Obtención de los aislados

El aislamiento de posibles rizobios se realizó en 43 sitios, a partir de nódulos provenientes de cinco plantas sanas y vigorosas de siete cultivares de garbanzo (Nacional-6, Nacional-24, Nacional-27, Nacional-29, Nacional-30, PJ-94 y Jamu-96), en la etapa de la floración. Las plantas se encontraban distribuidas en diferentes escenarios productivos de nueve provincias del país (Pinar del Rio, La Habana, Artemisa, Mayabeque, Santi Spíritus, Cienfuegos, Granma, Las Tunas y Guantánamo) y sobre cuatro tipos de suelos (Alítico, Ferralítico, Fersialítico y Sialítico).

Una vez retirados los nódulos de las plantas, se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio al 5 % y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril. Posteriormente, se colocaron en tubos de ensayo que contenían 15 mL de agua destilada estéril y se maceraron. Cada extracto se inoculó en el medio de cultivo Levadura Manitol Agar (LMA) con Rojo Congo (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) y se incubaron las placas a 28-30 °C de temperatura, durante 72 horas. La purificación de los microorganismos se realizó en este mismo medio de cultivo.

Caracterización morfo-fisiológico y bioquímica de los aislados

Se determinó la morfología de las colonias, tamaño y bordes, mediante su observación en microscopio estereoscópico Leica KL 300 LED (3X), mientras que la caracterización microscópica y tintorial se realizó a partir de una tinción de Gram (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ) y la observación en un microscopio óptico (Leica DM300 (1 000 X de aumento)).

Se evaluó, también, la producción de ácidos o bases por parte los aislados y la producción de cetolactasa. En el primer caso, se utilizó el medio de cultivo LMA (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) con azul de bromotimol y se realizó la incubación durante siete días a 28-30 °C de temperatura. Para el segundo, se usó el medio de cultivo Levadura Lactosa Agar (LLA) (66. Thies JE, Singleton PW, Bohlool BB. Modeling symbiotic performance of introduced rhizobia in the field by use of indices of indigenous population size and nitrogen status of the soil. Applied and Environmental Microbiology [Internet]. 1991;57(1):29-37. doi:10.1128/aem.57.1.29-37.1991 ).

Para la caracterización fisiológico-bioquímica se ejecutaron diferentes pruebas, según las referencias de (77. Harrigan WF, McCance ME. Métodos de laboratorio en microbiología [Internet]. España: Academia; 1968. 426 p. Available from: https://biblioteca.epn.edu.ec/cgi-bin/koha/opac-detail.pl?biblionumber=39933 ). En todos los casos, se partió de la inoculación con un cultivo de 24 horas en medio LMA con Rojo Congo (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ). Se incubó durante dos a cinco días a una temperatura de 28-30 °C y se realizaron las pruebas por triplicado. Las pruebas incluyeron presencia de las enzimas citocromo oxidasa y catalasa, hidrólisis del almidón, gelatina y caseína, utilización de citrato como fuente de carbono, producción de indol a partir de triptófano, fermentación de la glucosa, utilización de azufre y motilidad, esta última por el método de la gota colgante. Además, se determinó la capacidad de los aislados para degradar celulosa, para lo que se utilizó un medio de cultivo suplementado con 10 g de celulosa cristalina, en el que se inocularon los microorganismos. Se consideró positiva la prueba al presentarse una zona traslúcida alrededor del crecimiento bacteriano.

Evaluación de la tolerancia de los aislados a diferentes valores de pH y temperatura

El medio de cultivo líquido LM (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) se ajustó a diferentes valores de pH (3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9 y 9,5) con HCl o NaOH 1N. En todos los casos, se inocularon los aislados de forma independiente y se colocaron en un agitador orbital a 200 r.p.m, durante 48 horas, a una temperatura de 28-30 °C. Se tomó como criterio positivo el crecimiento visible por turbidez en el medio de cultivo y como negativo, la ausencia de crecimiento por transparencia del medio. Para determinar la tolerancia a diferentes temperaturas se utilizó el medio de cultivo LMA, donde se sembraron los aislados mediante una estría central y posteriormente se incubaron a 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 ºC de temperatura. Se consideró positiva la prueba al crecer el microorganismo y negativa ante la ausencia de crecimiento. En ambas determinaciones, los aislados se inocularon a partir de un cultivo joven de 24 horas en el medio de cultivo LMA con Rojo Congo y se incubaron durante dos a cinco días a una temperatura de 28-30 °C. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Caracterización morfo-fisiológica y bioquímica de los aislados

La morfología de los aislados purificados desde los nódulos de las diferentes variedades de garbanzo fue heterogénea y se pudieron identificar tres tipos de morfología celular, con predominio de la forma cocobacilar. El grupo más representativo, con un 24 % de aislados, correspondió a cocobacilos esporulados Gram positivos; mientras que el grupo más pequeño (15 % de los aislados) perteneció a los cocobacilos no esporulados Gram negativos (Tabla 1), morfología que se corresponde con la de los rizobios (5). Estos microorganismos fueron seleccionados para su posterior caracterización.

Todos los aislados mostraron colonias pequeñas o medianas, de coloración translúcida, blanquecina o ligeramente rosada en el centro, sin absorción de Rojo Congo y con la mucosidad típica de los rizobios.

De los 11 aislados seleccionados, nueve se caracterizaron por presentar colonias de 1 mm de diámetro y, sólo dos formaron colonias de 4 mm. Todas las colonias fueron circulares, convexas y mucilaginosas, cuatro presentaron una coloración beige, tres blancas, dos blanquecinas o ligeramente rosadas en el centro y dos translúcidas, aspectos que coinciden con los descritos para la familia de los rizobios (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ). De ellos, 8 se obtuvieron de la variedad Nacional-29, y los otros 3 correspondieron a los cultivares Nacional-6, Nacional 5HA y JP-94. En cuanto a la velocidad de crecimiento, siete de los aislados crecieron entre 2 y 3 días, mientras que los otros cuatro aislados se multiplicaron entre 7 y 9 días. Los 11 aislados produjeron ácidos en el medio de cultivo y mostraron un resultado negativo para la producción de cetolactasa.

En los últimos años, se ha demostrado que en los nódulos de las leguminosas conviven, junto a los rizobios, poblaciones de bacterias de la zona rizosférica que no tienen la capacidad de formar estas estructuras (1010. Velázquez E, García-Fraile P, Ramírez-Bahena M-H, Rivas R, Martínez-Molina E. Current Status of the Taxonomy of Bacteria Able to Establish Nitrogen-Fixing Legume Symbiosis. In: Zaidi A, Khan MS, Musarrat J, editors. Microbes for Legume Improvement [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2017 [cited 2024 Feb 6]. p. 1-43. doi:10.1007/978-3-319-59174-2_1 ). Para el caso del garbanzo, aunque en la mayoría de los estudios se relaciona el género Mesorhizobium como el más representativo, se ha descrito la presencia de nuevos géneros vinculados a este cultivo, como Achromobacter xylosoxidans, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis (1111. Egamberdieva D, Wirth SJ, Shurigin VV, Hashem A, Abd_Allah EF. Endophytic Bacteria Improve Plant Growth, Symbiotic Performance of Chickpea (Cicer arietinum L.) and Induce Suppression of Root Rot Caused by Fusarium solani under Salt Stress. Frontiers in Microbiology [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];8:1887. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2017.01887 ), Burkholderia andropogonis y Ochrobactrum ciceri (1212. Sahgal M, Jaggi V. Rhizobia: Culture Collections, Identification, and Methods of Preservation. In: Sharma SK, Varma A, editors. Microbial Resource Conservation: Conventional to Modern Approaches [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2018 [cited 2024 Feb 6]. p. 175-97. (Soil Biology). doi:10.1007/978-3-319-96971-8_6 ), entre otros. Estos resultados demuestran que es posible en los aislamientos iniciales purificar microorganismos que no pertenezcan necesariamente al grupo de los rizobios, tal y como sucedió en la presente investigación.

Las distintas velocidades de crecimiento que mostraron los 11 aislados seleccionados permitieron categorizar siete con crecimiento rápido (2-3 días), los que podrían ser miembros de la familia Rhizobiaceae, donde se incluyen los géneros Ensifer, Rhizobium y Shinella; mientras que los cuatro restantes se incluyen dentro del grupo de crecimiento lento (4- 7días), donde se incluye el género Bradyrhizobium (1010. Velázquez E, García-Fraile P, Ramírez-Bahena M-H, Rivas R, Martínez-Molina E. Current Status of the Taxonomy of Bacteria Able to Establish Nitrogen-Fixing Legume Symbiosis. In: Zaidi A, Khan MS, Musarrat J, editors. Microbes for Legume Improvement [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2017 [cited 2024 Feb 6]. p. 1-43. doi:10.1007/978-3-319-59174-2_1 ). La producción de ácido en el medio de cultivo y la respuesta negativa para la prueba de cetolactosa ratifica para estos 11 microorganismos su categorización dentro de la familia Rhizobiaceae (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ).

Los 11 aislados seleccionados como rizobios presentaron una respuesta positiva a las pruebas de oxidasa, catalasa, hidrólisis de caseína, utilización de citrato y motilidad; y negativa a la hidrólisis de almidón y de gelatina, la producción de indol a partir del triptófano, el uso de azufre a partir del crecimiento en medio Kliger y la degradación de la celulosa. Sin embargo, mostraron diferencias en cuanto a la fermentación de azúcares, determinada por las pruebas de Rojo Metilo y Vogues Proskauer, ya que siete de ellos (R1, R2, R3, R8, R19, R27 y R29) fermentaron la glucosa, mientras que cuatro (R1N, R9, R13 y R17) no lo hicieron (Tabla 2).

Los rizobios se describen, en el Manual de Sistemática para Bacterias (1313. American Society for Microbiology., Microbiology AS for, Bergey DH, Breed RS. Bergey’s manual of determinative bacteriology [Internet]. 7th ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co; 1957. 1130 p. doi:10.5962/bhl.title.10728 ), como bacterias con respuesta positiva frente a la prueba de la catalasa y la oxidasa, que no hidrolizan almidón ni gelatina y si caseína, utilizan citrato como fuente de carbono y tienen una respuesta negativa en el medio Kliger (1414. Singha B, Mazumder PB, Pandey P. Characterization of Plant Growth Promoting Rhizobia from Root Nodule of Two Legume Species Cultivated in Assam, India. Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B: Biological Sciences [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];88(3):1007-16. doi:10.1007/s40011-016-0836-6 ) y a la producción de indol a partir del triptófano (1515. Ojuederie OB, Olanrewaju OS, Babalola OO. Plant growth promoting rhizobacterial mitigation of drought stress in crop plants: Implications for Sustainable Agriculture. Agronomy [Internet]. 2019 [cited 2024 Feb 6];9(11):712. doi:10.3390/agronomy9110712 ), con cepas que utilizan glucosa como fuente de carbono. Estas características son similares a los que presentaron los once aislados seleccionados. Por lo tanto, la caracterización fisiológica realizada también refuerza su inclusión dentro del grupo de los rizobios.

Evaluación de la tolerancia de los aislados a diferentes valores de pH y temperatura

Ninguno de los 11 aislados creció a pH entre 3 y 5, ni a pH 9,5, mientras que el resto de los valores si mostraron diferencias entre los microorganismos; en tanto, a valores de pH entre 6,0 y 7,0 crecieron todos los aislados, a pH 5,5 solamente lo hicieron los aislados R1, R2, R3 y R19. Cuando el medio de cultivo presentó un pH 7,5, la mayor parte de los microorganismos mostró un crecimiento positivo, a excepción del aislado R8; pero valores superiores (pH entre 8,5 y 9,0), afectaron el crecimiento, aunque se puede destacar que R1, R2 y R3 presentaron una mayor tolerancia y, particularmente, el aislado R3, fue el único que creció cuando el medio de cultivo presentó un pH de 9,0 (Tabla 3).

La mayoría de los rizobios crecen en valores de pH cercanos a la neutralidad (1616. Andrews M, Andrews ME. Specificity in Legume-Rhizobia Symbioses. International Journal of Molecular Sciences [Internet]. 2017;18(4):705. doi:10.3390/ijms18040705 , 1717. Hussain HA, Hussain S, Khaliq A, Ashraf U, Anjum SA, Men S, et al. Chilling and Drought Stresses in Crop Plants: Implications, Cross Talk, and Potential Management Opportunities. Frontiers in Plant Science [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];9:1-21. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2018.00393 ). Sin embargo, se ha demostrado que algunas cepas de esta familia pueden tolerar rangos desde 3,5 hasta 9 (1818. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, et al. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];38(4):39-49. Available from: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401 ).

Los aislados R1, R2 y R3 fueron capaces de crecer a pH 5,5 y también a valores de 8,5; lo que sugiere la presencia de mecanismos de adaptación que le permiten sobrevivir en estas condiciones (1919. Rodiño AP, Riveiro M, De Ron AM. Implications of the Symbiotic Nitrogen Fixation in Common Bean under Seasonal Water Stress. Agronomy [Internet]. 2021 [cited 2024 Feb 6];11(1):70. doi:10.3390/agronomy11010070 ), aspecto que constituye una ventaja para el uso en la práctica de este microorganismo como principio activo de un biofertilizante para beneficiar al cultivo del garbanzo, ya que, de mantenerse su efecto estimulador del crecimiento en las diferentes condiciones de acidez, podría utilizarse en distintos tipos de suelo y en diferentes agroecosistemas. Una posible explicación de la tolerancia a la acidez o alcalinidad se basa en la capacidad del microsimbionte para mantener el pH interno cerca de la neutralidad, lo que podría estar relacionado con la exclusión de protones, el aumento en la capacidad del tampón citoplasmático o el mantenimiento de altas concentraciones de potasio y glutamato (2020. Dhull S, Gera R, Sheoran HS, Kakar R. Phosphate Solubilization Activity of Rhizobial Strains Isolated From Root Nodule of Cluster Bean Plant Native to Indian Soils. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];7(04):255-66. doi:10.20546/ijcmas.2018.704.029 ).

Ninguno de los 11 aislados creció a 25 y 27 ^oC, ni tampoco a 40 ^oC. Sin embargo, a partir de 30 ^oC y hasta 35 ^oC, se desarrollaron bien todos los microorganismos y entre 28 y 36 ^oC crecieron entre el 63 y el 82 % de los aislados, lo que pudiera estar relacionado con su procedencia de plantas cultivadas en las condiciones edafoclimáticas de Cuba, donde la temperatura oscila entre 28 y 35 ºC. Se destacaron los aislados R1, R2 y R3 por su crecimiento a altas temperaturas, ya que toleraron rangos desde 29 hasta 38 ^oC y, particularmente R3, único aislado que creció a los 39 ^oC de temperatura (Tabla 4).

Según varios autores, los rizobios pueden crecer a temperaturas entre 28-30 °C (1919. Rodiño AP, Riveiro M, De Ron AM. Implications of the Symbiotic Nitrogen Fixation in Common Bean under Seasonal Water Stress. Agronomy [Internet]. 2021 [cited 2024 Feb 6];11(1):70. doi:10.3390/agronomy11010070 ). Otras investigaciones han arrojado resultados similares a los alcanzados en el presente estudio, e incluso superiores, donde aislados de nódulos de Vigna unguiculata toleraron hasta 45 ^oC (1818. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, et al. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];38(4):39-49. Available from: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401 ), resultados que sugieren una adaptación a las altas temperaturas características de las áreas de procedencia.

La tolerancia de algunas cepas a diferentes pH y temperaturas puede favorecer su multiplicación en la rizosfera y contribuir a una mayor colonización de la especie, y con ello, a su éxito como bacteria promotora del crecimiento vegetal. Referente a ello, autores como (2121. Velazquez E, Carro L, Flores-Felix JD, Menendez E, Ramirez-Bahena MH, Peix A. Bacteria-inducing legume nodules involved in the improvement of plant growth, health and nutrition. Microbiome in Plant Health and Disease: Challenges and Opportunities. 2019 [cited 2024 Feb 6]; doi:10.1007/978-981-13-8495-0_4 , 2222. Lebrazi S, Fadil M, Chraibi M, Fikri-Benbrahim K. Screening and optimization of indole-3-acetic acid production by Rhizobium sp. strain using response surface methodology. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology [Internet]. 2020 [cited 2024 Feb 6];18(1):21. doi:10.1186/s43141-020-00035-9 ) señalaron que estos factores de supervivencia, persistencia y competitividad, le confieren a los rizobios mayores posibilidades de sobrevivir y competir con otras bacterias del suelo, lo que favorece la colonización de las raíces de las leguminosas y la fijación de nitrógeno atmosférico.

Isolation of isolates

The isolation of possible rhizobia was carried out in 43 sites, from nodules coming from five healthy and vigorous plants of seven chickpea cultivars (Nacional-6, Nacional-24, Nacional-27, Nacional-29, Nacional-30, PJ-94 and Jamu-96), at the flowering stage. The plants were distributed in different productive scenarios in nine provinces of the country (Pinar del Rio, Havana, Artemisa, Mayabeque, Santi Spíritus, Cienfuegos, Granma, Las Tunas and Guantánamo) and on four types of soils (Alitic, Ferrallitic, Fersialitic and Sialitic).

Once the nodules were removed from the plants, they were disinfected in a 5 % sodium hypochlorite solution and rinsed twice with sterile distilled water. Subsequently, they were placed in test tubes containing 15 mL of sterile distilled water and macerated. Each extract was inoculated into the culture medium Yeast Mannitol Agar (YMA) with Congo Red (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) and the plates were incubated at 28-30 °C temperature, for 72 hours. The purification of the microorganisms was carried out in this same culture medium.

Morpho-physiological and biochemical characterization of the isolates

Colony morphology, size and borders were determined by observation under a Leica KL 300 LED stereo microscope (3X), while microscopic and staining characterization was performed by Gram staining (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ) and observation under an optical microscope (Leica DM300 (1,000 X magnification)).

The production of acids or bases by the isolates and the production of ketolactase were also evaluated. In the first case, YMA culture medium (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) with bromothymol blue was used and incubation was carried out for seven days at 28-30 °C temperature. For the second, the culture medium Yeast Lactose Agar (YLA) (66. Thies JE, Singleton PW, Bohlool BB. Modeling symbiotic performance of introduced rhizobia in the field by use of indices of indigenous population size and nitrogen status of the soil. Applied and Environmental Microbiology [Internet]. 1991;57(1):29-37. doi:10.1128/aem.57.1.29-37.1991 ) was used.

For the physiological-biochemical characterization, different tests were performed, (77. Harrigan WF, McCance ME. Métodos de laboratorio en microbiología [Internet]. España: Academia; 1968. 426 p. Available from: https://biblioteca.epn.edu.ec/cgi-bin/koha/opac-detail.pl?biblionumber=39933 ). In all cases, the starting point was inoculation with a 24-hour culture in YMA medium with Congo Red (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ). It was incubated for two to five days at a temperature of 28-30 °C and tests were performed in triplicate. Tests included presence of cytochrome oxidase and catalase enzymes, hydrolysis of starch, gelatin and casein, utilization of citrate as a carbon source, indole production from tryptophan, glucose fermentation, sulfur utilization and motility, the latter by the hanging drop method. In addition, the ability of the isolates to degrade cellulose was determined using a culture medium supplemented with 10 g of crystalline cellulose, in which the microorganisms were inoculated. The test was considered positive when a translucent zone was present around the bacterial growth.

Evaluation of the tolerance of the isolates to different pH and temperature values

The LM liquid culture medium (44. Vincent JM. A manual for the practical study of root-nodule bacteria [Internet]. . International Biological Programme. London; 1970. 164 p. Available from: https://www.amazon.com/manual-practical-root-nodule-bacteria-handbook/dp/0632064102 ) was adjusted to different pH values (3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8; 8.5; 9 and 9.5) with HCl or NaOH 1N. In all cases, the isolates were inoculated independently and placed on an orbital shaker at 200 rpm for 48 hours at a temperature of 28-30 °C. Visible growth due to turbidity in the culture medium was taken as a positive criterion and absence of growth due to transparency of the medium as a negative criterion. To determine tolerance to different temperatures, YMA culture medium was used, where the isolates were seeded through a central streak and subsequently incubated at 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and 40 ºC temperature. The test was considered positive when the microorganism grew and negative in the absence of growth. In both determinations, the isolates were inoculated from a 24-hour young culture in YMA culture medium with Congo Red and incubated for two to five days at a temperature of 28-30 °C. The assays were performed in triplicate.

Morpho-physiological and biochemical characterization of isolates

The morphology of the isolates purified from the nodules of the different chickpea varieties was heterogeneous and three types of cell morphology could be identified, with a predominance of the coccobacillary form. The most representative group, with 24 % of isolates, corresponded to Gram-positive sporulated coccobacilli; while the smallest group (15 % of isolates) belonged to Gram-negative non-sporulated coccobacilli (Table 1), a morphology that corresponds to that of rhizobia (5). These microorganisms were selected for further characterization.

All isolates showed small to medium-sized colonies, with translucent, whitish or slightly pinkish coloration in the center, without Congo Red absorption and with the mucus typical of rhizobia.

From 11 isolates selected, nine were characterized by colonies of 1 mm in diameter and only two colonies of 4 mm formed. All the colonies were circular, convex and mucilaginous, four presented a beige coloration, three were white, two were whitish or slightly pink in the center and two were translucent, aspects that coincide with those described for the rhizobium family (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ). Of these, 8 were obtained from the variety Nacional-29, and the other 3 corresponded to the cultivars Nacional-6, Nacional 5HA and JP-94. In terms of growth rate, seven of the isolates grew between 2 and 3 days, while the other four isolates multiplied between 7 and 9 days. All 11 isolates produced acids in the culture medium and showed a negative result for ketolactase production.

In recent years, it has been shown that populations of bacteria from the rhizobial zone, which do not have the ability to form these structures, coexist with rhizobia in legume nodules (1010. Velázquez E, García-Fraile P, Ramírez-Bahena M-H, Rivas R, Martínez-Molina E. Current Status of the Taxonomy of Bacteria Able to Establish Nitrogen-Fixing Legume Symbiosis. In: Zaidi A, Khan MS, Musarrat J, editors. Microbes for Legume Improvement [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2017 [cited 2024 Feb 6]. p. 1-43. doi:10.1007/978-3-319-59174-2_1 ). In the case of chickpea, although most studies relate the genus Mesorhizobium as the most representative, the presence of new genera linked to this crop has been described, such as Achromobacter xylosoxidans, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis (1111. Egamberdieva D, Wirth SJ, Shurigin VV, Hashem A, Abd_Allah EF. Endophytic Bacteria Improve Plant Growth, Symbiotic Performance of Chickpea (Cicer arietinum L.) and Induce Suppression of Root Rot Caused by Fusarium solani under Salt Stress. Frontiers in Microbiology [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];8:1887. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2017.01887 ), Burkholderia andropogonis and Ochrobactrum ciceri (1212. Sahgal M, Jaggi V. Rhizobia: Culture Collections, Identification, and Methods of Preservation. In: Sharma SK, Varma A, editors. Microbial Resource Conservation: Conventional to Modern Approaches [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2018 [cited 2024 Feb 6]. p. 175-97. (Soil Biology). doi:10.1007/978-3-319-96971-8_6 ), among others. These results demonstrate that it is possible in the initial isolates to purify microorganisms that do not necessarily belong to the rhizobia group, as was the case in the present investigation.

The different growth rates shown by the 11 selected isolates allowed categorizing seven with rapid growth (2-3 days), which could be members of the Rhizobiaceae family, where the genera Ensifer, Rhizobium and Shinella are included; while the remaining four are included within the slow growth group (4- 7days), where the genus Bradyrhizobium is included (1010. Velázquez E, García-Fraile P, Ramírez-Bahena M-H, Rivas R, Martínez-Molina E. Current Status of the Taxonomy of Bacteria Able to Establish Nitrogen-Fixing Legume Symbiosis. In: Zaidi A, Khan MS, Musarrat J, editors. Microbes for Legume Improvement [Internet]. Cham: Springer International Publishing; 2017 [cited 2024 Feb 6]. p. 1-43. doi:10.1007/978-3-319-59174-2_1 ). The production of acid in the culture medium and the negative response to the ketolactose test ratify for these 11 microorganisms their categorization within the Rhizobiaceae family (55. Madigan M, Bender K, Buckley D, Sattley W, Stahl D. Brock Biology of Microorganisms [Internet]. NY, U.S.A; 2017. 1056 p. Available from: https://www.amazon.com/Brock-Biology-Microorganisms-Michael-Madigan/dp/0134261925 ).

The 11 isolates selected as rhizobia presented a positive response to the oxidase, catalase, casein hydrolysis, citrate utilization and motility tests; and negative to starch and gelatin hydrolysis, indole production from tryptophan, sulfur utilization from growth in Kliger medium and cellulose degradation. However, they showed differences in sugar fermentation as determined by Methyl Red and Vogues Proskauer tests, as seven of them (R1, R2, R3, R8, R19, R27 and R29) fermented glucose, while four (R1N, R9, R13 and R17) did not (Table 2).

Rhizobia are described in the Manual of Systematics for Bacteria (1313. American Society for Microbiology., Microbiology AS for, Bergey DH, Breed RS. Bergey’s manual of determinative bacteriology [Internet]. 7th ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co; 1957. 1130 p. doi:10.5962/bhl.title.10728 ) as bacteria with a positive response to the catalase and oxidase test, that do not hydrolyze starch or gelatin but casein, use citrate as a carbon source and have a negative response in the Kliger medium (1414. Singha B, Mazumder PB, Pandey P. Characterization of Plant Growth Promoting Rhizobia from Root Nodule of Two Legume Species Cultivated in Assam, India. Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B: Biological Sciences [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];88(3):1007-16. doi:10.1007/s40011-016-0836-6 ) and to the production of indole from tryptophan (1515. Ojuederie OB, Olanrewaju OS, Babalola OO. Plant growth promoting rhizobacterial mitigation of drought stress in crop plants: Implications for Sustainable Agriculture. Agronomy [Internet]. 2019 [cited 2024 Feb 6];9(11):712. doi:10.3390/agronomy9110712 ), with strains that use glucose as a carbon source. These characteristics are similar to those exhibited by the eleven selected isolates. Therefore, the physiological characterization performed also reinforces their inclusion within the rhizobial group.

Evaluation of the tolerance of the isolates to different pH and temperature values

None of the 11 isolates grew at pH between 3 and 5, nor at pH 9.5, while the rest of the values did show differences among the microorganisms; meanwhile, at pH values between 6.0 and 7.0 all the isolates grew, while at pH 5.5 only isolates R1, R2, R3 and R19 grew. When the culture medium had a pH of 7.5, most of the microorganisms showed positive growth, with the exception of isolate R8; but higher values (pH between 8.5 and 9.0) affected growth, although it should be noted that R1, R2 and R3 showed greater tolerance and, particularly, isolate R3 was the only one that grew when the culture medium had a pH of 9.0 (Table 3).

Most rhizobia grow at pH values close to neutral (1616. Andrews M, Andrews ME. Specificity in Legume-Rhizobia Symbioses. International Journal of Molecular Sciences [Internet]. 2017;18(4):705. doi:10.3390/ijms18040705 , 1717. Hussain HA, Hussain S, Khaliq A, Ashraf U, Anjum SA, Men S, et al. Chilling and Drought Stresses in Crop Plants: Implications, Cross Talk, and Potential Management Opportunities. Frontiers in Plant Science [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];9:1-21. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2018.00393 ). However, it has been shown that some strains of this family can tolerate ranges from 3.5 to 9 (1818. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, et al. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];38(4):39-49. Available from: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401 ).

Isolates R1, R2 and R3 were able to grow at pH 5.5 and also at values of 8.5; which suggests the presence of adaptation mechanisms that allow it to survive in these conditions (1919. Rodiño AP, Riveiro M, De Ron AM. Implications of the Symbiotic Nitrogen Fixation in Common Bean under Seasonal Water Stress. Agronomy [Internet]. 2021 [cited 2024 Feb 6];11(1):70. doi:10.3390/agronomy11010070 ), an aspect that constitutes an advantage for the practical use of this microorganism as the active principle of a biofertilizer to benefit the chickpea crop, since, if its growth stimulating effect is maintained in the different acidity conditions, it could be used in different types of soil and in different agroecosystems. A possible explanation for the tolerance to acidity or alkalinity is based on the ability of the microsymbiont to maintain internal pH close to neutrality, which could be related to proton exclusion, increased cytoplasmic buffer capacity, or maintenance of high potassium and glutamate concentrations (2020. Dhull S, Gera R, Sheoran HS, Kakar R. Phosphate Solubilization Activity of Rhizobial Strains Isolated From Root Nodule of Cluster Bean Plant Native to Indian Soils. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences [Internet]. 2018 [cited 2024 Feb 6];7(04):255-66. doi:10.20546/ijcmas.2018.704.029 ).

None of the 11 isolates grew at 25 and 27 ºC, nor did they grow at 40 ºC. However, from 30 ºC to 35 ºC, all the microorganisms developed well and between 28 and 36 ºC between 63 and 82 % of the isolates grew, which could be related to their origin from plants cultivated in the edaphoclimatic conditions of Cuba, where the temperature oscillates between 28 and 35 ºC. Isolates R1, R2 and R3 stood out for their growth at high temperatures, since they tolerated ranges from 29 to 38 ºC and, particularly R3, the only isolate that grew at 39 ºC (Table 4).

According to several authors, rhizobia can grow at temperatures between 28-30 °C (1919. Rodiño AP, Riveiro M, De Ron AM. Implications of the Symbiotic Nitrogen Fixation in Common Bean under Seasonal Water Stress. Agronomy [Internet]. 2021 [cited 2024 Feb 6];11(1):70. doi:10.3390/agronomy11010070 ). Other investigations have yielded results similar to those achieved in the present study, and even higher, where isolates from nodules of Vigna unguiculata tolerated up to 45 ºC (1818. Padilla EG, Ruiz-Díez B, Fajardo S, Eichler-Loebermann B, Samson R, Damme PV, et al. Caracterización de rizobios aislados de nódulos de frijol caupí, en suelos salinos de Cuba. Cultivos Tropicales [Internet]. 2017 [cited 2024 Feb 6];38(4):39-49. Available from: https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1401 ), results that suggest an adaptation to the high temperatures characteristic of the areas of origin.

The tolerance of some strains to different pH and temperatures can favor their multiplication in the rhizosphere and contribute to a greater colonization of the species, and with this, to its success as a plant growth promoting bacterium. In this regard, authors such as (2121. Velazquez E, Carro L, Flores-Felix JD, Menendez E, Ramirez-Bahena MH, Peix A. Bacteria-inducing legume nodules involved in the improvement of plant growth, health and nutrition. Microbiome in Plant Health and Disease: Challenges and Opportunities. 2019 [cited 2024 Feb 6]; doi:10.1007/978-981-13-8495-0_4 , 2222. Lebrazi S, Fadil M, Chraibi M, Fikri-Benbrahim K. Screening and optimization of indole-3-acetic acid production by Rhizobium sp. strain using response surface methodology. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology [Internet]. 2020 [cited 2024 Feb 6];18(1):21. doi:10.1186/s43141-020-00035-9 ) pointed out that these factors of survival, persistence and competitiveness give rhizobia greater possibilities of surviving and competing with other soil bacteria, which enhances the colonization of legume roots and the fixation of atmospheric nitrogen.