3.1. Principales virus que afectan el cultivo del ajo

A nivel mundial existen 15 virus asociados con el cultivo del ajo pertenecientes a cinco géneros diferentes (2121. Conci VC, Canavelli A, Lunello P, Di Rienzo J, Nome SF, Zumelzu G, et al. Yield losses associated with virus-infected garlic plants during five successive years. Plant Disease. 2003;87(12):1411–1415. Available in: https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS.2003.87.12.1411). Estos incluyen:

Las pérdidas provocadas por las infecciones virales varían y pueden depender, parcialmente, de la interacción agente viral-genotipo. En Argentina, se señala que el Garlic Virus A causó reducciones entre 14 y 32 % en la masa del bulbo y entre 6 y 11 % en el diámetro del bulbo de las variedades ‘Morado-INTA’ y ‘Blanco-IFFIVE’ (2222. Megino LV, Hernando ECC, González CI, Llamas DP. Influencia de la temperatura de termoterapia: El rendimiento del cultivo del ajo. Terralia. 2009;(74):32-4. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=3113290).

En México, se ha informado que las enfermedades provocadas por virus pueden causar una reducción del rendimiento entre 33-50 % y hasta el 30 % de la masa de los bulbos, especialmente, cuando la frecuencia de Virus como: Enanismo Amarillo de la Cebolla (OYDV), Jaspeado del Tabaco (LYSV) y Latente del Shallot (SLV), entre otros, es elevada (2323. Pérez-Moreno L, Santiago-Gómez D, Rico-Jaramillo E, Ramírez-Malagón R, Mendoza-Celedón B. Efecto de virus fitopatógenos sobre características agronómicas y calidad del ajo (Allium sativum l.), en el estado de Guanajuato, México. Revista mexicana de fitopatología. 2008;26(1):40-8. Available in: https://www.redalyc.org/pdf/612/61226107.pdf).

Para disminuir las fuentes de contaminación se debe preparar el material vegetal antes de llevarse al laboratorio, en una fase de invernadero o fase 0. Esto comprende llevar las plantas a un invernadero, donde por un período de tiempo se les aplica agroquímicos para disminuir las fuentes potenciales de contaminación, que pueden ser hongos o bacterias. Entre las sustancias utilizadas para disminuir la contaminación se encuentra el hipoclorito de sodio, el hipoclorito de calcio, el cloruro de mercurio (II), el alcohol al 70 % y el peróxido de hidrógeno. Su utilización dependerá del tipo de tejido vegetal (herbáceo o leñoso) o de la cantidad de inóculo contaminante que presente el explante (1818. Vazquez C, Bejerano MJ, Peralta EL, Dalmau E. Metodología de desinfección de Allium sativum L para su implantacion in vitro. Cultivos Tropicales. 1997;18(3):76–79. Available in: https://ediciones.inca.edu.cu/files/anteriores/1997/3/CT18314.pdf).

La utilización del cloruro de mercurio II (HgCl₂) como agente desinfectante constituye un método simple, rápido y eficaz para la obtención de explantes viables y libres de contaminación. Sin embargo, su utilización continúa siendo polémica por su alta toxicidad y elevado nivel de contaminación ambiental, además, puede provocar problemas de oscurecimiento en los tejidos.

3.2.1. Termoterapia

El empleo de elevadas temperaturas(40-75 °C) para eliminar o reducir la "carga viral" ha sido definida como la producción de un ambiente celular progresivamente menos adecuado para los agentes virales (3131. Velásquez-Valle R, Reveles Hernández M, Velásquez-Valle R, Reveles Hernández M. Efecto de la termoterapia sobre la emergencia y características vegetativas de genotipos de ajo. Revista mexicana de ciencias agrícolas. 2019;10(2):447-52. doi: http://doi.org/10.29312/remexca.v10i2.1522) y es un paso previo al cultivo de meristemos para proveer plantas libres de virus. Este último es un proceso que requiere de por lo menos cinco años (3232. Norris DO. Development of virus-free stock of Green Mountain Potato by treatment with malachite green. Australian Journal of Agricultural Research. 1954;5(4):658-63. doi: http://doi.org/10.1071/ar9540658).

En otros estudios (1414. Brenes-Madriz JA, Guillén-Watson AV. Establecimiento de un protocolo in vitro para el cultivo del ajo (Allium sativum L.) en Costa Rica. Revista Tecnología en Marcha. 2014;27(4):pág–49. Available in: https://repositoriotec.tec.ac.cr/handle/2238/4104) se mostró que los resultados del establecimiento in vitro en el cultivo del ajo dieron positivos al Virus del Enanismo Amarillo de la Cebolla (OYDV), por lo que con posterioridad se empleó la termoterapia con diferentes tratamientos térmicos y combinado con el cultivo de tejidos vegetales, con la finalidad de erradicar el potyvirus de las plántulas. Los resultados presentados en los ocho tratamientos del cultivar ‘Don Fermín’ permitió mostrar que la termoterapia, en combinación con el cultivo de tejidos, tiene una respuesta positiva al usar como fuente de explante domos meristemáticos de un tamaño aproximado de 1 a 2 mm, debido a que se logró obtener material vegetal libre del OYDV.

El empleo de la termoterapia y el cultivo de tejidos para la eliminación del OYDV mostró que los “dientes” expuestos a 40 °C por 40 días no produjeron ningún producto de amplificación del virus, es decir, las plántulas in vitro sometidas a dicho proceso no estaban infectadas por dicho virus. Es importante mencionar que la técnica de cultivo de tejidos en combinación con la termoterapia en ápices caulinares (5-8 mm), de un tamaño relativamente grande, resultó ser eficiente en la eliminación del OYDV (66. Carbajal Cruz NN. Termoterapia y cultivo in vitro de ajo (Allium sativum L.) para la eliminación del virus del enanismo amarillo de la cebolla. [Internet] [Masters]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 2018 [citado 29 de marzo de 2021]. 89 p. Available in: http://eprints.uanl.mx/15790/).

Una alternativa de manejo empleada, al alcance de los productores de ajo, es la aplicación de una elevada temperatura directamente a los bulbos para eliminar o reducir la "carga viral", sin dañar su capacidad de germinación o posterior desarrollo (3333. Ponce P, Juan N. Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. JN Pérez Ponce editor principal; editores Yelenys Alvarado Capó...[et al.]. 1998; Available in: https://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=DO2003100118). También, se ha comprobado que la termoterapia es un método eficaz y de fácil aplicación para reducir la cantidad de inóculo del hongo Sclerotium y los nemátodos del género Ditylenchus en los “dientes” de ajo (3434. Wagele R. Procedimiento para influir en el crecimiento de células e individuos bacterianos, animales y vegetales. Patentans Piiche. 1978;28(41):933.).

Resultados obtenidos probaron que la termoterapia no tiene efecto depresivo en las futuras plantas cuando éstas proceden de simientes tratadas entre 47-49 °C y tampoco se afecta negativamente la producción. La termoterapia a 49 °C, al ser letal para los parásitos ya instalados en el material de plantación, evita la infección de los terrenos de cultivo del ajo cuando se utilice dicha simiente; lo que consigue un efecto sanitario global positivo (3535. Hernandez R, Fontanella J, Noa JC, Manso R, Pichardo T, Càrdenas H. Electroterapia, nuevo mètodo para el saneamiento a virus en Allium sativum L., con optimizaciòn del diagnòstico por um-elisa. 24. 1. Total de registros: 1 BD FAUSAC Ayuda MegaBase Agropecuaria Alianza SIDALC. 1991; Available in: https://catalogosiidca.csuca.org/Record/UNANI.054555).

El empleo de elevadas temperaturas influye positivamente en la erradicación de diferentes virus presentes en el cultivo del ajo, tanto en condiciones de campo como a nivel de laboratorio mediante el cultivo de tejidos. Además, el empleo de esta técnica evita la contaminación del suelo o medio de cultivo al utilizar material contaminado.

3.2.2. Quimioterapia

La quimioterapia se define como la terapia mediante la utilización de productos químicos. Los primeros trabajos se realizaron con verde Malaquina contra el virus del mosaico débil o latente en papa (PVX) (3636. Carhuaricra E K, Olivera S J, Gonzales A J, Rodríguez L J. Introducción y multiplicación in vitro del cultivo de ajo variedad Morado Barranquino. Revista Peruana de Biología. 2012;19(3):341-4. Available in: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1727-99332012000300017&lng=es&nrm=iso&tlng=es), con muy baja efectividad. En lo adelante han sido empleados numerosos productos contra diferentes virus, pero en la mayoría de las sustancias utilizadas, las dosis no fitotóxicas solo pueden reducir las tasas de multiplicación viral de forma muy limitada (3737. Cafrune EE, Perotto MC, Conci VC. Effect of two Allexivirus isolates on garlic yield. Plant Disease. 2006;90(7):898-904. doi: http://doi.org/10.1094/PD-90-0898).

Algunos autores (3838. Dena Silva M. Efecto de la corriente eléctrica en la eliminación de virus del ajo (Allium sativum L.) [PhD Thesis]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 1997. Available in: http://eprints.uanl.mx/id/eprint/6391) mostraron que, las plantas de ajo del cultivar ‘Taiwan’, provenientes del cultivo de meristemos in vitro, luego de la aplicación del producto químico Rivabirin, solo el 32,5 % de las mismas presentaron lectura negativa a la presencia de virus.

En resultados obtenidos mediante el empleo de la quimioterapia se logró eliminar la incidencia de los virus: OYDV y LYSV en el cultivo del ajo (3939. Manjunathagowda DC, Gopal J, Archana R, Asiya KR. Virus-free seed production of garlic (Allium sativum L): Status and Prospects. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2017;6(6):2446–2456. Available in: https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.606.290). Estudios con la aplicación de virazol, mostraron un 100 % de plantas libres de virus cuando se cultivaron meristemos de 0,3 mm de tamaño en un medio de cultivo MS con 50 mg L^-1 del producto (4040. Sidaros SA, Omar RA, El-Kewey SA, El-Khalik SA. Virus elimination from infected garlic plants using different techniques. Egyptian J. Virol. 2004;1:333–341.). Otros autores informaron plantas de ajo libres de Potyvirus mediante quimioterapia de clavo con Ribavirina 205 µM, con una tasa de supervivencia que osciló entre 27,0-34,8 % (4141. Ramírez-Malagón R, Pérez-Moreno L, Borodanenko A, Salinas-González GJ, Ochoa-Alejo N. Differential organ infection studies, potyvirus elimination, and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006;86(1):103-10. doi: http://doi.org/10.1007/s11240-006-9102-6).

Se demostró que la utilización de compuestos químicos puede influir de manera positiva sobre el cultivo del ajo para la eliminación de diferentes virus, aunque, en ocasiones, el uso de algunos productos solo logra reducir la carga virar en un bajo porcentaje. Asimismo, los tratamientos con productos químicos, por lo general, hay que repetirlos en más de una ocasión.

3.2.3. Electroterapia

El concepto puede definirse como el uso de la corriente eléctrica con fines terapéuticos. Se basa, principalmente, en los fenómenos provocados en los tejidos por el paso de la electricidad, es decir, en el calentamiento por el efecto joule y en la electrólisis. En la práctica, se utilizan corrientes galvánicas, farádicas y alternas (3838. Dena Silva M. Efecto de la corriente eléctrica en la eliminación de virus del ajo (Allium sativum L.) [PhD Thesis]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 1997. Available in: http://eprints.uanl.mx/id/eprint/6391).

Las primeras experiencias en la aplicación de corriente eléctrica a través de tejidos vegetales, informaron que encontraron un aumento en los niveles de regeneración de células y tejidos. La electroterapia a “dientes” de ajo, ha sido utilizada en el saneamiento del complejo viral de esta especie, se ha logrado entre un 53-100 % de plantas sanas, al aplicar corriente directa (10-13 v) entre 5-30 minutos (3535. Hernandez R, Fontanella J, Noa JC, Manso R, Pichardo T, Càrdenas H. Electroterapia, nuevo mètodo para el saneamiento a virus en Allium sativum L., con optimizaciòn del diagnòstico por um-elisa. 24. 1. Total de registros: 1 BD FAUSAC Ayuda MegaBase Agropecuaria Alianza SIDALC. 1991; Available in: https://catalogosiidca.csuca.org/Record/UNANI.054555).

Estudios realizados con el empleo de esta técnica mostraron que dosis superiores a 30 V durante 10 min resultaron letales para el cultivo del ajo (4242. Hernandez R, Fontanella Y, Noa JC. Equipo y procedimiento de electroterapia para el saneamiento a virus en ajo (Allium sativum L.). Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, Palacio de las Convenciones; 23-27 Junio de 1997. 1997;). A su vez, otros autores (4343. Castro YI, Pérez RH, Noa-Carrazana JC, Pichardo T. Saneamiento al complejo viral del ajo (Allium sativum L.) mediante termoterapia y cultivo de meristemos. Cuadernos de fitopatología: Revista técnica de fitopatología y entomología. 1995;12(47):194-5. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=110011) mostraron una estimulación del crecimiento de plantas de ajo mediante esta técnica.

De acuerdo con los resultados obtenidos, el empleo de corriente eléctrica es una técnica favorable para eliminar gran parte de la carga viral presente en el cultivo del ajo, a pesar de no ser muy utilizada.

3.2.4. Empleo de técnicas combinadas para el saneamiento de virus del ajo

Dentro del ámbito de la protección de cultivos, la biotecnología es un proceso dinámico sin el cual no puede llevarse a cabo una agricultura competitiva. Las aplicaciones biotecnológicas contemplan estrategias dirigidas a la detección de patógenos, la obtención y mantenimiento de cultivares libres de patógenos, así como nuevas estrategias para el control de enfermedades para las que no existen vías convencionales. En el pasado siglo se incorporaron, sucesivamente, nuevas tecnologías que permitieron profundizar en la mejora de los cultivos, entre ellas cabe destacar, los cruzamientos interespecíficos y el cultivo in vitro (3737. Cafrune EE, Perotto MC, Conci VC. Effect of two Allexivirus isolates on garlic yield. Plant Disease. 2006;90(7):898-904. doi: http://doi.org/10.1094/PD-90-0898).

Algunos autores utilizaron termoterapia, quimioterapia y cultivo de meristemos en combinación para obtener plantas de ajo libres de virus del grupo Potyvirus. Los embriones se obtuvieron de clavos (explantes) que habían sido sometidos a quimioterapia y las plantas regeneradas a partir de embriones recibieron tratamiento de termoterapia. Estos meristemos se cultivaron y las plantas obtenidas se indexaron mediante ELISA y se encontró que la termoterapia tiene un efecto negativo en el establecimiento de las plantas. Pero la termoterapia en combinación con el cultivo de meristemos demostró ser un método más eficaz para la eliminación del virus (60,0-70,9 %) que el cultivo de meristemos solo (64 %). Sin embargo, informaron que la quimioterapia no fue efectiva para la eliminación del grupo Potyvirus (4141. Ramírez-Malagón R, Pérez-Moreno L, Borodanenko A, Salinas-González GJ, Ochoa-Alejo N. Differential organ infection studies, potyvirus elimination, and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006;86(1):103-10. doi: http://doi.org/10.1007/s11240-006-9102-6).

Otros autores probaron métodos de electroterapia, termoterapia, quimioterapia o disección meristemática (cultivo in vitro) para eliminar el virus OYDV de Allium sativum L. (4444. Soliman AM, Mahmoud SYM, Dawood RA. Molecular characterization of onion yellow dwarf virus (garlic isolate) with production of virus-free plantlets. International Journal of Virology. 2012;8(1):61-70. DOI: http://doi.org/10.3923/ijv.2012.61.70). Combinaron métodos de electro y quimioterapia (15 mA/10 min + 20 mg L^-1 Virazol) y obtuvieron los mejores resultados, el 85 % de las plántulas que sobrevivieron estaban libres del virus OYDV.

En estudios realizados (4545. CONCI VC. Virus de ajo, diagnóstico y obtención de plantas libres. Agro de Cuyo, Jornadas.(1): 59-60, 1991. 1991;) se trataron “dientes” de ajo para su saneamiento con agua y aire caliente en cámara de crecimiento y en invernadero. Los tratamientos con agua caliente fueron de 50 y 55 °C durante 5, 15 y 20 minutos, su eficiencia fue tan sólo del 13 % de saneamiento. Con aire caliente se aplicó una temperatura de 36 °C durante 30, 40 y 60 días, el porcentaje de regeneración disminuyó al incrementarse el tiempo de aplicación y se aumentó la eficiencia del saneamiento, se alcanzó hasta un 100 % con 60 días de aplicación.

3.2.5 Técnicas empleadas para el diagnóstico de virus en ajo

Los métodos confiables, rápidos y rentables para la detección de virus del ajo juegan un papel importante en el control y manejo de las enfermedades virales. El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) y la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción reversa (RT-PCR) se han utilizado para el diagnóstico de los virus del ajo (4646. Nam M, Lee Y-H, Park CY, Lee M-A, Bae Y-S, Lim S, et al. Development of Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of Garlic Viruses and the Incidence of Garlic Viral Disease in Garlic Genetic Resources. The Plant Pathology Journal. 2015;31(1):90-6. doi: http://doi.org/:10.5423/PPJ.NT.10.2014.0114). Sin embargo, los antisueros utilizados en el método de ELISA no siempre están disponibles para todos los virus y su diagnóstico se vuelve complejo debido a las múltiples infecciones virales; en cambio, la RT-PCR ha demostrado ser más sensible al detectar los virus en muy bajas concentraciones (4747. Walkey DGA, Webb MJW, Bolland CJ, Miller A. Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum L.) by meristem-tip culture. Journal of Horticultural Science. 1987;62(2):211-20. doi: http://doi.org/10.1080/14620316.1987.11515771).

Para la detección de complejos virales en el cultivo del ajo (4848. Smékalová K, Stavlíková H, Dušek K. Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Pathology. 2010;92(1):273-4. doi: http://doi.org/10.4454/jpp.v92i1.43) se utilizó la técnica de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Mediante dicha prueba se observó la presencia de cinco virus: los Potyvirus: Virus del Estriado Amarillo del Puerro (LYSV) y Virus Enanismo Amarillo de la Cebolla (OYDV); los Carlavirus: Virus Latente del Shallote (SLV) y Virus Latente Común del Ajo (GCLV); y el Tospovirus: Virus del Estriado Amarillo del Iris (IYSV) en el follaje de los ecotipos evaluados. En tres fechas de muestreos diferentes se detectó que el LYSV tuvo una frecuencia del 100, 100 y 100 %; en el OYDV las frecuencias de muestreos fueron de 50, 75 y 77,7 %; en el SLV de 19,4; 30,5 y 0 %; en el GCLV de 100; 97,2 y 91,6 %; y en el IYSV de 0,0; 2,7 y 22,2 %.

Estudios realizados en dicho cultivo (4949. Bhojwani SS, Dantu PK. Micropropagation. En: Bhojwani SS, Dantu PK, editores. Plant Tissue Culture: An Introductory Text [Internet]. India: Springer; 2013 [citado 29 de marzo de 2021]. p. 245-74. doi: http://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9_17) revelaron para las 54 muestras analizadas por RT-PCR la presencia de dos a cinco virus en cada planta, teniendo una tasa de coinfección del 100 %. Dos muestras (3,7 %) contenían 2 virus, seis muestras (11,11 %) contenían 3 virus, diez muestras (18,52 %) contenían 4 virus y, 36 muestras (66,67 %) contenían 5 virus. Las variedades de ajo ‘Tigre’ y ‘Fermín’ mostraron mayor frecuencia de virus que la variedad ‘California’.

3.3.1. Empleo de reguladores del crecimiento tradicionales

Estudios realizados mostraron que la iniciación de brotes ocurrió en el 98 % de los ápices cultivados en las sales del medio de cultivo basal MS suplementado con 0,5 mg L^-1 de 2-iP y 0,1 mg L^-1de ANA, esto permitió el desarrollo de un solo brote por tubo de ensayo con un promedio de altura entre 4-4,6 cm. La máxima altura se observó en el tratamiento T₂ (0,01 mg L^-1 de 2,4-D y 5 mg L^-1 de Kin) con 9,9 cm de altura, seguido por el T₃ (0,01 mg L^-1 de 2,4-D y 5 mg L^-1 de 6-BAP) con 8,2 cm, mientras que en el T₃ se obtuvo el mayor número de brotes por callo (3,9) seguido por el T₂ con 2,2 brotes por callo. En ausencia de reguladores de crecimiento [T₁ (MS)] no hubo caulogénesis. Estos resultados indicaron que la composición del medio nutritivo repercutió sobre la capacidad de regenerar brotes. Al respecto, se requirió una mayor proporción de citoquininas (Kin, 6-BAP) que de auxinas (2,4-D) en el medio de cultivo. En este caso, las citoquininas parecen jugar un papel específico para la regeneración de brotes a partir de callos, probablemente al determinar la ruta de la diferenciación hacia la caulogénesis (5555. Donoso-Huaral IEEA. Producción de semilla de ajo, empleando la técnica de micropropagación en el Perú. 2013; Available in: http://162.248.52.172:8080//jspui/handle/inia/506).

El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), a pesar de ser una auxina que a bajas concentraciones puede favorecer la inducción de brotes, no es muy recomendable su empleo en procesos de micropropagación ya que puede inducir variabilidad genética en los regenerantes obtenidos.

En el cultivo del ajo, con el ecotipo ‘Colorado de Mendoza’, se alcanzó el mayor número de raíces (2,5 raíces) con las sales del medio de cultivo basal MS (Murashige y Skoog con vitaminas sintéticas), mientras que el medio de cultivo MSM + EQ (Sales de Murashige y Skoog Modificado, sustitución de KNO₃, MgSO₄, NH₄NO₃ + extracto de quinua) fue el que obtuvo el menor número de raíces, uno (5656. Tyagi RK, Agrawal A, Mahalakshmi C, Hussain Z, Tyagi H. Low-cost media for in vitro conservation of turmeric (Curcuma longa L.) and genetic stability assessment using RAPD markers. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 2007;43(1):51-8. doi: http://doi.org/10.1007/s11627-006-9000-y) como promedio. El ecotipo ‘Rosado de Italia’ fue el que alcanzó el mayor promedio en cuanto al número de raíces (3,3 raíces) en presencia del medio de cultivo MSM (Sales de Murashige y Skoog Modificado, sustitución de KNO₃, MgSO₄, NH₄NO₃), mientras que con el medio de cultivo MSM +EQ se obtuvo el menor número de raíces (1,6 raíces) (5757. Kamenetsky R, Rabinowitch HD. The genus Allium: A developmental and horticultural analysis. Horticultural reviews-westport then New York-. 2006;32:329. Available in: https://doi.org/10.1002/9780470767986.ch7).

Con el medio de cultivo MSM (Murashige y Skoog Modificado con sales comerciales) suplementado con los reguladores de crecimiento Kinetina (1 mg L^-1) y Ácido Indolaceico (2 mg L^-1) se logró una mayor regeneración de brotes adventicios, un promedio de 2,1 brotes por explante para el ecotipo ‘Colorado de Mendoza’ y un brote por explante para el ecotipo ‘Rosado de Italia’ (5757. Kamenetsky R, Rabinowitch HD. The genus Allium: A developmental and horticultural analysis. Horticultural reviews-westport then New York-. 2006;32:329. Available in: https://doi.org/10.1002/9780470767986.ch7).

3.3.2. Empleo de bioestimuladores del crecimiento

El Biobras-6^® y Pectimorf^® se pueden utilizar como reguladores del crecimiento en todas las fases de la micropropagación del ajo clon ‘Criollo-9’; la combinación AIA (0,1 mg L^-1) y Biobras-6^® (0,05 mg L^-1) o AIA (0,5 mg L^-1) y Pectimorf^® (1 mg L^-1) aumentó el establecimiento in vitro de los ápices caulinares y disminuyó entre tres y cuatro días el tiempo de permanencia de los explantes en el medio de cultivo, con respecto al tratamiento control (AIA y 6-BAP). Para la obtención de brotes múltiples fueron mejores las combinaciones ANA (0,3 mg L^-1) y Biobras-6^® (2 mg L^-1) y AIA (0,5 mg L^-1) y Pectimorf^® (10 mg L^-1). La supervivencia y el enraizamiento durante la aclimatización de los microbulbillos fue superior, con la inmersión previa en Biobras-6^® (1 mg L^-1) o Pectimorf^® (10 mg L^-1) durante 15 minutos y la plantación posterior en un sustrato compuesto por zeolita cargada [Litonita] (25 %) y materia orgánica [cachaza descompuesta] (75 %). Las evaluaciones agronómicas evidenciaron que el Biobras-6^® produjo un rendimiento de 12,42 y el Pectimorf^® 11,67 t ha^-1, superiores en 4,47 y 2,72 t ha^-1, respectivamente, en relación con las plantas control (22. Izquierdo Oviedo H, Gómez O. Criollo-9, un cultivar de ajo resistente a las enfermedades fitopatógenas y elevado potencial de rendimiento. Cultivos Tropicales. 2012;33(2):68-68. Available in http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362012000200010&lng=es&nrm=iso).

Otros estudios con el empleo de sacarosa mostraron que el comportamiento de las plántulas in vitro y microbulbillos de ajo de diferentes genotipos (‘Criollo-9’, ‘Martínez’, ‘Criollo-6’, Criollo-3’ y ‘Vietnamita’) respecto al porcentaje de supervivencia en la fase de aclimatización, la respuesta más efectiva se obtuvo a partir de los microbulbillos inducidos in vitro con 75 g L^-1 de sacarosa. En el caso de las plántulas in vitro, la supervivencia osciló de 39,50-49,62 % y para los microbulbillos entre 90,70-94,95 %, los mejores valores los alcanzaron los clones ‘Criollo-9’ y ‘Martínez’, con 94,95 y 93,56 %, respectivamente (1717. Izquierdo H, Quiñones Y, Disotuar R, Pedroso D. Evaluación de diferentes sustratos en la aclimatización de vitroplantas y microbulbillos de ajo (Allium sativum L.). Cultivos Tropicales. 2002;23(3):63–69. Available in: https://link.gale.com/apps/doc/A146790764/AONE?u=anon~e52262bd&sid=googleScholar&xid=bb3f669f).

3.5.1. A mediano plazo

En el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta 12 meses, con un manejo de las condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre subcultivos (6060. Benson EE, Johnston J, Muthusamy J, Harding K. Physical and engineering perspectives of in vitro plant Cryopreservation. En: Gupta SD, Ibaraki Y, editores. Plant tissue culture engineering [Internet]. Dordrecht: Springer Netherlands; 2008 [citado 29 de marzo de 2021]. p. 441-76. (Focus on Biotechnology). doi: http://doi.org/10.1007/978-1-4020-3694-1_24).

Resultados alcanzados demuestran que a la temperatura de 6 ºC se observó la reducción de la tasa de crecimiento del cultivo del ajo, pues se requirió de mayor tiempo para que las plantas alcanzaran la altura de 5 cm, y que resultara evidente la bulbificación y se produjera el enraizamiento profuso (de 3-5 raíces). El efecto de la disminución de la temperatura de conservación en dicho enraizamiento fue notable, ya que el tiempo para alcanzar el enraizamiento fue aproximadamente 5 veces el requerido a 24 ºC. La contaminación observada fue baja por lo que no parece ser un aspecto limitante. El contenido del medio de cultivo en los tubos para ensayos decreció en un 25 % respecto al inicial, de modo que las plántulas llegaron a alcanzar el año de conservación y aún se mantenía, aproximadamente, un 75 % del contenido del medio de cultivo (6161. García-Águila L, Feria M de, Acosta K. Aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal. Biotecnología Vegetal [Internet]. 2007 [citado 29 de marzo de 2021];7(2). Available in: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/359).

Otros estudios sobre conservación in vitro (6262. Pardo A, Rivero S, Alvarado G. Conservación in vitro de microbulbos de ajo (Allium sativum L.). Bioagro. 2014;26(2):115–122. Available in: http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1316-33612014000200006&lng=es&nrm=iso) informaron que durante el cultivo de microbulbos de A. sativum L., en cinco medios de conservación in vitro almacenados en ¼ MS con 45 g L^-1 de sacarosa (T4), mostraron porcentajes de supervivencia de 86,6; 76,6 y 73,3 % a los 150, 180 y 210 días, respectivamente. Así mismo, registraron el mejor vigor con valores promedio de 1,16; 0,93 y 1,04 según la escala establecida (1= bulbos definidos en un 75 %; 2 = bulbos definidos en un 50 %; 3 = bulbos definidos en un 25 % y 4 = ausencia de bulbos o bulbos no definidos) a los 150, 180 y 210 días de evaluación, respectivamente.

Otros estudios mostraron que, respecto al índice de bulbificación todas las plantas de ajo conservadas a 24 ^oC habían bulbificado a los 4 meses de conservación. A 6 ^oC no se observó bulbificación hasta los 6 meses y la bulbificación de todas las plantas se apreció a los 10 meses (6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf).

3.5.2. A largo plazo

El almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente en agricultura, horticultura, y forestería para la investigación y el monitoreo ambiental. Se considera que el almacenamiento por largo plazo es una práctica útil para evitar la variación somaclonal en plantas con propagación vegetativa y permite mantener los explantes sin alteración alguna bajo estas condiciones (6464. Makowska Z, Keller J, Engelmann F. Cryopreservation of apices isolated from garlic (Allium sativum L.) bulbils and cloves. Cryo-Letters. 1999;20(3):175-82. Available in: http://www.documentation.ird.fr/hor/fdi:010018253).

Estudios realizados mostraron que el cultivo de brotes de tres cultivares de ajo se mantuvo a diversas temperaturas y medios de cultivo para mantener su viabilidad sin subcultivos (6565. El-Gizawy AM, Ford-Lloyd BV. An in vitro method for the conservation and storage of garlic (Allium sativum L.) germplasm. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987;9(2):147-50. doi: http://doi.org/10.1007/BF00044250). Como resultado se registró un elevado nivel de viabilidad después de 16 meses de cultivo a 4 °C con 100 g L^-1 de sacarosa en medio B-5.

3.5.3. Crioconservación

La crioconservación permite el almacenamiento de células, tejidos u órganos vegetales vivos a temperaturas extremadamente bajas (-80 °C). Esta técnica permite el almacenamiento durante períodos prolongados (mayores a un año) con el uso de nitrógeno líquido (NL), el cual normalmente se encuentra a -196 °C. En algunas ocasiones, se combina el NL con otros gases inertes (como el helio y el argón) (5959. Pardo A, Hernández A, Méndez N. Caracterización molecular de siete clones de ajo (Allium sativum L.) mediante la técnica rapd. Bioagro. 2009;21(2):81-6. Available in: http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1316-33612009000200001&lng=es&nrm=iso&tlng=es).

En el caso de los clones de ajo ‘Castaño INTA’, ‘Sureño INTA’ y ‘Morado INTA’ se obtuvo 96,7, 92,9 y 89,3 % de explantes brotados, respectivamente, cuando se crioconservaron ápices de “dientes” mediante la metodología de la gota congelada (6666. Castelar I. Crioconservación de recursos fitogenéticos en la red de bancos y colecciones de germoplasma de INTA. Available in: https://www.researchgate.net/publication/260122882_Crioconservacion_de_Recursos_Fitogeneticos_en_la_Red_de_Bancos_y_Colecciones_de_Germoplasma_de_INTA_-_Argentina).

En el IBONE (Instituto de Botánica del Nordeste) se desarrollaron protocolos para bulbillos aéreos y ápices de “dientes” y se empleó el método de encapsulamiento-deshidratación con descenso térmico rápido y lento. Los ápices fueron encapsulados con 3 % de alginato de calcio. Las cápsulas fueron precultivadas en tres soluciones de concentraciones crecientes de sacarosa (0,5; 0,75; 1 M) en agitación permanente a 80 rpm. La deshidratación se realizó con gel de sílice durante 5 horas. Posteriormente, los ápices fueron colocados en el equipo de descenso programado de temperatura e introducidos en nitrógeno líquido (24 horas). Luego fueron descongelados a 30 ºC durante dos minutos, rehidratados en medios líquidos con concentración decreciente de sacarosa (0,75 y 0,5 M) y recultivados en medio Murashige y Skoog (1962) modificado. Esta metodología permitió obtener aproximadamente el 95 % de regeneración para ápices de “dientes” de 3 clones; sin embargo, los bulbillos aéreos no sobrevivieron a los tratamientos previos (6767. Mroginski L, Rey H, Dolce N, Scocchi A, Clausen A, Luna C, et al. Estado actual de las investigaciones sobre crioconservación de germoplasma vegetal en la Argentina. En América Latina y el Caribe. :53.).

3.6.1. Técnicas morfológicas

En los estudios morfológicos, los caracteres deben ser descubiertos y delimitados generalmente sin ningún criterio explícito para la selección o la codificación del carácter, por lo que tienen el potencial de ser arbitrarios. Sin embargo, tienen la ventaja de permitir un muestreo taxonómico mucho más cuidadoso que el que se realiza con análisis moleculares, lo que es importante para las revisiones sistemáticas, los estudios de la evolución del carácter y la valoración filogenética (6868. Al-Zahim M.A., Ford-Lloyd B.V., Newbury H.J. Detection of somaclonal variation in garlic (Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis. Plant Cell Reports. 1999;18(6):473–477. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050606).

Estudios realizados en ajo (6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf) evidenciaron que el clon ‘UCLA-1’ (grupo III) se destacó del resto de los materiales por presentar los mayores valores para las características relacionadas con el bulbo y el follaje. Los clones ‘AN-2’ y ‘AN-1’ (grupo I), con idéntico perfil electroforético, mostraron diferencias morfológicas, ya que ‘AN-2’ mostró en comparación con ‘AN-1’, elevados promedios para la altura y el número de hojas por planta, así como para las características masa y diámetro del bulbo.

En lo que se refiere a las características relacionadas con el follaje de la planta, el cultivar ‘PAL-1’ presentó el mayor promedio para la altura de la planta, con un valor de 59,2 cm seguido de los cultivares ‘AN-1’, ‘BO-4’ y ‘AN-2’; mientras que el cultivar ‘SAL-2’ resultó con el menor valor para esta característica del follaje(6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf).

3.6.2. Técnicas citogenéticas

Actualmente, existen técnicas citogenéticas como las llamadas FISH (hibridación in situ por fluorescencia) y GISH (hibridación in situ del genoma) en las que se hace uso de tintes para marcar regiones diferentes del ADN. Ambas técnicas se utilizan para identificar cromosomas extraños o para detectar traslocaciones (cambios de posición de partes del cromosoma) en híbridos, lo cual no es posible con las técnicas de citogenética clásica como la tinción o el bandeo (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

En estudios sobre la detección de la variación somaclonal en ajo mediante análisis citológico se examinaron los cariotipos de 75 regenerantes derivados de los cultivos de callos de tres clones de ajo parentales y se encontró que el 9,3 % eran tetraploides, el 4 % aneuploides y el 2,6 % mostró un cambio en la posición de la constricción secundaria. No se pudo demostrar ninguna asociación entre la tasa de variación de los caracteres moleculares y citológicos, ya sea al comparar cultivares o examinar regenerantes individuales (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Las diferentes concentraciones y combinaciones de reguladores del crecimiento (kinetina, ácido indol-3-ilacético, ácido 2,4-diclorofenoxiacético) en los medios de cultivo de tejidos vegetales, a bajas concentraciones, no tienen ningún efecto sobre la inducción de aberraciones mitóticas o la inhibición de la actividad mitótica en células del meristemo de la raíz de Allium sativum L. Luego de estudios realizados, se observó inhibición de la actividad mitótica, tendencia a la adherencia y aglutinación de los cromosomas y un ligero aumento en la frecuencia de aberraciones mitóticas a concentraciones más altas. Por lo que se puede decir, que los medios de cultivo de tejidos vegetales no tienen un efecto directo sobre la inducción de aberraciones mitóticas en cultivos de tejidos vegetales in vitro (6969. Dolezel J, Novák F.J. Cytogenetic effect of plant tissue culture medium with certain growth substances on Allium sativum L. meristem root tip cells. Biologia Plantarum. 1984;26(4):293-8. doi: http://doi.org/10.1007/BF02902911).

Estudios realizados para validar el uso de Allium sativum L. como un modelo de prueba sensible para genotoxicidad, evaluaron los efectos citogenéticos de una formulación comercial del insecticida piretroide, Cipermetrina, en las células del meristemo de la raíz de A. sativum. Para el ensayo citogenético, las células del meristemo de la raíz se expusieron a 1; 2; 4; 8 y 16 ppm (mg L^-1) del compuesto de prueba durante 24 h, y se procesaron inmediatamente para el análisis o se incubaron en agua durante 24 h de recuperación y luego se procesaron. Las células analizadas inmediatamente después de la exposición presentaron una inhibición significativa dependiente de la dosis del índice mitótico (IM) y la inducción de aberraciones mitóticas y cromosómicas (AM y AC). El período de recuperación de 24 h redujo el efecto del compuesto de prueba sobre el IM y el porcentaje de aberraciones; sin embargo, las células expuestas a 8 y 16 ppm mostraron una frecuencia significativa de aberraciones a pesar del período de recuperación. Los datos indicaron que dosis más elevadas de Cipermetrina producían toxicidad, AC y MA en A. sativum L (7070. Saxena PN, Chauhan LKS, Gupta SK. Cytogenetic effects of commercial formulation of cypermethrin in root meristem cells of Allium sativum L.: Spectroscopic basis of chromosome damage. Toxicology. 2005;216(2):244-52. doi: http://doi.org/10.1016/j.tox.2005.08.008).

3.6.3. Técnicas isoenzimáticas

Con el avance tecnológico ocurrido en los años 70, el uso de geles de almidón y la tinción histoquímica de las proteínas, se demostró dentro de un organismo la existencia de las isoenzimas, formas moleculares múltiples dentro de un organismo que catalizan una misma reacción. El efecto de una modificación alélica puede ser detectado con certeza, debido a un cambio de movilidad electroforética. Esta sensibilidad electroforética hizo que la técnica haya revolucionado los estudios de diversidad genética en diversas especies (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Para tales estudios se han utilizado varias estructuras de la planta, hojas, raíces o botones florales, de las cuales se obtiene un extracto crudo proteico. La técnica consiste en la separación de las enzimas del extracto crudo, en un soporte permeable (almidón, PAGE), bajo la acción de un campo eléctrico y seguido de un teñido histoquímico. La separación se realiza mediante la carga eléctrica neta, masa molecular, punto isoeléctrico y combinación de estos criterios (separación multidimensional). De este modo se separan las enzimas codificadas por genes diferentes o productos de diferentes alelos de un mismo gen (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

M tumefaciens según el ensayo histoquímico permitió detectar la actividad del gen GUS en los 30 clones obtenidos en el tratamiento de inoculación I2, el cual consistió en secar los callos al ser expuestos al aire de una campana de flujo laminar durante 10 min, después se sumergieron en la suspensión durante 5 min y se colocaron sobre una toalla de papel esterilizada, pero con diferente magnitud. El 43 % de ellas (13 colonias) mostraron una coloración azul intensa, mientras que en el resto la coloración fue más tenue (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Algunos autores evaluaron los efectos de una dosis aguda de rayos γ (10 Gy) a dientes de ajo post-latentes sobre el crecimiento interno de los brotes y los cambios en las peroxidasas y proteínas solubles hasta 100 días de almacenamiento en la oscuridad a 19±1 °C y 42±2 % de humedad relativa. La inhibición del crecimiento de brotes inducida por radiación se hizo evidente después de 25 días de tratamiento y fue sincrónica con un marcado aumento en la actividad de peroxidasa. El enfoque isoeléctrico de capa fina reveló que la radiación inducía un aumento en el número de isoenzimas de peroxidasa anódica a los 100 días, lo que sugiere modificaciones en el proceso de vascularización. Ni el contenido de proteína soluble ni el patrón de proteína se vieron afectados por la irradiación. Estos resultados se discuten en términos de un posible efecto mediador de la peroxidasa sobre la inhibición de brotes inducida por radiación en el ajo (7171. Croci CA, Argüello JA, Curvetto NR, Orioli GA. Changes in peroxidases associated with radiation-induced sprout inhibition in garlic (Allium sativum L.). International Journal of Radiation Biology. 1991;59(2):551-7. doi: http://doi.org/10.1080/09553009114550481).

3.6.4. Técnicas moleculares

El polimorfismo basado en proteínas ha sido de gran utilidad en las investigaciones realizadas en plantas, pero con el desarrollo de las tecnologías basadas en ADN, la investigación en esta área se ha visto favorecida con la disponibilidad de una mayor cantidad de marcadores, aquellos basados en Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLP) y en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Ambos métodos han derivado en múltiples técnicas como son la Amplificación de ADN al Azar (RAPD), Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP), minisatélites (VNTR) y microsatélites (SSR), entre otros (7272. Izquierdo-Oviedo H, Disotuar R, González MC, González SJ. Micropropagation of garlic (Allium sativum L.) and determination of the genetic stability of the plantlets obtained by AFLP markers. Biotecnología Aplicada. 2017;33(4):4211-8. Available in: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumenI.cgi?IDARTICULO=73723).

Estudios realizados sobre la diversidad genética de poblaciones de ajo evidenciaron que el ADN aislado de 71 muestras analizadas por la técnica de AFLP^TM detectó un alto nivel de polimorfismo para la diferenciación de las muestras en estudio. Se esperaba que las diferencias genéticas no fueran tan marcadas, debido a que se trata de una especie apomíctica obligada y exige reproducción clonal desde hace, aproximadamente, 5000 años (7373. Longo FUR, Monterroso LGM. Diversidad genética de poblaciones de ajo (Allium sativum L.) cultivadas en Guatemala, definida por marcadores de ADN. Agronomía Mesoamericana. 2007;18(1):85-92. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=5039991).

Estudios realizados con la técnica AFLP mostraron un total de 130 bandas claramente separadas. Todas las bandas cuantificadas fueron monomórficas (100 %), por lo que la distancia filogenética fue 0. Se detectó el mismo número de bandas con cada conjunto de cebadores en una planta parental recolectada en campo y en aquellas sometidas a tres tratamientos de cultivo diferentes (Medio MS, control absoluto, medio MS + ANA (0,1 mg L^-1) + Kin (8 mg L^-1), Medio MS suplementado con ANA (0,1 mg L^-1) + 2-iP (4 mg L^-1) en tres subcultivos, respectivamente. Este análisis indica que no hubo diferencias a nivel molecular entre las plántulas in vitro regeneradas en los diferentes medios de cultivo, en los tres subcultivos que se realizaron y el stock de campo, para las combinaciones de cebadores que se analizaron (7272. Izquierdo-Oviedo H, Disotuar R, González MC, González SJ. Micropropagation of garlic (Allium sativum L.) and determination of the genetic stability of the plantlets obtained by AFLP markers. Biotecnología Aplicada. 2017;33(4):4211-8. Available in: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumenI.cgi?IDARTICULO=73723).

Las técnicas empleadas para detectar variabilidad genética en las plántulas de ajo obtenidas por cultivo in vitro son muy utilizadas en todo el mundo con buenos resultados. Con el empleo de las mismas se pueden identificar cromosomas extraños, detectar traslocaciones y facilita el muestreo taxonómico de plantas mucho más cuidadoso. Además de detectar los niveles de polimorfismo a partir de tecnologías basadas en ADN.

Otros estudios mediante la combinación de cebadores de ASLSM2 produjeron 11 alelos (bandas de diferentes tamaños) entre los 25 clones de ajo evaluados. Por otro lado, la combinación de cebadores de ASLSM4 produjeron solo 1 alelo polimórfico, que estaba presente solo en los clones de ajo agrupados en los grupos AFLP VII y X. Otras combinaciones de cebadores, ASLSM1 y ASLSM3, produjeron alelos polimórficos 7 y 5, respectivamente (7474. İpek M, İpek A, Simon PW. Rapid Characterization of garlic clones with locus-specific DNA markers. Turkish journal of agriculture and forestry. 2008;32(5):357-62. Available in: https://journals.tubitak.gov.tr/agriculture/vol32/iss5/1/).

El empleo de técnicas moleculares basadas en ADN ha sido muy utilizado para evaluar la integridad genética de los bancos de germoplasma o para detectar la presencia de variaciones genéticas en materiales sometidos a un tratamiento mutagénico, por lo que se considera un gran avance en la biotecnología vegetal.

3.1. Main viruses affecting garlic cultivation

Worldwide there are 15 viruses associated with garlic cultivation belonging to five different genera (2121. Conci VC, Canavelli A, Lunello P, Di Rienzo J, Nome SF, Zumelzu G, et al. Yield losses associated with virus-infected garlic plants during five successive years. Plant Disease. 2003;87(12):1411–1415. Available in: https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS.2003.87.12.1411). These include:

Losses caused by viral infections vary and may depend, partially, on the viral agent-genotype interaction. In Argentina, Garlic Virus A caused reductions between 14 and 32 % in bulb mass and between 6 and 11 % in diameter in 'Morado-INTA' and 'Blanco-IFFIVE' varieties (2222. Megino LV, Hernando ECC, González CI, Llamas DP. Influencia de la temperatura de termoterapia: El rendimiento del cultivo del ajo. Terralia. 2009;(74):32-4. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=3113290).

In Mexico it has been reported that diseases caused by viruses can cause a yield reduction between 33-50 % and up to 30 % of bulb mass, especially when the frequency of viruses such as Onion Yellow Dwarfism (OYDV), Tobacco marbling (LYSV) and Latent Shallot (SLV), among others, is high (2323. Pérez-Moreno L, Santiago-Gómez D, Rico-Jaramillo E, Ramírez-Malagón R, Mendoza-Celedón B. Efecto de virus fitopatógenos sobre características agronómicas y calidad del ajo (Allium sativum l.), en el estado de Guanajuato, México. Revista mexicana de fitopatología. 2008;26(1):40-8. Available in: https://www.redalyc.org/pdf/612/61226107.pdf).

To reduce these sources of inoculum, the plant material must be prepared before being taken to the laboratory, in a greenhouse phase or phase 0. This involves taking the plants to a greenhouse, where for a period agrochemicals are applied to them to reduce potential sources of contamination, which can be fungi or bacteria. Among the substances used to reduce contamination are sodium hypochlorite, calcium hypochlorite, mercury (II) chloride, 70 % alcohol and hydrogen peroxide. Their use will depend on the type of plant tissue (herbaceous or woody) or the amount of contaminating inoculum present in the explant (1818. Vazquez C, Bejerano MJ, Peralta EL, Dalmau E. Metodología de desinfección de Allium sativum L para su implantacion in vitro. Cultivos Tropicales. 1997;18(3):76–79. Available in: https://ediciones.inca.edu.cu/files/anteriores/1997/3/CT18314.pdf).

The use of mercuric chloride II (HgCl₂) as a disinfecting agent is a simple, fast and effective method for obtaining viable explants free of contamination. However, its use continues to be controversial due to its high toxicity and high level of environmental contamination, in addition, it can cause problems of tissue browning.

3.2.1. Thermotherapy

The use of high temperatures (40-75 °C) to eliminate or reduce the "viral load" has been defined as the production of a progressively less suitable cellular environment for viral agents (3131. Velásquez-Valle R, Reveles Hernández M, Velásquez-Valle R, Reveles Hernández M. Efecto de la termoterapia sobre la emergencia y características vegetativas de genotipos de ajo. Revista mexicana de ciencias agrícolas. 2019;10(2):447-52. doi: http://doi.org/10.29312/remexca.v10i2.1522) and it is a step prior to the culture of meristems to provide virus-free plants. The latter is a process that requires at least five years (3232. Norris DO. Development of virus-free stock of Green Mountain Potato by treatment with malachite green. Australian Journal of Agricultural Research. 1954;5(4):658-63. doi: http://doi.org/10.1071/ar9540658).

In other studies, it was shown that the results of in vitro establishment in garlic culture were positive for OYDV (1414. Brenes-Madriz JA, Guillén-Watson AV. Establecimiento de un protocolo in vitro para el cultivo del ajo (Allium sativum L.) en Costa Rica. Revista Tecnología en Marcha. 2014;27(4):pág–49. Available in: https://repositoriotec.tec.ac.cr/handle/2238/4104), so thermotherapy was subsequently used with different thermal treatments and combined with plant tissue culture in order to eradicate the potyvirus from the seedlings. The results presented in the eight treatments of the cultivar 'Don Fermín' showed that thermotherapy in combination with tissue culture has a positive response when using as a source of explant meristematic domes of a size of approximately 1 to 2 mm because it was possible to obtain plant material free of OYDV.

The use of thermotherapy and tissue culture for the elimination of the Onion Yellow Dwarfing Virus (OYDV) showed that the "teeth" (cloves) exposed to 40 °C for 40 days did not produce any amplification product, that is, this virus did not infect the in vitro seedlings subjected to this process. It is important to mention that the tissue culture technique in combination with thermotherapy on caulinar apices (5-8 mm) of a relatively large size proved to be efficient in the elimination of OYDV (66. Carbajal Cruz NN. Termoterapia y cultivo in vitro de ajo (Allium sativum L.) para la eliminación del virus del enanismo amarillo de la cebolla. [Internet] [Masters]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 2018 [citado 29 de marzo de 2021]. 89 p. Available in: http://eprints.uanl.mx/15790/).

An alternative management method available to garlic growers is the application of high temperature directly to the bulbs to eliminate or reduce the "viral load" without damaging their germination capacity or subsequent development (3333. Ponce P, Juan N. Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. JN Pérez Ponce editor principal; editores Yelenys Alvarado Capó...[et al.]. 1998; Available in: https://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=DO2003100118). It has been proven that thermotherapy is an effective and easily applied method to reduce the amount of inoculum of the Sclerotium fungus and nematodes of the genus Ditylenchus in garlic "cloves" (3434. Wagele R. Procedimiento para influir en el crecimiento de células e individuos bacterianos, animales y vegetales. Patentans Piiche. 1978;28(41):933.).

Results obtained proved that thermotherapy has no depressive effect on future plants when they come from seeds treated between 47-49 °C; and neither is production negatively affected. Thermotherapy at 49 °C, being lethal to parasites already installed in the planting material, avoids infection of the garlic growing soil when this seed is used, which achieves a positive overall health effect (3535. Hernandez R, Fontanella J, Noa JC, Manso R, Pichardo T, Càrdenas H. Electroterapia, nuevo mètodo para el saneamiento a virus en Allium sativum L., con optimizaciòn del diagnòstico por um-elisa. 24. 1. Total de registros: 1 BD FAUSAC Ayuda MegaBase Agropecuaria Alianza SIDALC. 1991; Available in: https://catalogosiidca.csuca.org/Record/UNANI.054555).

The use of high temperatures positively influences the eradication of different viruses present in the garlic crop, both in field conditions and at laboratory level by means of tissue culture. In addition, the use of this technique avoids contamination of the soil or culture medium when using contaminated material.

3.2.2. Chemotherapy

Chemotherapy is defined as the therapy using chemical products. The first works were carried out with Malaquine green against the potato weak or latent mosaic virus (PVX) (3636. Carhuaricra E K, Olivera S J, Gonzales A J, Rodríguez L J. Introducción y multiplicación in vitro del cultivo de ajo variedad Morado Barranquino. Revista Peruana de Biología. 2012;19(3):341-4. Available in: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1727-99332012000300017&lng=es&nrm=iso&tlng=es), with very low effectiveness. Subsequently, numerous products have been used against different viruses, but in most of the substances used, non-phytotoxic doses can only reduce viral multiplication rates to a very limited extent (3737. Cafrune EE, Perotto MC, Conci VC. Effect of two Allexivirus isolates on garlic yield. Plant Disease. 2006;90(7):898-904. doi: http://doi.org/10.1094/PD-90-0898).

Some authors showed that, garlic plants cultivar 'Taiwan' from in vitro meristem culture, after the application of the chemical product Rivabirin, only 32.5 % of them presented negative reading to the presence of virus (3838. Dena Silva M. Efecto de la corriente eléctrica en la eliminación de virus del ajo (Allium sativum L.) [PhD Thesis]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 1997. Available in: http://eprints.uanl.mx/id/eprint/6391).

In results obtained with chemotherapy, the incidence of the OYDV and LYSV viruses in the garlic crop was eliminated. In the case of virus per se, it was possible to reduce its incidence up to 85-95 % (3939. Manjunathagowda DC, Gopal J, Archana R, Asiya KR. Virus-free seed production of garlic (Allium sativum L): Status and Prospects. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2017;6(6):2446–2456. Available in: https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.606.290). Other studies with the application of virazole showed 100 % of virus-free plants when 0.3 mm meristems were cultivated in a MS culture medium with 50 mg L^-1 of the product (4040. Sidaros SA, Omar RA, El-Kewey SA, El-Khalik SA. Virus elimination from infected garlic plants using different techniques. Egyptian J. Virol. 2004;1:333–341.). Other authors reported Potyvirus-free garlic plants by clove chemotherapy with Ribavirin 205 µM with a survival rate ranging from 27.0-34.8 % (4141. Ramírez-Malagón R, Pérez-Moreno L, Borodanenko A, Salinas-González GJ, Ochoa-Alejo N. Differential organ infection studies, potyvirus elimination, and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006;86(1):103-10. doi: http://doi.org/10.1007/s11240-006-9102-6).

It was demonstrated that the use of chemical compounds could positively influence the garlic crop for the elimination of different viruses, although sometimes the use of some products only manages to reduce the viral load in a low percentage. In addition, treatments with chemical products usually have to be repeated more than once.

3.2.3. Electrotherapy

The concept can be defined as the use of electric current for therapeutic purposes. It is based mainly on the phenomena caused in the tissues by the passage of electricity, i.e. heating by the joule effect and electrolysis. In practice, galvanic, faradic and alternating currents are used (3838. Dena Silva M. Efecto de la corriente eléctrica en la eliminación de virus del ajo (Allium sativum L.) [PhD Thesis]. Universidad Autónoma de Nuevo León; 1997. Available in: http://eprints.uanl.mx/id/eprint/6391).

The first experiences in the application of electric current through plant tissues, reported that they found an increase in the levels of cell and tissue regeneration. The electrotherapy to garlic "cloves" has been used in the sanitation of the viral complex of this species; it has been achieved between 53-100 % of healthy plants, when applying direct current (10-13 v) between 5-30 minutes (3535. Hernandez R, Fontanella J, Noa JC, Manso R, Pichardo T, Càrdenas H. Electroterapia, nuevo mètodo para el saneamiento a virus en Allium sativum L., con optimizaciòn del diagnòstico por um-elisa. 24. 1. Total de registros: 1 BD FAUSAC Ayuda MegaBase Agropecuaria Alianza SIDALC. 1991; Available in: https://catalogosiidca.csuca.org/Record/UNANI.054555).

Studies carried out with the use of this technique showed that doses higher than 30 V during 10 min were lethal for the garlic crop (4242. Hernandez R, Fontanella Y, Noa JC. Equipo y procedimiento de electroterapia para el saneamiento a virus en ajo (Allium sativum L.). Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, Palacio de las Convenciones; 23-27 Junio de 1997. 1997;). At the same time, other authors showed a stimulation of the growth of garlic plants by means of this technique (4343. Castro YI, Pérez RH, Noa-Carrazana JC, Pichardo T. Saneamiento al complejo viral del ajo (Allium sativum L.) mediante termoterapia y cultivo de meristemos. Cuadernos de fitopatología: Revista técnica de fitopatología y entomología. 1995;12(47):194-5. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=110011).

According to the results, the use of electric current is a favorable technique for eliminating a large part of the viral load present in the garlic crop, although it is not widely used.

3.2.4. Use of combined techniques for garlic virus sanitation

Within the field of crop protection, biotechnology is a dynamic process without which competitive agriculture cannot be carried out. Biotechnological applications include strategies aimed at pathogen detection, obtaining and maintaining pathogen-free cultivars, as well as new strategies for the control of diseases for which there are no conventional ways. In the last century, new technologies were successively incorporated that made it possible to deepen the improvement of cultivars, including interspecific crosses and in vitro cultivation (3737. Cafrune EE, Perotto MC, Conci VC. Effect of two Allexivirus isolates on garlic yield. Plant Disease. 2006;90(7):898-904. doi: http://doi.org/10.1094/PD-90-0898).

Some authors used thermotherapy, chemotherapy and meristem culture in combination to obtain garlic plants free of viruses of the Potyvirus group. Embryos were obtained from cloves (explants) that had undergone chemotherapy and plants regenerated from embryos received thermotherapy treatment. These meristems were cultured and ELISA indexed the plants obtained and it was found that thermotherapy has a negative effect on plant establishment. Nevertheless, thermotherapy in combination with meristem culture proved to be a more effective method for virus elimination (60.0-70.9 %) than meristem culture alone (64 %). However, they reported that chemotherapy was not effective for the elimination of the Potyvirus group (4141. Ramírez-Malagón R, Pérez-Moreno L, Borodanenko A, Salinas-González GJ, Ochoa-Alejo N. Differential organ infection studies, potyvirus elimination, and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006;86(1):103-10. doi: http://doi.org/10.1007/s11240-006-9102-6).

Other authors tested electrotherapy, thermotherapy, chemotherapy, or meristem dissection (in vitro culture) methods to eliminate OYDV from Allium sativum L (4444. Soliman AM, Mahmoud SYM, Dawood RA. Molecular characterization of onion yellow dwarf virus (garlic isolate) with production of virus-free plantlets. International Journal of Virology. 2012;8(1):61-70. DOI: http://doi.org/10.3923/ijv.2012.61.70). They combined electro- and chemotherapy methods (15 mA/10 min + 20 mg L^-1 Virazol) and obtained the best results, 85 % of the surviving seedlings were free of OYDV.

In studies (4545. CONCI VC. Virus de ajo, diagnóstico y obtención de plantas libres. Agro de Cuyo, Jornadas.(1): 59-60, 1991. 1991;) garlic "cloves" were treated for sanitation with hot water and air in growth chamber and greenhouse. The hot water treatments were 50 and 55 °C for 5, 15 and 20 minutes, with an efficiency of only 13 % sanitation. With hot air, a temperature of 36 °C was applied for 30, 40 and 60 days; the percentage of regeneration decreased as the application time increased and the efficiency of sanitation increased, reaching up to 100 % with 60 days of application.

3.2.5 Techniques used for virus diagnosis in garlic

Reliable, rapid and cost-effective methods for the detection of garlic viruses play an important role in the control and management of viral diseases. Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) have been used for the diagnosis of garlic viruses (4646. Nam M, Lee Y-H, Park CY, Lee M-A, Bae Y-S, Lim S, et al. Development of Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of Garlic Viruses and the Incidence of Garlic Viral Disease in Garlic Genetic Resources. The Plant Pathology Journal. 2015;31(1):90-6. doi: http://doi.org/:10.5423/PPJ.NT.10.2014.0114). However, the antisera used in the ELISA method are not always available for all viruses and their diagnosis becomes complex due to multiple viral infections; in contrast, RT-PCR has been shown to be more sensitive by detecting viruses at very low concentrations (4747. Walkey DGA, Webb MJW, Bolland CJ, Miller A. Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum L.) by meristem-tip culture. Journal of Horticultural Science. 1987;62(2):211-20. doi: http://doi.org/10.1080/14620316.1987.11515771).

For the detection of viral complexes in the garlic crop (4848. Smékalová K, Stavlíková H, Dušek K. Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Pathology. 2010;92(1):273-4. doi: http://doi.org/10.4454/jpp.v92i1.43), the enzyme immunoadsorption technique (ELISA) was used. By means of this test, the presence of five viruses was observed: Potyviruses: Leek Yellow Streak Virus (LYSV) and Onion Yellow Dwarfing Virus (OYDV); Carlaviruses: Shallote Latent Virus (SLV) and Garlic Common Latent Virus (GCLV); and Tospovirus: Iris Yellow Streak Virus (IYSV) in the foliage of the ecotypes evaluated. In three different sampling dates, it was detected that LYSV had a frequency of 100, 100 and 100 %; in OYDV the sampling frequencies were 50, 75 and 77.7 %; in SLV 19.4, 30.5 and 0 %; in GCLV 100, 97.2 and 91.6 %; and in IYSV 0.0, 2.7 and 22.2 %.

Studies carried out on this crop (4949. Bhojwani SS, Dantu PK. Micropropagation. En: Bhojwani SS, Dantu PK, editores. Plant Tissue Culture: An Introductory Text [Internet]. India: Springer; 2013 [citado 29 de marzo de 2021]. p. 245-74. doi: http://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9_17) revealed for the 54 samples analyzed by RT-PCR the presence of two to five viruses in each plant, with a co-infection rate of 100 %. Two samples (3.7 %) contained 2 viruses, six samples (11.11 %) contained 3 viruses, ten samples (18.52 %) contained 4 viruses and 36 samples (66.67 %) contained 5 viruses. The garlic varieties 'Tigre' and 'Fermín' showed a higher frequency of viruses than the variety 'California'.

3.3.1. Use of traditional growth regulators

Studies showed that shoot initiation occurred in 98 % of the apices grown in the MS basal culture medium salts supplemented with 0.5 mg L^-1 of 2-iP and 0.1 mg L^-1 of ANA, which allowed the development of only one shoot per test tube with an average height between 4-4.6 cm. The maximum height was observed in treatment T2 (0.01 mg L^-1 of 2.4-D and 5 mg L^-1 of Kin). It is with 9.9 cm height, followed by T3 (0.01 mg L^-1 of 2.4-D and 5 mg L^-1 of 6-BAP) with 8.2 cm, while in T3 the highest number of shoots per callus was obtained (3.9) followed by T2 with 2.2 shoots per callus. In the absence of growth regulators [T1 (MS)] there was no caulogenesis. These results indicated that the composition of the nutrient medium had an impact on the ability to regenerate shoots. In this regard, a higher proportion of cytokinins (Kin, 6-BAP) than auxins (2,4-D) was required in the growth medium. In this case, cytokinins seem to play a specific role for shoot regeneration from callus, probably by determining the differentiation pathway toward caulogenesis (5555. Donoso-Huaral IEEA. Producción de semilla de ajo, empleando la técnica de micropropagación en el Perú. 2013; Available in: http://162.248.52.172:8080//jspui/handle/inia/506).

Although 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is an auxin that at low concentrations can favor shoot induction, its use in micropropagation processes is not recommended because it can induce genetic variability in the regenerants obtained.

In garlic cultivation, the ecotype 'Colorado de Mendoza' achieved the highest number of roots (2.5 roots) with the basal culture medium MS salts (Murashige and Skoog with synthetic vitamins). The culture medium MSM + EQ (Modified Murashige and Skoog salts, substitution of KNO₃, MgSO₄, NH₄NO_e + quinoa extract) was the one that obtained the lowest number of roots, one on average (5656. Tyagi RK, Agrawal A, Mahalakshmi C, Hussain Z, Tyagi H. Low-cost media for in vitro conservation of turmeric (Curcuma longa L.) and genetic stability assessment using RAPD markers. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 2007;43(1):51-8. doi: http://doi.org/10.1007/s11627-006-9000-y). The ecotype 'Rosado de Italia' achieved the highest average root number (3.3 roots) in the presence of MSM culture medium (Murashige and Skoog Salts Modified, KNO₃, MgSO₄, NH₄NO₃ substitution), while MSM +EQ culture medium obtained the lowest root number (1.6 roots) (5757. Kamenetsky R, Rabinowitch HD. The genus Allium: A developmental and horticultural analysis. Horticultural reviews-westport then New York-. 2006;32:329. Available in: https://doi.org/10.1002/9780470767986.ch7).

The MSM culture medium (Murashige, and Skoog Modified with commercial salts) supplemented with the growth regulators Kinetin (1 mg L^-1) and Indolaceic Acid (2 mg L^-1) showed a higher regeneration of adventitious shoots. An average of 2.1 shoots per explant was reached for the ecotype 'Colorado de Mendoza' and one (1) shoot per explant for the ecotype 'Rosado de Italia' (5757. Kamenetsky R, Rabinowitch HD. The genus Allium: A developmental and horticultural analysis. Horticultural reviews-westport then New York-. 2006;32:329. Available in: https://doi.org/10.1002/9780470767986.ch7).

3.3.2. Use of growth biostimulators

Biobras-6^® and Pectimorf^® can be used as growth regulators in all phases of micropropagation of garlic clone 'Criollo-9'. The combination of IAA (0.1 mg L^-1) and Biobras-6^® (0.05 mg L^-1) or IAA (0.5 mg L^-1) and Pectimorf^® (1 mg L^-1) increased the in vitro establishment of caulinar apices and decreased the time the explants remained in the culture medium by three to four days compared to the control treatment (IAA and 6-BAP). The combinations ANA (0.3 mg L^-1) and Biobras-6^® (2 mg L^-1) and IAA (0.5 mg L^-1) and Pectimorf^® (10 mg L^-1) were better for obtaining multiple shoots. Survival and rooting during acclimatization of microbulbils was superior with prior immersion in Biobras-6^® (1 mg L^-1) or Pectimorf^® (10 mg L^-1) for 15 min and subsequent planting in a substrate composed of charged zeolite [Litonite] (25 %) and organic matter [decomposed cachaça] (75 %). Agronomic evaluations showed that Biobras-6^® produced a yield of 12.42 and Pectimorf^® 11.67 t ha-1, higher by 4.47 and 2.72 t ha-1, respectively in relation to the control plants (22. Izquierdo Oviedo H, Gómez O. Criollo-9, un cultivar de ajo resistente a las enfermedades fitopatógenas y elevado potencial de rendimiento. Cultivos Tropicales. 2012;33(2):68-68. Available in http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362012000200010&lng=es&nrm=iso).

Other studies with the use of sucrose showed that the behavior of in vitro garlic seedlings and microbulblets of different genotypes ('Criollo-9', 'Martinez', 'Criollo-6', Criollo-3' and 'Vietnamita') with respect to the percentage of survival in the acclimatization phase, the most effective response was obtained from microbulblets induced in vitro with 75 g L^-1 of sucrose. In the case of in vitro seedlings, survival ranged between 39.50-49.62 % and for microbulblets between 90.70-94.95 %, the best values were achieved by the clones 'Criollo-9' and 'Martinez' with 94.95 and 93.56 %, respectively (1717. Izquierdo H, Quiñones Y, Disotuar R, Pedroso D. Evaluación de diferentes sustratos en la aclimatización de vitroplantas y microbulbillos de ajo (Allium sativum L.). Cultivos Tropicales. 2002;23(3):63–69. Available in: https://link.gale.com/apps/doc/A146790764/AONE?u=anon~e52262bd&sid=googleScholar&xid=bb3f669f).

3.5.1. Medium-term

In short-term storage, explants remain in vitro for up to 12 months, with management of the culture conditions to delay growth and increase the intervals between subcultures (6060. Benson EE, Johnston J, Muthusamy J, Harding K. Physical and engineering perspectives of in vitro plant Cryopreservation. En: Gupta SD, Ibaraki Y, editores. Plant tissue culture engineering [Internet]. Dordrecht: Springer Netherlands; 2008 [citado 29 de marzo de 2021]. p. 441-76. (Focus on Biotechnology). doi: http://doi.org/10.1007/978-1-4020-3694-1_24).

Results showed that at a temperature of 60 ºC, a reduction in the growth rate of the garlic crop was observed, since more time was required for the plants to reach a height of 5 cm, for bulbification to become evident and for profuse rooting to occur (3-5 roots). The effect of lowering the storage temperature on rooting was remarkable, as the time to reach rooting was approximately 5 times the time required at 24 ºC. The contamination observed was low, so it does not seem to be a limiting aspect. The culture medium content in the test tubes decreased by 25 % with respect to the initial one, so that the seedlings reached one year of preservation and approximately 75 % of the culture medium content was still present (6161. García-Águila L, Feria M de, Acosta K. Aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal. Biotecnología Vegetal [Internet]. 2007 [citado 29 de marzo de 2021];7(2). Available in: https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/359).

Other studies on in vitro preservation (6262. Pardo A, Rivero S, Alvarado G. Conservación in vitro de microbulbos de ajo (Allium sativum L.). Bioagro. 2014;26(2):115–122. Available in: http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1316-33612014000200006&lng=es&nrm=iso) reported that during the cultivation of A. sativum L. microbulbs in five in vitro preservation media stored at ¼ MS with 45 g L^-1 sucrose (T4) showed survival percentages of 86.6, 76.6 and 73.3 % at 150, 180 and 210 days, respectively. Likewise, they registered the best vigor with average values of 1.16, 0.93 and 1.04 according to the established scale (1 = 75 % defined bulbs; 2 = 50 % defined bulbs; 3 = 25 % defined bulbs and 4 = absence of bulbs or undefined bulbs) at 150, 180 and 210 days of evaluation, respectively.

Other studies showed that, with respect to the bulbing index, all garlic plants stored at 24 ºC had bulbed at 4 months of storage. At 6 ºC, bulbing was not observed until 6 months and bulbing of all plants was observed at 10 months (6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf).

3.5.2. Long-term

Long-term storage is very safe and it is used extensively in agriculture, horticulture, and forestry for research and environmental monitoring. Long-term storage is considered a useful practice to avoid somaclonal variation in vegetatively propagated plants and allows keeping explants unaltered under these conditions (6464. Makowska Z, Keller J, Engelmann F. Cryopreservation of apices isolated from garlic (Allium sativum L.) bulbils and cloves. Cryo-Letters. 1999;20(3):175-82. Available in: http://www.documentation.ird.fr/hor/fdi:010018253).

Studies showed that shoot cultures of three garlic cultivars were maintained at various temperatures and media to maintain viability without subculturing (6565. El-Gizawy AM, Ford-Lloyd BV. An in vitro method for the conservation and storage of garlic (Allium sativum L.) germplasm. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987;9(2):147-50. doi: http://doi.org/10.1007/BF00044250). As a result, a high level of viability was recorded after 16 months of cultivation at 4 °C with 100 g L^-1 sucrose in B-5 medium.

3.5.3. Cryopreservation

Cryopreservation allows the storage of living plant cells, tissues or organs at extremely low temperatures (-80 °C). This technique allows storage for prolonged periods (greater than one year) with the use of liquid nitrogen (NL), which is normally at -196 °C. On some occasions, NL is combined with other inert gases (such as helium and argon) (5959. Pardo A, Hernández A, Méndez N. Caracterización molecular de siete clones de ajo (Allium sativum L.) mediante la técnica rapd. Bioagro. 2009;21(2):81-6. Available in: http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1316-33612009000200001&lng=es&nrm=iso&tlng=es).

In the case of garlic clones 'Castaño INTA', 'Sureño INTA' and 'Morado INTA', 96.7, 92.9 and 89.3 % of sprouted explants were obtained, respectively, when "clove" apices were cryopreserved using the frozen drop methodology (6666. Castelar I. Crioconservación de recursos fitogenéticos en la red de bancos y colecciones de germoplasma de INTA. Available in: https://www.researchgate.net/publication/260122882_Crioconservacion_de_Recursos_Fitogeneticos_en_la_Red_de_Bancos_y_Colecciones_de_Germoplasma_de_INTA_-_Argentina).

Protocols for aerial bulblets and "tooth" apices were developed at IBONE (Institute of Botany of the Northeast), and the encapsulation-dehydration method with rapid and slow thermal descent was employed. Apices were encapsulated with 3 % calcium alginate. The capsules were pre-cultured in three solutions of increasing sucrose concentrations (0.5; 0.75; 1 M) under permanent agitation at 80 rpm. Dehydration was carried out with silica gel for 5 hours. Subsequently, the apices were placed in the programmed temperature lowering equipment and were placed in liquid nitrogen (24 hours). They were then thawed at 30 ºC for two minutes, rehydrated in liquid media with decreasing sucrose concentration (0.75 and 0.5 M) and recultured in modified Murashige and Skoog (1962) medium. This methodology allowed obtaining approximately 95 % regeneration for apices of "teeth" of 3 clones; however, aerial bulblets did not survive the previous treatments (6767. Mroginski L, Rey H, Dolce N, Scocchi A, Clausen A, Luna C, et al. Estado actual de las investigaciones sobre crioconservación de germoplasma vegetal en la Argentina. En América Latina y el Caribe. :53.).

3.6.1. Morphological Techniques

In morphological studies, characters must be discovered and be delimited usually without any explicit criteria for selection or character coding, so they have the potential to be arbitrary. However, they have the advantage of allowing much more careful taxonomic sampling than molecular analyses, which is important for systematic reviews, studies of character evolution, and phylogenetic assessment (6868. Al-Zahim M.A., Ford-Lloyd B.V., Newbury H.J. Detection of somaclonal variation in garlic (Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis. Plant Cell Reports. 1999;18(6):473–477. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050606).

Studies on garlic (6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf) showed that the clone 'UCLA-1' (group III) stood out from the rest of the materials for having the highest values for bulb and foliage characteristics. Clones 'AN-2' and 'AN-1' (group I), with identical electrophoretic profile, showed morphological differences, since 'AN-2' showed in comparison with 'AN-1', high averages for height and number of leaves per plant, as well as for bulb characteristics such as mass and diameter.

Regarding the characteristics related to plant foliage, cultivar 'PAL-1' presented the highest average for plant height, with a value of 59.2 cm followed by cultivars 'AN-1', 'BO-4' and 'AN-2'; while cultivar 'SAL-2' resulted with the lowest value for this foliage characteristic(6363. Torres M de los A, Font A, López MR, Rodríguez AJ, Capote A, Llorente O. Conservación de semilla de ajo por métodos biotecnológicos. Available in: https://www.grupoagricoladecuba.gag.cu/media/Agrotecnia/pdf/2007/Revista2/28.pdf).

3.6.2. Cytogenetic techniques

Currently there are cytogenetic techniques such as FISH (fluorescence in situ hybridization) and GISH (genome in situ hybridization) in which dyes are used to mark different regions of the DNA. Both techniques are used to identify foreign chromosomes or to detect translocations (changes in the position of parts of the chromosome) in hybrids, which is not possible with classical cytogenetic techniques such as staining or banding (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Studies on the detection of somaclonal variation in garlic by cytological analysis examined the karyotypes of 75 regenerants derived from callus cultures of three parental garlic cloves and found that 9.3 % were tetraploid, 4 % aneuploid, and 2.6 % showed a change in the position of the secondary constriction. No association could be demonstrated between the rate of variation in molecular and cytological characters, either when comparing cultivars or examining individual regenerants (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Different concentrations and combinations of growth regulators (kinetin, indole-3-ylacetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid) in plant tissue culture media at low concentrations have no effect on the induction of mitotic aberrations or inhibition of mitotic activity in Allium sativum L. meristem root tip cells. After studies, inhibition of mitotic activity, tendency to chromosome adhesion and agglutination, and a slight increase in the frequency of mitotic aberrations were observed at higher concentrations. Thus, it can be said that plant tissue culture media do not have a direct effect on the induction of mitotic aberrations in in vitro plant tissue cultures (6969. Dolezel J, Novák F.J. Cytogenetic effect of plant tissue culture medium with certain growth substances on Allium sativum L. meristem root tip cells. Biologia Plantarum. 1984;26(4):293-8. doi: http://doi.org/10.1007/BF02902911).

Studies conducted to validate the use of Allium sativum L. as a sensitive test model for genotoxicity evaluated the cytogenetic effects of a commercial formulation of the pyrethroid insecticide, cypermethrin, on root meristem cells of A. sativum. For the cytogenetic assay, root meristem cells were exposed to 1; 2; 4; 8 and 16 ppm (mg L^-1) of the test compound for 24 h, and either processed immediately for analysis or incubated in water for 24 h recovery and then processed. Cells analyzed immediately after exposure exhibited significant dose-dependent inhibition of mitotic index (MI) and induction of mitotic and chromosomal aberrations (MA and CA). The 24-h recovery period reduced the effect of the test compound on MI and the percentage of aberrations; however, cells exposed at 8 and 16 ppm showed a significant frequency of aberrations despite the recovery period. The data indicated that higher doses of cypermethrin produced toxicity, CA and MA in A. sativum L (7070. Saxena PN, Chauhan LKS, Gupta SK. Cytogenetic effects of commercial formulation of cypermethrin in root meristem cells of Allium sativum L.: Spectroscopic basis of chromosome damage. Toxicology. 2005;216(2):244-52. doi: http://doi.org/10.1016/j.tox.2005.08.008).

3.6.3. Isoenzymatic techniques

With the technological advances of the 1970s, the use of starch gels and histochemical staining of proteins, the existence of isoenzymes, multiple molecular forms within an organism that catalyze the same reaction, was demonstrated within an organism. The effect of an allelic modification can be detected with certainty, due to a change in electrophoretic mobility. This electrophoretic sensitivity has led to the technique revolutionizing genetic diversity studies in various species (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

For these studies, several plant structures have been used, such as leaves, roots or flower buds, from which a crude protein extract is obtained. The technique consists of the separation of enzymes from the crude extract, on a permeable support (starch, PAGE) under the action of an electric field and followed by histochemical staining. Separation is performed by net electrical charge, molecular mass, isoelectric point and combination of these criteria (multidimensional separation). This separates enzymes encoded by different genes or products of different alleles of the same gene (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

M tumefaciens according to the histochemical assay allowed detecting the activity of the GUS gene in the 30 clones obtained in the inoculation treatment I2, which consisted of drying the corns when exposed to the air of a laminar flow hood for 10 min. Then it immersed in the suspension for 5 min and placed on a sterilized paper towel, but with different magnitude. Forty-three percent of them (13 colonies) showed intense blue coloration, while in the rest the coloration was fainter (5454. Fortiz EL. Transformación genética de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. 2009; Available in: https://docplayer.es/26467271-Transformacion-genetica-de-ajo-allium-sativum-l-mediante-agrobacterium-tumefaciens.html).

Some authors evaluated the effects of an acute dose of γ-rays (10 Gy) to post-latent garlic cloves on shoot ingrowth and changes in peroxidases and soluble proteins up to 100 days of storage in the dark at 19±1 °C and 42±2 % relative humidity. Radiation-induced inhibition of shoot growth was evident after 25 days of treatment and was synchronous with a marked increase in peroxidase activity. Thin-layer isoelectric focusing revealed that radiation induced an increase in the number of anodic peroxidase isoenzymes at 100 days, suggesting modifications in the vascularization process. Neither soluble protein content nor protein pattern was affected by irradiation. These results are discussed in terms of a possible mediating effect of peroxidase on radiation-induced shoot inhibition in garlic (7171. Croci CA, Argüello JA, Curvetto NR, Orioli GA. Changes in peroxidases associated with radiation-induced sprout inhibition in garlic (Allium sativum L.). International Journal of Radiation Biology. 1991;59(2):551-7. doi: http://doi.org/10.1080/09553009114550481).

3.6.4. Molecular Techniques

Protein-based polymorphism has been very useful in plant research, but with the development of DNA-based technologies, research in this area has been favored with the availability of a larger number of markers, those based on Restriction Fragment Polymorphism (RFLP) and Polymerase Chain Reaction (PCR). Both methods have led to multiple techniques such as Random DNA Amplification (RAPD), Amplified DNA Polymorphic Fragments (AFLP), minisatellites (VNTR) and microsatellites (SSR), among others (7272. Izquierdo-Oviedo H, Disotuar R, González MC, González SJ. Micropropagation of garlic (Allium sativum L.) and determination of the genetic stability of the plantlets obtained by AFLP markers. Biotecnología Aplicada. 2017;33(4):4211-8. Available in: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumenI.cgi?IDARTICULO=73723).

Studies on genetic diversity of garlic populations showed that DNA isolated from 71 samples analyzed by the AFLPTM technique detected a high level of polymorphism for the differentiation of the samples under study. It was expected that the genetic differences would not be so marked, because this is an obligate apomictic species and has required clonal reproduction for approximately 5000 years (7373. Longo FUR, Monterroso LGM. Diversidad genética de poblaciones de ajo (Allium sativum L.) cultivadas en Guatemala, definida por marcadores de ADN. Agronomía Mesoamericana. 2007;18(1):85-92. Available in: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=5039991).

Studies performed with the AFLP technique showed 130 clearly separated bands. All quantified bands were monomorphic (100 %), so the phylogenetic distance was zero. The same number of bands was detected with each set of primers in a field-collected parental plant and in those subjected to three different culture treatments (MS medium, absolute control; MS medium + ANA (0.1 mg L^-1) + Kin (8 mg L^-1); MS medium supplemented with ANA (0.1 mg L^-1) + 2-iP (4 mg L^-1) in three subcultures, respectively. This analysis indicates that there were no differences at the molecular level between the in vitro seedlings regenerated in the different culture media, in the three subcultures that were performed and the field stock, for the primer combinations that were analyzed (7272. Izquierdo-Oviedo H, Disotuar R, González MC, González SJ. Micropropagation of garlic (Allium sativum L.) and determination of the genetic stability of the plantlets obtained by AFLP markers. Biotecnología Aplicada. 2017;33(4):4211-8. Available in: https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumenI.cgi?IDARTICULO=73723).

The techniques used to detect genetic variability in garlic seedlings obtained by in vitro culture are widely used worldwide with good results. With the use of these techniques, foreign chromosomes can be identified, translocations can be detected, and taxonomic sampling of plants is much more careful. In addition to detecting polymorphism levels from DNA-based technologies.

Other studies using the ASLSM2 primer combination produced 11 alleles (bands of different sizes) among the 25 garlic clones evaluated. On the other hand, the combination of ASLSM4 primers produced only one polymorphic allele, which was present only in garlic clones clustered in AFLP groups VII and X. Other primer combinations, ASLSM1 and ASLSM3, produced 7 and 5 polymorphic alleles, respectively (7474. İpek M, İpek A, Simon PW. Rapid Characterization of garlic clones with locus-specific DNA markers. Turkish journal of agriculture and forestry. 2008;32(5):357-62. Available in: https://journals.tubitak.gov.tr/agriculture/vol32/iss5/1/).

The use of DNA-based molecular techniques has been widely used to detect the genetic integrity of germplasm banks or to detect the presence of genetic variation in materials subjected to mutagenic treatment, and therefore is considered a breakthrough in plant biotechnology.