Introducción

La aplicación de fertilizantes minerales suple parte de las necesidades nutricionales de cultivos de importancia económica en Cuba como el arroz (Oryza sativa L.) (11. MINAG. Modificaciones al Instructivo Técnico Para el Cultivo del Arroz. La Habana, Cuba. 2022. 30p). Sin embargo, el uso irresponsable de estos productos impacta negativamente en los ecosistemas, pues afecta el equilibrio que establecen los ciclos biogeoquímicos. Esto conlleva a la acidificación de los suelos cultivables y de las aguas, tanto superficiales como profundas y al incremento de la emisión a la atmósfera de gases con efecto invernadero como el óxido nitroso (22. Bogusz P, Rusek P, Brodowska MS. Suspension fertilizers: How to reconcile sustainable fertilization and environmental protection. Agriculture. 2021; 11(10): 1-14. ISSN: 2077-0472). Este impacto ambiental viene aparejado de graves consecuencias en la salud humana y al incremento considerable de los costos de producción (33. Rani L, Thapa K, Kanojia N, Sharma N, Singh S, Grewal AS, et al. An extensive review on the consequences of chemical pesticides on human health and environment. Journal of cleaner production. 2021; 283: 124657. https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2020.124657 ).

Por otra parte, los rizobios son bacterias que tradicionalmente se han estudiado por su capacidad de establecer una relación simbiótica con las plantas leguminosas (44. Concha Vidal C, Doerner P. The impact of the rhizobia-legume symbiosis on host root system Architecture. Journal of Experimental Botany. 2020; 71(13): 3902-3921. https://doi.org/10.1093/jxb/eraa198 ). Sin embargo, algunos trabajos confirman el efecto positivo de su inoculación en otros cultivos no leguminosos como la lechuga (Lactuca sativa), el trigo (Triticum spp.) y el maíz (Zea mays L.) (55. Barquero M, Poveda J, Laureano-Marín AM, Ortiz-Liébana N, Brañas J, González-Andrés F. Mechanisms involved in drought stress tolerance triggered by rhizobia strains in wheat. Frontiers in Plant Science. 2022; 13, 1036973. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1036973 -77. Verma, M, Singh A, Dwivedi DH, Arora NK. Zinc and phosphate solubilizing Rhizobium radiobacter (LB2) for enhancing quality and yield of loose leaf lettuce in saline soil. Environmental Sustainability. 2020; 3(2): 209-218. https://doi.org/10.1007/s42398-020-00110-4 ). Estas evidencias han permitido clasificar a los rizobios como Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (BPCV), pues producen un efecto beneficioso en el crecimiento y el desarrollo de las plantas, debido a su actividad biofertilizante, bioestimulante y biocontroladora (88. Manzano-Gómez LA, Rincón-Rosales R, Flores-Felix JD, Gen-Jimenez A, Ruíz-Valdiviezo VM, Ventura-Canseco LMC, et al. Cost-Effective Cultivation of Native PGPB Sinorhizobium Strains in a Homemade Bioreactor for Enhanced Plant Growth. Bioengineering. 2023; 10(8): 960. https://doi.org/10.3390/bioengineering10080960 ).

En los últimos años, múltiples investigaciones en Cuba se han enfocado en el estudio de la interacción de los rizobios con el arroz. Este es de gran importancia económica para el país con un consumo de más de 70 kg per cápita por año (99. FAO. Food Outlook Biannual Report on Global Food Markets. 2023. Available online: http://www.fao.org/economic/est/estcommodities/oilcrops/oilcrop-policies/en/ (accessed on 10 Noviembre 2023).). Se ha demostrado ampliamente el efecto positivo de estas bacterias en la promoción del crecimiento, la nutrición y el rendimiento de cultivares de arroz importantes para el país como INCA LP-5 e INCA LP-7 cultivo (1010. Hernández I, Nápoles MC. Rhizobia Promote Rice (Oryza sativa L.) Growth: First Evidence in Cuba. In: González F, Zúñiga D, Ormeño E, editors. Microbial Probiotics for Agricultural Systems: Advances in agronomics use. Springer Nature Switzerland AG; 2019. p. 155-168. dpi:10.1007/978-3-030-17597-9_10 -1212. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1), 22-33. https://doi.org/10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). Esto sugiere que el desarrollo y empleo de bioproductos a base de rizobios constituye una alternativa a la fertilización mineral del arroz. El cultivar de arroz Selección 1 forma parte de los once cultivares que se designan para la siembra en las principales estaciones productoras cubanas de arroz. Presenta un rendimiento promedio de 5,8 a 7,1 t h^-1 y excelente calidad molinera. En 2020 se sembraron alrededor de 47 mil ha en todo el país (11. MINAG. Modificaciones al Instructivo Técnico Para el Cultivo del Arroz. La Habana, Cuba. 2022. 30p). Sin embargo, no existen estudios que reflejen el efecto de productos biológicos a base de BPCV en el crecimiento de este cultivar.

Bioenraiz^® constituye un bioestimulante cubano de uso agrícola que se produce por fermentación sumergida de una cepa de Rhizobium sp. La última etapa de su proceso productivo consiste en retirar las células bacterianas del fermentado final, quedando como ingrediente activo los metabolitos auxínicos que produjo la bacteria durante la fermentación (1313. Beiro O, Echevarría ME, Fraga R, Suárez A, Domínguez J, Trujillo A, et al. Toxicidad aguda por contacto del Bioenraiz^® en abejas (Apis mellifera). Revista de Toxicología. 2003. 39-50. ISSN 1697-0748. ). En Cuba existe muy poca información publicada en revistas científicas que demuestren el efecto de Bioenraiz^® en los cultivos. Solo una investigación, en el cultivo del café (Coffea arabica L.) resume el efecto bioestimulador del producto pues incrementa la germinación de las semillas (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). De esta manera, resulta de interés conocer los beneficios de Bioenraiz^®, sobre todo en cultivos de importancia económica como el arroz. El objetivo del presente trabajo fue: Determinar el efecto de Bioenraiz^® y el producto final de la fermentación con presencia de la cepa Rhizobium sp. en el crecimiento y algunos parámetros fisiológicos del cultivar de arroz Selección 1.

Materiales y métodos

Se emplearon dos productos biológicos certificados y con los criterios de control de calidad óptimos: el bioestimulante Bioenraiz^® y el producto final de la fermentación con presencia de la cepa de Rhizobium sp. (Producto final de la fermentación). Ambos provinieron de la Unidad Empresarial de Base Bioprocesos “Cuba 10” del Municipio Quivicán, Provincia Mayabeque; actualmente responsable de la producción de estos biopreparados.

Semillas certificadas de arroz del cultivar Selección 1 se pre-germinaron. Para ello, se colocaron en placas Petri sobre papel de filtro estéril, el cual se humedeció con 10 mL de agua destilada estéril. Se colocaron 25 semillas por placa y se incubaron a 28 ^oC, en oscuridad durante 72 h para promover la geminación.

Semillas de arroz pre-germinadas, con radículas de 0,5 - 1,0 cm de largo se colocaron en tres macetas con capacidad de 1,2 kg, a razón de 50 semillas por maceta. Estas contenían el mismo volumen de una mezcla de suelo Ferralítico Rojo y materia orgánica (3:1). Siete días después de la siembra, las plántulas se trasplantaron a macetas similares, a razón de dos plántulas por maceta.

En el momento del trasplante, se embebieron las raíces de las plántulas en ambos bioproductos durante 20 min. Se establecieron tres tratamientos, con 24 plantas cada uno y dos plantas por maceta. Los tratamientos fueron: (i) plántulas sin inocular (control del ensayo), (ii) plántulas inoculadas con Bioenraiz^®, (iii) plántulas inoculadas con el fermentado final. Las plantas crecieron en condiciones semicontroladas en invernadero y se regaron en días alternos con agua corriente.

A los 60 días después del trasplante, se evaluó la altura de las plantas (cm), la longitud radical (cm) y la masa seca aérea y de raíz (g). También se determinó el contenido de clorofilas a, b y total, esta última mediante la suma de los valores de las dos primeras, así como el contenido de carotenoides totales por métodos espectrofotométricos (1515. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology.1949; 24(1): 1-15. https://doi.org/10.1104/pp.24.1.1 ). Para ello, se pesaron 0,04 g de la hoja bandera de las plantas, se sumergieron en 10 mL de etanol (95 % v/v) y se incubaron en la oscuridad por 24 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se leyó la absorbancia a 470, 664 y 649 nm para las clorofilas a, b y carotenos; respectivamente. La concentración de cada uno de los pigmentos se expresó en μg g^-1 de masa fresca de hoja, según las ecuaciones siguientes:

Donde:

Ca, Cb:

clorofila a y b, respectivamente

A470, A649, A664:

absorbancia a 440, 649 y 665 nm, respectivamente

Resultados y discusión

Aunque existen algunas referencias del efecto bioestimulador de Bioenraiz^® en cultivos de importancia en Cuba, solo una investigación en el cultivo del café constituye evidencia científica registrada del efecto positivo de este producto en los cultivos (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). La presente investigación constituye la primera evidencia en Cuba que demuestra el efecto bioestimulador de Bioenraiz^® en el cultivo del arroz.

Se empleó el arroz para el estudio por su importancia en la alimentación de los cubanos y porque se desconoce el efecto de Bioenraiz^® en esta gramínea. Los resultados mostraron que Bioenraiz^® incrementó el largo de las raíces de las plantas de arroz cultivar Selección 1, a los 60 días de la aplicación del producto (Figura. 1).

Se apreciaron diferencias significativas en la altura de las plantas que se inocularon con Bioenraiz^® y el tratamiento control, a favor de este último. Sin embargo, en esta variable no existieron diferencias entre las plantas inoculadas con este bioproducto y las que se trataron con el producto final de la fermentación (Figura 1).

Los resultados mostraron además un efecto positivo en el crecimiento de las raíces de las plantas de arroz cuando se inocularon con ambos productos (Figura 2 y 3).

Las plantas inoculadas con Bioenraiz^® presentaron mayor masa seca aérea que las tratadas con el producto final de la fermentación. Además, no se apreciaron diferencias entre las plantas control y las inoculadas con ambos productos en esta variable (Figura 3).

Bioenraiz^® es un biostimulante con altas concentraciones (>150 mg L^-1) en metabolitos con actividad auxínica, fundamentalmente ácido indol acético (AIA), que constituye su principal ingrediente activo. Este ácido se libera al medio durante la fermentación de la cepa Rhizobium sp. (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). La fitoestimulación, a partir de la producción de compuestos indólicos como el AIA, es reconocida como uno de los mecanismos más importantes que emplean los rizobios para promover el crecimiento de las gramíneas (1616. Chi F, Yang P, Han F, Jing Y, Shen S. Proteomic analysis of rice seedlings infected by Sinorhizobium meliloti 1021. Proteomics. 2010; 10(9): 1861-1874. https://doi.org/10.1002/pmic.200900694 ). Esto explicaría el efecto bioestimulador de Bioenraiz® y del producto final de la fermentación al incrementar la masa seca de raíz. Plantas con un sistema radical más desarrollado pueden explorar una superficie de suelo más extensa y absorber mayor contenido de nutrientes.

Múltiples estudios han comprobado el efecto bioestimulador del AIA producido por diferentes géneros bacterianos reconocidos como BPCV. Tal es el caso de Pseudomonas y Bacillus, los cuales potencian la iniciación radical, la elongación celular y la formación de pelos radicales (1717. Duca DR, Glick BR. Indole-3-acetic acid biosynthesis and its regulation in plant-associated bacteria. Applied microbiology and biotechnology. 2020; 104: 8607-8619. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10869-5 -1919. Singh A, Yadav VK, Chundawat RS, Soltane R, Awwad NS, Ibrahium HA, et al. Enhancing plant growth promoting rhizobacterial activities through consortium exposure: A review. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023; 11: 1099999. https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1099999 ). Investigaciones previas en gramíneas como maíz y caña de azúcar (Saccharum officinarum) reafirman la actividad bioestimulante del AIA proveniente de Azospirillum y Bacillus (2020. Kashyap BK, Solanki MK, Pandey AK, Prabha S, Kumar P, Kumari B. Bacillus as plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): a promising green agriculture technology. In: Ansari, R., Mahmood, I. editors. Plant Health Under Biotic Stress; 2019. p. 219-236. https://doi.org/10.1007/978-981-13-6040-4 _11 , 2121. Suhameena B, Devi S, Gowri R, Kumar A. Utilization of Azospirillum as a Biofertilizer-an overview. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2020; 62(22): 141-145. ISSN 0976 -044X, 2222. Díaz AAV, Quintal-Vargas YY, Chale-Dzul JB, Santillán-Fernández A, Ferrera-Cerrato R, López-Hernández M. Isolation and selection of rhizospheric bacteria with biofertilizing potential for corn cultivation. Agro Productividad. 2021; 14(1): 69-73. https://doi.org/10.32854/agrop.v14i14.1854 ). Rhizobium también ejerce un efecto fitoestimulante en caña de azúcar a los 30 y 75 días del trasplante, pues sobrenadantes libres de células de la bacteria contienen metabolitos con actividad auxínica como el AIA y giberelinas (2323. Ferreira NS, Matos GF, Meneses CHSG, Reis Rouws JRC, Schwab S, Schwab S. Interaction of phytohormone-producing rhizobia with sugarcane mini-setts and their effect on plant development. Plant Soil. 2020; 451, 221-238. https://doi.org/10.1007/s11104-019-04388-0 ).

En Cuba, existen algunos trabajos con el género Azospirillum en cultivos de gramíneas, fundamentalmente arroz, que han demostrado su efecto fitoestimulador por ser un grupo de bacterias altamente productores de AIA. El empleo de inoculantes a base de Azospirillum incrementó el desarrollo vegetativo del cultivo, con índices de efectividad de hasta 21,77 % en altura y 102,06 % en masa seca de la parte aérea, respecto al control sin inocular. Trabajos similares han constatado la posibilidad de disminuir la fertilización nitrogenada del cultivo del arroz en un 33 %, a partir de la actividad fitoestimulante de este género bacteriano, parir de la producción de AIA (2424. Velazco A, Castro R. Estudio de la inoculación de Azospirillum brasilense en el cultivo del arroz (Variedad A´82) en condiciones de macetas. Cultivos Tropicales. 1999; 20(1): 5-9. ISSN: 1819-4087. ).

Teniendo en cuenta que la aplicación de Bioenraiz^® y el fermentado final provocaron efectos positivos en el crecimiento de las plantas de arroz, se determinaron variables fisiológicas vegetales que permitieran explicar también el efecto de estos productos.

Además de la producción de AIA, se conoce que la estimulación de la fotosíntesis constituye otro de los mecanismos principales que explican la promoción del crecimiento de las gramíneas por los rizobios (1616. Chi F, Yang P, Han F, Jing Y, Shen S. Proteomic analysis of rice seedlings infected by Sinorhizobium meliloti 1021. Proteomics. 2010; 10(9): 1861-1874. https://doi.org/10.1002/pmic.200900694 ). Este proceso suministra compuestos carbonados a la planta que contribuyen a su crecimiento y que se potencia, entre otros indicadores, por un incremento en el contenido de clorofilas. Estas moléculas permiten captar la luz, primera etapa del proceso de la fotosíntesis (2525. Degiovanni V, Berrio LE, Charry RE. Producción Eco- Eficiente del arroz en Amárica Latina. 1st ed. Cali, Colombia: Editorial Centro Internacional de Agricultura Tropical; 2010. 513 p. ISBN: 978-958-694-103-7). Sin embargo, los resultados de la presente investigación no evidenciaron un efecto de ambos bioproductos en la estimulación de contenido de clorofilas totales de las plantas de arroz cultivar Selección 1, respecto a las plantas control (Tabla 1).

A diferencia de lo mencionado, los resultados mostraron diferencias significativas entre las plantas control y las tratadas con el producto final de la fermentación en el contenido de clorofilas a, mientras que no hubo diferencias estadísticas entre los tratamientos en el contenido de clorofilas b (Tabla 1).

Trabajos previos han demostrado el efecto positivo de la inoculación de bacterias del grupo de los rizobios en el contenido de clorofilas; tal es el caso de consorcios microbianos en el arroz, Sinorhizobium meliloti en plantas de alfalfa (Medicago sativa) sometidas a estrés por altas concentraciones de cobre y de Rhizobium leguminosarum en Lens culinaris (2626. Duan C, Mei Y, Wang Q, Wang Y, Li Q, Hong M, et al. Rhizobium inoculation enhances the resistance of alfalfa and microbial characteristics in copper-contaminated soil. Frontiers in Microbiology. 2022; 12, 781831. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.781831 , 2727. Hussain A, Faizan S. Rhizobium induced modulation of growth and photosynthetic efficiency of Lens culinaris Medik. Grown on fly ash amended soil by antioxidants regulation. Environmental Science and Pollution Research. 2023; 30(16): 46295-46305. https://doi.org/10.1007/s11356-023-25616-2 ).

Por otra parte, los carotenoides son pigmentos (amarillo-anaranjados) que protegen el aparato fotosensible mediante mecanismos de disipación y extinción de energía. Al igual que las clorofilas, también participan en captar la luz solar, sobre todo en el espectro de luz entre 450 y 500 nm, en el cual las clorofilas absorben poco (2828. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Plant physiology and development. 6th ed. La Sunderland, USA: Sinauer Associates; 2015. 761 p.). De ahí el interés por determinar el efecto de ambos bioproductos en el contenido de estas moléculas. Los resultados no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos que se estudiaron. Sin embargo, trabajos previos revelaron que la inoculación de cepas de Bradyrhizobium y Enterobacter produjeron incrementos en el contenido de carotenoides totales de plantas de soya (Glycine max) en condiciones de estrés salino (2929. Agha MS, Haroun SA, Abbas MA, Sofy MR, Mowafy AM. Growth and Metabolic Response of Glycine max to the Plant Growth‑Promoting Enterobacter Delta PSK and Bradyrhizobium japonicum Under Salinity Stress. Journal of Plant Growth Regulation. 2023; 42: 5816-5830. https://doi.org/10.1007/s00344-023-10967-4 2023 ).

Bioenraiz^® constituye un producto que, aunque ha sido oportunamente estudiado, no cuenta prácticamente con resultados científicos publicadas que expliquen su efecto fitoestimulante en los cultivos. Los resultados que aquí se exponen contribuyen en obtener conocimientos sobre su efecto en el cultivo del arroz y con ello formar parte de la divulgación de las potencialidades de este bioproducto como estimulador del crecimiento vegetal. Es imperante sustituir parte de la fertilización mineral que se emplea en los cultivos, sobre todo en aquellos de importancia económica. El empleo de productos como Bioenraiz^® pudiera formar parte de este fin.

Conclusiones

Bioenraiz^® y el producto final de la fermentación de la cepa Rhizobium sp., ambos de elaboración nacional, constituyen bioproductos promisorios para la inoculación del cultivar de arroz Selección 1, uno de los de mayor generalización en el país. Ambos productos tuvieron un efecto positivo en el desarrollo radical de la gramínea. Sin embargo, Bioenraiz^® produjo resultados más alentadores en el largo radical y la masa seca de la parte aérea de las plantas. Teniendo en cuenta las limitaciones de la presente investigación, es recomendable continuar con experimentaciones similares, incluso extenderlas a otros cultivos y condiciones de campo para tener un criterio más sólido a la hora de decidir sobre el proceso productivo de esos bioproductos y por lo tanto, cuál sería más oportuno emplear.

Introduction

The application of mineral fertilizers supplies part of the nutritional needs of economically important crops in Cuba, such as rice (Oryza sativa L.) (11. MINAG. Modificaciones al Instructivo Técnico Para el Cultivo del Arroz. La Habana, Cuba. 2022. 30p). However, the irresponsible use of these products has a negative impact on ecosystems, as it affects the balance established by biogeochemical cycles. This leads to the acidification of arable soils and water, both surface and deep, and to an increase in the emission of greenhouse gases such as nitrous oxide into the atmosphere (22. Bogusz P, Rusek P, Brodowska MS. Suspension fertilizers: How to reconcile sustainable fertilization and environmental protection. Agriculture. 2021; 11(10): 1-14. ISSN: 2077-0472). This environmental impact is associated with serious consequences for human health and a considerable increase in production costs (33. Rani L, Thapa K, Kanojia N, Sharma N, Singh S, Grewal AS, et al. An extensive review on the consequences of chemical pesticides on human health and environment. Journal of cleaner production. 2021; 283: 124657. https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2020.124657 ).

On the other hand, rhizobia are bacteria that have traditionally been studied for their ability to establish a symbiotic relationship with leguminous plants (44. Concha Vidal C, Doerner P. The impact of the rhizobia-legume symbiosis on host root system Architecture. Journal of Experimental Botany. 2020; 71(13): 3902-3921. https://doi.org/10.1093/jxb/eraa198 ). However, some studies confirm the positive effect of their inoculation on other non-leguminous crops such as lettuce (Lactuca sativa), wheat (Triticum spp.) and corn (Zea mays L.) (55. Barquero M, Poveda J, Laureano-Marín AM, Ortiz-Liébana N, Brañas J, González-Andrés F. Mechanisms involved in drought stress tolerance triggered by rhizobia strains in wheat. Frontiers in Plant Science. 2022; 13, 1036973. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1036973 -77. Verma, M, Singh A, Dwivedi DH, Arora NK. Zinc and phosphate solubilizing Rhizobium radiobacter (LB2) for enhancing quality and yield of loose leaf lettuce in saline soil. Environmental Sustainability. 2020; 3(2): 209-218. https://doi.org/10.1007/s42398-020-00110-4 ). These evidences have allowed the classification of rhizobia as Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB), since they produce a beneficial effect on plant growth and development, due to their biofertilizing, biostimulant and biocontrolling activity (88. Manzano-Gómez LA, Rincón-Rosales R, Flores-Felix JD, Gen-Jimenez A, Ruíz-Valdiviezo VM, Ventura-Canseco LMC, et al. Cost-Effective Cultivation of Native PGPB Sinorhizobium Strains in a Homemade Bioreactor for Enhanced Plant Growth. Bioengineering. 2023; 10(8): 960. https://doi.org/10.3390/bioengineering10080960 ).

In recent years, multiple researches in Cuba have focused on the study of the interaction of rhizobia with rice. Rice is of great economic importance for the country with a consumption of more than 70 kg per capita per year (99. FAO. Food Outlook Biannual Report on Global Food Markets. 2023. Available online: http://www.fao.org/economic/est/estcommodities/oilcrops/oilcrop-policies/en/ (accessed on 10 Noviembre 2023).). The positive effect of these bacteria in promoting growth, nutrition and yield of important rice cultivars for the country such as INCA LP-5 and INCA LP-7 crop has been widely demonstrated (1010. Hernández I, Nápoles MC. Rhizobia Promote Rice (Oryza sativa L.) Growth: First Evidence in Cuba. In: González F, Zúñiga D, Ormeño E, editors. Microbial Probiotics for Agricultural Systems: Advances in agronomics use. Springer Nature Switzerland AG; 2019. p. 155-168. dpi:10.1007/978-3-030-17597-9_10 -1212. Hernández I, Pérez-Pérez R, Nápoles MC, Maqueira LA, Rojan O. Rhizospheric rhizobia with potential as biofertilizers from Cuban rice cultivars. Agronomía Colombiana. 2021b; 39(1), 22-33. https://doi.org/10.15446/agron.colomb.v39n1.88907 ). This suggests that the development and use of rhizobia-based bioproducts constitutes an alternative to mineral fertilization of rice. The rice cultivar Selección 1 is one of the eleven cultivars designated for planting in the main Cuban rice producing stations. It has an average yield of 5.8 to 7.1 t h^-1 and excellent milling quality. In 2020, about 47 thousand ha were planted throughout the country (11. MINAG. Modificaciones al Instructivo Técnico Para el Cultivo del Arroz. La Habana, Cuba. 2022. 30p). However, there are no studies that reflect the effect of biological products based on PGPB on the growth of this cultivar.

Bioenraiz^® is a Cuban biostimulant for agricultural use that is produced by submerged fermentation of a Rhizobium sp strain. The last stage of its production process consists of removing the bacterial cells from the final fermentation, leaving as active ingredient the auxinic metabolites produced by the bacteria during fermentation (1313. Beiro O, Echevarría ME, Fraga R, Suárez A, Domínguez J, Trujillo A, et al. Toxicidad aguda por contacto del Bioenraiz^® en abejas (Apis mellifera). Revista de Toxicología. 2003. 39-50. ISSN 1697-0748. ). In Cuba, there is very little information published in scientific magazines that demonstrate the effect of Bioenraiz^® in crops. Only one research, in the cultivation of coffee (Coffea arabica L.) summarizes the biostimulatory effect of the product as it increases seed germination (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). Thus, it is of interest to know the benefits of Bioenraiz^®, especially in economically important crops such as rice. The objective of this study was to determine the effect of Bioenraiz^® and the final fermentation product with the presence of the Rhizobium sp. strain on the growth and some physiological parameters of the rice cultivar Selección 1.

Materials and methods

Two certified biological products with optimal quality control criteria were used: the biostimulant Bioenraiz^® and the final fermentation product with the presence of the Rhizobium sp. strain (final fermentation product). Both came from the Bioprocesses Base Business Unit "Cuba 10" from Quivicán Municipality, Mayabeque Province; currently responsible for the production of these biopreparations.

Certified rice seeds of the Selección 1 cultivar were pre-germinated. For this purpose, they were placed in Petri dishes on sterile filter paper, which was moistened with 10 mL of sterile distilled water. Twenty-five seeds per plate were placed and incubated at 28 ºC, in darkness for 72 h to promote germination.

Pre-germinated rice seeds with 0.5-1.0 cm long radicles were placed in three 1.2 kg capacity pots at the rate of 50 seeds per pot. These contained the same volume of a mixture of Ferrallitic Red soil and organic matter (3:1). Seven days after sowing, the seedlings were transplanted into similar pots at the rate of two seedlings per pot.

At the time of transplanting, the roots of the seedlings were soaked in both bioproducts for 20 min. Three treatments were established, with 24 plants each and two plants per pot. The treatments were: (i) uninoculated seedlings (control of the trial), (ii) seedlings inoculated with Bioenraiz^®, (iii) seedlings inoculated with the final fermentation. Plants were grown under semi-controlled conditions in a greenhouse and watered every other day with tap water.

At 60 days after transplanting, plant height (cm), root length (cm), and aerial and root dry mass (g) were evaluated. Chlorophyll a, b and total chlorophyll content was also determined, the latter by summing the values of the first two, as well as total carotenoid content by spectrophotometric methods (1515. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology.1949; 24(1): 1-15. https://doi.org/10.1104/pp.24.1.1 ). For this purpose, 0.04 g of the flag leaf of the plants were weighed, immersed in 10 mL of ethanol (95 % v/v) and incubated in the dark for 24 h at room temperature. Subsequently, absorbance was read at 470, 664 and 649 nm for chlorophylls a, b and carotenes; respectively. The concentration of each pigment was expressed in μg g^-1 of fresh leaf mass, according to the following equations:

Where:

Ca, Cb:

chlorophyll a and b, respectively.

A470, A649, A664:

absorbance at 440, 649 and 665 nm, respectively

Results and discussion

Although there are some references of the biostimulatory effect of Bioenraiz^® on important crops in Cuba, only one research on coffee cultivation constitutes registered scientific evidence of the positive effect of this product on crops (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). The present research constitutes the first evidence in Cuba that demonstrates the biostimulatory effect of Bioenraiz^® on the rice crop.

Rice was used for the study because of its importance in the diet of Cubans and because the Bioenraiz^® effect on this grass is unknown. The results showed that Bioenraiz^® increased the length of the roots of rice plants cultivar Selección 1, 60 days after the application of the product (Figure 1).

Significant differences were observed in the height of the plants inoculated with Bioenraiz^® and the control treatment, in favor of the latter. However, there were no differences in this variable between plants inoculated with this bioproduct and those treated with the final fermentation product (Figure 1).

The results also showed a positive effect on the root growth of rice plants when inoculated with both products (Figure 2 and 3).

Plants inoculated with Bioenraiz^® showed higher aerial dry mass than those treated with the final fermentation product. In addition, no differences were observed between control plants and those inoculated with both products in this variable (Figure 3).

Bioenraiz^® is a biostimulant with high concentrations (>150 mg L^-1) of metabolites with auxinic activity, mainly indole acetic acid (IAA), which is its main active ingredient. This acid is released to the medium during the fermentation of the Rhizobium sp. strain (1414. González ME, Rosales PR, Castilla Y, Lacerra JA, Ferrer M. Effect of Bioenraiz^® as stimulant of coffee plants (Coffea arabica L.) germination and the development. Cultivos Tropicales. 2015; 36 (1): 73-79). Phytostimulation, from the production of indole compounds such as IAA, is recognized as one of the most important mechanisms used by rhizobia to promote the growth of grasses (1616. Chi F, Yang P, Han F, Jing Y, Shen S. Proteomic analysis of rice seedlings infected by Sinorhizobium meliloti 1021. Proteomics. 2010; 10(9): 1861-1874. https://doi.org/10.1002/pmic.200900694 ). This would explain the biostimulatory effect of Bioenraiz^® and of the final fermentation product in increasing root dry mass. Plants with a more developed root system can explore a larger soil surface and absorb more nutrients.

Multiple studies have proven the biostimulatory effect of IAA produced by different bacterial genera recognized as PGPB. Such is the case of Pseudomonas and Bacillus, which enhance root initiation, cell elongation and root hair formation (1717. Duca DR, Glick BR. Indole-3-acetic acid biosynthesis and its regulation in plant-associated bacteria. Applied microbiology and biotechnology. 2020; 104: 8607-8619. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10869-5 -1919. Singh A, Yadav VK, Chundawat RS, Soltane R, Awwad NS, Ibrahium HA, et al. Enhancing plant growth promoting rhizobacterial activities through consortium exposure: A review. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023; 11: 1099999. https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1099999 ). Previous research on grasses such as corn and sugarcane (Saccharum officinarum) reaffirms the biostimulant activity of IAA from Azospirillum and Bacillus (2020. Kashyap BK, Solanki MK, Pandey AK, Prabha S, Kumar P, Kumari B. Bacillus as plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): a promising green agriculture technology. In: Ansari, R., Mahmood, I. editors. Plant Health Under Biotic Stress; 2019. p. 219-236. https://doi.org/10.1007/978-981-13-6040-4 _11 -2222. Díaz AAV, Quintal-Vargas YY, Chale-Dzul JB, Santillán-Fernández A, Ferrera-Cerrato R, López-Hernández M. Isolation and selection of rhizospheric bacteria with biofertilizing potential for corn cultivation. Agro Productividad. 2021; 14(1): 69-73. https://doi.org/10.32854/agrop.v14i14.1854 ). Rhizobium also exerts a phytostimulant effect on sugarcane 30 and 75 days after transplanting, since cell-free supernatants of the bacteria contain metabolites with auxinic activity such as IAA and gibberellins (2323. Ferreira NS, Matos GF, Meneses CHSG, Reis Rouws JRC, Schwab S, Schwab S. Interaction of phytohormone-producing rhizobia with sugarcane mini-setts and their effect on plant development. Plant Soil. 2020; 451, 221-238. https://doi.org/10.1007/s11104-019-04388-0 ).

In Cuba, there are some works with the genus Azospirillum in gramineae crops, mainly rice, which have demonstrated its phytostimulatory effect for being a group of bacteria highly producers of IAA. The use of Azospirillum-based inoculants increased the vegetative development of the crop, with effectiveness rates of up to 21.77 % in height and 102.06 % in dry mass of the aerial part, with respect to the control without inoculation. Similar works have shown the possibility of reducing the nitrogen fertilization of the rice crop by 33%, based on the phytostimulant activity of this bacterial genus, starting from the production of IAA (2424. Velazco A, Castro R. Estudio de la inoculación de Azospirillum brasilense en el cultivo del arroz (Variedad A´82) en condiciones de macetas. Cultivos Tropicales. 1999; 20(1): 5-9. ISSN: 1819-4087. ).

Considering that the Bioenraiz^® application and the final fermentation caused positive effects on the growth of rice plants, plant physiological variables were determined to explain the effect of these products.

In addition to the IAA production, it is known that the stimulation of photosynthesis is another of the main mechanisms that explain the promotion of grass growth by rhizobia (1616. Chi F, Yang P, Han F, Jing Y, Shen S. Proteomic analysis of rice seedlings infected by Sinorhizobium meliloti 1021. Proteomics. 2010; 10(9): 1861-1874. https://doi.org/10.1002/pmic.200900694 ). This process supplies carbon compounds to the plant that contribute to its growth and is enhanced, among other indicators, by an increase in chlorophyll content. These molecules allow light to be captured, the first stage of the photosynthesis process (2525. Degiovanni V, Berrio LE, Charry RE. Producción Eco- Eficiente del arroz en Amárica Latina. 1st ed. Cali, Colombia: Editorial Centro Internacional de Agricultura Tropical; 2010. 513 p. ISBN: 978-958-694-103-7). However, the results of the present investigation did not show an effect of both bioproducts in the stimulation of total chlorophyll content of rice plants cultivar Selección 1, with respect to control plants (Table 1).

In contrast, the results showed significant differences between the control plants and those treated with the final fermentation product in chlorophyll a content, while there were no statistical differences between the treatments in chlorophyll b content (Table 1).

Previous work has demonstrated the positive effect of the inoculation of bacteria of the rhizobia group on chlorophyll content; such is the case of microbial consortia in rice, Sinorhizobium meliloti in alfalfa plants (Medicago sativa) subjected to stress by high concentrations of copper and Rhizobium leguminosarum in Lens culinaris (2626. Duan C, Mei Y, Wang Q, Wang Y, Li Q, Hong M, et al. Rhizobium inoculation enhances the resistance of alfalfa and microbial characteristics in copper-contaminated soil. Frontiers in Microbiology. 2022; 12, 781831. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.781831 , 2727. Hussain A, Faizan S. Rhizobium induced modulation of growth and photosynthetic efficiency of Lens culinaris Medik. Grown on fly ash amended soil by antioxidants regulation. Environmental Science and Pollution Research. 2023; 30(16): 46295-46305. https://doi.org/10.1007/s11356-023-25616-2 ).

On the other hand, carotenoids are pigments (yellow-orange) that protect the photosensitive apparatus by energy dissipation and extinction mechanisms. Like chlorophylls, they also participate in capturing sunlight, especially in the light spectrum between 450 and 500 nm, in which chlorophylls absorb little (2828. Taiz L, Zeiger E, Moller IM, Murphy A. Plant physiology and development. 6th ed. La Sunderland, USA: Sinauer Associates; 2015. 761 p.). Hence the interest in determining the effect of both bioproducts on the content of these molecules. The results showed no significant differences between the treatments studied. However, previous studies revealed that the inoculation of Bradyrhizobium and Enterobacter strains produced increases in the total carotenoid content of soybean (Glycine max) plants under salt stress conditions (2929. Agha MS, Haroun SA, Abbas MA, Sofy MR, Mowafy AM. Growth and Metabolic Response of Glycine max to the Plant Growth‑Promoting Enterobacter Delta PSK and Bradyrhizobium japonicum Under Salinity Stress. Journal of Plant Growth Regulation. 2023; 42: 5816-5830. https://doi.org/10.1007/s00344-023-10967-4 2023 ).

Bioenraiz^® is a product that, although it has been opportunely studied, has practically no published scientific results to explain its phytostimulant effect on crops. Results presented here contribute to obtain knowledge about its effect on rice cultivation and thus form part of the dissemination of the potential of this bioproduct as a plant growth stimulator. It is imperative to replace part of the mineral fertilization used in crops, especially in those of economic importance. The use of products such as Bioenraiz^® could be part of this goal.

Conclusions

Bioenraiz^® and the final fermentation product of the Rhizobium sp. strain, both of which are produced domestically, are promising bioproducts for the inoculation of the rice cultivar Selección 1, one of the most widespread in the country. Both products had a positive effect on the root development of the grass. However, Bioenraiz^® produced more encouraging results on root length and dry mass of the aerial part of the plants. Taking into account the limitations of the present research, it is advisable to continue with similar experiments, even extending them to other crops and field conditions, in order to have a more solid criterion when deciding on the productive process of these bioproducts and, therefore, which one would be more appropriate to use.