Introducción

El cocotero es un cultivo de amplios usos lo que la convierten en una planta única. Tiene aplicaciones en la industria alimenticia (11. Qadi WSM, Mediani A, Benchoula K, Wong EH, Misnan NM, Sani NA. Characterization of Physicochemical, Biological, and Chemical Changes Associated with Coconut Milk Fermentation and Correlation Revealed by 1H NMR-Based Metabolomics. Foods. 2023, 12(10): 1971. doi: http://doi.org/10.3390/foods12101971., 22. Wirkijowska A, Sobota A, Zarzycki P, Nawrocka A, Blicharz-Kania A y Andrejko D. Chemical, technological, and sensory evaluation of the suitability of coconut by-products in white rolls. J Sci Food Agric. 2022; 102(8):3370-3378. doi: http://doi.org/10.1002/jsfa.11684.), como sustitutos de aceites y edulcorante (33. Saraiva A, Carrascosa C, Ramos F, Raheem D, MariaLopes M y Raposo A. coconut sugar: chemical analysis and nutritional profile; health impacts; safety and quality control; food industry applications. Int J Environ Res Public Health. 2023, 19;20(4):3671. doi: http://doi.org/10.3390/ijerph20043671.), así como por su alto valor nutricional (44. Divya PM, Roopa BS, Manusha C y Balannara P. A concise review on oil extraction methods, nutritional and therapeutic role of coconut products. Review J Food Sci Technol. 2023, 60(2):441-452. doi: http://doi.org/10.1007/s13197-022-05352-0., 22. Wirkijowska A, Sobota A, Zarzycki P, Nawrocka A, Blicharz-Kania A y Andrejko D. Chemical, technological, and sensory evaluation of the suitability of coconut by-products in white rolls. J Sci Food Agric. 2022; 102(8):3370-3378. doi: http://doi.org/10.1002/jsfa.11684.). También, posee amplias aplicaciones en la industria cosmética (55. Kaushik V, Chogale R y Mhaskar S. Single hair fiber assessment techniques to discriminate between mineral oil and coconut oil effect on hair physical properties. Journal of Cosmet Dermatol. 2021; 20(4), 1306–1317. doi: http://doi.org/10.1111/jocd.13724.-77. Sumit AF, Sharmin T y Ahmed T. Evaluation of the in vitro antimicrobial activity as well as preservative capacity of several popular cosmetic products available in the neighbouring shops in Bangladesh. Mymensingh Medical Journal. 2021; 30(2), 478-484. PMID: 33830132.), en la maderable y artesanal (88. Limones BV, Fernández BMA. El cocotero: “El árbol de la vida”. Herbario CICY. 2016; 8:107–110. Available from: http://www.cicy.mx/sitios/desde_herbario/.). Los subproductos como la fibra se emplean en la agricultura para la preparación de sustratos (99. Gopal M, Gupta A, Arunachalam V, Maheswarappa HP, Thomas GV, Jacob PM. Autochthonous nutrient recycling driven by soil microbiota could be sustaining high coconut productivity in Lakshadweep Islands sans external fertilizer application. World J Microbiol Biotechnol. 2022; 2;38(11):213. doi: http://doi.org/10.1007/s11274-022-03373-7., 1010. Tuckeldoe RB, Maluleke MK y Adriaanse P. The effect of coconut coir substrate on the yield and nutritional quality of sweet peppers (Capsicum annuum) varieties. Sci Rep. 2023; 15;13(1):2742. doi: http://doi.org/10.1038/s41598-023-29914-0.), y en la pecuaria para la elaboración de aditivos para piensos (1111. Masijn Q, Libberecht S, Meyfroot A, Goemaere O, Hanskens J y Fraeye I. Structure and physical stability of plant-based food gel systems: Impact of protein (mung bean, pea, potato, soybean) and fat (coconut, sunflower). Heliyon. 2023; 6; 9(9):e18894. doi: http://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e18894.). Además, tiene importantes aplicaciones en la medicina en enfermedades de la piel (1212. Deen A, Visvanathan R, Wickramarachchi D, Marikkar N, Nammi S, Jayawardanae BC y Liyanagea R. Chemical composition and health benefits of coconut oil: an overview. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2021; 101(6), 2182-2193. doi: http://doi.org/10.1002/jsfa.10870.-1414. Neelakantan N, Seah JYH y van Dam RM. The Effect of Coconut Oil Consumption on Cardiovascular Risk Factors: A Systematic Review and Meta-Analysis of Clinical Trials. Circulation. 2020; 141(10), 803-814. doi: http://doi.org/10.1161/circulationaha.119.043052), cardiovascular (1515. Schwingshackl L, Schlesinger S. Coconut Oil and Cardiovascular Disease Risk. Curr Atheroscler Rep. 2023; 25(5):231-236. doi: http://doi.org/10.1007/s11883-023-01098-y-1717. Teng M, Zhao YJ, Khoo AL, Yeo TC, Yong QW y Lim BP. Impact of coconut oil consumption on cardiovascular health: a systematic review and meta-analysis. Nutrition Reviews. 2020; 78(3), 249-259. doi: http://doi.org/10.1093/nutrit/nuz074) y esclerosis múltiple (1818. Cuerda-Ballester M, Proaño B, Alarcón-Jimenez J, Bernardo N, Villaron-Casales C, Lajara Romance JM, Rubia Ortí JE. Improvements in gait and balance in patients with multiple sclerosis after treatment with coconut oil and epigallocatechin gallate. A pilot study. Food Funct. 2023; 14(2):1062-1071. doi: http://doi.org/10.1039/d2fo02207a). Su empleo se ha extendido a más de 94 países de todo el mundo, proporcionando sustento para millones de personas en las regiones de Asia y el Pacífico (1919. Rethinam P. Chapter 2: International Scenario of Coconut Sector. In: Nampoothiri KUK, Krishnakumar V, Thampan PK, Achuthan Nair M, editors. The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018; pp 21-56. Singapore: Springer. doi: http://doi.org/10.1007/978-981-13-2754_2). Sin embargo, en la mayoría de estos países se presenta un envejecimiento de las plantaciones que constituye la principal limitante para la obtención de altos rendimientos (2020. Samosir YMS y Adkins SW. Improving acclimatization through the photoautotrophic culture of coconut (Cocos nucifera) seedlings: an in vitro system for the efficient exchange of germplasm. In Vitro Cell Dev Plant. 2014; 50:493–501. doi: http://doi.org/10.1007/s11627-014-9599-z), efecto que se observa también en las plantaciones de Cuba. Esto produce afectaciones económicas para los productores y para las empresas que emplean sus derivados, como el aceite de coco, ya que tiene que importarlo de un mercado externo. Debido a esto se hace necesario la aplicación de tecnologías de producción de posturas de calidad, como paso crucial para la obtención de poblaciones vigorosas y productivas. La calidad del material de siembra determina en gran medida los rendimientos finales del coco, siendo la base para una producción exitosa (21[21] Thomas, GV, Krishnakumar, V, Dhanapal, R, y Reddy, DVS Chapter 7 Agro-management Practices for Sustainable Coconut Production. En: Nampoothiri, KUK, Krishnakumar, V, Thampan, PK, Achuthan Nair, M (eds.), The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018. (pp. 227-322). Singapore: Springer. DOI: 10.1007/978-981-13-2754_7.).

El empleo de microorganismos, componentes activos de los biofertilizantes, puede representar una tecnología alternativa factible para mejorar el rendimiento de las plantas (2222. Vafa ZN, Sohrabi Y, Sayyed RZ, Luh Suriani N y Datta R. Effects of the Combinations of Rhizobacteria, Mycorrhizae, and Seaweed, and Supplementary Irrigation on Growth and Yield in Wheat Cultivars. Plants. 2021; 10(4), 811. doi: http://doi.org/10.3390/plants10040811, 2323. Vishwakarma K, Kumar N, Shandilya C, Mohapatra S, Bhayana S y Varma A. Revisiting Plant–Microbe Interactions and Microbial Consortia Application for Enhancing Sustainable Agriculture: A Review. Front. Microbiol. 2020; 11:560406. doi: http://doi.org/10.3389/fmicb.2020.560406.). Las formulaciones efectivas de microorganismos de importancia agrícola, tales como fijadores de nitrógeno, rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) y los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) se han desarrollado como insumos valiosos para la producción de los cultivos (21[21] Thomas, GV, Krishnakumar, V, Dhanapal, R, y Reddy, DVS Chapter 7 Agro-management Practices for Sustainable Coconut Production. En: Nampoothiri, KUK, Krishnakumar, V, Thampan, PK, Achuthan Nair, M (eds.), The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018. (pp. 227-322). Singapore: Springer. DOI: 10.1007/978-981-13-2754_7.).

Los HMA son el grupo microbiano de más amplia distribución geográfica de todos los microorganismos biofertilizantes con una gran adaptación a diversas condiciones de suelo (2424. Siim KS, Teele J, Martti V, Martin Z, Maarja Ö. Effects of land use on arbuscular mycorrhizal fungal communities in Estonia. Mycorrhiza. 2018; 28 (3): 259–268. DOI: http://doi.org/10.1007/s00572-018-0822-3.). Desempeñan una importante función, contribuyendo de forma más eficiente a la supervivencia y crecimiento de las posturas, al jugar un papel crucial en la nutrición de las plantas (2525. Müller LM y Harrison MJ. Phytohormones, miRNAs, and peptide signals integrate plant phosphorus status with arbuscular mycorrhizal symbiosis. Current Opinion in Plant Biology, 2019; 50, 132–139. http://doi.org/10.1016/j.pbi.2019.05.004, 2626. Sarmiento-López LG, López-Meyer M, Sepúlveda-Jiménez G, Cárdenas L y Rodríguez-Monroy M. Photosynthetic performance and stevioside concentration are improved by the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Stevia rebaudiana under different phosphate concentrations. Peer J. 2020; 18p. http://doi.org/10.7717/peerj.10173). Estudios realizados en la rizosfera de plantaciones adultas de cocotero han demostrado la rica diversidad de esta especie, cuyas raíces son colonizadas por los HMA (2727. Rajeshkumar PP, Thomas GV, Gupta A y Gopal M. Diversity, richness and degree of colonization of arbuscular mycorrhizal fungi in coconut cultivated along with intercrops in high productive zone of Kerala, India. Symbiosis. 2015; 65, 125–14. http://doi.org/10.1007/s13199-015-0326-2).

Dentro de las PGPR se encuentra el género Azotobacter. Estas son bacterias asociativas de vida libre, con potencialidades entre las cuales se destacan la fijación de N y la producción de fitohormonas (2828. Martin Del Campo JS, Rigsbee J, Bueno Batista M, Mus F, Rubio LM, Einsle O, Peters JW, Dixon R, Dean DR y Dos Santos PC. Overview of physiological, biochemical, and regulatory aspects of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2022; 57(5-6):492-538. http://doi.org/10.1080/10409238.2023.2181309). También son antagonistas a patógenos del suelo (2929. Sumbul A, Ansari RA, Rizvi R y Mahmood I. Azotobacter: A potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi Journal of Biological Sciences. 2020; 27, 3634-3640. http://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004), así como inductoras de resistencia sistémica en las plantas contra patógenos foliares y radicales (3030. Carmona A, Reyes JJ, Chiquito RG, Rincon G, Cerdan CR y Hernández LG. Biocontrol of postharvest fruit fungal diseases by bacterial antagonists: A Review. Agronomy. 2021; 9, 121. http://doi.org/10.3390/agronomy9030121).

En otros cultivos, diferentes al cocotero, se ha demostrado que la aplicación conjunta de los HMA y Azotobacter promueven el crecimiento de las plantas (3131. Kalapchieva S, Tringovska I, Bozhinova R, Kosev V, Hristeva T. Population response of rhizosphere microbiota of garden pea genotypes to inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi. Int J Mol Sci. 2023; 24(2):1119. http://doi.org/10.3390/ijms24021119, 3232. Lamlom SF, Irshad A, Mosa WFA. The biological and biochemical composition of wheat (Triticum aestivum) as affected by the bio and organic fertilizers. BMC Plant Biol. 2023; 23(1):111. http://doi.org/10.1186/s12870-023-04120-2), por diferentes mecanismos como la regulación de hormonas de crecimiento vegetal (2828. Martin Del Campo JS, Rigsbee J, Bueno Batista M, Mus F, Rubio LM, Einsle O, Peters JW, Dixon R, Dean DR y Dos Santos PC. Overview of physiological, biochemical, and regulatory aspects of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2022; 57(5-6):492-538. http://doi.org/10.1080/10409238.2023.2181309) y la mejora de la nutrición (2626. Sarmiento-López LG, López-Meyer M, Sepúlveda-Jiménez G, Cárdenas L y Rodríguez-Monroy M. Photosynthetic performance and stevioside concentration are improved by the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Stevia rebaudiana under different phosphate concentrations. Peer J. 2020; 18p. http://doi.org/10.7717/peerj.10173) y constituyen un enfoque extremadamente útil para la agricultura sostenible, inclusive en ecosistemas afectados por algún estrés (3333. Sagar A, Rathore P, Ramteke PW, Ramakrishna W, Reddy MS y Pecoraro L. Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Their Synergistic Interactions to Counteract the Negative Effects of Saline Soil on Agriculture: Key Macromolecules and Mechanisms. Microorganisms. 2021; 9, 1491. http://doi.org/10.3390/microorganisms9071491-3535. Wahab A, Muhammad M, Munir A, Abdi G, Zaman W, Ayaz A, Khizar C y Reddy SPP. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in regulating growth, enhancing productivity, and potentially influencing ecosystems under abiotic and biotic stresses. Plants. (Basel) 2023; 12(17):3102. http://doi.org/10.3390/plants12173102). El empleo conjunto de ambos grupos microbianos puede constituir una tecnología para la obtención de posturas de calidad, que conduzcan a plantaciones rejuvenecidas de alta productividad.

Por estas razones, se propuso como objetivo del presente trabajo estudiar el efecto combinado de los HMA y cepas de Azotobacter en la producción de posturas de cocotero de alta calidad, en vivero.

Materiales y metodos

El experimento se desarrolló en los viveros de Playa Duaba con un suelo Arenosol háplico (ARh), y Cabacú con un suelo Gleysol Flúvico háplico (GFh), ambos del municipio Baracoa, Guantánamo, Cuba. Se empleó como sustrato la combinación Suelo: Humus de lombriz: Fibra de Coco (S:H:FC), en la relación 4:1:1 (v/v/v), teniendo en cuenta los resultados de trabajos previos (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). En cada vivero se empleó el suelo de la propia localidad para preparar los sustratos. Como control se emplearon sustratos conformados por la combinación de suelo y las fuentes orgánicas empleada en la proporción 1:1:1 v/v/v según se recomienda en el Instructivo técnico del cultivo del coco (37[37] MINAG. Instructivo técnico para el cultivo del COCO. 1ra Edición, edit. Biblioteca ACTAF, Ciudad de la Habana. 2011, 15p. Available from: http://actaf.co.cu/index.php.). Se realizó la caracterización parcial de los sustratos (38[38] Paneque PVM, Calaña NJM, Calderón VM, Borges BY, Hernández GTC, y Caruncho CM. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. 1st ed. La Habana, Cuba: Ediciones INCA. 2010. Available from: http://mst.ama.cu/578/.) y se cuantificó las poblaciones autóctonas de los HMA en cada tipo de suelo (3939. Herrera PRA, Furrazola E, Ferrer RL, Fernández VR y Torres Y. Functional strategies of root hair sand arbuscular mycorrhizae in an evergreen tropical forest, Sierra del Rosario, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas. 2004; 35(2),113-123. Available from: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181226079010.). En la tabla 1 se muestra la caracterización parcial de los sustratos y los resultados de la cuantificación de las poblaciones autóctonas de HMA de los suelos.

Se empleó el ecotipo domesticado de cocotero “Indio Verde-1” (4040. Alonso, M., Cueto, J.R., Santos, Y., Romero, W., LLauger, R. y Rohde, W. (2007). Variabilidad morfológica y molecular de una población de cocoteros verdes en la región de Baracoa. Cultivos Tropicales. 28(3), 69-75. Available from: https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/download/293/pdf/813&ved=2ahUKEwjrla_53ZCJAxU_TDABHXhBA6MQFnoECBgQAQ&usg=AOvVaw3NkCnmnalNP5YOZQV6CY5i.), cuyas semillas fueron obtenidas de plantas madre sanas, las que fueron preparadas y sembradas según se refiere (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495).

Se seleccionaron tres especies de HMA, las cuales procedieron del cepario del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA): Glomus cubense, Y. Rodr. y Dalpé (4141. Rodríguez Y, Dalpé Y, Séguin S, Fernández K, Fernández F, Rivera RA. Glomus cubenses p. nov., an arbuscular mycorrhizal fungus from Cuba. Mycotaxon. 2011; 118(1): 337-347. doi http://doi.org/10.5248/118.337.) cepa INCAM-4 (DAOM241198), con 92 esporas g-1 de inóculo; Rhizophagus irregularis (Blaszk, Wubet, Renker y Buscot) Walker y Shüβler (4242. Shüßler A, Walker C. The Glomeromycota: a species list with new families and new genera. Gloucester: The Royal Botanic Garden Edinburgh, The Royal Botanic Garden Kew, Botanische Staatssammlung Munich, and Oregon State University. 2011, 58p. Available from: https://books.google.com.cu/books/about/The_Glomeromycota.html?id=qjILywAACAAJ&redir_esc=y.), cepa INCAM-11 (DAOM711363), con 73 esporas g-¹ de inóculo y Funneliformis mosseae, (Nicol. y Gerd.) Walker y Schüßler (4242. Shüßler A, Walker C. The Glomeromycota: a species list with new families and new genera. Gloucester: The Royal Botanic Garden Edinburgh, The Royal Botanic Garden Kew, Botanische Staatssammlung Munich, and Oregon State University. 2011, 58p. Available from: https://books.google.com.cu/books/about/The_Glomeromycota.html?id=qjILywAACAAJ&redir_esc=y.), cepa INCAM-2, con 57 esporas g-1 de inóculo. Los inóculos se ajustaron para garantizar 215 esporas por semilla, (4343. Sabio C. Evaluación de Mycoral® en tres variedades de cocotero resistentes al Amarillamiento Letal del cocotero para mejorar el crecimiento en condiciones de vivero [en línea] [Tesis para optar por el título de Ingeniero Agrónomo], Escuela Agrícola panamericana. Zamorano, Honduras. 2002; 37 p. [Consultado: 25 de mayo de 2012], Available from: http://www.bdigital.zamorano.edu/bitstream/11036/2209/1/cpa.2002-%20T101.). Para la aplicación se mezcló el inoculante con 600 mL de agua, en la cual se sumergió la semilla, por la parte de la entalladura, utilizando el método de recubrimiento de la semilla (4444. Fernández F, Gómez R, Vanegas LF, Noval BM, Martínez MA. Producto inoculante micorrizógeno; Cuba; Oficina Nacional de Propiedad Industrial Patente No. 22641, 2000. Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf;jsessionid=ED1D72BCCE74B2DBD801D4D94327D0B1.wapp2nA?docId=CU4401498yrecNum=98yoffice=yqueryString=yprevFilter=%26fq%3DOF%3ACU%26fq%3DICF_M%3A%22A01N%22ysortOption=Pub+Date+DescymaxRec=135.) con la modificación referida.

Todos los tratamientos inoculados con HMA fueron coinoculados con cepas de A. chroococcum pertenecientes al cepario del Instituto Nacional de Investigaciones Fundamentales de Agricultura Tropical (INIFAT), aisladas de los viveros que fueron objeto de estudio. En los tratamientos del vivero Playa Duaba se inoculó la cepa CDM-1 y en el vivero Cabacú la cepa CDM-2, en ambos casos, posterior a la inoculación de las especies de HMA, teniendo en cuenta los resultados de trabajos previos (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). Las cepas fueron preparadas según se refiere en el trabajo citado.

En el control no se realizó la inoculación de microorganismos. Se empleó un tratamiento adicional, conformado por la fertilización mineral (NPK 100 %) para lo que se empleó la fórmula completa 9:13:17 a razón de 45 g por semilla, fraccionado al 33 % a los 30 días posteriores a la siembra (dps) y el resto a los 90 dps, para evaluar el efecto de los HMA con respecto al control de la fertilización completa (37[37] MINAG. Instructivo técnico para el cultivo del COCO. 1ra Edición, edit. Biblioteca ACTAF, Ciudad de la Habana. 2011, 15p. Available from: http://actaf.co.cu/index.php.).

Se empleó un diseño en bloques al azar con tres réplicas. Cada parcela experimental dentro del bloque contenía 20 semillas sembradas a una distancia de 0,05 x 0,20 m.

El experimento tuvo una duración de 180 días. A los 120 dps se calculó el índice de velocidad de germinación (IVG) (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495), según la fórmula:

Para esta variable se calculó el por ciento de incremento de los tratamientos inoculados con relación al control.

A los 180 dps se muestrearon quince plantas por réplica y se evaluó la altura, el diámetro en la base del vástago, el número de hojas, el área foliar y la masa seca total (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). En la parte aérea se cuantificaron los contenidos de N, P y K (4545. Paneque VM, Calaña JM. La fertilización de los cultivos. Aspectos teórico-prácticos para su recomendación. Departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas. INCA. La Habana. 2001; 29 p. Available from: http://www.inca.edu.cu.).

Se realizó, además, la cuantificación de las variables micorrícicas, porcentaje de la colonización (%) (4646. Giovanetti M, Mosse B. An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, 84, 489–500. doi: http://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1980.tb04556.x.) e intensidad de la colonización micorrícica (%) y las poblaciones autóctonas de HMA en la rizosfera, evaluada como número de esporas (3939. Herrera PRA, Furrazola E, Ferrer RL, Fernández VR y Torres Y. Functional strategies of root hair sand arbuscular mycorrhizae in an evergreen tropical forest, Sierra del Rosario, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas. 2004; 35(2),113-123. Available from: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181226079010.).

El experimento se repitió durante dos años, para lo cual se empleó un diseño en bloques al azar. Los datos fueron procesaron mediante el Análisis de Varianza de Clasificación Simple y la comparación de las medias mediante la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan con un nivel de significación del 95 %. Los datos de la variable porcentaje de la colonización micorrícica se transformaron por la fórmula arcseno√x. Se empleó el paquete estadístico STATGRAPHIC versión 15.2.

Resultados

Al analizar los resultados de los diferentes indicadores evaluados, no se observó interacción entre el factor repetición en el tiempo, en ninguno de los viveros, por lo que se analizan las medias de ambas repeticiones.

Con relación al IVG, se observó que la coinoculación con los HMA con las cepas de A. chroococcum aceleraron el proceso germinativo, independientemente de la cepa de HMA inoculada (Figura 1). El control y el tratamiento fertilizado (NPK) mostraron similitud entre ellos, pero diferencias con relación a los inoculados, en los dos suelos estudiados.

En el Vivero Cabacú (suelo GFh), se observaron porcientos de incremento del tratamiento inoculado superiores a los obtenidos en el Vivero Playa Duaba (suelo ARh) (71-77 y 28-33, respectivamente), debido a que tanto el control como el tratamiento fertilizado mostraron valores más bajos en este último, lo cual demuestra que se obtuvo un mayor efecto micorrícico en el suelo GFh.

Al analizar los resultados del desarrollo vegetativo (Tabla 2) se observó una respuesta diferencial de las cepas de HMA estudiadas en los dos viveros, correspondientes a dos tipos de suelo. En el Vivero Playa Duaba se observó que el tratamiento coinoculado R. intraradices - A. chroococcum CDM-1 mostró niveles significativamente superiores al resto de las variantes, en todos los indicadores evaluados (altura, diámetro del tallo, número de hojas, área foliar y masa seca total). Con el empleo de G. cubense y F. mosseae se alcanzaron valores de altura, diámetro del tallo y área foliar similares estadísticamente con el control; sin embargo, en el resto de los indicadores fue inferior a este. El tratamiento fertilizado mostró los niveles más bajos en todos los indicadores.

A diferencia del Vivero Playa Duaba, en Cabacú los mejores resultados se obtuvieron con la combinación G. cubense - A. chroococcum cepa CDM-2, la cual superó de forma significativa al resto de los tratamientos en todos los indicadores evaluados. En los tratamientos inoculados con R. irregularis y F. mosseae se alcanzaron valores similares o inferiores al control en todos los indicadores evaluados, a excepción del área foliar donde superaron al control. En todos los casos el tratamiento fertilizado mostró los niveles más bajos.

Al analizar los contenidos de N, P y K en la planta, en el vivero Playa Duaba (suelo ARh), se destacaron los tratamientos de la coinoculación R. irregularis - A. chroococcum CDM-1, con incremento de los contenidos de los tres elementos. En los tratamientos donde se emplearon G. cubense y F. mosseae se alcanzaron niveles intermedios, siendo superiores estadísticamente al control. El control y el tratamiento fertilizado mostraron similitud estadística, obteniendo los valores más bajos.

En el vivero Cabacú (suelo GFLh) se encontró efecto positivo sobre los contenidos de N, P y K con la combinación de G. cubense - A. chroococcum CDM-2, mientras que los tratamientos donde se emplearon R. irregularis y F. mosseae se obtuvieron valores intermedios, con diferencias significativas entre ellos. El control y el tratamiento fertilizado mostraron los niveles más bajos; sin embargo, el abonado orgánico (control) superó a la fertilización con NPK.

Con relación a los indicadores de la micorrización, en el vivero Playa Duaba (suelo ARh) el control mostró niveles de colonización similares a los obtenidos por los tratamientos micorrizados (Figura 2); sin embargo, al analizar la IC la cepa de R. irregularis superó a todos los tratamientos, de forma similar a como se observó en el estudio del desarrollo vegetativo. Este comportamiento fue similar al observado en el análisis de la abundancia de las esporas, indicador en el que todos los tratamientos alcanzaron valores elevados.

En el vivero Cabacú (suelo GFLh) se observó un comportamiento similar al obtenido en el análisis del desarrollo vegetativo, para los tres indicadores evaluados; sin embargo, la coinoculación G. cubense - A. chroococcum CDM-2 superó de forma significativa a todos los tratamientos.

En el análisis conjunto de las variables evaluadas se observó que cuando se emplea el suelo ARh (vivero Playa Duaba), el mejor tratamiento resultó ser la coinoculación de R. irregularis - A. chroococcum CDM-1, mientras que con el suelo GFLh (vivero Cabacú) la combinación de G. cubense - A. chroococcum CDM-2 fue con la que se obtuvo los mejores resultados. En estos tratamientos, la coinoculación de los microorganismos indujo en las plantas un mejor aprovechamiento de nutrimentos, incremento de la superficie fotosintética (área foliar) y mayor acumulación de biomasa (masa seca total).

Discusión

En los suelos empleados para la preparación del sustrato en ambos viveros se encontraron niveles elevados de propágulos de HMA residentes (923,33 y 2676,67 esporas de HMA g^-1 en los suelos ARh y GFLh, respectivamente, tabla 1), similares a los encontrados por otros autores en agroecosistemas similares, no disturbados (4747. Furrazola E, Covacevich F, Torres AY, Rodríguez RRM, Ley RJF, Izquierdo K, Fernández VR, Louro BRL. Functionality of arbuscular mycorrhizal fungi in three plant communities in the Managed Floristic Reserve San Ubaldo-Sabanalamar, Cuba. International Journal Tropical Biology, (2015). 63(2), 341–356. ISSN: 0034-7744., 4848. Furrazola GE, Rodríguez RRM, Torres AY, González GS, Ortega FR, Ley RJF. Hongos micorrizógenos arbusculares (Glomeromycotina) en ecosistemas naturales y agrícolas en la Reserva de la Biosfera Ciénaga de Zapata, Cuba. Acta Botánica Cubana, (2018). 217(1), 85–93. Available from: https://www.revistasgeotech.com/index.php/abc/article/view/225.). Se observó un efecto de la simbiosis micorrícica sobre los diferentes indicadores evaluados.

El análisis de los resultados de la interacción HMA-A. chroococcum permite plantearse que es posible que la coinoculación pudo haber roto las barreras impuestas por la competencia de las cepas de HMA inoculadas con las autóctonas debido a que Azotobacter libera metabolitos activos que permiten el crecimiento del hongo. Además, modula la expresión de proteínas específicas activas que juegan un papel importante en la fisiología y establecimiento de la simbiosis, ya que estimulan la esporulación durante el estado vegetativo. Por otro lado, estas proteínas regulan la síntesis de ATP y amonio, que pueden ser empleadas en los procesos de absorción activa de fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico por el micelio, energía que también es utilizada por el hongo para su crecimiento (4949. Kumar BS, Bandyopadhyay P, Kumar P, Kumar MD, Prasad R, Kumari A, Chandra UK, Kumar YP, Varma A. Interaction of Piriformospora indica with Azotobacter chroococcum. Scientific Reports. 2015; 5(13911):1-13. http://doi.org/10.1038/srep13911). De forma similar a los resultados del presente trabajo, otros autores han observado que la inoculación conjunta de tres PGPR (A. chroococum, B. megaterium y B. mucilaginous) con dos HMA resultaron en el incremento de la colonización micorrícica (5050. Khalid M, Hassani D, Bilal M, Asad F y Huang D. Influence of bio fertilizer containing beneficial fungi and rhizospheric bacteria on health promoting compounds and antioxidant activity of Spinacia oleracea L. Botanical Studies. 2017; 58, 35. http://doi.org/10.1186/s40529-017-0189-3).

El cocotero es un cultivo que de forma natural establece simbiosis con los HMA (5151. Lara-Pérez LA, Oros-Ortega I, Córdova-Lara I, Estrada-Medina H, O'Connor-Sánchez A, Góngora-Castillo E, Sáenz-Carbonell L. Seasonal shifts of arbuscular mycorrhizal fungi in Cocos nucifera roots in Yucatán, México. Mycorrhiza. 2020; 30(2-3):269-283. http://doi.org/10.1007/s00572-020-00944-0) y se asocia con bacterias del género Azotobacter (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495, 5252. Pandey S y Gupta S. Diversity analysis of ACC deaminase producing bacteria associated with rhizosphere of coconut tree (Cocos nucifera L.) grown in Lakshadweep islands of India and their ability to promote plant growth under saline conditions. J Biotechnol. 2020; 20;324:183-197. http://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.10.024), lo cual se evidenció en las plantas crecidas dentro de los controles evaluados (S-H-FC 1:1:1 y NPK 100%) los cuales no se inocularon, por lo que las poblaciones cuantificadas de ambos grupos microbianos, correspondieron a las autóctonas.

La respuesta positiva en relación al incremento de los contenidos de N, P y K en la parte aérea de las plantas con resultados de los tratamientos R. irregularis - A. chroococum CDM-1 y G. cubense - A. chroococum CDM-2, superiores a los controles NPK 100 % y 1:1:1 de S-H-FC pudiera estar dada por el efecto combinado del abono orgánico con la coinoculación de Azotobacter chroococum y las cepas de HMA. Se conoce que los abonos orgánicos mejoran las propiedades físicas de los suelos por diferentes mecanismos (5353. Ayamba BE, Abaidoo RC, Opoku A, Ewusi-Mensah N. Mechanisms for nutrient interactions from organic amendments and mineral fertilizer inputs under cropping systems: a review. Peer J. 2023; 4;11:e15135. http://doi.org/10.7717/peerj.15135), permitiendo mayor disponibilidad de los nutrientes, lo que favorece un mejor desarrollo de las plantas (5454. Khanal U, Wilson C, Rahman S, Lee BL y Hoang VN. Smallholder farmers'adaptation to climate change and its potential contribution to UN's sustainable development goals of zero hunger and no poverty. Journal of Cleaner Production. 2021; 281:124999. http://doi.org/10.1016/j.jclepro.2020.124999) y, por consiguiente, pudo incrementar la cantidad y calidad de los exudados radicales y con ello el establecimiento de las cepas de A. chroococum y de HMA más eficientes para cada suelo.

A. chroococum produce la secreción de fitohormonas que favorecen el crecimiento radical de las plantas, permitiendo mayor absorción de agua y absorción de nutrientes, además, posee la capacidad de solubilizar el fósforo, fijar nitrógeno atmosférico y hacer disponible el Fe a través de la producción de sideróforos (2929. Sumbul A, Ansari RA, Rizvi R y Mahmood I. Azotobacter: A potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi Journal of Biological Sciences. 2020; 27, 3634-3640. http://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004). De esta forma, las plantas pueden disponer de mayor contenido de nutrientes obtenido a través del proceso de fijación de nitrógeno, pues el Fe constituye un cofactor importante para este mecanismo biológico (5555. Sadvakasova AK, Kossalbayev BD, Token AI, Bauenova MO, Wang J, Zayadan BK, Balouch H, Alwasel S, Leong YK, Chang JS y Allakhverdiev SI. Influence of Mo and Fe on Photosynthetic and Nitrogenase Activities of Nitrogen-Fixing Cyanobacteria under Nitrogen Starvation. Cells. 2022; 5;11(5):904. http://doi.org/10.3390/cells11050904).

Resultados experimentales evidencian que la estimulación por las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal es el resultado de varios mecanismos que actúan de forma conjunta y se activan simultáneamente. Las simbiosis de las plantas con los microorganismos del suelo confieren beneficios energéticos debido a la mejora de la nutrición de las plantas; el suministro de N y P del simbionte microbiano a la planta depende de la disponibilidad de ATP en el simbionte microbiano, que está regulada por su demanda de compuestos de carbono (5656. Ortíz J, Sanhueza C, Romero-Munar A, Hidalgo-Castellanos J, Castro C, Bascuñán-Godoy L, Coba de la Peña T, López-Gómez M, Florez-Sarasa I y Del-Saz NF. In Vivo Metabolic Regulation of Alternative Oxidase under Nutrient Deficiency-Interaction with Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Rhizobium Bacteria. Int J Mol Sci. 2020; 12;21(12):4201. doi: http://doi.org/10.3390/ijms21124201.).

Es conocido que los HMA promueven el crecimiento vegetal por diferentes mecanismos, entre los que se encuentran la mejora del estatus hídrico (5757. Santana LR, da Silva LN, Tavares GG, Batista PF, Cabral JSR y Souchie EL. Arbuscular mycorrhizal fungi associated with maize plants during hydric deficit. Sci Rep. 2023; 27;13(1):1519. doi: http://doi.org/10.1038/s41598-023-28744-4.) y el aumento de la absorción de elementos minerales presentes en el suelo, fundamentalmente los de difusión limitada como el P (3434. Shi J, Wang X, Wang E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 2023; 74:569-607. http://doi.org/10.1146/annurev-arplant-061722-090342), el Zn y el Cu (5858. Sethi D, Subudhi S, Rajput VD, Kusumavathi K, Sahoo TR, Dash S, Mangaraj S, Nayak DK, Pattanayak SK, Minkina T, Glinushkin AP y Kalinitchenko VP. Exploring the role of mycorrhizal and rhizobium inoculation with organic and inorganic fertilizers on the nutrient uptake and growth of Acacia mangium saplings in acidic soil. Forests. 2021; 12(12):1657. doi: http://doi.org/10.3390/f12121657.). Se plantea que puede existir una necesidad diferenciada en base a la demanda nutricional de la propia cepa de HMA inoculada, lo cual pudiera constituir una posible explicación a los resultados observados (5959. Hodge A, Storer K. Arbuscular mycorrhiza and nitrogen: implications for individual plants through to ecosystems. Plant and Soil. 2015; 386 (1-2): 1-19. doi: http://doi.org/10.1007/s11104-014-2162-1.).

En sentido general, los resultados pudieron estar condicionados por la relación que se establece entre A. chroococcum y los HMA. Las cepas de Azotobacter inoculadas, al establecerse en el sustrato, pudieron producir fitohormonas que estimularon el crecimiento de las raíces en las plantas, induciendo la secreción de exudados radicales que permitieron la colonización de la cepa de HMA, según el tipo de suelo utilizado en el sustrato (6060. Bahrani A, Pourreza J, Hagh JM. Response of winter wheat to co-inoculation with Azotobacter and Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) under Different Sources of Nitrogen Fertilizer. American-Eurasian Journal Agricultural and Environment Sciences. 2010; 8(1):95-103. ISSN: 1818-6769.). Por otra parte, el pH que poseían los sustratos estaba en el rango óptimo para el crecimiento de Azotobacter, lo que favoreció el establecimiento de esta bacteria (6161. Rico GMA. Capacidad promotora de crecimiento vegetal por bacterias del género Azotobacter y Actinomicetos aislados de cultivos de Solanum tuberosum Linnaeus, 1753 (Papa) cultivados en zonas altoandinas del Perú. [en línea] [Tesis en opción título profesional de Biólogo con Mención en Biología Celular y Genética] Facultad de Ciencias Biológica. E. A. P. de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor De San Marcos. Lima, Perú. 2009; 152 p. [Consultado: 20 de enero de 2018], Available from: http://www.cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/875/1/Rico_gm.pdf.). A estos valores de pH, la bacteria pudo haber solubilizado los fosfatos insolubles lo que, al parecer, resultó favorable para el establecimiento de las cepas de HMA, teniendo en cuenta que este es uno de los factores que regula su establecimiento y funcionamiento (6262. Rivera R, González PJ, Hernández JA, Martín G, Ruíz L, Fernández K, Simó J, García M, Pérez A, Riera M, Bustamante C, Joao JP, Ruiz M. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. En: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo, del 2 al 5 de Junio. La Habana, Cuba. 2015. Available from: https://www.researchgate.net/publication/279193397_La_importancia_del_ambiente_edafico_y_del_pH_sobre_la_efectividad_y_la_recomendacion_de_cepas_eficientes_de_HMA_para_la_inoculacion_de_los_cultivos).

Las diferentes especies de HMA estudiadas respondieron al sustrato en dependencia del suelo que lo conformó. Se observó un efecto en función de los altos niveles de propágulos autóctonas existentes, a pesar de poseer similitud en el pH, así como en el contenido de materia orgánica y en la relación C/N, lo que indicó que otras propiedades físico-químicas y biológicas de los sustratos pudieran estar influyendo en la respuesta diferencial de los HMA observadas, por lo que se hace necesario profundizar los estudios de inoculación micorrícica en estos suelos, ya que no existían resultados anteriormente publicados.

El micelio extraradical de los HMA puede traslocar de forma efectiva los productos de la actividad de las rizobacterias, cuando conviven en la rizosfera de las plantas, por lo que la respuesta de las mismas a la simbiosis micorrícica involucra la acción, también, de los microorganismos rizosféricos en su conjunto (6363. Zhang W, Li XG, Sun K, Tang MJ, Xu FJ, Zhang M y Dai CC. Mycelial network-mediated rhizobial dispersal enhances legume nodulation. ISME J. 2020; 4(4):1015-1029. doi: http://doi.org/10.1038/s41396-020-0587-5.).

En la interacción HMA- Azotobacter se favoreció el incremento de los niveles de absorción de nutrimentos como nitrógeno, fósforo y potasio y su translocación hacia el interior de la planta, con el incremento de la capacidad fotosintética y, por consiguiente, el aumento en los indicadores morfológicos evaluados, que permitieron la disminución del período de permanencia en el vivero.

En todos los casos, los tratamientos donde se obtuvieron los mejores resultados indican, además, que debió ocurrir una mayor capacidad de captación de energía solar para llevar a cabo la fotosíntesis, al mostrar mayor número de hojas y área foliar. Se ha observado que los HMA mejoran significativamente la tasa fotosintética y aumentan el contenido de clorofila (6464. Huang D, Ma M, Wang Q, Zhang M, Jing G, Li C y Ma F. Arbuscular mycorrhizal fungi enhanced drought resistance in apple by regulating genes in the MAPK pathway. Plant Physiol Biochem. 2020; 149:245-255. doi: http://doi.org/10.1016/j.plaphy.2020.02.020., 3434. Shi J, Wang X, Wang E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 2023; 74:569-607. http://doi.org/10.1146/annurev-arplant-061722-090342), lo que provocaría un elevado impacto sobre la tasa de crecimiento.

Se ha referido el efecto beneficioso en el crecimiento vegetal cuando se emplean inoculantes compuestos por bacterias fijadoras de nitrógeno y HMA, combinados con abonos orgánicos, con la reducción de los niveles de fertilizantes minerales empleados (5858. Sethi D, Subudhi S, Rajput VD, Kusumavathi K, Sahoo TR, Dash S, Mangaraj S, Nayak DK, Pattanayak SK, Minkina T, Glinushkin AP y Kalinitchenko VP. Exploring the role of mycorrhizal and rhizobium inoculation with organic and inorganic fertilizers on the nutrient uptake and growth of Acacia mangium saplings in acidic soil. Forests. 2021; 12(12):1657. doi: http://doi.org/10.3390/f12121657.).

En una investigación realizada en posturas de cocotero con el uso de los HMA, se encontró un efecto positivo sobre el número, volumen y masa seca de las raíces primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias, a partir del cuarto mes posterior a la inoculación, lo cual mejoró la eficiencia en la absorción de agua y nutrientes e indujo incrementos en el perímetro de la base del tallo y la masa seca de la parte aérea a partir del sexto mes (6565. Ilangamudali IMPS, Senarathne SHS. Effectiveness of Arbuscular Mycorrhizal Fungi based biofertilizer on early growth of coconut seedlings. COCOS. 2016; 22: 1-12. doi: http://doi.org/10.4038/cocos.v22i1.5807.).

Se ha demostrado en otros cultivos la acción positiva de las interacciones entre HMA y PGPR sobre la promoción del crecimiento (2222. Vafa ZN, Sohrabi Y, Sayyed RZ, Luh Suriani N y Datta R. Effects of the Combinations of Rhizobacteria, Mycorrhizae, and Seaweed, and Supplementary Irrigation on Growth and Yield in Wheat Cultivars. Plants. 2021; 10(4), 811. doi: http://doi.org/10.3390/plants10040811, 2323. Vishwakarma K, Kumar N, Shandilya C, Mohapatra S, Bhayana S y Varma A. Revisiting Plant–Microbe Interactions and Microbial Consortia Application for Enhancing Sustainable Agriculture: A Review. Front. Microbiol. 2020; 11:560406. doi: http://doi.org/10.3389/fmicb.2020.560406., 6666. Pokluda R, Ragasová L, Jurica M, Kalisz A, Komorowska M, Niemiec M y Sekara A. Effects of growth promoting microorganisms on tomato seedlings growing in different media conditions. PLoS ONE. 2021; 16(11): e0259380. doi: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0259380.), así como la de estos grupos microbianos y abonos orgánicos (6767. Mesbah R, Ardakani MR, Moghaddam A y Rafiei F. Yield and morpho-physiological traits of tobacco (Nicotiana tabacum L.) as affected by azotobacter, mycorrhizal symbiosis and biochar application. Plant Science Today. 2021; 8(4): 986-994. doi: http://doi.org/10.14719/pst.1378.); sin embargo, estudios similares no se han realizado en coco con anterioridad, en el cual solo se habían empleado de forma independiente. Contar con resultados de la coinoculación de los HMA y Azotobacter en este cultivo permite potenciar el uso de los mismos y, de esta forma posibilitar la obtención de posturas de calidad, y por consiguiente, lograr el incremento de los rendimientos.

El estudio combinado de fuentes orgánicas, HMA y bacterias fijadoras de nitrógeno han demostrado que las fuentes combinadas proporcionan un ambiente adecuado para el crecimiento de las plantas en una etapa temprana (5757. Santana LR, da Silva LN, Tavares GG, Batista PF, Cabral JSR y Souchie EL. Arbuscular mycorrhizal fungi associated with maize plants during hydric deficit. Sci Rep. 2023; 27;13(1):1519. doi: http://doi.org/10.1038/s41598-023-28744-4.).

Las prácticas de agricultura orgánica con enfoque en la construcción de bases de fertilidad biológica del suelo a través de la aplicación de insumos orgánicos y bioproductos, como los HMA y PGPR (Azotobacter), permiten la producción sostenible de coco, de una manera respetuosa con el medio ambiente.

Conclusiones

Teniendo en cuenta los resultados se puede concluir que la coinoculación de R. irregularis con la cepa de A. chroococcum CDM-1 permite la obtención de posturas de coco de alta calidad para emplearse en el Vivero Playa Duaba con suelo ARh, mientras que la combinación de G. cubense y A. chroococcum CDM-2 muestran los mejores indicadores para el Vivero Cabacú con suelo GFh, ambos empleando como sustrato la combinación de S-H-FC (4:1:1), lo cual permite optimizar el empleo de los abonos orgánicos locales. Se demuestra el efecto promotor del crecimiento de los HMA y Azotobacter combinado con abonos orgánicos para la obtención de posturas de coco.

Introduction

The coconut palm is a crop with a wide range of uses, which makes it a unique plant. It has applications in the food industry (11. Qadi WSM, Mediani A, Benchoula K, Wong EH, Misnan NM, Sani NA. Characterization of Physicochemical, Biological, and Chemical Changes Associated with Coconut Milk Fermentation and Correlation Revealed by 1H NMR-Based Metabolomics. Foods. 2023, 12(10): 1971. doi: http://doi.org/10.3390/foods12101971., 22. Wirkijowska A, Sobota A, Zarzycki P, Nawrocka A, Blicharz-Kania A y Andrejko D. Chemical, technological, and sensory evaluation of the suitability of coconut by-products in white rolls. J Sci Food Agric. 2022; 102(8):3370-3378. doi: http://doi.org/10.1002/jsfa.11684.), as an oil substitute and sweetener (33. Saraiva A, Carrascosa C, Ramos F, Raheem D, MariaLopes M y Raposo A. coconut sugar: chemical analysis and nutritional profile; health impacts; safety and quality control; food industry applications. Int J Environ Res Public Health. 2023, 19;20(4):3671. doi: http://doi.org/10.3390/ijerph20043671.), as well as for its high nutritional value (44. Divya PM, Roopa BS, Manusha C y Balannara P. A concise review on oil extraction methods, nutritional and therapeutic role of coconut products. Review J Food Sci Technol. 2023, 60(2):441-452. doi: http://doi.org/10.1007/s13197-022-05352-0., 22. Wirkijowska A, Sobota A, Zarzycki P, Nawrocka A, Blicharz-Kania A y Andrejko D. Chemical, technological, and sensory evaluation of the suitability of coconut by-products in white rolls. J Sci Food Agric. 2022; 102(8):3370-3378. doi: http://doi.org/10.1002/jsfa.11684.). It also has wide applications in the cosmetic industry (55. Kaushik V, Chogale R y Mhaskar S. Single hair fiber assessment techniques to discriminate between mineral oil and coconut oil effect on hair physical properties. Journal of Cosmet Dermatol. 2021; 20(4), 1306–1317. doi: http://doi.org/10.1111/jocd.13724.-77. Sumit AF, Sharmin T y Ahmed T. Evaluation of the in vitro antimicrobial activity as well as preservative capacity of several popular cosmetic products available in the neighbouring shops in Bangladesh. Mymensingh Medical Journal. 2021; 30(2), 478-484. PMID: 33830132.), in the timber and handicraft industries (88. Limones BV, Fernández BMA. El cocotero: “El árbol de la vida”. Herbario CICY. 2016; 8:107–110. Available from: http://www.cicy.mx/sitios/desde_herbario/.). By-products such as fiber are used in agriculture for the preparation of substrates (99. Gopal M, Gupta A, Arunachalam V, Maheswarappa HP, Thomas GV, Jacob PM. Autochthonous nutrient recycling driven by soil microbiota could be sustaining high coconut productivity in Lakshadweep Islands sans external fertilizer application. World J Microbiol Biotechnol. 2022; 2;38(11):213. doi: http://doi.org/10.1007/s11274-022-03373-7., 1010. Tuckeldoe RB, Maluleke MK y Adriaanse P. 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The Effect of Coconut Oil Consumption on Cardiovascular Risk Factors: A Systematic Review and Meta-Analysis of Clinical Trials. Circulation. 2020; 141(10), 803-814. doi: http://doi.org/10.1161/circulationaha.119.043052), cardiovascular diseases (1515. Schwingshackl L, Schlesinger S. Coconut Oil and Cardiovascular Disease Risk. Curr Atheroscler Rep. 2023; 25(5):231-236. doi: http://doi.org/10.1007/s11883-023-01098-y-1717. Teng M, Zhao YJ, Khoo AL, Yeo TC, Yong QW y Lim BP. Impact of coconut oil consumption on cardiovascular health: a systematic review and meta-analysis. Nutrition Reviews. 2020; 78(3), 249-259. doi: http://doi.org/10.1093/nutrit/nuz074) and multiple sclerosis (1818. Cuerda-Ballester M, Proaño B, Alarcón-Jimenez J, Bernardo N, Villaron-Casales C, Lajara Romance JM, Rubia Ortí JE. Improvements in gait and balance in patients with multiple sclerosis after treatment with coconut oil and epigallocatechin gallate. A pilot study. Food Funct. 2023; 14(2):1062-1071. doi: http://doi.org/10.1039/d2fo02207a). Its use has spread to more than 94 countries around the world, providing livelihoods for millions of people in the Asia-Pacific regions (1919. Rethinam P. Chapter 2: International Scenario of Coconut Sector. In: Nampoothiri KUK, Krishnakumar V, Thampan PK, Achuthan Nair M, editors. The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018; pp 21-56. Singapore: Springer. doi: http://doi.org/10.1007/978-981-13-2754_2). However, in most of these countries there is an aging of plantations that constitutes the main limitation for obtaining high yields (2020. Samosir YMS y Adkins SW. Improving acclimatization through the photoautotrophic culture of coconut (Cocos nucifera) seedlings: an in vitro system for the efficient exchange of germplasm. In Vitro Cell Dev Plant. 2014; 50:493–501. doi: http://doi.org/10.1007/s11627-014-9599-z), an effect that is also observed in Cuban plantations. This produces economic effects for the producers and for the companies that use its derivatives, such as coconut oil, since they have to import it from an external market. Because of this, it is necessary to apply technologies for the production of quality seedlings, as a crucial step to obtain vigorous and productive populations. The quality of the planting material determines to a great extent the final yields of the coconut, being the basis for a successful production (21[21] Thomas, GV, Krishnakumar, V, Dhanapal, R, y Reddy, DVS Chapter 7 Agro-management Practices for Sustainable Coconut Production. En: Nampoothiri, KUK, Krishnakumar, V, Thampan, PK, Achuthan Nair, M (eds.), The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018. (pp. 227-322). Singapore: Springer. DOI: 10.1007/978-981-13-2754_7.).

The use of microorganisms, active components of biofertilizers, may represent a feasible alternative technology to improve plant yields (2222. Vafa ZN, Sohrabi Y, Sayyed RZ, Luh Suriani N y Datta R. Effects of the Combinations of Rhizobacteria, Mycorrhizae, and Seaweed, and Supplementary Irrigation on Growth and Yield in Wheat Cultivars. Plants. 2021; 10(4), 811. doi: http://doi.org/10.3390/plants10040811, 2323. Vishwakarma K, Kumar N, Shandilya C, Mohapatra S, Bhayana S y Varma A. Revisiting Plant–Microbe Interactions and Microbial Consortia Application for Enhancing Sustainable Agriculture: A Review. Front. Microbiol. 2020; 11:560406. doi: http://doi.org/10.3389/fmicb.2020.560406.). Effective formulations of agriculturally important microorganisms such as nitrogen fixers, plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR), and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) have been developed as valuable inputs for crop production (21[21] Thomas, GV, Krishnakumar, V, Dhanapal, R, y Reddy, DVS Chapter 7 Agro-management Practices for Sustainable Coconut Production. En: Nampoothiri, KUK, Krishnakumar, V, Thampan, PK, Achuthan Nair, M (eds.), The Coconut Palm (Cocos nucifera L.) - Research and Development Perspectives. 2018. (pp. 227-322). Singapore: Springer. DOI: 10.1007/978-981-13-2754_7.).

AMF are the most widely geographically distributed microbial group of all biofertilizing microorganisms with a high adaptation to diverse soil conditions (2424. Siim KS, Teele J, Martti V, Martin Z, Maarja Ö. Effects of land use on arbuscular mycorrhizal fungal communities in Estonia. Mycorrhiza. 2018; 28 (3): 259–268. DOI: http://doi.org/10.1007/s00572-018-0822-3.). They play an important role, contributing most efficiently to seedling survival and growth by playing a crucial role in plant nutrition (2525. Müller LM y Harrison MJ. Phytohormones, miRNAs, and peptide signals integrate plant phosphorus status with arbuscular mycorrhizal symbiosis. Current Opinion in Plant Biology, 2019; 50, 132–139. http://doi.org/10.1016/j.pbi.2019.05.004, 2626. Sarmiento-López LG, López-Meyer M, Sepúlveda-Jiménez G, Cárdenas L y Rodríguez-Monroy M. Photosynthetic performance and stevioside concentration are improved by the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Stevia rebaudiana under different phosphate concentrations. Peer J. 2020; 18p. http://doi.org/10.7717/peerj.10173). Studies conducted in the rhizosphere of adult coconut plantations have demonstrated the rich diversity of this species, whose roots are colonized by AMF (2727. Rajeshkumar PP, Thomas GV, Gupta A y Gopal M. Diversity, richness and degree of colonization of arbuscular mycorrhizal fungi in coconut cultivated along with intercrops in high productive zone of Kerala, India. Symbiosis. 2015; 65, 125–14. http://doi.org/10.1007/s13199-015-0326-2).

Among the PGPR is the genus Azotobacter. These are free-living associative bacteria, with potentialities among which N fixation and phytohormone production stand out (2828. Martin Del Campo JS, Rigsbee J, Bueno Batista M, Mus F, Rubio LM, Einsle O, Peters JW, Dixon R, Dean DR y Dos Santos PC. Overview of physiological, biochemical, and regulatory aspects of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2022; 57(5-6):492-538. http://doi.org/10.1080/10409238.2023.2181309). They are also antagonists to soil pathogens (2929. Sumbul A, Ansari RA, Rizvi R y Mahmood I. Azotobacter: A potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi Journal of Biological Sciences. 2020; 27, 3634-3640. http://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004), as well as inducers of systemic resistance in plants against foliar and root pathogens (3030. Carmona A, Reyes JJ, Chiquito RG, Rincon G, Cerdan CR y Hernández LG. Biocontrol of postharvest fruit fungal diseases by bacterial antagonists: A Review. Agronomy. 2021; 9, 121. http://doi.org/10.3390/agronomy9030121).

In crops other than coconut, the joint application of AMF and Azotobacter has been shown to promote plant growth (3131. Kalapchieva S, Tringovska I, Bozhinova R, Kosev V, Hristeva T. Population response of rhizosphere microbiota of garden pea genotypes to inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi. Int J Mol Sci. 2023; 24(2):1119. http://doi.org/10.3390/ijms24021119, 3232. Lamlom SF, Irshad A, Mosa WFA. The biological and biochemical composition of wheat (Triticum aestivum) as affected by the bio and organic fertilizers. BMC Plant Biol. 2023; 23(1):111. http://doi.org/10.1186/s12870-023-04120-2), by different mechanisms such as the regulation of plant growth hormones (2828. Martin Del Campo JS, Rigsbee J, Bueno Batista M, Mus F, Rubio LM, Einsle O, Peters JW, Dixon R, Dean DR y Dos Santos PC. Overview of physiological, biochemical, and regulatory aspects of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2022; 57(5-6):492-538. http://doi.org/10.1080/10409238.2023.2181309) and the improvement of nutrition (2626. Sarmiento-López LG, López-Meyer M, Sepúlveda-Jiménez G, Cárdenas L y Rodríguez-Monroy M. Photosynthetic performance and stevioside concentration are improved by the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Stevia rebaudiana under different phosphate concentrations. Peer J. 2020; 18p. http://doi.org/10.7717/peerj.10173), and constitutes an extremely useful approach for sustainable agriculture, including in ecosystems affected by some stress (3333. Sagar A, Rathore P, Ramteke PW, Ramakrishna W, Reddy MS y Pecoraro L. Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Their Synergistic Interactions to Counteract the Negative Effects of Saline Soil on Agriculture: Key Macromolecules and Mechanisms. Microorganisms. 2021; 9, 1491. http://doi.org/10.3390/microorganisms9071491-3535. Wahab A, Muhammad M, Munir A, Abdi G, Zaman W, Ayaz A, Khizar C y Reddy SPP. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in regulating growth, enhancing productivity, and potentially influencing ecosystems under abiotic and biotic stresses. Plants. (Basel) 2023; 12(17):3102. http://doi.org/10.3390/plants12173102). The joint use of both microbial groups may constitute a technology for obtaining quality seedlings, leading to rejuvenated plantations with high productivity.

For these reasons, the objective of the present work was to study the combined effect of AMF and Azotobacter strains in the production of high quality coconut seedlings in the nursery.

Materials and methods

The experiment was developed in the nurseries of Playa Duaba with an Arenosol haplic soil (ARh), and Cabacú with a Gleysol Fluvic haplic soil (GFh), both in Baracoa municipality, Guantánamo, Cuba. The substrate used was the combination Soil: Earthworm Humus: Coconut Fiber (S:H:FC), in a 4:1:1 ratio (v/v/v/v), taking into account the results of previous works (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). In each nursery, local soil was used to prepare the substrates. As a control, substrates made up of the combination of soil and organic sources were used in the ratio 1:1:1 v/v/v/v as recommended in the Technical Instructions for coconut cultivation (37[37] MINAG. Instructivo técnico para el cultivo del COCO. 1ra Edición, edit. Biblioteca ACTAF, Ciudad de la Habana. 2011, 15p. Available from: http://actaf.co.cu/index.php.). Partial characterization of the substrates was carried out (38[38] Paneque PVM, Calaña NJM, Calderón VM, Borges BY, Hernández GTC, y Caruncho CM. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. 1st ed. La Habana, Cuba: Ediciones INCA. 2010. Available from: http://mst.ama.cu/578/.) and the autochthonous populations of AMF in each type of soil were quantified (3939. Herrera PRA, Furrazola E, Ferrer RL, Fernández VR y Torres Y. Functional strategies of root hair sand arbuscular mycorrhizae in an evergreen tropical forest, Sierra del Rosario, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas. 2004; 35(2),113-123. Available from: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181226079010.). Table 1 shows the partial characterization of the substrates and the results of the quantification of the autochthonous AMF populations of the soils.

The domesticated ecotype of coconut palm “Indio Verde-1” (4040. Alonso, M., Cueto, J.R., Santos, Y., Romero, W., LLauger, R. y Rohde, W. (2007). Variabilidad morfológica y molecular de una población de cocoteros verdes en la región de Baracoa. Cultivos Tropicales. 28(3), 69-75. Available from: https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/download/293/pdf/813&ved=2ahUKEwjrla_53ZCJAxU_TDABHXhBA6MQFnoECBgQAQ&usg=AOvVaw3NkCnmnalNP5YOZQV6CY5i.) was used, whose seeds were obtained from healthy mother plants, which were prepared and sown as reported (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495).

Three species of AMF were selected, which came from the stock of the National Institute of Agricultural Sciences (INCA): Glomus cubense, Y. Rodr. and Dalpé (4141. Rodríguez Y, Dalpé Y, Séguin S, Fernández K, Fernández F, Rivera RA. Glomus cubenses p. nov., an arbuscular mycorrhizal fungus from Cuba. Mycotaxon. 2011; 118(1): 337-347. doi http://doi.org/10.5248/118.337.) strain INCAM-4 (DAOM241198), with 92 spores g-1 of inoculum; Rhizophagus irregularis (Blaszk, Wubet, Renker and Buscot) Walker and Shüβler (4242. Shüßler A, Walker C. The Glomeromycota: a species list with new families and new genera. Gloucester: The Royal Botanic Garden Edinburgh, The Royal Botanic Garden Kew, Botanische Staatssammlung Munich, and Oregon State University. 2011, 58p. Available from: https://books.google.com.cu/books/about/The_Glomeromycota.html?id=qjILywAACAAJ&redir_esc=y.), strain INCAM-11 (DAOM711363), with 73 spores g^-1 of inoculum and Funneliformis mosseae, (Nicol. and Gerd.) Walker and Schüßler (4242. Shüßler A, Walker C. The Glomeromycota: a species list with new families and new genera. Gloucester: The Royal Botanic Garden Edinburgh, The Royal Botanic Garden Kew, Botanische Staatssammlung Munich, and Oregon State University. 2011, 58p. Available from: https://books.google.com.cu/books/about/The_Glomeromycota.html?id=qjILywAACAAJ&redir_esc=y.), strain INCAM-2, with 57 spores g^-1 inoculum. Inocula were adjusted to ensure 215 spores per seed, (4343. Sabio C. Evaluación de Mycoral® en tres variedades de cocotero resistentes al Amarillamiento Letal del cocotero para mejorar el crecimiento en condiciones de vivero [en línea] [Tesis para optar por el título de Ingeniero Agrónomo], Escuela Agrícola panamericana. Zamorano, Honduras. 2002; 37 p. [Consultado: 25 de mayo de 2012], Available from: http://www.bdigital.zamorano.edu/bitstream/11036/2209/1/cpa.2002-%20T101.). For the application, the inoculant was mixed with 600 mL of water, in which the seed was immersed, by the part of the notch, using the seed coating method (4444. Fernández F, Gómez R, Vanegas LF, Noval BM, Martínez MA. Producto inoculante micorrizógeno; Cuba; Oficina Nacional de Propiedad Industrial Patente No. 22641, 2000. Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf;jsessionid=ED1D72BCCE74B2DBD801D4D94327D0B1.wapp2nA?docId=CU4401498yrecNum=98yoffice=yqueryString=yprevFilter=%26fq%3DOF%3ACU%26fq%3DICF_M%3A%22A01N%22ysortOption=Pub+Date+DescymaxRec=135.) with the referred modification.

All treatments inoculated with AMF were co-inoculated with strains of A. chroococcum belonging to the strain collection of the National Institute for Fundamental Research in Tropical Agriculture (INIFAT), isolated from the nurseries that were the object of the study. In the Playa Duaba nursery treatments, strain CDM-1 was inoculated and in the Cabacú nursery, strain CDM-2, in both cases, after the inoculation of AMF species, taking into account the results of previous studies (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). The strains were prepared as described in the aforementioned work.

No inoculation of microorganisms was performed in the control. An additional treatment was used, conformed by mineral fertilization (NPK 100 %) for which the complete formula 9:13:17 was used at a rate of 45 g per seed, fractioned at 33 % at 30 days after sowing (das) and the rest at 90 das, to evaluate the effect of AMF with respect to the control of complete fertilization (37[37] MINAG. Instructivo técnico para el cultivo del COCO. 1ra Edición, edit. Biblioteca ACTAF, Ciudad de la Habana. 2011, 15p. Available from: http://actaf.co.cu/index.php.).

A randomized block design with three replications was used. Each experimental plot within the block contained 20 seeds sown at 0.05 x 0.20 m spacing.

The experiment had a duration of 180 days. At 120 das, the germination velocity index (GVI) was calculated (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495), according to the formula:

For this variable, the percent increase of the inoculated treatments relative to the control was calculated.

At 180 das, fifteen plants per replicate were sampled and height, diameter at the stem base, number of leaves, leaf area, and total dry mass were evaluated (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495). In the aerial part, N, P and K contents were quantified (4545. Paneque VM, Calaña JM. La fertilización de los cultivos. Aspectos teórico-prácticos para su recomendación. Departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas. INCA. La Habana. 2001; 29 p. Available from: http://www.inca.edu.cu.).

The quantification of mycorrhizal variables, percentage of colonization (%) (4646. Giovanetti M, Mosse B. An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, 84, 489–500. doi: http://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1980.tb04556.x.), and intensity of mycorrhizal colonization (%) and native AMF populations in the rhizosphere, evaluated as number of spores (3939. Herrera PRA, Furrazola E, Ferrer RL, Fernández VR y Torres Y. Functional strategies of root hair sand arbuscular mycorrhizae in an evergreen tropical forest, Sierra del Rosario, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas. 2004; 35(2),113-123. Available from: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181226079010.), was also carried out.

The experiment was repeated for two years, using a randomized block design. The data were processed by Simple Classification Analysis of Variance and the comparison of means by Duncan's Multiple Range Test with a significance level of 95 %. Data for the variable percentage of mycorrhizal colonization were transformed by the formula arcseno√x. The statistical package STATGRAPHIC version 15.2 was used.

Results

When analyzing the results of the different indicators evaluated, no interaction was observed between the repetition factor and time in any of the nurseries, so the means of both repetitions are analyzed.

Regarding the GVI, it was observed that co-inoculation with AMF with A. chroococcum strains accelerated the germination process, regardless of the AMF strain inoculated (Figure 1). The control and the fertilized treatment (NPK) showed similarities between them, but differences in relation to the inoculated ones, in the two soils studied.

In the Cabacú nursery (GFh soil), higher percentages of increase were observed for the inoculated treatment than those obtained in the Playa Duaba nursery (ARh soil) (71-77 and 28-33, respectively), due to the fact that both the control and the fertilized treatment showed lower values in the latter, which shows that a greater mycorrhizal effect was obtained in the GFh soil.

When analyzing the results of vegetative development (Table 2), a differential response of the AMF strains studied in the two nurseries, corresponding to two types of soil, was observed. In the Playa Duaba nursery, the co-inoculated R. intraradices - A. chroococcum CDM-1 treatment showed significantly higher levels than the rest of the variants in all the indicators evaluated (height, stem diameter, number of leaves, leaf area and total dry mass). With the use of G. cubense and F. mosseae, values of height, stem diameter and leaf area were statistically similar to those of the control; however, in the rest of the indicators it was lower than the control. The fertilized treatment showed the lowest levels in all indicators.

Unlike the Playa Duaba nursery, in Cabacú the best results were obtained with the combination G. cubense - A. chroococcum strain CDM-2, which significantly outperformed the rest of the treatments in all the indicators evaluated. The treatments inoculated with R. irregularis and F. mosseae achieved values similar to or lower than the control in all the indicators evaluated, with the exception of leaf area, where they exceeded the control. In all cases, the fertilized treatment showed the lowest levels.

When analyzing the contents of N, P and K in the plant, in the Playa Duaba nursery (ARh soil), the R. irregularis - A. chroococcum CDM-1 co-inoculation treatments stood out, with an increase in the contents of the three elements. In the treatments where G. cubense and were used, intermediate levels were reached, being statistically superior to the control. The control and the fertilized treatment showed statistical similarity, obtaining the lowest values.

In the Cabacú nursery (GFLh soil), the combination of G. cubense - A. chroococcum CDM-2 had a positive effect on N, P and K contents, while the treatments using R. irregularis and F. mosseae obtained intermediate values, with significant differences between them. The control and the fertilized treatment showed the lowest levels; however, the organic fertilizer (control) outperformed the NPK fertilization.

Regarding mycorrhization indicators, in the Playa Duaba nursery (ARh soil) the control showed similar colonization levels to those obtained by the mycorrhized treatments (Figure 2); however, when analyzing the CI, the R. irregularis strain surpassed all treatments, similar to what was observed in the vegetative development study. This behavior was similar to that observed in the analysis of spore abundance, an indicator in which all treatments reached high values.

In Cabacú nursery (GFLh soil), a behavior similar to that obtained in the analysis of vegetative development was observed for the three indicators evaluated; however, the co-inoculation G. cubense - A. chroococcum CDM-2 significantly outperformed all treatments.

In the joint analysis of the variables evaluated, it was observed that when using the ARh soil (Playa Duaba nursery), the best treatment was the co-inoculation of R. irregularis - A. chroococcum CDM-1, while with the GFLh soil (Cabacú nursery) the combination of G. cubense - A. chroococcum CDM-2 was the one with which the best results were obtained. In these treatments, the co-inoculation of the microorganisms induced in the plants a better utilization of nutrients, an increase in photosynthetic surface (leaf area) and a greater accumulation of biomass (total dry mass).

Discussion

In the soils used for substrate preparation in both nurseries, high levels of resident AMF propagules were found (923.33 and 2676.67 AMF spores g-1 in ARh and GFLh soils, respectively, Table 1), similar to those found by other authors in similar, undisturbed agroecosystems (4747. Furrazola E, Covacevich F, Torres AY, Rodríguez RRM, Ley RJF, Izquierdo K, Fernández VR, Louro BRL. Functionality of arbuscular mycorrhizal fungi in three plant communities in the Managed Floristic Reserve San Ubaldo-Sabanalamar, Cuba. International Journal Tropical Biology, (2015). 63(2), 341–356. ISSN: 0034-7744., 4848. Furrazola GE, Rodríguez RRM, Torres AY, González GS, Ortega FR, Ley RJF. Hongos micorrizógenos arbusculares (Glomeromycotina) en ecosistemas naturales y agrícolas en la Reserva de la Biosfera Ciénaga de Zapata, Cuba. Acta Botánica Cubana, (2018). 217(1), 85–93. Available from: https://www.revistasgeotech.com/index.php/abc/article/view/225.). An effect of mycorrhizal symbiosis on the different indicators evaluated was observed.

The analysis of the results of the AMF-A. chroococcum interaction suggests that it is possible that the co-inoculation could have broken the barriers imposed by the competition of the inoculated AMF strains with the autochthonous strains because Azotobacter releases active metabolites that allow the growth of the fungus. In addition, it modulates the expression of specific active proteins that play an important role in the physiology and establishment of the symbiosis, since they stimulate sporulation during the vegetative state. On the other hand, these proteins regulate the synthesis of ATP and ammonium, which can be used in the processes of active absorption of organic and inorganic nitrogen sources by the mycelium, energy that is also used by the fungus for its growth (4949. Kumar BS, Bandyopadhyay P, Kumar P, Kumar MD, Prasad R, Kumari A, Chandra UK, Kumar YP, Varma A. Interaction of Piriformospora indica with Azotobacter chroococcum. Scientific Reports. 2015; 5(13911):1-13. http://doi.org/10.1038/srep13911). Similar to the results of the present work, other authors have observed that joint inoculation of three PGPR (A. chroocococum, B. megaterium, and B. mucilaginous) with two AMF resulted in increased mycorrhizal colonization (5050. Khalid M, Hassani D, Bilal M, Asad F y Huang D. Influence of bio fertilizer containing beneficial fungi and rhizospheric bacteria on health promoting compounds and antioxidant activity of Spinacia oleracea L. Botanical Studies. 2017; 58, 35. http://doi.org/10.1186/s40529-017-0189-3).

Coconut is a crop that naturally establishes symbiosis with AMF (5151. Lara-Pérez LA, Oros-Ortega I, Córdova-Lara I, Estrada-Medina H, O'Connor-Sánchez A, Góngora-Castillo E, Sáenz-Carbonell L. Seasonal shifts of arbuscular mycorrhizal fungi in Cocos nucifera roots in Yucatán, México. Mycorrhiza. 2020; 30(2-3):269-283. http://doi.org/10.1007/s00572-020-00944-0) and is associated with bacteria of the genus Azotobacter (3636. Alvarado K, Blanco A, Martín GM, Ríos Y, Capdesuñer R, Matos K, de la Noval BM. Influencia de un sistema de abonado orgánico y Azotobacter chroococcum sobre posturas de cocotero. Cultivos Tropicales. 2019; 40(1): a06-e06. https://ediciones.inca.edu.cu/index.php/ediciones/article/view/1495, 5252. Pandey S y Gupta S. Diversity analysis of ACC deaminase producing bacteria associated with rhizosphere of coconut tree (Cocos nucifera L.) grown in Lakshadweep islands of India and their ability to promote plant growth under saline conditions. J Biotechnol. 2020; 20;324:183-197. http://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.10.024), which was evidenced in plants grown within the evaluated controls (S-H-FC 1:1:1 and NPK 100 %) which were not inoculated, so that the quantified populations of both microbial groups corresponded to the autochthonous ones.

The positive response in relation to the increase of N, P and K contents in the aerial part of the plants with results of the treatments R. irregularis - A. chroocococum CDM-1 and G. cubense - A. chroocococum CDM-2, superior to the NPK 100 % and 1:1:1 controls of S-H-FC could be due to the combined effect of the organic fertilizer with the co-inoculation of Azotobacter chroocococum and AMF strains. It is known that organic fertilizers improve the physical properties of soils by different mechanisms (5353. Ayamba BE, Abaidoo RC, Opoku A, Ewusi-Mensah N. Mechanisms for nutrient interactions from organic amendments and mineral fertilizer inputs under cropping systems: a review. Peer J. 2023; 4;11:e15135. http://doi.org/10.7717/peerj.15135), allowing greater availability of nutrients, which favors better plant development (5454. Khanal U, Wilson C, Rahman S, Lee BL y Hoang VN. Smallholder farmers'adaptation to climate change and its potential contribution to UN's sustainable development goals of zero hunger and no poverty. Journal of Cleaner Production. 2021; 281:124999. http://doi.org/10.1016/j.jclepro.2020.124999) and, consequently, could increase the quantity and quality of root exudates and thus the establishment of the most efficient A. chroocococum and AMF strains for each soil.

A. chroocococum produces the secretion of phytohormones that favor plant root growth, allowing greater water absorption and nutrient absorption, in addition, it has the capacity to solubilize phosphorus, fix atmospheric nitrogen and make Fe available through the production of siderophores (2929. Sumbul A, Ansari RA, Rizvi R y Mahmood I. Azotobacter: A potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi Journal of Biological Sciences. 2020; 27, 3634-3640. http://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004). In this way, plants can have a higher content of nutrients obtained through the nitrogen fixation process, since Fe constitutes an important cofactor for this biological mechanism (5555. Sadvakasova AK, Kossalbayev BD, Token AI, Bauenova MO, Wang J, Zayadan BK, Balouch H, Alwasel S, Leong YK, Chang JS y Allakhverdiev SI. Influence of Mo and Fe on Photosynthetic and Nitrogenase Activities of Nitrogen-Fixing Cyanobacteria under Nitrogen Starvation. Cells. 2022; 5;11(5):904. http://doi.org/10.3390/cells11050904).

Experimental results show that stimulation by plant growth-promoting rhizobacteria is the result of several mechanisms that act together and are activated simultaneously. Plant symbioses with soil microorganisms confer energetic benefits due to improved plant nutrition; the supply of N and P from the microbial symbiont to the plant depends on the availability of ATP in the microbial symbiont, which is regulated by its demand for carbon compounds (5656. Ortíz J, Sanhueza C, Romero-Munar A, Hidalgo-Castellanos J, Castro C, Bascuñán-Godoy L, Coba de la Peña T, López-Gómez M, Florez-Sarasa I y Del-Saz NF. In Vivo Metabolic Regulation of Alternative Oxidase under Nutrient Deficiency-Interaction with Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Rhizobium Bacteria. Int J Mol Sci. 2020; 12;21(12):4201. doi: http://doi.org/10.3390/ijms21124201.).

It is known that AMF promote plant growth by different mechanisms, among which are the improvement of water status (5757. Santana LR, da Silva LN, Tavares GG, Batista PF, Cabral JSR y Souchie EL. Arbuscular mycorrhizal fungi associated with maize plants during hydric deficit. Sci Rep. 2023; 27;13(1):1519. doi: http://doi.org/10.1038/s41598-023-28744-4.) and the increased uptake of mineral elements present in the soil, mainly those of limited diffusion such as P (3434. Shi J, Wang X, Wang E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 2023; 74:569-607. http://doi.org/10.1146/annurev-arplant-061722-090342), Zn, and Cu (5858. Sethi D, Subudhi S, Rajput VD, Kusumavathi K, Sahoo TR, Dash S, Mangaraj S, Nayak DK, Pattanayak SK, Minkina T, Glinushkin AP y Kalinitchenko VP. Exploring the role of mycorrhizal and rhizobium inoculation with organic and inorganic fertilizers on the nutrient uptake and growth of Acacia mangium saplings in acidic soil. Forests. 2021; 12(12):1657. doi: http://doi.org/10.3390/f12121657.). It is suggested that there may be a differentiated need based on the nutritional demand of the inoculated AMF strain itself, which could be a possible explanation for the observed results (5959. Hodge A, Storer K. Arbuscular mycorrhiza and nitrogen: implications for individual plants through to ecosystems. Plant and Soil. 2015; 386 (1-2): 1-19. doi: http://doi.org/10.1007/s11104-014-2162-1.)^.

In a general sense, the results could be conditioned by the relationship established between A. chroococcum and AMF. The inoculated Azotobacter strains, when established in the substrate, were able to produce phytohormones that stimulated root growth in plants, inducing the secretion of radical exudates that allowed the colonization of the AMF strain, depending on the type of soil used in the substrate (6060. Bahrani A, Pourreza J, Hagh JM. Response of winter wheat to co-inoculation with Azotobacter and Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) under Different Sources of Nitrogen Fertilizer. American-Eurasian Journal Agricultural and Environment Sciences. 2010; 8(1):95-103. ISSN: 1818-6769.). On the other hand, the pH of the substrates was in the optimal range for the growth of Azotobacter, which favored the establishment of this bacterium (6161. Rico GMA. Capacidad promotora de crecimiento vegetal por bacterias del género Azotobacter y Actinomicetos aislados de cultivos de Solanum tuberosum Linnaeus, 1753 (Papa) cultivados en zonas altoandinas del Perú. [en línea] [Tesis en opción título profesional de Biólogo con Mención en Biología Celular y Genética] Facultad de Ciencias Biológica. E. A. P. de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor De San Marcos. Lima, Perú. 2009; 152 p. [Consultado: 20 de enero de 2018], Available from: http://www.cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/875/1/Rico_gm.pdf.). At these pH values, the bacteria could have solubilized insoluble phosphates, which apparently was favorable for the establishment of AMF strains, considering that this is one of the factors that regulates their establishment and functioning (6262. Rivera R, González PJ, Hernández JA, Martín G, Ruíz L, Fernández K, Simó J, García M, Pérez A, Riera M, Bustamante C, Joao JP, Ruiz M. La importancia del ambiente edáfico y del pH sobre la efectividad y la recomendación de cepas eficientes de HMA para la inoculación de los cultivos. En: VIII Congreso de la Sociedad Cubana de la Ciencia del Suelo, del 2 al 5 de Junio. La Habana, Cuba. 2015. Available from: https://www.researchgate.net/publication/279193397_La_importancia_del_ambiente_edafico_y_del_pH_sobre_la_efectividad_y_la_recomendacion_de_cepas_eficientes_de_HMA_para_la_inoculacion_de_los_cultivos).

The different AMF species studied responded to the substrate depending on the soil that formed it. An effect was observed depending on the high levels of existing autochthonous propagules, in spite of having similarity in pH, as well as in the organic matter content and in the C/N ratio, which indicated that other physicochemical and biological properties of the substrates could be influencing the differential response of the AMF observed, so it is necessary to deepen the studies of mycorrhizal inoculation in these soils, since there were no previously published results.

The extraradical mycelium of AMF can effectively translocate the products of rhizobacterial activity when they coexist in the rhizosphere of the plants, so that their response to mycorrhizal symbiosis also involves the action of rhizospheric microorganisms as a whole (6363. Zhang W, Li XG, Sun K, Tang MJ, Xu FJ, Zhang M y Dai CC. Mycelial network-mediated rhizobial dispersal enhances legume nodulation. ISME J. 2020; 4(4):1015-1029. doi: http://doi.org/10.1038/s41396-020-0587-5.).

The AMF-Azotobacter interaction favored an increase in the levels of absorption of nutrients such as nitrogen, phosphorus and potassium and their translocation to the interior of the plant, with an increase in photosynthetic capacity and, consequently, an increase in the morphological indicators evaluated, which allowed a reduction in the period of permanence in the nursery.

In all cases, the treatments where the best results were obtained also indicate that a greater capacity to capture solar energy to carry out photosynthesis must have occurred, as they showed a greater number of leaves and leaf area. It has been observed that AMF significantly improve photosynthetic rate and increase chlorophyll content (6464. Huang D, Ma M, Wang Q, Zhang M, Jing G, Li C y Ma F. Arbuscular mycorrhizal fungi enhanced drought resistance in apple by regulating genes in the MAPK pathway. Plant Physiol Biochem. 2020; 149:245-255. doi: http://doi.org/10.1016/j.plaphy.2020.02.020., 3434. Shi J, Wang X, Wang E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 2023; 74:569-607. http://doi.org/10.1146/annurev-arplant-061722-090342), which would have a high impact on growth rate.

The beneficial effect on plant growth has been reported when using inoculants composed of nitrogen-fixing bacteria and AMF, combined with organic fertilizers, with the reduction of the levels of mineral fertilizers used (5858. Sethi D, Subudhi S, Rajput VD, Kusumavathi K, Sahoo TR, Dash S, Mangaraj S, Nayak DK, Pattanayak SK, Minkina T, Glinushkin AP y Kalinitchenko VP. Exploring the role of mycorrhizal and rhizobium inoculation with organic and inorganic fertilizers on the nutrient uptake and growth of Acacia mangium saplings in acidic soil. Forests. 2021; 12(12):1657. doi: http://doi.org/10.3390/f12121657.).

In a research carried out in coconut postures with the use of AMF, it was found a positive effect on the number, volume and dry mass of primary, secondary, tertiary and quaternary roots, from the fourth month after inoculation, which improved the efficiency in the absorption of water and nutrients and induced increases in the perimeter of the base of the stem and the dry mass of the aerial part from the sixth month (6565. Ilangamudali IMPS, Senarathne SHS. Effectiveness of Arbuscular Mycorrhizal Fungi based biofertilizer on early growth of coconut seedlings. COCOS. 2016; 22: 1-12. doi: http://doi.org/10.4038/cocos.v22i1.5807.).

The positive action of interactions between AMF and PGPR on growth promotion has been demonstrated in other crops (2222. Vafa ZN, Sohrabi Y, Sayyed RZ, Luh Suriani N y Datta R. Effects of the Combinations of Rhizobacteria, Mycorrhizae, and Seaweed, and Supplementary Irrigation on Growth and Yield in Wheat Cultivars. Plants. 2021; 10(4), 811. doi: http://doi.org/10.3390/plants10040811, 2323. Vishwakarma K, Kumar N, Shandilya C, Mohapatra S, Bhayana S y Varma A. Revisiting Plant–Microbe Interactions and Microbial Consortia Application for Enhancing Sustainable Agriculture: A Review. Front. Microbiol. 2020; 11:560406. doi: http://doi.org/10.3389/fmicb.2020.560406., 6666. Pokluda R, Ragasová L, Jurica M, Kalisz A, Komorowska M, Niemiec M y Sekara A. Effects of growth promoting microorganisms on tomato seedlings growing in different media conditions. PLoS ONE. 2021; 16(11): e0259380. doi: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0259380.), as well as that of these microbial groups and organic fertilizers (6767. Mesbah R, Ardakani MR, Moghaddam A y Rafiei F. Yield and morpho-physiological traits of tobacco (Nicotiana tabacum L.) as affected by azotobacter, mycorrhizal symbiosis and biochar application. Plant Science Today. 2021; 8(4): 986-994. doi: http://doi.org/10.14719/pst.1378.); however, similar studies have not been carried out in coconut before, where they had only been used independently. Having results of the co-inoculation of AMF and Azotobacter in this crop makes it possible to enhance the use of these microbes and, thus, make it possible to obtain quality seedlings and, consequently, to increase yields.

The combined study of organic sources, AMF and nitrogen-fixing bacteria has shown that the combined sources provide a suitable environment for plant growth at an early stage (5757. Santana LR, da Silva LN, Tavares GG, Batista PF, Cabral JSR y Souchie EL. Arbuscular mycorrhizal fungi associated with maize plants during hydric deficit. Sci Rep. 2023; 27;13(1):1519. doi: http://doi.org/10.1038/s41598-023-28744-4.).

Organic farming practices with a focus on building biological soil fertility bases through the application of organic inputs and bioproducts, such as AMF and PGPR (Azotobacter), allow for sustainable coconut production in an environmentally friendly manner.

Conclusions

Considering the results, it can be concluded that the co-inoculation of R. irregularis with the A. chroococcum CDM-1 strain allows obtaining high quality coconut seedlings to be used in the Playa Duaba Nursery with ARh soil, while the combination of G. cubense and A. chroococcum CDM-2 show the best indicators for the Cabacú Nursery with GFh soil, both using as substrate the combination of S-H-FC (4:1:1), which allows optimizing the use of local organic fertilizers. The growth promoting effect of AMF and Azotobacter combined with organic fertilizers to obtain coconut seedlings is demonstrated.