISSN 0258-5936. Disponible en: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1556., 3838. Alonso GMM, Aguilar YT, Forte IH, Nualles MV, Araujo E da S. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de 15N y diferencia de N total. Cultivos Tropicales. 2017;38(1):122-130. ISSN 1819-4087. [Consultado: 18 de octubre de 2023]. Disponible en: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193250540016.).

CONCLUSIONS

 
  • It was demonstrated that the inoculant Azofert®-F could be conserved at 4 and 29±2 °C, for 150 and 90 days, respectively, without the need for preservatives in its formation and that up to 120 days of conservation it does not affect the formation of nodules in bean plants. These evidences would allow to establish a strategy of production and commercialization of the inoculant with adequate quality during the whole year that assures to cover the demands of the product, fundamentally in the sowing time.