Características de las semillas de araçá-boi (Eugenia stipitata McVaugh)

La semilla de araçá-boi tiene una cubierta delgada y coriácea. Su superficie exterior es de color marrón oscuro, con aspecto de piel de ante. Internamente, la cubierta de la semilla es lisa y de color marrón claro. En cuanto a la forma, puede ser reniforme, aplanada, discoidal, con mayor longitud que anchura o viceversa, casi esférica, pero la morfología predominante es reniforme con aplanamiento lateral (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.).

La semilla es ex-albuminosa, amilácea y paquicalazal, con una cubierta de estructura compleja impregnada de sustancias fenólicas. El paquicalazal es una estructura importante para las semillas recalcitrantes, ya que está relacionado con estrategias micromorfológicas para neutralizar la pérdida de agua, asegurando así el contenido de agua en el embrión, que es eugenioide y tiene un eje embrionario indiferenciado, por lo que es pseudomonocotiledónea (1414. Mendes AMS, Mendonça MS. Análise anatômica e histoquímica de sementes maduras de Eugenia stipitata ssp. sororia Mc Vaugh (araçá-boi) - Myrtaceae. Brazilian Journal of Development. 2020;6(10):77510-77522. doi: 10.34117/bjdv6n10-251.).

En general, se han conseguido muchos avances con las semillas de araçá-boi, como: el potencial de regeneración de embriones cuando se suprime parte de sus tejidos, lo que puede proporcionar nuevas plántulas completas (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.) y diferencias en los límites de tolerancia a la desecación y al almacenamiento (1515. Kohama S, Maluf AM, Bilia DAC, Barbedo CJ. Secagem e armazenamento de sementes de Eugenia brasiliensis Lam. (grumixameira). Revista Brasileira de Sementes. 2006;28:72-78. doi: 10.1590/S0101-31222006000100010.).

Aspecto germinativo del araçá-boi

Las semillas del género Eugenia son conocidas por su intolerancia a la desecación (recalcitrantes) y su resistente cubierta seminal, que tras la desecación se vuelve resistente a la ruptura por el embrión, lo que provoca un retraso en la germinación (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.).

La latencia de las semillas de araçá-boi puede deberse a la presencia de sustancias químicas inhibidoras de la germinación, como el ácido abscísico y los compuestos fenólicos. Siendo sugerida la lixiviación como método para superar la dormancia causada por estos inhibidores. Por otro lado, el fraccionamiento de semillas, puede desencadenar el equilibrio entre producción y eliminación de especies reactivas de oxígeno (peróxido de hidrógeno y oxígeno singlete), que promueven procesos biológicos que favorecen la emergencia de raíces, lo que actúa como un signo positivo en la superación de la dormancia (1616. Amorim IP, Silva JPN, Barbedo CJ. As sementes de Eugenia spp. (Myrtaceae) e seus novos conceitos sobre propagação. Hoehnea. 2020;47:e292020. doi: 10.1590/2236-8906-29/2020.).

Aunque el ensayo de germinación es el estándar realizado en el laboratorio, puede requerir mucho tiempo, dependiendo de la especie analizada, y el retraso en la obtención de la germinación conlleva una seria limitación en el proceso de toma de decisiones en la industria semillera; para E. stipitate, el ensayo de emergencia dura alrededor de 180 días después de la siembra (44. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instruções para análise de sementes de espécies florestais. 2013Available from: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/insumos-agropecuarios/insumos-agricolas/sementes-e-mudas/publicacoes-sementes-e-mudas/instrucoes-para-analise-de-sementes-de-especies-florestais/view.).

Estos hechos obligan a la investigación científica a buscar metodologías prometedoras para la germinación de semillas de especies nativas, que permitan la producción a gran escala de plántulas de araçá-boi a través de semillas (1717. Smiderle OJ, Sousa RCP. Dormência em sementes de paricarana (Bowdichia virgilioides Kunth - Fabaceae - Papilionidae). Revista Brasileira de Sementes. 2003;25(2):48-52. doi: 10.1590/S0101-31222003000100012.). Por lo tanto, el uso de la prueba de tetrazolio puede optimizar la predicción de la viabilidad fisiológica de las semillas de las especies en estudio.

Prueba del tetrazolio y su importancia

La evaluación rápida del potencial fisiológico de las semillas es importante para que los agricultores, los investigadores y las empresas utilicen sus recursos de forma racional. En ese sentido, se han utilizado diferentes procedimientos para evaluar la viabilidad de las semillas en la identificación de lotes con alto o bajo vigor (1818. Rodrigues MHBS, da Silva Santos A, de Melo EN, Da Silva JN, Oliveira CJA. Vigor de sementes: métodos para análise e fatores que o influenciam. Meio Ambiente (Brasil). 2020;2(3). Available from: https://meioambientebrasil.com.br/index.php/ MABRA/article/ view/53., 1919. França Neto JB, Henning AA, Krzyzanowski FC, Lorini I. DIACOM: 35 anos de capacitação nos testes de tetrazólio e Patologia de sementes de soja. 2015. Available from: https://seednews.com.br/artigos/1381-35-anos-de-capacitacao-nos-testes-de-tetrazolio-e-patologia-de-sementes-de-soja-edicao-setembro-2015.). Entre ellos, la prueba de tetrazolio se destaca por generar resultados promisorios para determinar la viabilidad de semillas de cultivos frutales nativos. Esta prueba es relativamente sencilla, pero el precio de la sal es elevado, por lo que se recomiendan metodologías ajustadas para realizarla. En consecuencia, la prueba del tetrazolio se ha mostrado como una alternativa interesante debido a la calidad y rapidez en la determinación de la viabilidad y vigor de las semillas, permitiendo obtener resultados generalmente en menos de 24 horas (2020. Dias MCLL, Alves SJ. Avaliação da viabilidade de sementes de Panicum maximum Jacq pelo teste de tetrazólio. Revista Brasileira de Sementes. 2008;30(3):152-158. doi: 10.1590/S0101-31222008000300020.).

Fisiología de la prueba del tetrazolio

La prueba del tetrazolio se basa en la inmersión de semillas en una solución incolora de sal de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio, utilizada como indicador del proceso de reducción que tiene lugar en el interior de las células vivas. En este proceso, los iones H⁺ liberados durante la respiración de los tejidos vivos son transferidos por un grupo de enzimas, en particular la deshidrogenasa del ácido málico, e interactúan con la sal de tetrazolio, que se reduce a un compuesto rojo, estable y no difusible denominado trifenilformazán, lo que indica que existe actividad respiratoria y viabilidad celular del tejido (66. França Neto JDB, Krzyzanowski FC. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Soja. 1st ed. Londrina: Embrapa Soja; 2018, 108 p. Available from: https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/1098452/metodologia-do-teste-de-tetrazolio-em-sementes-de-soja.).

La formación de rojo carmín claro indica tejido viable, mientras que el rojo carmín intenso revela tejido deteriorado, en el caso de los tejidos en descomposición, liberan cantidades muy pequeñas de iones hidrógeno, insuficientes para la reacción con la sal de tetrazolio (2121. MARCOS FILHO J., 2015 - Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. - Londrina: ABRATES, 660. Available from: https://repositorio.usp.br/item/002724502.), por lo que no se producirá la reducción de la sal y el tejido muerto contrastará como blanco (66. França Neto JDB, Krzyzanowski FC. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Soja. 1st ed. Londrina: Embrapa Soja; 2018, 108 p. Available from: https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/1098452/metodologia-do-teste-de-tetrazolio-em-sementes-de-soja.).

Estas diferencias de tinción, observadas en las semillas después de someterlas a la solución de tetrazolio, son las principales características que deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados de las pruebas, además de si la intensidad de la tinción de las semillas varía entre especies (2222. Bento SRSO, Santos AEO, Melo DRM, Torres SB. Eficiência dos testes de vigor na avaliação da qualidade fisiológica de sementes de mulungu (Erythrina velutina WILLD.). Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(4):111-117. doi: 10.1590/S0101-31222010000400012.).

Ajuste de la prueba de tetrazolio

La eficacia de la prueba para evaluar la viabilidad y el vigor de las semillas está relacionada con la aplicación de metodologías ajustadas para cada especie, con el fin de definir las condiciones más apropiadas para la preparación (2323. Guedes RS, Alves EU, Gonçalves EP, Viana JS, Silva KB, Gomes MSS. Metodologia para teste de tetrazólio em sementes de Amburana cearensis (Allemão) A.C. Smith. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2010;12(1):120-126. doi: 10.1590/S1516-05722010000100017.). Tal es el caso de algunas especies que necesitan pasar por etapas preparatorias antes de la inmersión en la solución de tetrazolio para que las semillas la absorban adecuadamente (2424. Costa CJ, Santos CP. Teste de tetrazólio em sementes de leucena. Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(2):66-72. doi: 10.1590/S0101-31222010000200008.). Así, el proceso de imbibición desencadena la actividad fisiológica de la semilla y facilita la eliminación de la cubierta de la semilla y la exposición del embrión al contacto con la solución utilizada (2525. Cunha MCL, Gomes IHRA. Viabilidade de sementes de Erythrina velutina Willd pelo teste de tetrazólio. Nativa. 2015;3(3):196-200. doi: 10.14583/2318-7670.v03n03a08.). Tras la imbibición, muchas especies requieren aún técnicas preparatorias, que implican la punción, el corte y/o la eliminación de la cubierta de la semilla (2424. Costa CJ, Santos CP. Teste de tetrazólio em sementes de leucena. Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(2):66-72. doi: 10.1590/S0101-31222010000200008.).

El seccionamiento longitudinal, seguido de la eliminación de la cubierta de la semilla, antes de la inmersión en la solución de tetrazolio, a pesar de ser una operación delicada y laboriosa, permite reducir el tiempo necesario para que las semillas adquieran la tinción (2626. Sarmento MB, Silva ACS, Villela FA, Santos KLD, Mattos LCP. Teste de tetrazólio para avaliação da qualidade fisiológica em sementes de goiabeira-serrana (Acca sellowiana O. Berg Burret). Revista Brasileira de Fruticultura. 2013;35(1):270-276. doi: 10.1590/S0100-29452013000100031.).

Por lo tanto, para la realización de la prueba de tetrazolio es indispensable realizar procedimientos para determinar el cebado y el corte de las semillas antes de someterlas a la sal de tetrazolio, así como la tinción, variando la concentración de la solución de sal de tetrazolio, el tiempo y la temperatura de cebado, que se determinan para cada especie (99. Lamarca EV, Barbedo CJ. Methodology of the tetrazolium test for assessing the viability of seeds of Eugenia brasiliensis Lam., Eugenia uniflora L. and Eugenia pyriformis Cambess. Journal of Seed Science. 2014;36(4):427-434. doi: 10.1590/2317-1545v36n41029., 2121. MARCOS FILHO J., 2015 - Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. - Londrina: ABRATES, 660. Available from: https://repositorio.usp.br/item/002724502., 2323. Guedes RS, Alves EU, Gonçalves EP, Viana JS, Silva KB, Gomes MSS. Metodologia para teste de tetrazólio em sementes de Amburana cearensis (Allemão) A.C. Smith. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2010;12(1):120-126. doi: 10.1590/S1516-05722010000100017.).

En algunas especies, para obtener resultados satisfactorios de tinción por la sal de tetrazolio, es necesario realizar un cebado para mejorar la penetración de la solución en los tejidos de interés a evaluar, así como ajustes en la concentración de la solución de tetrazolio, tiempo y temperatura de cebado (2727. Zorzal TA, Fantinato DE, Campos LM, Luz ACC, Corte VB. Teste do tetrazólio para estimativa da viabilidade de sementes. Natureza on line. 2015;13(3):144-149. Available from: https://scholar.google.com.br/scholar?hl=pt-BR&as_sdt=0%2C5&q=Teste+do+tetra z%C3%B3lio+para+estimativa+da+viabilidade+de+sementes&btnG=.). La temperatura del aire contribuye a aumentar la viscosidad del agua, lo que acelera su absorción por la semilla en la fase I del patrón trifásico de germinación (2828. Carvalho SMC, Torres SB, Benedito CP, Nogueira NW, Souza AAT, Souza Neta MLD. Viability of Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz var. ferrea) seeds by tetrazolium test. Journal of Seed Science. 2017;39(1):7-12. doi: 10.1590/2317-1545v39n1163784.).

La elección del método adecuado debe basarse en la facilidad de identificación de tejidos viables e inviables y en la capacidad de diferenciar lotes con distintas cualidades fisiológicas (2929. Azerêdo GA, Paula RC, Valeri SV. Viabilidade de sementes de Piptadenia moniliformis Benth. pelo teste de tetrazólio. Revista Brasileira de Sementes. 2011;33(1):061-068. doi: 10.1590/S0101-31222011000100007.). En cuanto a la temperatura, el color de tinción debe desarrollarse entre 35 y 40 ºC, porque es más rápido, pero la prueba puede realizarse normalmente a temperaturas desde 20 a 40 ºC (3030. Añez LMM, Coelho MFB, Albuquerque MCF, Mendonça EAF, Dombroski JLD. Padronização da metodologia do teste de tetrazólio para sementes de Jatropha elliptica M. Arg. (Euphorbiaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2007;9(3):82-88. Available from: https://docplayer.com.br/68834449-Padronizacao-da-metodologia-do-teste-de-tetrazolio-para-sementes-de-jatropha-elliptica-m-arg-euphorbiaceae.html.).

Potencial de la prueba del tetrazolio en la viabilidad de las semillas de Eugenia spp

En la Tabla 1 se enumeran los mejores resultados de la prueba del tetrazolio y en la Figura 1 se muestran los resultados de la tinción de la prueba del tetrazolio en diferentes especies del género Eugenia.

Como se muestra en la Tabla 1 y en la Figura 1, a pesar de pertenecer al mismo género, las especies presentan diferencias entre las combinaciones ideales para el uso de la prueba de tetrazolio. Tales variaciones enfatizan la necesidad de adaptar la metodología de la prueba de tetrazolio para cada especie, ya que estos resultados pueden estar relacionados con la especificidad y la variación genética, la reducción del contenido de humedad durante el período de almacenamiento o el grado de madurez en el momento de la cosecha de los frutos, lo que puede alterar el equilibrio hormonal de las semillas (2626. Sarmento MB, Silva ACS, Villela FA, Santos KLD, Mattos LCP. Teste de tetrazólio para avaliação da qualidade fisiológica em sementes de goiabeira-serrana (Acca sellowiana O. Berg Burret). Revista Brasileira de Fruticultura. 2013;35(1):270-276. doi: 10.1590/S0100-29452013000100031.).

Influencia de los biorreguladores en el proceso de germinación de las semillas

Los biorreguladores del crecimiento, también llamados bioestimulantes o fitohormonas, contienen en su composición: aminoácidos, sustancias húmicas (ácidos húmicos y ácidos fúlvicos), hormonas del crecimiento vegetal, vitaminas y otros elementos diversos, y pueden contener sustancias orgánicas procedentes de extractos de algas (1111. Kolachevskaya OO, Sergeeva L, Floková K, Getman IA, Lomin SN, Alekseeva VV, et al. Auxin synthesis gene tms1 driven by tuberspecific promoter alters hormonal status of transgenic potato plants and their responses to exogenous phytohormones. Plant Cell Reports. 2017;36(2):419-435. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-016-2091-y.).

Los biorreguladores funcionan como activadores del metabolismo de las semillas y de las células vegetales, reactivan los procesos fisiológicos en diferentes fases de desarrollo y estimulan el crecimiento de las raíces (1212. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Fisiologia e Desenvolvimento Vegetal. 6st ed. Artmed Editora; 2017. 857 p. Available from: https://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=PpO4DQAAQBAJ&oi=fnd&pg=PR1&dq=Fisiologia+e+Desenvolvimento+Vegetal&ots=7RGgtRKUQf&sig=naVcej7-22XCsHGMurUkhQt-yFY#v=onepage&q=Fisiologia%20e%20Desenvolvimento%20Vegetal&f=false., 3131. Amaro HTR, Costa RC, Porto EMV, Araújo ECM, Fernandes HMF. Tratamento de sementes com produtos à base de fertilizantes e reguladores de crescimento. Pesquisa Agropecuária Gaúcha. 2020;26(1):222-242. doi: 10.36812/pag.2020261222-242.). Stimulate^® es un producto comercial conocido por contener tres hormonas vegetales en su composición, 0,009 % de kinetina, 0,005 % de ácido giberélico (GA₃) y 0,005 % de ácido indolil butírico (AIB), fitorreguladores como auxinas, giberelinas y citoquinas (3232. Smiderle OJ, Souza AG, Maia SS, Reis ND, Costa JS, Pereira GS. Do stimulate® and acadian® promote increased growth and physiological indices of Hymenaea courbaril seedlings?. Revista Brasileira de Fruticultura. 2022;44(2):e-872. doi: 10.1590/0100-29452022872.).

Las auxinas actúan, principalmente, en la regulación del crecimiento y promoción del enraizamiento de primordios radiculares, mientras que las giberelinas tienen como una de sus principales funciones la estimulación de la división y elongación celular, además de tener mayor influencia en el proceso de germinación, ya que tienen un efecto estimulante. Tanto en presencia como en ausencia de dormancia en la semilla, actúan en la activación del crecimiento vegetativo del embrión, movilización de las reservas del endospermo y debilitamiento de la capa de endospermo que rodea al embrión (1212. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Fisiologia e Desenvolvimento Vegetal. 6st ed. Artmed Editora; 2017. 857 p. Available from: https://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=PpO4DQAAQBAJ&oi=fnd&pg=PR1&dq=Fisiologia+e+Desenvolvimento+Vegetal&ots=7RGgtRKUQf&sig=naVcej7-22XCsHGMurUkhQt-yFY#v=onepage&q=Fisiologia%20e%20Desenvolvimento%20Vegetal&f=false.). A su vez, las citoquininas estimulan, principalmente, los procesos de división celular (citocinesis) (3333. Chrysargyris A, Xylia P, Anastasiou M, Pantelides I, Tzortzakis N. Effects of Ascophyllum nodosum seaweed extracts on lettuce growth, physiology and fresh‐cut salad storage under potassium deficiency. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2018;98(15):5861-5872. doi: 10.1002/jsfa.9139.).

La concentración ideal del producto comercial compuesto por kinetina, ácido giberélico y ácido indol butírico optimizó el porcentaje de emergencia en la especie Acacia mangium (3434. Carvalho JHN, Lima APL, Lima SF. Adição de moinha de carvão e de Stimulate^® na formação de mudas de Acacia mangium. Revista de Agricultura Neotropical. 2018;5(1):66-74. doi: 10.32404/rean.v5i1.2126.). En Hymenaea courbaril, la dosis de 2.0 ml L^-1 de regulador vegetal resultó en un incremento del 18 % en la altura de los brotes, comparado con el testigo a los 90 DDT; sin embargo, no promovió un incremento en la clorofila a y b (3232. Smiderle OJ, Souza AG, Maia SS, Reis ND, Costa JS, Pereira GS. Do stimulate® and acadian® promote increased growth and physiological indices of Hymenaea courbaril seedlings?. Revista Brasileira de Fruticultura. 2022;44(2):e-872. doi: 10.1590/0100-29452022872.). Concentraciones inadecuadas de biorreguladores vegetales pueden provocar deterioro por alteraciones fitosanitarias, fisiológicas, bioquímicas y citológicas en las semillas, culminando en baja emergencia o incluso muerte embrionaria (3535. Singh V, Sergeeva L, Ligterink W, Aloni R, Zemach H, Doron FA, Yang J, Zhang P, Shabtai S, Firon N. Gibberellin Promotes Sweetpotato Root Vascular Lignification and Reduces Storage-Root Formation Frontiers Plant Science. 2019;10(3):1320. doi: 10.3389/fpls.2019.01320.).

Sin embargo, existen pocos estudios con biorreguladores en semillas nativas de la Amazonia (3131. Amaro HTR, Costa RC, Porto EMV, Araújo ECM, Fernandes HMF. Tratamento de sementes com produtos à base de fertilizantes e reguladores de crescimento. Pesquisa Agropecuária Gaúcha. 2020;26(1):222-242. doi: 10.36812/pag.2020261222-242.), lo que puede ser un campo de estudio para mejorar el vigor de las plántulas, permitiendo la obtención de plántulas de calidad.

En vista de lo anterior, las especies del género Eugenia tienen potencial como cultivos frutales, siendo la semilla la principal vía de propagación. Además, el fraccionamiento de semillas de araçá-boi tiene la ventaja de homogeneizar la emergencia y mejorar las plantas en el vivero, resultando en un mejor rendimiento en el uso del material de propagación y en la calidad de las plántulas producidas.

Seed characteristics of araçá-boi (Eugenia stipitata McVaugh)

Araçá-boi seed has slender, coriaceous and thick seed coat. Its outer surface is dark brown, with a suede-leather appearance. Internally, the seed coat is smooth and light brown. In relation to shape, it can be reniform, flattened, discoidal, with length greater than width or vice versa, almost spherical, but the predominant morphology is reniform with lateral flattening (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.).

The seed is exalbuminous, starchy and pachychalazal, with a coat of complex structure impregnated with phenolic substances. Pachychalazal is an important structure for recalcitrant seeds, as it is related to micromorphological strategies to neutralize water loss, thus ensuring the water content in the embryo, which is eugenioid and has an undifferentiated embryonic axis, hence being pseudomonocotyledonous (1414. Mendes AMS, Mendonça MS. Análise anatômica e histoquímica de sementes maduras de Eugenia stipitata ssp. sororia Mc Vaugh (araçá-boi) - Myrtaceae. Brazilian Journal of Development. 2020;6(10):77510-77522. doi: 10.34117/bjdv6n10-251.).

In general, many advances have been achieved with araçá-boi seeds, such as: the potential for regeneration of embryos when part of their tissues are suppressed, which can provide new complete seedlings (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.), and differences in the limits of tolerance to desiccation and storage (1515. Kohama S, Maluf AM, Bilia DAC, Barbedo CJ. Secagem e armazenamento de sementes de Eugenia brasiliensis Lam. (grumixameira). Revista Brasileira de Sementes. 2006;28:72-78. doi: 10.1590/S0101-31222006000100010.).

Germination aspect of araçá-boi

Seeds of the genus Eugenia are known for their intolerance to desiccation (recalcitrant) and resistant seed coat, which after drying becomes resistant to rupture by the embryo, resulting in delayed germination (1313. Anjos AMG, Ferraz IDK. Morfologia, germinação e teor de água das sementes de araçá-boi (Eugenia stipitata ssp. sororia). Acta Amazonica. 1999;29:337-348. doi: 10.1590/1809-4392199929334.).

The dormancy of araçá-boi seeds may be due to the presence of germination-inhibiting chemicals such as abscisic acid and phenolic compounds. Being suggest leaching as a method for overcoming dormancy caused by these inhibitors. On the other hand, seed fractionation, can trigger the balance between production and elimination of reactive oxygen species (hydrogen peroxide and singlet oxygen), which promote biological processes that favor the emergence of roots, which acts as a positive sign in dormancy overcoming (1616. Amorim IP, Silva JPN, Barbedo CJ. As sementes de Eugenia spp. (Myrtaceae) e seus novos conceitos sobre propagação. Hoehnea. 2020;47:e292020. doi: 10.1590/2236-8906-29/2020.).

Although the germination test is the standard performed in the laboratory, it may be time consuming, depending on the species under analysis, and the delay in obtaining the germination leads to a serious limitation to the decision-making process in the seed industry; for E. stipitate, the emergence test lasts around 180 days after sowing (44. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instruções para análise de sementes de espécies florestais. 2013Available from: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/insumos-agropecuarios/insumos-agricolas/sementes-e-mudas/publicacoes-sementes-e-mudas/instrucoes-para-analise-de-sementes-de-especies-florestais/view.).

These facts require scientific research to search for promising methodologies for analysis of seeds of native species, which will enable large-scale production of araçá-boi seedlings via seeds (1717. Smiderle OJ, Sousa RCP. Dormência em sementes de paricarana (Bowdichia virgilioides Kunth - Fabaceae - Papilionidae). Revista Brasileira de Sementes. 2003;25(2):48-52. doi: 10.1590/S0101-31222003000100012.). Therefore, using the tetrazolium test can optimize the prediction of the physiological viability of seeds of the species under study.

Tetrazolium Test Importance of the tetrazolium test

Rapid evaluation of the physiological potential of seeds is important so that farmers, researchers and companies use their resources rationally. In that regard, different procedures for evaluating seed viability have been used in the identification of lots with high or low vigor (1818. Rodrigues MHBS, da Silva Santos A, de Melo EN, Da Silva JN, Oliveira CJA. Vigor de sementes: métodos para análise e fatores que o influenciam. Meio Ambiente (Brasil). 2020;2(3). Available from: https://meioambientebrasil.com.br/index.php/ MABRA/article/ view/53., 1919. França Neto JB, Henning AA, Krzyzanowski FC, Lorini I. DIACOM: 35 anos de capacitação nos testes de tetrazólio e Patologia de sementes de soja. 2015. Available from: https://seednews.com.br/artigos/1381-35-anos-de-capacitacao-nos-testes-de-tetrazolio-e-patologia-de-sementes-de-soja-edicao-setembro-2015.). Among them, the tetrazolium test stands out for generating promising results to determine the viability of seeds of native fruit crops. This test is relatively simple, but the price of the salt is high, so adjusted and promising methodologies are recommended to perform the test. Consequently, the tetrazolium test has been shown to be an interesting alternative due to the quality and speed in determining seed viability and vigor, making it possible to obtain results usually in less than 24 hours (2020. Dias MCLL, Alves SJ. Avaliação da viabilidade de sementes de Panicum maximum Jacq pelo teste de tetrazólio. Revista Brasileira de Sementes. 2008;30(3):152-158. doi: 10.1590/S0101-31222008000300020.).

Physiology of the tetrazolium test

The tetrazolium test is based on the immersion of seeds in a colorless solution of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride salt, used as an indicator of the reduction process that occurs within living cells. In this process, H+ ions released during the respiration of living tissues are transferred by a group of enzymes, particularly malic acid dehydrogenase, and interact with the tetrazolium salt, which is reduced to a red, stable and non-diffusible compound called triphenylformazan, indicating that there is respiratory activity and cellular viability of the tissue (66. França Neto JDB, Krzyzanowski FC. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Soja. 1st ed. Londrina: Embrapa Soja; 2018, 108 p. Available from: https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/1098452/metodologia-do-teste-de-tetrazolio-em-sementes-de-soja.).

The formation of light carmine red indicates viable tissue, while intense carmine red reveals deteriorating tissue, since decayed tissues release very small amounts of hydrogen ions, insufficient for the reaction with the tetrazolium salt (2121. MARCOS FILHO J., 2015 - Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. - Londrina: ABRATES, 660. Available from: https://repositorio.usp.br/item/002724502.), so the reduction of the salt will not occur and the dead tissue will contrast as white (66. França Neto JDB, Krzyzanowski FC. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Soja. 1st ed. Londrina: Embrapa Soja; 2018, 108 p. Available from: https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/1098452/metodologia-do-teste-de-tetrazolio-em-sementes-de-soja.).

These staining differences, observed in the seeds after they are subjected to the tetrazolium solution, are the main characteristics that must be considered in the interpretation of the test results, in addition to whether the intensity of seed staining varies between species (2222. Bento SRSO, Santos AEO, Melo DRM, Torres SB. Eficiência dos testes de vigor na avaliação da qualidade fisiológica de sementes de mulungu (Erythrina velutina WILLD.). Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(4):111-117. doi: 10.1590/S0101-31222010000400012.).

Adjust of the tetrazolium test

The effectiveness of the test in assessing seed viability and vigor is related to the application of methodologies adjusted for each species, in order to define the most appropriate conditions for the preparation (2323. Guedes RS, Alves EU, Gonçalves EP, Viana JS, Silva KB, Gomes MSS. Metodologia para teste de tetrazólio em sementes de Amburana cearensis (Allemão) A.C. Smith. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2010;12(1):120-126. doi: 10.1590/S1516-05722010000100017.). However, some species need to go through preparatory steps prior to immersion in the tetrazolium solution so that it is adequately absorbed by the seeds (2424. Costa CJ, Santos CP. Teste de tetrazólio em sementes de leucena. Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(2):66-72. doi: 10.1590/S0101-31222010000200008.). Thus, the imbibition process triggers the physiological activity of the seed and facilitates seed coat removal and exposure of the embryo to the contact with the solution used (2525. Cunha MCL, Gomes IHRA. Viabilidade de sementes de Erythrina velutina Willd pelo teste de tetrazólio. Nativa. 2015;3(3):196-200. doi: 10.14583/2318-7670.v03n03a08.). After priming, many species still require preparatory techniques, which involve puncture, cutting and/or removal of the seed coat (2424. Costa CJ, Santos CP. Teste de tetrazólio em sementes de leucena. Revista Brasileira de Sementes. 2010;32(2):66-72. doi: 10.1590/S0101-31222010000200008.).

The longitudinal sectioning, followed by seed coat removal, prior to immersion in tetrazolium solution, despite being a delicate and laborious operation, makes it possible to reduce the time necessary for seeds to acquire the staining (2626. Sarmento MB, Silva ACS, Villela FA, Santos KLD, Mattos LCP. Teste de tetrazólio para avaliação da qualidade fisiológica em sementes de goiabeira-serrana (Acca sellowiana O. Berg Burret). Revista Brasileira de Fruticultura. 2013;35(1):270-276. doi: 10.1590/S0100-29452013000100031.).

Therefore, the conduction of the tetrazolium test it is indispensable to perform procedures to determine the priming and cutting of the seeds before they are subjected to the tetrazolium salt, as well as the staining, varying the concentration of the tetrazolium salt solution, time and priming temperature, which are determined for each species (99. Lamarca EV, Barbedo CJ. Methodology of the tetrazolium test for assessing the viability of seeds of Eugenia brasiliensis Lam., Eugenia uniflora L. and Eugenia pyriformis Cambess. Journal of Seed Science. 2014;36(4):427-434. doi: 10.1590/2317-1545v36n41029., 2121. MARCOS FILHO J., 2015 - Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. - Londrina: ABRATES, 660. Available from: https://repositorio.usp.br/item/002724502., 2323. Guedes RS, Alves EU, Gonçalves EP, Viana JS, Silva KB, Gomes MSS. Metodologia para teste de tetrazólio em sementes de Amburana cearensis (Allemão) A.C. Smith. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2010;12(1):120-126. doi: 10.1590/S1516-05722010000100017.).

In some species to obtain satisfactory results of staining by the tetrazolium salt, priming needs to be carried out to favor the penetration of the solution into the tissues of interest to be evaluated, as well as adjustments in the tetrazolium solution concentration, time and priming temperature (2727. Zorzal TA, Fantinato DE, Campos LM, Luz ACC, Corte VB. Teste do tetrazólio para estimativa da viabilidade de sementes. Natureza on line. 2015;13(3):144-149. Available from: https://scholar.google.com.br/scholar?hl=pt-BR&as_sdt=0%2C5&q=Teste+do+tetra z%C3%B3lio+para+estimativa+da+viabilidade+de+sementes&btnG=.). Air temperature contributes to increasing water viscosity, which accelerates water absorption by the seed in phase I of the three-phase germination pattern (2828. Carvalho SMC, Torres SB, Benedito CP, Nogueira NW, Souza AAT, Souza Neta MLD. Viability of Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz var. ferrea) seeds by tetrazolium test. Journal of Seed Science. 2017;39(1):7-12. doi: 10.1590/2317-1545v39n1163784.).

The choice of the appropriate method should be based on the ease of identification of viable and unviable tissues and on the ability to differentiate lots with different physiological qualities (2929. Azerêdo GA, Paula RC, Valeri SV. Viabilidade de sementes de Piptadenia moniliformis Benth. pelo teste de tetrazólio. Revista Brasileira de Sementes. 2011;33(1):061-068. doi: 10.1590/S0101-31222011000100007.). For temperature, the staining color should be developed between 35 and 40 ºC, because it is faster, but the test can be performed normally at temperatures from 20 to 40 ºC (3030. Añez LMM, Coelho MFB, Albuquerque MCF, Mendonça EAF, Dombroski JLD. Padronização da metodologia do teste de tetrazólio para sementes de Jatropha elliptica M. Arg. (Euphorbiaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2007;9(3):82-88. Available from: https://docplayer.com.br/68834449-Padronizacao-da-metodologia-do-teste-de-tetrazolio-para-sementes-de-jatropha-elliptica-m-arg-euphorbiaceae.html.).

Potential of the tetrazolium test in the viability of Eugenia spp. seeds

Table 1 lists the best results of the tetrazolium test, and Figure 1 shows the results of staining of tetrazolium test in different species of the genus Eugenia.

The Figure 1 (99. Lamarca EV, Barbedo CJ. Methodology of the tetrazolium test for assessing the viability of seeds of Eugenia brasiliensis Lam., Eugenia uniflora L. and Eugenia pyriformis Cambess. Journal of Seed Science. 2014;36(4):427-434. doi: 10.1590/2317-1545v36n41029.) shows the results of staining of the tetrazolium m test in different species of the genus Eugenia.

As shown in Table 1 and Figure 1, despite belonging to the same genus, the species have differences between the ideal combinations for the use of the tetrazolium test. Such variations emphasize the need to adapt the tetrazolium test methodology for each species, as these results may be related to specificity and genetic variation, reduction of moisture content during the storage period or maturity degree at the time of fruit harvest, which may alter the hormonal balance of seeds (2626. Sarmento MB, Silva ACS, Villela FA, Santos KLD, Mattos LCP. Teste de tetrazólio para avaliação da qualidade fisiológica em sementes de goiabeira-serrana (Acca sellowiana O. Berg Burret). Revista Brasileira de Fruticultura. 2013;35(1):270-276. doi: 10.1590/S0100-29452013000100031.).

Influence of bioregulators on seed germination process

Growth bioregulators, also called biostimulants or phytohormones, contain in their composition: amino acids, humic substances (humic acids and fulvic acids), plant growth hormones, vitamins and various other elements, and may contain organic substances from algae extract (1111. Kolachevskaya OO, Sergeeva L, Floková K, Getman IA, Lomin SN, Alekseeva VV, et al. Auxin synthesis gene tms1 driven by tuberspecific promoter alters hormonal status of transgenic potato plants and their responses to exogenous phytohormones. Plant Cell Reports. 2017;36(2):419-435. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-016-2091-y.).

Bioregulators function as activators of seed and plant cell metabolism, reactivate physiological processes in different stages of development and stimulate root growth (1212. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Fisiologia e Desenvolvimento Vegetal. 6st ed. Artmed Editora; 2017. 857 p. Available from: https://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=PpO4DQAAQBAJ&oi=fnd&pg=PR1&dq=Fisiologia+e+Desenvolvimento+Vegetal&ots=7RGgtRKUQf&sig=naVcej7-22XCsHGMurUkhQt-yFY#v=onepage&q=Fisiologia%20e%20Desenvolvimento%20Vegetal&f=false., 3131. Amaro HTR, Costa RC, Porto EMV, Araújo ECM, Fernandes HMF. Tratamento de sementes com produtos à base de fertilizantes e reguladores de crescimento. Pesquisa Agropecuária Gaúcha. 2020;26(1):222-242. doi: 10.36812/pag.2020261222-242.). Stimulate^® is a commercial product known to contain three plant hormones in its composition, 0.009 % kinetin, 0.005 % gibberellic acid (GA3) and 0.005 % indolyl butyric acid (IBA), phytoregulators such as auxins, gibberellins and cytokines (3232. Smiderle OJ, Souza AG, Maia SS, Reis ND, Costa JS, Pereira GS. Do stimulate® and acadian® promote increased growth and physiological indices of Hymenaea courbaril seedlings?. Revista Brasileira de Fruticultura. 2022;44(2):e-872. doi: 10.1590/0100-29452022872.).

Auxins act mainly in the regulation of growth and promotion of rooting of root primordia, whereas gibberellins have as one of their main functions the stimulation of cell division and elongation, besides having greater influence on the germination process. They have a stimulating effect, in both the presence and the absence of dormancy in the seed, acting in the activation of vegetative growth of the embryo, mobilization of endosperm reserves and weakening of the endosperm layer surrounding the embryo (1212. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Fisiologia e Desenvolvimento Vegetal. 6st ed. Artmed Editora; 2017. 857 p. Available from: https://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=PpO4DQAAQBAJ&oi=fnd&pg=PR1&dq=Fisiologia+e+Desenvolvimento+Vegetal&ots=7RGgtRKUQf&sig=naVcej7-22XCsHGMurUkhQt-yFY#v=onepage&q=Fisiologia%20e%20Desenvolvimento%20Vegetal&f=false.). In turn, cytokinins mainly stimulate cell division processes (cytokinesis) (3333. Chrysargyris A, Xylia P, Anastasiou M, Pantelides I, Tzortzakis N. Effects of Ascophyllum nodosum seaweed extracts on lettuce growth, physiology and fresh‐cut salad storage under potassium deficiency. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2018;98(15):5861-5872. doi: 10.1002/jsfa.9139.).

The ideal concentration of the commercial product composed of kinetin, gibberellic acid and indole butyric acid optimized the percentage of emergence in Acacia mangium (3434. Carvalho JHN, Lima APL, Lima SF. Adição de moinha de carvão e de Stimulate^® na formação de mudas de Acacia mangium. Revista de Agricultura Neotropical. 2018;5(1):66-74. doi: 10.32404/rean.v5i1.2126.). In Hymenaea courbaril the 2.0 ml L^-1 dose of plant regulator resulted in an 18 % increase in shoot height, compared to the control at 90 DAT. however, did not promote an increase in chlorophyll a and b (3232. Smiderle OJ, Souza AG, Maia SS, Reis ND, Costa JS, Pereira GS. Do stimulate® and acadian® promote increased growth and physiological indices of Hymenaea courbaril seedlings?. Revista Brasileira de Fruticultura. 2022;44(2):e-872. doi: 10.1590/0100-29452022872.). Inadequate concentrations of plant bioregulators can lead to deterioration by phytosanitary, physiological, biochemical, and cytological alterations in the seeds, culminating in low emergence or even embryo death (3535. Singh V, Sergeeva L, Ligterink W, Aloni R, Zemach H, Doron FA, Yang J, Zhang P, Shabtai S, Firon N. Gibberellin Promotes Sweetpotato Root Vascular Lignification and Reduces Storage-Root Formation Frontiers Plant Science. 2019;10(3):1320. doi: 10.3389/fpls.2019.01320.).

However, there are few studies with bioregulators in native seeds of the Amazon (3131. Amaro HTR, Costa RC, Porto EMV, Araújo ECM, Fernandes HMF. Tratamento de sementes com produtos à base de fertilizantes e reguladores de crescimento. Pesquisa Agropecuária Gaúcha. 2020;26(1):222-242. doi: 10.36812/pag.2020261222-242.), which can be a field of study to enhance the vigor of plantlets, consequently leading to quality seedlings.

In view of the above, species of the genus Eugenia have potential as fruit crops, and the seed is the main pathway of propagation. In addition, the fractionation of araçá-boi seeds has the advantage of homogenizing emergence and improving plant stand in the nursery, resulting in better yield in the use of propagative material and in the quality of the seedlings produced.