Introducción

Se han desarrollado diferentes herramientas para estudiar en detalle la asociación bacteria-planta, como las ciencias “ómicas”, las técnicas serológicas acopladas a la microscopía de barrido láser confocal y el método del marcaje con genes que codifican para una proteína fluorescente (11. Sarhan MS, Hamza MA, Youssef HH, Patz S, Becker M, ElSawey H, et al. Culturomics of the plant prokaryotic microbiome and the dawn of plant-based culture media-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19(19):15-27. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.002 -33. Geddes, BA, Paramasivan P, Joffrin A, Thompson AL, Christensen K, Jorrin B, et al. Engineering transkingdom signalling in plants to control gene expression in rhizosphere bacteria. Nature communications. 2019;10(1):1-11. doi: 10.1038/s41467-019-10882-x ). Estas herramientas han permitido explorar la interacción rizobio-arroz y comprender las diferencias entre esta asociación y la que establecen los rizobios con plantas leguminosas, sobre todo durante el proceso de infección y la distribución de bacterias dentro del tejido vegetal (44. Chen X, Miché L, Sachs S, Wang Q, Buschart A, Yang HY, et al. Rice responds to endophytic colonization which is independent of the common symbiotic signaling pathway. New Phytologist. 2015;208(2):531-543. doi: 10.1111/nph.13458 ,55. Wu Q, Peng X, Yang M, Zhang W, Dazzo FB, Uphoff N, et al. Rhizobia promote the growth of rice shoots by targeting cell signaling, division and expansion. Plant Molecular Biology2018;97(6):507-523. doi: 10.1007/s11103-018-0756-3 ).

Recientemente, se informó por primera vez en Cuba que Rhizobium es un “endófito verdadero” del arroz, lo cual se demostró mediante ensayos de inoculación con una cepa transconjugante que se visualizó mediante microscopía confocal (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Aunque en este trabajo se observaron células transconjugantes que contenían el gen gfp que codifica una proteína verde fluorescente (cepa Rpd16pHC60 con el plásmido pHC60) colonizando los tejidos de la planta de arroz INCA LP-5, no se mostraron evidencias de la obtención de estas bacterias, ni tampoco a partir de otras cepas que han mostrado actividad promotora del crecimiento en plantas de arroz de este cultivar. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue obtener cepas transconjugantes para estudios de la interacción planta-bacteria.

Materiales y métodos

Las bacterias utilizadas en este trabajo y sus principales características se enumeran en la Tabla 1.

Todas las cepas bacterianas pertenecen a la Colección de bacterias del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Cuba. Tres de estas, Rhizobium sp. Rpd16, Rhizobium sp. Rpr11 y Rhizobium sp. 5P1 se estudiaron en investigaciones previas (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ,77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). La cepa Pseudomonas sp. S5-38 está menos estudiada y es posible endófito de semillas de arroz cv. INCA LP-5.

Resultados y discusión

Previamente, se demostró que la cepa Rhizobium sp. Rpd16 es endófito de arroz, ya que se visualizó mediante microscopía confocal en los espacios intercelulares del parénquima de la raíz y la vaina de la hoja. Para ello, se obtuvo una cepa transconjugante que contenía el plásmido pHC60 (Rpd16pHC60) (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). De igual forma, en el presente trabajo se comprobó que el apareamiento triparental con cepas de E. coli permitió obtener cepas que contenían este plásmido, lo cual se confirmó cuando las cepas Rpr11pHC60, 5P1pHC60 y S5-38pHC60 crecidas en medio TY con tetraciclina y 5-nitrofurantoína, mostraron colonias fluorescentes en presencia de luz UV (Figura 1).

Las dinámicas de multiplicación mostraron algunas diferencias en el crecimiento de las cepas. Sin embargo, los valores de densidad óptica de las cuatro cepas de tipo salvaje y sus correspondientes transconjugantes fueron similares al final del experimento (Figura 2). El efecto del plásmido pHC60 en el crecimiento de las cepas transconjugantes podría no ser significativo.

Los resultados mostraron además que no se observaron diferencias significativas en el crecimiento de la cepa Rpd16pHC60 y la cepa salvaje en todos los momentos de la evaluación. Este comportamiento también se informó cuando se estudió el marcaje con el gen gfp en la cepa diazotrófica y endófita Paenibacillus polymyxa (1010. Padda KP, Puri A, Zeng Q, Chanway CP, Wu X. Effect of GFP-tagging on nitrogen fixation and plant growth promotion of an endophytic diazotrophic strain of Paenibacillus polymyxa. Botany. 2017; 95(9):933-942. doi: 10.1139/cjb-2017-0056 ). Probablemente, sea esta otra razón que explique por qué el plásmido pHC60 no afectó la capacidad de la cepa Rpd16 para colonizar tejidos vegetales, como se informó en trabajos anteriores (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Solo se observaron diferencias significativas a las 12-14 h entre las cepas S5-38 y S5-38pHC60, y a las 10-20 h entre Rpr11 y Rpr11pHC60, y entre 5P1 y 5P1pHC60. En esos momentos de la evaluación, las cepas transconjugantes S5-38pHC60 y 5P1pHC60 tenían mayor DO que sus correspondientes cepas salvajes.

Por otro lado, se conoce que en la interacción bacteria-planta se distinguen asociaciones con diferentes grados de complejidad, donde la rizosfera, filosfera y endosfera han sido los principales escenarios para el estudio de las particularidades de esta interacción. El conocimiento de los niveles de asociación entre bacterias y plantas es fundamental para comprender cómo el microorganismo coloniza la planta, lo cual es necesario para diseñar y validar inoculantes efectivos en campo (11. Sarhan MS, Hamza MA, Youssef HH, Patz S, Becker M, ElSawey H, et al. Culturomics of the plant prokaryotic microbiome and the dawn of plant-based culture media-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19(19):15-27. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.002 ,22. Hartmann A, Fischer D, Kinzel L, Chowdhury SP, Hofmann A, Baldani JI, et al. Assessment of the structural and functional diversities of plant microbiota: Achievements and challenges-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19:3-13. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.007 ). Con el fin de estudiar la interacción bacteria-planta, plántulas de arroz cv. INCA LP-5 se inocularon con las cepas Rpd16 pHC60 y Rpr11pHC60. La selección se basó a partir de estudios previos donde se sugieren que sus correspondientes cepas salvajes son promisorias para biofertilizar el cultivo de arroz (77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ).

Aunque ya existía evidencia sobre el comportamiento endofítico en arroz de la cepa Rpd16pHC60, se utilizó esta cepa en el presente estudio para profundizar en las formas de asociación con las plantas de arroz y como modelo de comparación con la cepa Rpr11. Se analizaron secciones transversales de raíces de arroz mediante microscopía confocal a 72 hpi. Los resultados mostraron células individuales de la cepa Rpd16pHC60 en los espacios intercelulares del parénquima cortical de la raíz (Figura 3a), similar a lo que previamente se informó (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Sin embargo, también se visualizó la bacteria, unida a los pelos radicales. Este comportamiento no fue posible visualizarlo en trabajaos anteriores con esta cepa (Figura 3b).

Por otra parte, la cepa Rpr11pHC60 se localizó colonizando los espacios intercelulares del parénquima de la raíz . Esta es una nueva evidencia que sugiere que otra cepa perteneciente al género Rhizobium se comporta como endófito de arroz cv. INCA LP-5. Sin embargo, es necesario estudiar más profundamente su interacción con el arroz para concluir que es un “endófito verdadero”.

Trabajos anteriores abordan el estudio de las interacciones rizobio-pinaca (Spinacia oleracea) y rizobio-caña de azúcar (Saccharum officinarum) mediante el método del marcaje con genes que codifican para una proteína fluorescente (1111. Jiménez-Gómez A, Flores-Félix JD, García-Fraile P, Mateos PF, Menéndez E, Velázquez E, et al. Probiotic activities of Rhizobium laguerreae on growth and quality of spinach. Scientific Reports. 2018;8(1):1-10. doi: 10.1038/s41598-017-18632-z ,1212. Ferreira NS, Matos GF, Meneses CH, Reis VM, Rouws JR, Schwab S, et al. Interaction of phytohormone-producing rhizobia with sugarcane mini-setts and their effect on plant development. Plant and Soil. 2020; 451(1):221-238. doi: 10.1007/s11104-019-04388-0 ). Estudios previos mostraron que la inoculación de plantas de arroz cv. INCA LP-5 con la cepa Rpr11 incrementó el contenido de potasio y masa seca de la raíz en condiciones de invernadero (77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). Por lo tanto, el comportamiento endofítico de esta cepa constituye un atributo que también permitiría explicar su actividad promotora del crecimiento vegetal en la gramínea.

Conclusiones

El empleo de cepas transconjugantes y la microscopía confocal para estudios de interacción planta-bacteria es una herramienta efectiva y novedosa. Aquí, se obtuvieron tres cepas transconjugantes que contenían el plásmido pHC60 y una de ellas es posible endófito de arroz cv. INCA LP-5. El hecho de que las cepas salvajes que se emplearon provengan de diferentes cultivares de arroz y niveles de asociación con la planta podría brindar un mayor conocimiento sobre la particularidad de su interacción con la planta de arroz.

Introduction

Different tools have been development to study deeply the bacteria-plant association such as omic sciences, serological techniques coupled with confocal laser scanning microscopy and the method of the tagging with genes coding for a fluorescing protein (11. Sarhan MS, Hamza MA, Youssef HH, Patz S, Becker M, ElSawey H, et al. Culturomics of the plant prokaryotic microbiome and the dawn of plant-based culture media-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19(19):15-27. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.002 -33. Geddes, BA, Paramasivan P, Joffrin A, Thompson AL, Christensen K, Jorrin B, et al. Engineering transkingdom signalling in plants to control gene expression in rhizosphere bacteria. Nature communications. 2019;10(1):1-11. doi: 10.1038/s41467-019-10882-x ). These tools have allow explore the rhizobia-rice interaction and understand the differences between this association and rhizobia-legume plants interaction, above all of infection process and bacteria distribution inside the vegetable tissue (44. Chen X, Miché L, Sachs S, Wang Q, Buschart A, Yang HY, et al. Rice responds to endophytic colonization which is independent of the common symbiotic signaling pathway. New Phytologist. 2015;208(2):531-543. doi: 10.1111/nph.13458 ,55. Wu Q, Peng X, Yang M, Zhang W, Dazzo FB, Uphoff N, et al. Rhizobia promote the growth of rice shoots by targeting cell signaling, division and expansion. Plant Molecular Biology2018;97(6):507-523. doi: 10.1007/s11103-018-0756-3 ).

Recently, it was report in Cuba for first time that Rhizobium is “true endophyte” of rice which was demonstrated by inoculation assays with a transconjugant strain which was visualized by confocal microscopy (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Although in this work transconjugant cells containing gfp gene which coding for a green fluorescent protein (stain Rpd16pHC60 containing the plasmid pHC60) were showed colonizing the tissues of rice plant cv. INCA LP-5, no evidence of the obtaining of these bacteria was shown, even from other strains that have showed promoting growth activity in rice plant cultivar INCA LP-5. Taking into account the above, the objective of this work was to obtain effective transconjugant strains for plant-bacteria interaction studies.

Materials and methods

Bacteria used in this work and their main characteristics are listed in Table 1.

All they belong to bacteria collections of the National Institute of Agricultural Science, Cuba. Three of them; Rhizobium sp. Rpd16, Rhizobium sp. Rpr11 and Rhizobium sp. 5P1 were studied deeply in previous investigations (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ,77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). The strain Pseudomonas sp. S5-38 is less studied and it is putative endophytic bacteria of rice seed cv. INCA LP-5.

Results and discussion

Previously, it was demonstrate that strain Rhizobium sp. Rpd16 is endophyte of rice, since it was showed in intercellular spaces of the parenchyma of root and leaf sheath by confocal microscopy. For this, a transconjugant strain containing the plasmid pHC60 was obtained (Rpd16pHC60) (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Similarly, the triparental mating with E. coli strains allowed obtain strains containing this plasmid which was confirmed when the strains Rpr11pHC60, 5P1pHC60 and S5-38pHC60 grown in TY medium with tetracycline and 5-nitrofurantoine, and fluorescent colonies were showed in presence of UV light (Figure 1).

Multiplication dynamics showed some differences in the strains growth. However the optical density of four wild type strains and their transconjugant strains were similar at the end of experiment (Figure 2). The effect of plasmid pHC60 in the transconjugant strains growth could be not significative.

No significative differences were showed in the strain Rpd16pHC60 growth and its wild type strain in all evaluation moments. This behavior was also reported when the effect of GFP-tagging on an diazotrophic and endophytic strain Paenibacillus polymyxa was studied (1010. Padda KP, Puri A, Zeng Q, Chanway CP, Wu X. Effect of GFP-tagging on nitrogen fixation and plant growth promotion of an endophytic diazotrophic strain of Paenibacillus polymyxa. Botany. 2017; 95(9):933-942. doi: 10.1139/cjb-2017-0056 ). Probably, it is other reason to think why the plasmid pHC60 did not affect the ability of strain Rpd16 to colonize plant tissues, as was reported in previous works (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). Only significative differences were showed at 12-14 h between strains S5-38 and S5-38pHC60, and at 10-20h between Rpr11 and Rpr11pHC60, and between 5P1 and 5P1pHC60. In those moments, the transconjugant strains S5-38pHC60 and 5P1pHC60 had greater OD than theirs wild type strains.

In the other hand, it is know that in bacteria-plant interaction are distinguished associations with different degrees of complexity and the rhizosphere, phyllosphere and endosphere have been the main sceneries for the study of particularities of this interaction. The knowledge of association levels between bacteria and plants is essential for understand the how the microorganism colonizes the plant which is necessary to design and validate effective’s inoculants in the field (11. Sarhan MS, Hamza MA, Youssef HH, Patz S, Becker M, ElSawey H, et al. Culturomics of the plant prokaryotic microbiome and the dawn of plant-based culture media-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19(19):15-27. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.002 ,22. Hartmann A, Fischer D, Kinzel L, Chowdhury SP, Hofmann A, Baldani JI, et al. Assessment of the structural and functional diversities of plant microbiota: Achievements and challenges-A review. Journal of Advanced Research. 2019;19:3-13. doi: 10.1016/j.jare.2019.04.007 ). In order to study the interaction bacteria-plant, rice seedlings cv. INCA LP-5 was inoculated only with the strains Rpd16 pHC60 and Rpr11pHC60. The selection was based on previous studies that suggesting that their wild type strains are promising to bio-fertilize rice crop (77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ).

Although there was already evidence about the endophytic behavior of Rpd16pHC60 strain of rice, it was used on this occasion to delve into the forms of association with rice plants and as a comparison model with the Rpr11 strain. Cross sections of rice roots were analyzed by confocal microscopy at 72 hpi and the results showed individual bacterial of the strain Rpd16pHC60 in the intercellular spaces of the cortical root parenchyma, similar to reported previously (Fig. 3a) (66. Hernández I, Taulé C, Pérez-Pérez R, Battistoni F, Fabiano E, Rivero D, et al. Endophytic rhizobia promote the growth of Cuban rice cultivar. Symbiosis. 2021a; 85(2):1-16. doi: 10.1007/s13199-021-00803-2 ). However, transconjugant cells were also visualized attached to the root hair which was not showed in micrographs reported before (Figura. 3b).

The strain Rpr11pHC60 was localized colonizing the intercellular spaces of root parenchyma. This is new evidence that suggest other strain belonging Rhizobium genus as endophyte of rice cv. INCA LP-5. However, it is necessary to study more deeply their interaction with rice to conclude that it is a “true endophyte”. Previously, it is reported studies about rhizobia-pinach (Spinacia oleracea) and rhizobia-sugarcane (Saccharum officinarum) interactions by the method of the tagging with genes coding for a fluorescing protein (1111. Jiménez-Gómez A, Flores-Félix JD, García-Fraile P, Mateos PF, Menéndez E, Velázquez E, et al. Probiotic activities of Rhizobium laguerreae on growth and quality of spinach. Scientific Reports. 2018;8(1):1-10. doi: 10.1038/s41598-017-18632-z ,1212. Ferreira NS, Matos GF, Meneses CH, Reis VM, Rouws JR, Schwab S, et al. Interaction of phytohormone-producing rhizobia with sugarcane mini-setts and their effect on plant development. Plant and Soil. 2020; 451(1):221-238. doi: 10.1007/s11104-019-04388-0 ). Previous investigations confirmed that inoculation of rice plants cv. INCA LP-5 with strain Rpr11 increased the potassium content and root dry weigh in greenhouse conditions (77. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1),26-37. doi: 10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). Thus, if Rpr11 have an endophytic behavior, it is an attribute that also would allow explaining its plant growth promoting activity.

Conclusions

The employ of transconjugant strains and the confocal microscopy for plant-bacteria interaction studies is an effective and novel tool. Here, three transconjugant strains containing the pHC60 plasmid were obtained and one of these is a putative endophyte of rice cv. INCA LP-5. The fact that the wild type strains used came from of different rice cultivars and association levels with the plant could give us more knowledge about the particularly of their interaction with rice plant.