Introducción

El frijol (Phaseolus vulgaris L.), es la especie del género Phaseolus más cultivada en los trópicos y subtrópicos de América Latina, el Caribe y África, principalmente por ser fuente de proteínas, vitaminas y minerales, que lo ubican entre los cinco cultivos con mayor superf icie dedicada a la agricultura en los países latinoamericanos (11. Colás, A., Díaz, B., Rodríguez, A., Gatorno, S. y Rodríguez, O. (2018). Efecto de la biofertilización en la morfofisiología y rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Ctro. Agríc., 45, 34-42.).

En Cuba, constituye uno de los platos indispensables en el menú cubano, siendo el frijol negro el más común en la comida criolla (22. Chazan, M. (2008). World Prehistory and Archaeology: Pathways through Time. Pearson Education, Inc. ISBN 0-205-40621-1.). A pesar de su importancia y el hecho que es un cultivo tradicional, es necesario incrementar la productividad de las plantas de manera sostenible, con baja cantidad de recursos y con los mejores estándares de calidad (33. Rivera, R.; Calderón, A.; Nápoles, M.C.; Ruiz, L.; Simo, J.; Plana, R. (2012). La validación a escala productiva del biofertilizante EcoMic® y su aplicación conjunta con rizobios en el cultivo del frijol, en centro y occidente del país. Disponible en: https://scholar.google.com.cu/scholar?q=Rivera+2012+validacion+productiva+del+biofertilizante&hl=es&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholar#d=gs_qabs&t=1656518913656&u=%23p%3Dbf9PtcqgG20J). Sin embargo, la producción nacional no satisface las demandas de la población, pues existe necesidad de importar anualmente 14 400 toneladas de este grano (44. ONEI (Oficina Nacional de Estadística e Información). (2019). Anuario Estadístico de Cuba 2018. En: Agricultura. La Habana, Cuba. Disponible en: http://www.one.cu/aec2017/09%20Agriculhtura.).

En este contexto, los biofertilizantes representan un medio sustentable, económicamente atractivo y ecológicamente aceptable para reducir los insumos externos y mejorar la cantidad y calidad de los productos agrícolas, mediante la utilización de microorganismos del suelo debidamente seleccionados, capaces de poner a disposición de las plantas, mediante su actividad biológica, una parte importante de los nutrimentos que se necesitan para su desarrollo, así como suministrar sustancias hormonales o promotoras del crecimiento (55. Martínez, R.; Dibut, B. (2012). Biofertilizantes bacterianos. Editorial Científico-Técnica, La Habana, Cuba. ISBN 978-959-05-0659-8.).

Entre los biofertilizantes más empleados se encuentran los hongos micorrizicos arbusculares (HMA) y los rizobios, que se asocian de manera simbiótica con la planta y generan un intercambio positivo de nutrimentos, en el cual la planta suministra carbohidratos a los simbiontes y éstos a su vez, favorecen la absorción y translocación de agua y nutrimentos; entre ellos, fósforo, cinc y cobre, la fijación biológica del nitrógeno, protección contra patógenos de las raíces y tolerancia de las plantas a diversos estreses bióticos y abióticos (66. Wilches, W.; Ramírez, M.; Pérez, U.; Serralde, D.; Peñaranda, A. y Ramírez, L. (2019). Association of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) with sugarcane plants (Saccharum officinarum) for panela production in Colombia. Terra Latinoamericana, 37, 175-184. doi: https://doi.org/10.28940/terra.v37i2.481).

En la coinoculación rizobios - HMA - leguminosas se ha informado que las relaciones simbióticas proporcionan un mayor intercambio entre los simbiontes y efectos superiores a las plantas. En este caso la simbiosis rizobios - leguminosas aporta N₂ y las micorrizas incrementan la absorción de otros elementos, entre ellos el P, muy importante para garantizar una adecuada fijación biológica de N, aumentan el número, masa seca en los nódulos y el crecimiento de las plantas (77. Martín, G.M.; Tamayo, Y.; Hernández, M.; Varela y da Silva, E. (2017). Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de ¹⁵N y diferencia de N total. Cult. Tropic., 38, 122–130.).

Teniendo en cuenta esta problemática, la presente investigación fue encaminada a determinar la mejor combinación de cepas de rizobios y cepas de hongos micorrízicos arbusculares en dos cultivares de CC25-9 negro y Lewa en un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado.

Materiales y métodos

Los experimentos se desarrollaron en el Departamento de Servicios Agrícolas (finca Las Papas), del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), ubicado en los 23º01´Latitud Norte y 82º08´Longitud Oeste, a 138 msnm. El experimento se efectuó sobre un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado, según la Clasificación de los Suelos de Cuba (88. Hernández, A.; Pérez, J.; Bosch, M.; Castro, D. (2015). Nueva versión de clasificación genética de los suelos de Cuba. Ediciones INCA. Mayabeque, Cuba. ISBN 978-959-7023-77-7.). Se realizó un muestreo inicial de suelo para determinar algunas propiedades químicas, por los siguientes métodos (99. Paneque, V. M.; Calaña, J. M.; Calderón, M.; Borges, Y.; Hernández, T. C. y Caruncho, M. (2010). Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Ediciones INCA. 160 p, ISBN: 978-959-7023-51-7.): pH (H₂O) por el método potenciométrico, con relación suelo:solución de 1:2,5; materia orgánica (% M.O) por el método de Walkley y Black; P asimilable por extracción con H₂SO₄ 0,1 N con relación suelo:solución 1:2,5; cationes intercambiables (cmol kg^-1) por extracción con NH₄Ac 1 Mol L^-1 a pH 7 y determinación por complexometría (Ca y Mg) y fotometría de llama (K y Na). Las características agroquímicas del suelo donde se sembró el experimento se muestran en la tabla 1.

Las determinaciones del conteo de esporas de hongos micorrizógenos arbusculares se realizó por el método de tamizado en húmedo y decantado, la toma de muestra se realizó antes de la siembra.

En el experimento se sembraron dos cultivares de frijol: Cuba Cueto 25-9 (CC25-9 N), el color de la testa del grano es negro, la fecha de siembra recomendada para este cultivar es del 1^ro de octubre al 30 de noviembre y Lewa, el color de la testa del grano es blanco, la fecha de siembra recomendada para esta variedad es del 1^ro de octubre al 30 de enero.

Se emplearon dos cepas de HMA, las cuales proceden del cepario del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA): Glomus cubense, cepa INCAM-4 y Rhizophagus irregularis cepa INCAM-11.

Respecto a las cepas de rizobios, se emplearon tres cepas para frijol: cepa CF 1 (Rhizobium leguminosarum), cepa PRF 81 (Rhizobium freirei) y cepa CIAT 899 (Rhizobium tropici), procedentes del cepario del Departamento de Fisiología y Bioquímica del INCA.

Las semillas de cada cultivar se embebieron en el inoculante a base de rizobios correspondiente a cada tratamiento en una dosis equivalente a 200 mL ha^-1. El testigo sin inoculación se embebió en agua corriente. La aplicación de los Hongos Micorrizógenos Arbusculares se realizó con una dosis equivalente al 8 % de la masa total de la semilla a inocular, espolvoreando el producto sobre la semilla húmeda a sembrar, las semillas inoculadas de cada tratamiento se pusieron a secar a la sombra y posteriormente se procedió a la siembra.

Los experimentos estaban compuestos por un total de 48 parcelas cada uno, cada parcela estaba constituida por 6 surcos de 5 m de largo por 4,2 m de ancho, con una distancia de camellón de 70 cm.

En el experimento se empleó un diseño experimental en bloques al azar con cuatro réplicas, en un arreglo bifactorial. Los factores en estudio fueron tres niveles de inoculación micorrízica (dos cepas y un control sin inoculación) y cuatro niveles de inoculación con rizobios (tres cepas y un control sin inoculación), para un total de doce tratamientos. Los experimentos se realizaron en condiciones de campo en el período comprendido entre diciembre de 2018 a marzo 2019. Se aplicó la fórmula completa NPK (9-13-17) a razón de 200 kg ha, en el fondo del surco antes de la siembra en todos los tratamientos evaluados.

De los 35 a 45 días de sembrado el cultivo, en etapa de prefloración, se tomaron las plantas centrales de 1 m lineal en cada tratamiento y en cada réplica. Se midieron las variables de crecimiento: altura de la planta (cm), diámetro del tallo (mm), masa seca del tallo y hojas (g). En el momento de la cosecha se evaluaron el rendimiento y sus componentes: número de vainas por plantas, número de granos por planta, masa de 100 granos (g) y el rendimiento (t ha^-1).

Para el análisis estadístico, primeramente, se comprobó la normalidad de los datos y la homogeneidad de la varianza de las variables evaluadas. Con posterioridad se realizó un análisis de varianza a los datos obtenidos, en función del diseño experimental, comparando los tratamientos y sus interacciones.

En el caso que las interacciones fueran significativas las medias de los tratamientos fueron comparadas por la prueba de Rango Múltiple de Duncan (p≤0,1). Se empleó el programa STATGRAPHICS Centurión XV. II.

Resultados

Al analizar el comportamiento morfológico de las plantas en los cultivares en estudio (Tabla 2) se encontró interacción entre los factores (inoculación de rizobios y HMA) para las dos variables evaluadas, y se evidenció un comportamiento diferente en cada tratamiento con respecto a la altura de las plantas y el diámetro del tallo.

En las inoculaciones simples de los rizobios en la altura de las plantas y el diámetro del tallo para los diferentes cultivares, se encontró un comportamiento diferenciado entre los cultivares. En el cultivar CC25-9 N todas las cepas de rizobios provocaron alturas superiores al testigo y sin diferencias significativas entre estas. En el cultivar Lewa solo se encontró respuesta significativa a la aplicación de la cepa CIAT 899 con respecto al testigo sin inocular. Mientras que en el diámetro del tallo, en el cultivar CC 25-9 N la inoculación de las tres cepas de rizobios provocó aumentos de la variable respecto al testigo. En el cultivar Lewa no se encontraron diferencias entre las cepas de rizobios en estudio y el testigo sin inocular.

Respecto a la inoculación con las cepas de HMA, se encontró que la altura de la planta fue superior con la inoculación de ambas cepas de micorrizas respecto al testigo sin inocular en los dos cultivares. Es de resaltar que en el cultivar Lewa la inoculación simple de INCAM 11 fue superior a cualquiera de las coinoculaciones estudiadas. Respecto al diámetro del tallo a las aplicaciones simples de HMA, la inoculación de INCAM 11 provocó un aumento del valor de la variable en ambos cultivares.

En relación con la coinoculación, la efectividad de la misma en la altura de las plantas varió con los cultivares. Para el cultivar CC 25-9 N la coinoculación presentó mayores incrementos de la variable con las combinaciones INCAM 4+PRF 81, INCAM 11+PRF 81 e INCAM 11+CIAT 899. En cuanto al cultivar Lewa, las mayores alturas de las plantas se encontraron con la coinoculación de INCAM 11+CIAT 899, INCAM 11+CF 1 e INCAM 4+CF 1, aunque todas estas combinaciones fueron semejantes a la inoculación simple de INCAM 11.

Los mayores valores de diámetro del tallo en el cultivar CC 25-9 N se encontraron en las combinaciones INCAM 4+CF 1 e INCAM 11+PRF 81 y sin diferencias con las otras combinaciones de microorganismos y la inoculación simple de INCAM 11, aunque sí se encontraron diferencias con INCAM 4+CIAT 899. En el cultivar Lewa, la mejor combinación fue INCAM 11+PRF 81, no difiriendo de la inoculación simple de INCAM 11.

Al analizar el comportamiento de la masa seca del tallo y de las hojas (Tabla 3) se encontró interacción entre los factores en estudio. En los cultivares estudiados, el mayor efecto de la inoculación con rizobios en la masa seca del tallo se alcanzó con la cepa CIAT 899 respecto al testigo sin inocular. Mientras que en la masa seca de la hoja solo se presentaron efectos significativos en el cultivar CC 25-9 N, con las cepas PRF 81 y CIAT 899

En relación con las aplicaciones simples de HMA en la masa seca del tallo, la inoculación con INCAM 4 provocó el mayor valor de la variable en el cultivar CC 25-9 N. En el cultivar Lewa se obtuvo incrementos significativos de la variable con la inoculación de cualquiera de las dos cepas de HMA evaluadas y sin diferencias entre las mismas. En la masa seca de las hojas, la inoculación con HMA, en el cultivar CC 25-9 N se obtuvo una respuesta superior al testigo sin inocular con las dos cepas de HMA. En el cultivar Lewa, esta respuesta solo se observó con la cepa INCAM 11.

Al analizar los resultados de la coinoculaciónen la masa seca del tallo, el mejor resultado se encontró con la combinación INCAM 4+PRF 81 en el cultivar CC 25-9 N. En el cultivar Lewa, el mejor comportamiento se obtuvo con INCAM 4+PRF 81, sin diferencias con las coinoculaciones de INCAM 4 e INCAM 11 con la cepa de rizobio CF 1.

Al observar los resultados de la coinoculación en la masa seca de las hojas, la mejor combinación que se comportó en el cultivar CC 25-9 N fue INCAM 4+PRF 81, no presentando diferencias con el resto de las combinaciones de microorganismos y la inoculación simple de PRF 81, CIAT 899, INCAM 4 e INCAM 11, excepto con INCAM 11+PRF 81, con la que si presentó diferencias. El cultivar Lewa presentó el mayor valor de la masa seca de las hojas con la combinación de INCAM 4+CIAT 899, que fue semejante a la inoculación simple de INCAM 11 y sin diferencias con las coinoculaciones de INCAM 4+CF 1 y CIAT 899 y la inoculación simple de INCAM 11 y las tres cepas de rizobios.

El efecto de los tratamientos en el número de vainas por plantas (Tabla 4) se encontró, para el caso de la inoculación con rizobios, que en el cultivar CC 25-9 N no hubo respuesta a la inoculación simple con ninguna de las cepas evaluadas de este microorganismo. En el cultivar Lewa la mejor cepa de rizobios fue CIAT 899. En el número de granos por planta, en el cultivar de frijol CC 25-9 N, las tres cepas de rizobios fueron superiores al testigo. En el Lewa, la mejor cepa de rizobios fue CIAT 899 comportándose semejante a la evaluación anterior.

En el caso de la inoculación con HMA en el número de vainas por planta, el cultivar CC 25-9 N no presentó respuesta a la inoculación. En el cultivar Lewa solo esta cepa fue significativa INCAM 11. Mientras que para el número de granos por planta se observó que en el cultivar CC 25-9N las dos cepas inoculadas presentaron un mejor comportamiento que el testigo y similares entre sí. En el cultivar Lewa, el mejor comportamiento se observó con la inoculación de INCAM 11 y la cepa INCAM 4 fue semejante al testigo.

Al analizar la efectividad de la coinoculación en el número de vainas, se encontró interacción entre los factores. En el cultivar CC 25-9 N el mayor resultado se presentó con la coinoculación INCAM 4+CF 1 significativamente superior a las aplicaciones simples y al testigo. En el cultivar Lewa, el mejor tratamiento coinoculado fue INCAM 4+CF 1, aunque no resultó superior a la inoculación simple de INCAM 11.

En relación con la coinoculación en el número de granos por planta, los mejores resultados en el cultivar CC 25-9 N se encontraron con la aplicación de INCAM 4+PRF 81 que fue superior a las otras combinaciones de microorganismos, a las aplicaciones simples y al testigo. Por otra parte, en el cultivar Lewa, la mejor combinación fue INCAM 4+CF 1, aunque sin diferencias con la inoculación simple de INCAM 11.

En la Tabla 5 se observa el efecto de los tratamientos tanto en la masa seca de 100 granos como en el rendimiento del cultivo. En ambas evaluaciones, los dos cultivares, los tratamientos inoculados con diferentes cepas de rizobios fueron superiores al testigo. Este mismo comportamiento se pudo apreciar en la inoculación simple de las cepas de HMA.

En relación con la coinoculación en la masa de 100 granos por planta, aunque diferentes combinaciones presentaron valores altos, en ninguno de los cultivares estos resultados fueron estadísticamente superiores a la inoculación simple de los microorganismos.

Al analizar el efecto de las coinoculaciones en el rendimiento del cultivo, para el cultivar CC 25-9 N, las mejores combinaciones se encontraron con INCAM 4+CIAT 899 e INCAM 11 con CF 1 y CIAT 899 y aunque estos resultados no difirieron del resto de los tratamientos coinoculados, si fueron superiores a la inoculación simple de los microorganismos. En el cultivar Lewa, la mejor combinación fue INCAM 4+CIAT 899, aunque sin diferencias con CIAT 899+CF 1; INCAM 11 combinado con las tres cepas de rizobios y la inoculación simple de CIAT 899.

Discusión

En los últimos años con el auge de potenciar la actividad biológica de los microorganismos del suelo y aprovechar sus beneficios, se incrementan las publicaciones con el uso, tanto de los inoculantes micorrízicos arbusculares (1010. Zhang, S.; Lehmann, A.; Zheng, W.; You, Z.; Rillig, M.C. (2018). Arbuscular mycorrhizal fungi increase grain yields: a meta-analysis. New Phytologist. doi: http://doi.org/10.1111/nph.15570,1111. Rillig, M.C.; Aguilar-Trigueros, C.A.; Camenzind, T.; Cavagnaro, R.T.; Degrune, F.; Hohmann, P. et al. (2019). Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal simbiosis? New Phytologist, 222(3), 1171-1175. DOI: http://doi.org/10.1111/nph.15602) como de los rizobios en leguminosas (1212. Santos, M.S.; Nogueira, M. A.; Hungria M. Microbial inoculants: reviewing the past, discussing the present and previewing an outstanding future for the use of beneficial bacteria in agriculture. AMB. 2019. Expr. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0932-0).

De forma general se encontró una respuesta significativa y similar de los cultivares a la aplicación de INCAM 4 o INCAM 11. En los últimos años se ha establecido que la efectividad de la inoculación de estas cepas se encuentra relacionada con el pH (H₂O) del suelo o sustrato donde crecen los cultivos (1313. Rivera, R.; Fernández, F.; Ruiz, L.; González, P.J.; Rodríguez, Y.; Pérez, E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic® en la producción agrícola. R Rivera Ed Ediciones INCA, San José de las Lajas, Cuba. 2020. 151p.,1414. Buil, P.A.; Jansa, J.; Blažková, A.; Holubík, O.; Dufková, R.; Rozmoš, M.; Püschel, D.; Kotianová, M. & Janoušková, M. Infectivity and symbiotic efficiency of native arbuscular mycorrhizal fungi from high-input arable soils. Plant Soil, 2022. https://doi.org/10.1007/s11104-022-05715-8), de forma tal que en el rango de pH entre 5,6 y 7,2 la cepa INCAM 4 presenta la mayor efectividad y en el rango de pH 7 - 8 la mayor efectividad la presenta INCAM 11, con una zona de solapamiento de las efectividades entre 7 a 7,2.

Respecto al comportamiento de las variables morfológicas, en otros estudios realizados, se encontraron una mayor altura y diámetro del tallo de las plantas en frijoles inoculados con rizobios y HMA, siendo siempre los tratamientos inoculados los de mejor comportamiento respecto al testigo sin inocular (1515. Liriano, R.; Núñez, D.B.; Barceló, R. Efecto de la aplicación de Rhizobium y micorriza en el crecimiento del frijol (Phaseolus vulgaris L) variedad CC-25-9 negro, Centro Agrícola, 39(4), 17-20. 2012. octubre-diciembre, ISSN papel: 0253-5785 ISSN on line: 2072-2001.).

Otros autores obtuvieron incrementos de los valores de altura en plantas de frijol, en rangos de hasta 10 cm, enfatizando en el papel que juega la disponibilidad de los nutrientes, principalmente el fósforo, en el crecimiento de las plantas (1616. Martín, N.J.; Llerena, Á.B.; Acosta, J.L. Influencia de los hongos micorrízicos arbusculares, abonos orgánicos y sacarosa en el cultivo del fríjol (Phaseolus vulgaris L.). Alternativas, 2018. ISSN: 13T90-1915, 19(2), 89-96pp.). Al respecto, a nivel mundial, se han encontrado resultados consistentes que confirman que la absorción de nutrientes se facilita mediante la presencia en el suelo de una red efectiva de simbiosis micorrízica, la que además incrementa el crecimiento de las plantas (1717. Bukovská, P.; Rozmoš, M.; Kotianová, M.; Gancarcíková, K.; Dudáš, M.; Hršelová, H.; Jansa, J. Arbuscular Mycorrhiza Mediates Efficient Recycling From Soil to Plants of Nitrogen Bound in Chitin. Front. Microbiol, 12, 574060. 2021. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2021.574060).

En relación con la masa seca, se han observado incrementos en las plantas de frijol de los tratamientos micorriza + rizobios y rizobios que los encontrados en los tratamientos control y micorrizas, posiblemente asociados a los niveles de nutrientes en el suelo y dejando claro la relevancia de la coinoculación en el crecimiento y desarrollo del cultivo (1818. Hidalgo, J.E.; Ramos, C.C. Coinoculación de Rhizophagus irregularis y Rhizobium sp. en Phaseolus vulgaris L. var. canario (Fabaceae) “frijol canario”. Arnaldoa, 26(3), 991-1006. 2019. DOI: http://doi.org/10.22497/arnaldoa.263.26309).

En relación con la coinoculación, los resultados mostraron un comportamiento diferenciado en función de los cultivares. Si bien en todos los casos algunas combinaciones rizobios-HMA alcanzaron siempre los mayores rendimientos, las diferencias con relación a los rendimientos obtenidos por las inoculaciones simples fueron significativas.

De ese modo, en los resultados de este trabajo, se corrobora la compatibilidad entre el frijol, los rizobios y los HMA, lo que favoreció el crecimiento y rendimiento. Estos resultados coinciden con otras investigaciones realizadas donde también encontraron diferencias en los componentes del rendimiento del cultivo de frijol con la aplicación combinada de microorganismos (1919. Calero, A.; Pérez, Y.; Quintero, E.; Olivera, D.; Peña, K. Efecto de la aplicación asociada entre Rhizobium leguminosarum y microorganismos eficientes sobre la producción del fríjol común. Cienc. Tecnol. Agropec, 20, 295-308. 2019. DOI: https://doi.org/10.21930/rcta.vol20_num2_art:1460).

Asimismo, los resultados en esta investigación concuerdan con los obtenidos por otras investigaciones donde se obtuvo un número de vainas mayor en las plantas sometidas a los tratamientos con rizobios y micorrizas (1818. Hidalgo, J.E.; Ramos, C.C. Coinoculación de Rhizophagus irregularis y Rhizobium sp. en Phaseolus vulgaris L. var. canario (Fabaceae) “frijol canario”. Arnaldoa, 26(3), 991-1006. 2019. DOI: http://doi.org/10.22497/arnaldoa.263.26309).

Es importante recalcar que la coinoculación de las cepas de rizobios y hongos micorrizógenos arbusculares incrementó significativamente el número de granos por vaina de las plantas evaluadas en los dos cultivares. En este sentido en trabajos realizados se reportaron aumentos en el rendimiento del frijol con las inoculaciones combinadas de rizobios y de hongos micorrízicos, concluyendo que las acciones combinadas de los microorganismos tienen un efecto sinérgico en el crecimiento vegetal (2020. Tamayo-Vélez, A.; Bernal Estrada, J.A. Common bean (Phaseolus vulgaris L.) yield response to chemical and biological fertilization in different localities of Colombia. Rev. Fac. Nac. Agron. Medellín, 71, 8573-8579. 2018. DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rfnam.v71n3.72392, 2121. Colás-Sánchez, A.; Díaz-Pérez, B.; Rodríguez-Urrutia, A.; Gatorno-Muños, S.; Rodríguez-López, O. Efecto de la biofertilización en la morfofisiología y rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Revista Centro Agrícola, 45(4), 34-42. 2018.).

Los resultados de estos experimentos amplían la información y las bases para el manejo de la coinoculación con rizobios y hongos micorrízicos arbusculares en la producción de frijol, al comprobar que existen opciones prácticas para el manejo de la inoculación de cepas eficientes de ambos microorganismos que aseguren un adecuado crecimiento, desarrollo de las plantas y apropiados indicadores de funcionamiento microbiano, todo lo cual redunda en rendimientos sostenibles con un mínimo de insumos agrícolas.

Conclusiones

Introduction

The bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most widely cultivated species of the genus Phaseolus in the tropics and subtropics of Latin America, the Caribbean and Africa, mainly because it is a source of proteins, vitamins and minerals, which place it among the five crops with the largest surface area dedicated to agriculture in Latin American countries (11. Colás, A., Díaz, B., Rodríguez, A., Gatorno, S. y Rodríguez, O. (2018). Efecto de la biofertilización en la morfofisiología y rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Ctro. Agríc., 45, 34-42.).

In Cuba, it constitutes one of the indispensable dishes in the Cuban menu, being the black bean the most common in Creole food (22. Chazan, M. (2008). World Prehistory and Archaeology: Pathways through Time. Pearson Education, Inc. ISBN 0-205-40621-1.). Despite its importance and the fact that it is a traditional crop, it is necessary to increase the productivity of the plants in a sustainable way, with a low amount of resources and with the best quality standards (33. Rivera, R.; Calderón, A.; Nápoles, M.C.; Ruiz, L.; Simo, J.; Plana, R. (2012). La validación a escala productiva del biofertilizante EcoMic® y su aplicación conjunta con rizobios en el cultivo del frijol, en centro y occidente del país. Disponible en: https://scholar.google.com.cu/scholar?q=Rivera+2012+validacion+productiva+del+biofertilizante&hl=es&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholar#d=gs_qabs&t=1656518913656&u=%23p%3Dbf9PtcqgG20J). However, national production does not meet the demands of the population, as there is a need to import 14.400 tons of this grain annually (44. ONEI (Oficina Nacional de Estadística e Información). (2019). Anuario Estadístico de Cuba 2018. En: Agricultura. La Habana, Cuba. Disponible en: http://www.one.cu/aec2017/09%20Agriculhtura.).

In this context, biofertilizers represent a sustainable, economically attractive and ecologically acceptable means to reduce external inputs and improve the quantity and quality of agricultural products, through the use of properly selected soil microorganisms, capable of making available to plants, through their biological activity, an important part of the nutrients needed for their development, as well as supplying hormonal or growth-promoting substances (55. Martínez, R.; Dibut, B. (2012). Biofertilizantes bacterianos. Editorial Científico-Técnica, La Habana, Cuba. ISBN 978-959-05-0659-8.).

Among the most widely used biofertilizers are arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and rhizobia, which associate symbiotically with the plant and generate a positive exchange of nutrients, in which the plant supplies carbohydrates to the symbionts and these, in turn, favor the absorption and translocation of water and nutrients. These include phosphorus, zinc and copper, biological nitrogen fixation, protection against root pathogens and plant tolerance to various biotic and abiotic stresses (66. Wilches, W.; Ramírez, M.; Pérez, U.; Serralde, D.; Peñaranda, A. y Ramírez, L. (2019). Association of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) with sugarcane plants (Saccharum officinarum) for panela production in Colombia. Terra Latinoamericana, 37, 175-184. doi: https://doi.org/10.28940/terra.v37i2.481).

In rhizobia - AMF - legume co-inoculation, symbiotic relationships have been reported to provide enhanced exchange between symbionts and superior effects to plants. In this case, the rhizobia-legume symbiosis provides N2 and the mycorrhizae increase the absorption of other elements, among them P, very important to guarantee an adequate biological fixation of N, increase the number, dry mass in the nodules and the growth of the plants (77. Martín, G.M.; Tamayo, Y.; Hernández, M.; Varela y da Silva, E. (2017). Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno en Canavalia ensiformis crecida en un suelo pardo mullido carbonatado mediante los métodos de abundancia natural de ¹⁵N y diferencia de N total. Cult. Tropic., 38, 122–130.).

Considering this problem, the present research was aimed at determining the best combination of rhizobia strains and arbuscular mycorrhizal fungi strains in two cultivars of CC25-9 black and Lewa in a Nitisol soil.

Materials and methods

The experiments were carried out at the Department of Agricultural Services (Las Papas farm), of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), located at 23º01' North Latitude and 82º08' West Longitude, at 138 meters above sea level. The experiment was carried out on a Ferrallitic Red Leached soil, according to the Cuban Soil Classification (88. Hernández, A.; Pérez, J.; Bosch, M.; Castro, D. (2015). Nueva versión de clasificación genética de los suelos de Cuba. Ediciones INCA. Mayabeque, Cuba. ISBN 978-959-7023-77-7.). An initial soil sampling was carried out to determine some chemical properties, by the following methods (99. Paneque, V. M.; Calaña, J. M.; Calderón, M.; Borges, Y.; Hernández, T. C. y Caruncho, M. (2010). Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Ediciones INCA. 160 p, ISBN: 978-959-7023-51-7.): pH (H₂O) by the potentiometric method, with a soil:solution ratio of 1:2.5; organic matter (% M. O) by the Walkley and Black method; assimilable P by extraction with H₂SO₄ 0.1 N with a soil:solution ratio of 1:2.5; exchangeable cations (cmol kg^-1) by extraction with NH₄Ac 1 Mol L^-1 at pH 7 and determination by complexometry (Ca and Mg) and flame photometry (K and Na). The agrochemical characteristics of the soil where the experiment was planted are shown in Table 1.

The determination of the spore count of arbuscular mycorrhizal fungi was carried out by wet sieving and decanting, the sample was taken before planting.

Two bean cultivars were planted in the experiment: Cuba Cueto 25-9 (CC25-9 N), the color of the bean testa is black, the recommended planting date for this cultivar is from October 1 to November 30, and Lewa, the color of the bean testa is white, the recommended planting date for this variety is from October 1 to January 30.

Two AMF strains were used, which come from the National Institute of Agricultural Sciences (INCA): Glomus cubense, strain INCAM-4 and Rhizophagus irregularis strain INCAM-11.

Regarding the rhizobial strains, three bean strains were used: strain CF 1 (Rhizobium leguminosarum), strain PRF 81 (Rhizobium freirei) and strain CIAT 899 (Rhizobium tropici), from the INCA's Department of Physiology and Biochemistry.

Seeds of each cultivar were soaked in the rhizobium-based inoculant corresponding to each treatment at a dose equivalent to 200 mL ha^-1. The control without inoculation was soaked in tap water. The application of the Arbuscular Mycorrhizal Fungi was carried out at a dose equivalent to 8 % of the total mass of the seed to be inoculated, sprinkling the product on the wet seed to be sown, the inoculated seeds of each treatment were put to dry in the shade and then proceeded to sowing.

Experiments were composed of a total of 48 plots each, each plot consisted of 6 furrows of 5 m long by 4.2 m wide, with a distance of 70 cm between ridges.

The experiment used a randomized block experimental design with four replications, in a bifactorial arrangement. The factors under study were three levels of mycorrhizal inoculation (two strains and a control without inoculation) and four levels of inoculation with rhizobia (three strains and a control without inoculation), for a total of twelve treatments. The experiments were conducted under field conditions in the period from December 2018 to March 2019. The NPK complete formula (9-13-17) was applied at the rate of 200 kg ha, at the bottom of the furrow before planting in all treatments evaluated.

From 35 to 45 days after sowing the crop, at the pre-flowering stage, the central plants of 1 linear m were taken in each treatment and in each replicate. Growth variables were measured: plant height (cm), stem diameter (mm), stem and leaf dry mass (g). At harvest, yield and its components were evaluated: number of pods per plant, number of grains per plant, mass of 100 grains (g) and yield (t ha^-1).

For the statistical analysis, first, the normality of the data and the homogeneity of variance of the variables evaluated were checked. Subsequently, an analysis of variance was performed on the data obtained, according to the experimental design, comparing the treatments and their interactions.

In the case that the interactions were significant, the means of the treatments were compared by Duncan's Multiple Range test (p≤0.1). The STATGRAPHICS Centurion XV program II was used.

Results

When analyzing the morphological behavior of the plants in the cultivars under study (Table 2), an interaction between the factors (rhizobia inoculation and AMF) was found for the two variables evaluated, and a different behavior was observed in each treatment with respect to plant height and stem diameter.

In the single inoculations of rhizobia on plant height and stem diameter for the different cultivars, a differentiated behavior was found among the cultivars. In the CC25-9 N cultivar, all rhizobia strains produced higher heights than the control, with no significant differences among them. In the cultivar Lewa, only a significant response to the application of strain CIAT 899 was found with respect to the control without inoculation. In the CC 25-9 N cultivar, the inoculation of the three rhizobia strains caused increases in stem diameter with respect to the control. In the cultivar Lewa, no differences were found between the rhizobial strains under study and the control without inoculation.

With respect to inoculation with AMF strains, it was found that plant height was greater with the inoculation of both mycorrhizal strains than with the uninoculated control in the two cultivars. It is noteworthy that in the cultivar Lewa, the single inoculation of INCAM 11 was superior to any of the co-inoculations studied. With respect to stem diameter after single applications of AMF, INCAM 11 inoculation caused an increase in the value of the variable in both cultivars.

Regarding co-inoculation, the effectiveness of co-inoculation on plant height varied with cultivars. For the cultivar CC 25-9 N, co-inoculation presented greater increases in the variable with the combinations INCAM 4+PRF 81, INCAM 11+PRF 81 and INCAM 11+CIAT 899.As for the cultivar Lewa, the greatest plant heights were found with the co-inoculation of INCAM 11+CIAT 899, INCAM 11+CF 1 and INCAM 4+CF 1, although all these combinations were similar to the single inoculation of INCAM 11.

The highest values of stem diameter in the cultivar CC 25-9 N were found in the combinations INCAM 4+CF 1 and INCAM 11+PRF 81 and without differences with the other combinations of microorganisms and the simple inoculation of INCAM 11, although differences were found with INCAM 4+CIAT 899. In the cultivar Lewa, the best combination was INCAM 11+PRF 81, not differing from the simple inoculation of INCAM 11.

When analyzing the behavior of stem and leaf dry mass (Table 3), interaction between the factors under study was found. In the cultivars studied, the greatest effect of rhizobia inoculation on stem dry mass was achieved with strain CIAT 899 with respect to the non-inoculated control. While in leaf dry mass, significant effects were only found in the cultivar CC 25-9 N, with strains PRF 81 and CIAT 899.

In relation to the single applications of AMF on stem dry mass, inoculation with INCAM 4 caused the highest value of the variable in the cultivar CC 25-9 N. In the cultivar Lewa, significant increases of the variable were obtained with the inoculation of any of the two AMF strains evaluated and without differences between them. In leaf dry mass, inoculation with AMF in cultivar CC 25-9 N resulted in a superior response to the control without inoculation with the two AMF strains. In the cultivar Lewa, this response was only observed with strain INCAM 11.

When analyzing the results of coinoculation on stem dry mass, the best result was found with the combination INCAM 4+PRF 81 in cultivar CC 25-9 N. In cultivar Lewa, the best performance was obtained with INCAM 4+PRF 81, with no differences with the coinoculations of INCAM 4 and INCAM 11 with rhizobia strain CF 1.

When observing the results of the coinoculation in the dry mass of leaves, the best combination that behaved in the cultivar CC 25-9 N was INCAM 4+PRF 81, presenting no differences with the rest of the combinations of microorganisms and the simple inoculation of PRF 81, CIAT 899, INCAM 4 and INCAM 11, except with INCAM 11+PRF 81, with which it did present differences. The cultivar Lewa presented the highest value of leaf dry mass with the combination of INCAM 4+CIAT 899, which was similar to the single inoculation of INCAM 11 and without differences with the co-inoculations of INCAM 4+CF 1 and CIAT 899 and the single inoculation of INCAM 11 and the three rhizobial strains.

The effect of treatments on the number of pods per plant (Table 4) was found, in the case of inoculation with rhizobia, that in the cultivar CC 25-9 N there was no response to the simple inoculation with any of the evaluated strains of this microorganism. In the cultivar Lewa, the best rhizobia strain was CIAT 899. In the number of grains per plant, in the bean cultivar CC 25-9 N, the three rhizobia strains were superior to the control. En el Lewa, la mejor cepa de rizobios fue CIAT 899 comportándose semejante a la evaluación anterior.

In the case of AMF inoculation on the number of pods per plant, the CC 25-9 N cultivar did not respond to the inoculation. In the Lewa cultivar, only this strain was significant INCAM 11. For the number of grains per plant, it was observed that in the CC 25-9N cultivar, the two inoculated strains performed better than the control and were similar to each other. In the cultivar Lewa, the best performance was observed with the INCAM 11 inoculation and the INCAM 4 strain was similar to the control.

When analyzing the effectiveness of co-inoculation on the number of pods, interaction between the factors was found. In the CC 25-9 N cultivar, the best results were obtained with the INCAM 4+CF 1 co-inoculation, which was significantly superior to the single applications and the control. In the cultivar Lewa, the best co-inoculated treatment was INCAM 4+CF 1, although it was not superior to the single inoculation of INCAM 11.

In relation to co-inoculation in the number of grains per plant, the best results in the cultivar CC 25-9 N were found with the application of INCAM 4+PRF 81, which was superior to the other combinations of microorganisms, to the simple applications and to the control. On the other hand, in the cultivar Lewa, the best combination was INCAM 4+CF 1, although without differences with the simple inoculation of INCAM 11.

Table 5 shows the effect of the treatments on both 100-grain dry mass and crop yield. In both evaluations, both cultivars, the treatments inoculated with different rhizobia strains were superior to the control. The same behavior was observed in the single inoculation of AMF strains.

In relation to the co-inoculation in the mass of 100 grains per plant, although different combinations presented high values, in none of the cultivars were these results statistically superior to the simple inoculation of the microorganisms.

When analyzing the effect of co-inoculations on crop yield, for cultivar CC 25-9 N, the best combinations were found with INCAM 4+CIAT 899 and INCAM 11 with CF 1 and CIAT 899, and although these results did not differ from the rest of the co-inoculated treatments, they were superior to the simple inoculation of the microorganisms. In the Lewa cultivar, the best combination was INCAM 4+CIAT 899, although without differences with CIAT 899+CF 1; INCAM 11 combined with the three rhizobia strains and the simple inoculation of CIAT 899.

Discussion

In recent years, with the boom in the use of arbuscular mycorrhizal inoculants (1010. Zhang, S.; Lehmann, A.; Zheng, W.; You, Z.; Rillig, M.C. (2018). Arbuscular mycorrhizal fungi increase grain yields: a meta-analysis. New Phytologist. doi: http://doi.org/10.1111/nph.15570,1111. Rillig, M.C.; Aguilar-Trigueros, C.A.; Camenzind, T.; Cavagnaro, R.T.; Degrune, F.; Hohmann, P. et al. (2019). Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal simbiosis? New Phytologist, 222(3), 1171-1175. DOI: http://doi.org/10.1111/nph.15602) and rhizobia in legumes (1212. Santos, M.S.; Nogueira, M. A.; Hungria M. Microbial inoculants: reviewing the past, discussing the present and previewing an outstanding future for the use of beneficial bacteria in agriculture. AMB. 2019. Expr. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0932-0), there has been an increase in publications on the use of soil microorganisms to enhance the biological activity of soil microorganisms and to take advantage of their benefits.

In general, a significant and similar response of cultivars to the application of INCAM 4 or INCAM 11 was found. In recent years it has been established that the effectiveness of the inoculation of these strains is related to the pH (H₂O) of the soil or substrate where the crops grow (1313. Rivera, R.; Fernández, F.; Ruiz, L.; González, P.J.; Rodríguez, Y.; Pérez, E. Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic® en la producción agrícola. R Rivera Ed Ediciones INCA, San José de las Lajas, Cuba. 2020. 151p.,1414. Buil, P.A.; Jansa, J.; Blažková, A.; Holubík, O.; Dufková, R.; Rozmoš, M.; Püschel, D.; Kotianová, M. & Janoušková, M. Infectivity and symbiotic efficiency of native arbuscular mycorrhizal fungi from high-input arable soils. Plant Soil, 2022. https://doi.org/10.1007/s11104-022-05715-8), so that in the pH range between 5.6 and 7.2 the INCAM 4 strain presents the highest effectiveness and in the pH range 7 - 8 the highest effectiveness is presented by INCAM 11, with an overlapping zone of effectiveness between 7 and 7.2.

Regarding the behavior of morphological variables, other studies have found a greater height and diameter of the stem of plants in beans inoculated with rhizobia and AMF, being always the inoculated treatments those of better behavior with respect to the control without inoculation (1515. Liriano, R.; Núñez, D.B.; Barceló, R. Efecto de la aplicación de Rhizobium y micorriza en el crecimiento del frijol (Phaseolus vulgaris L) variedad CC-25-9 negro, Centro Agrícola, 39(4), 17-20. 2012. octubre-diciembre, ISSN papel: 0253-5785 ISSN on line: 2072-2001.).

Other authors obtained increases in height values in bean plants, in ranges of up to 10 cm, emphasizing the role played by the availability of nutrients, mainly phosphorus, in plant growth (1616. Martín, N.J.; Llerena, Á.B.; Acosta, J.L. Influencia de los hongos micorrízicos arbusculares, abonos orgánicos y sacarosa en el cultivo del fríjol (Phaseolus vulgaris L.). Alternativas, 2018. ISSN: 13T90-1915, 19(2), 89-96pp.), and consistent results have been found worldwide confirming that nutrient absorption is facilitated by the presence in the soil of an effective network of mycorrhizal symbiosis, which also increases plant growth (1717. Bukovská, P.; Rozmoš, M.; Kotianová, M.; Gancarcíková, K.; Dudáš, M.; Hršelová, H.; Jansa, J. Arbuscular Mycorrhiza Mediates Efficient Recycling From Soil to Plants of Nitrogen Bound in Chitin. Front. Microbiol, 12, 574060. 2021. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2021.574060).

In relation to dry mass, increases have been observed in bean plants of mycorrhiza + rhizobia and rhizobia treatments than those found in control treatments and mycorrhizae, possibly associated with the levels of nutrients in the soil and making clear the relevance of co-inoculation in the growth and development of the crop (1818. Hidalgo, J.E.; Ramos, C.C. Coinoculación de Rhizophagus irregularis y Rhizobium sp. en Phaseolus vulgaris L. var. canario (Fabaceae) “frijol canario”. Arnaldoa, 26(3), 991-1006. 2019. DOI: http://doi.org/10.22497/arnaldoa.263.26309).

In relation to co-inoculation, the results showed a differentiated behavior depending on the cultivars. Although in all cases some rhizobia-AMF combinations always achieved the highest yields, differences in relation to the yields obtained by single inoculations were significant.

Thus, the results of this work corroborate the compatibility between beans, rhizobia and AMF, which favored growth and yield. These results coincide with other research conducted where they also found differences in the yield components of the bean crop with the combined application of microorganisms (1919. Calero, A.; Pérez, Y.; Quintero, E.; Olivera, D.; Peña, K. Efecto de la aplicación asociada entre Rhizobium leguminosarum y microorganismos eficientes sobre la producción del fríjol común. Cienc. Tecnol. Agropec, 20, 295-308. 2019. DOI: https://doi.org/10.21930/rcta.vol20_num2_art:1460).

Likewise, the results in this research agree with those obtained by other investigations where a greater number of pods was obtained in plants subjected to rhizobia and mycorrhizae treatments (1818. Hidalgo, J.E.; Ramos, C.C. Coinoculación de Rhizophagus irregularis y Rhizobium sp. en Phaseolus vulgaris L. var. canario (Fabaceae) “frijol canario”. Arnaldoa, 26(3), 991-1006. 2019. DOI: http://doi.org/10.22497/arnaldoa.263.26309).

It is important to emphasize that the co-inoculation of rhizobia strains and arbuscular mycorrhizal fungi significantly increased the number of grains per pod of the plants evaluated in the two cultivars. In this sense, in previous studies, increases in bean yield were reported with combined inoculations of rhizobia and mycorrhizal fungi, concluding that the combined actions of the microorganisms have a synergistic effect on plant growth (2020. Tamayo-Vélez, A.; Bernal Estrada, J.A. Common bean (Phaseolus vulgaris L.) yield response to chemical and biological fertilization in different localities of Colombia. Rev. Fac. Nac. Agron. Medellín, 71, 8573-8579. 2018. DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rfnam.v71n3.72392,2121. Colás-Sánchez, A.; Díaz-Pérez, B.; Rodríguez-Urrutia, A.; Gatorno-Muños, S.; Rodríguez-López, O. Efecto de la biofertilización en la morfofisiología y rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Revista Centro Agrícola, 45(4), 34-42. 2018.).

The results of these experiments expand the information and bases for the management of co-inoculation with rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi in bean production, proving that there are practical options for the management of the inoculation of efficient strains of both microorganisms that ensure adequate growth, plant development and appropriate indicators of microbial performance, all of which results in sustainable yields with a minimum of agricultural inputs.

Conclusions