Introducción

La agricultura moderna se enfrenta a desafíos constantes debido a las enfermedades fúngicas que afectan a los cultivos, ocasionando pérdidas económicas significativas y poniendo en riesgo la seguridad alimentaria global (11. Vera-Rodríguez JH, Duarte-Cuesta JM, del Rocío Villamar-Aveiga M, Sevilla-Carrasco JD, Ortiz-Mata JD, Gavin-Moyano CS, et al. Morphological characterization, molecular identification, and phylogenetic analysis of Lasiodiplodia theobromae associated with CCN-51 cacao plants in Ecuador. Sci Agropecu [Internet]. 2025 Aug 8 [cited 2025 Sep 8];16(4):513-9. Available from: https://doi.org/10.17268/sci.agropecu.2025.039 ). Entre estas enfermedades, la escoba de bruja causada por el hongo Moniliophthora perniciosa (anteriormente Crinipellis perniciosa), representa una de las principales amenazas para el cultivo de cacao (Theobroma cacao L.) en diversas regiones productoras del mundo, incluyendo Ecuador (22. Peralta SLP, Herrera CW, Castro B del RG. Estimación de pérdidas económicas en Cacao causado por Escoba de Bruja (Crinipellis Perniciosa) y Monilia (Monilia Roreri) en pequeños productores. Rev la Univ del Zulia [Internet]. 2024;15(42):179-92. Available from: https://doi.org/10.46925//rdluz.42.10 ). Este patógeno es responsable de la deformación de brotes, cojines florales y frutos, impactando severamente la producción y calidad del cacao (33. Sánchez MAL, Aguayo AAA, Campoverde AG. El Análisis comparativo sobre la incidencia de las tres principales enfermedades en el cacao CCN-51, en el cantón La Troncal, provincia del Cañar, Ecuador. Rev Científica Ciencias Nat y Ambient [Internet]. 2018;12(1). Available from: https://doi.org/10.53591/cna.v12i1.271 ).

El manejo de enfermedades fúngicas en la agricultura tradicionalmente ha dependido del uso de fungicidas sintéticos (44. Villa-Martínez A, Pérez-Leal R, Morales-Morales HA, Basurto-Sotelo M, Soto-Parra JM, Martínez-Escudero E. Situación actual en el control de Fusarium spp. y evaluación de la actividad antifúngica de extractos vegetales. Acta agronómica [Internet]. 2015;64(2):194-205. Available from: https://doi.org/10.15446/acag.v64n2.43358 ). Si bien estas sustancias ofrecen un control eficaz a corto plazo, su aplicación indiscriminada genera preocupación por los efectos negativos en el medio ambiente, la salud humana y la aparición de cepas de patógenos resistentes (55. Bobadilla CCC, Ruíz JRC. Efecto antifúngico del aceite esencial de Origanum vulgare sobre el crecimiento micelial de Rhizoctonia solani. Sagasteguiana [Internet]. 2015;3(1):79-86. Available from: https://revistas.unitru.edu.pe/index.php/REVSAGAS/article/view/2011 ). Esta problemática ha impulsado la búsqueda de alternativas más sostenibles y ecológicas para el control de enfermedades, siendo el control biológico una de las estrategias más prometedoras (66. Jeres-Caguana GA, Montaño-Roldan VL, Ordoñez-Zuñiga NL, Vera-Rodriguez JH, Lucas-Vidal LR. Efecto biorremediador de la espirulina y Trichoderma spp. en suelo contaminado con plomo (Pb). Multidiscip Collab J [Internet]. 2025;3(2):1-12. Available from: https://doi.org/10.70881/mcj/v3/n2/48 ).

En este contexto, el uso de microorganismos benéficos como agentes de control biológico ha ganado gran relevancia (77. Vera J, Sarango Y, Villamar M, Ortiz J, Sevilla-Carrasco J, Duarte J LL. Effect of herbicides on the growth of beneficial microorganisms in rhizospheric soil. Rev Fac Agron [Internet]. 2025;42(2):e254222. Available from: https://www.produccioncientificaluz.org/index.php/agronomia/article/view/43831 ). El género Trichoderma se destaca como uno de los grupos de hongos más estudiados y aplicados en la agricultura debido a su versatilidad y sus múltiples mecanismos de acción antagonista contra fitopatógenos (88. Parraguirre-Lezama C, Romero-Arenas O, Cruz Coronel A, Mauricio-Gutiérrez A, Contreras-Paredes CA, Rivera Tapia A. Toxicidad de fungicidas de contacto en cuatro especies de Trichoderma, un enfoque de compatibilidad in vitro. Rev Mex Fitopatol [Internet]. 2025;43(1). Available from: https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2402-7 ). Diversas especies de Trichoderma son reconocidas por su capacidad de promover el crecimiento vegetal, mejorar la absorción de nutrientes y, fundamentalmente, suprimir el desarrollo de enfermedades (99. Rios-Catota DV, Álvarez-Sánchez AR, Vera-Rodríguez JH. Biosíntesis de nanopartículas de plata mediante Trichoderma asperellum y su impacto en el crecimiento vegetativo del maíz (Zea mays L.). Multidiscip Collab J [Internet]. 2025;3(2):148-58. Available from: https://doi.org/10.70881/mcj/v3/n2/57 ).

Dentro del género Trichoderma, la especie Trichoderma asperellum ha demostrado ser particularmente eficaz en el control de una amplia gama de patógenos fúngicos (1010. Cruz A, Rivero D, Echevarría A, Rodríguez AT. Manejo de hongos fitopatógenos en Oryza sativa con la aplicación de Trichoderma asperellum. Cultiv Trop [Internet]. 2022;43(4):1-5. Available from: https://cu-id.com/2050/v43n4e01 ). Sus mecanismos antagónicos incluyen el micoparasitismo, donde el hongo benéfico ataca directamente al patógeno (1111. Duarte-Leal Y, Lamz-Piedra A, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de aislamientos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a Sclerotium rolfsii Sacc. Rev protección Veg [Internet]. 2017;32(3):0. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522017000300003&script=sci_arttext ); la competencia por nutrientes y espacio, donde supera al patógeno en la colonización de sustratos (1212. Martínez B, Infante D, Reyes Y. Trichoderma spp. y su función en el control de plagas en los cultivos. Rev Protección Veg [Internet]. 2013;28(1):1-11. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=s1010-27522013000100001&script=sci_arttext ); la producción de compuestos antifúngicos como metabolitos secundarios y enzimas líticas (1313. Mesa-Vanegas AM, Marin A, Calle-Osorno J. Metabolitos secundarios en Trichoderma spp. y sus aplicaciones biotecnológicas agrícolas. Actual biológicas [Internet]. 2019;41(111):32-44. Available from: https://doi.org/10.17533/udea.acbi.v41n111a02 ); y la inducción de resistencia sistémica en la planta hospedera (1414. Camacho-Luna V, Flores-Moctezuma HE, Rodríguez-Monroy M, Montes-Belmont R, Sepúlveda-Jiménez G. Inducción de la respuesta de defensa de plantas de cebolla en la interacción con Trichoderma asperellum y Alternaria porri. Rev Mex ciencias agrícolas [Internet]. 2021;12(4):685-98. Available from: https://doi.org/10.29312/remexca.v12i4.2683 ).

La escoba de bruja del cacao, causada por Moniliophthora perniciosa, es una enfermedad de gran complejidad debido a la variabilidad genética del patógeno y a su ciclo de vida particular, que involucra diferentes estadios en la planta de cacao (1515. Tirado-Gallego PA, Lopera-Álvarez A, Ríos-Osorio LA. Estrategias de control de Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa en Theobroma cacao L.: revisión sistemática. Cienc y Tecnol Agropecu [Internet]. 2016;17(3):417-30. Available from: http://dx.doi.org/10.21930/rcta.vol17_num3_art:517 ). El hongo infecta los tejidos meristemáticos, provocando una proliferación anormal de brotes y ramas, que eventualmente se secan y mueren, formando las características "escobas" (1616. Lopes MA, Gomes DS, Koblitz MGB, Pirovani CP, de Mattos Cascardo JC, Góes-Neto A, et al. Use of response surface methodology to examine chitinase regulation in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa. Mycol Res [Internet]. 2008;112(3):399-406. Available from: https://doi.org/10.1016/j.mycres.2007.10.017 ). Si los frutos son afectados, se momifican y pierden su valor comercial (1717. Garcia O, Macedo JAN, Tibúrcio R, Zaparoli G, Rincones J, Bittencourt LMC, et al. Characterization of necrosis and ethylene-inducing proteins (NEP) in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom in Theobroma cacao. Mycol Res [Internet]. 2007;111(4):443-55. Available from: https://doi.org/10.1016/j.mycres.2007.01.017 ).

A pesar de los esfuerzos de investigación, el control efectivo y sostenible de M. perniciosa sigue siendo un desafío (1818. Rivera-Fernández RD, Valarezo-Beltron O, Macías LV, Chavarría-Párraga JE, Cedeño ÁMG. Efecto de la poda fitosanitaria sobre la enfermedad escoba de bruja en el cultivo de cacao. Intropica Rev del Inst Investig Trop [Internet]. 2014;9(1):129-36. Available from: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=5111585 ). Las estrategias actuales a menudo combinan prácticas culturales, como la poda sanitaria, con la aplicación de fungicidas (1919. Almestar-Montenegro J, Leiva-Espinoza S, Borjas-Ventura R, Valderrama-Palacios D, León-Rojas F, Castro-Cepero V, et al. Efecto de la poda y la remoción de frutos sobre las enfermedades de la mazorca de cacao en Copallín, Amazonas, Perú. Idesia (Arica) [Internet]. 2024;42(4):69-77. Available from: http://dx.doi.org/10.4067/s0718-34292024000400069 ). Sin embargo, estas medidas no siempre son suficientes para mitigar el impacto de la enfermedad, especialmente en zonas de alta presión de inóculo (2020. Hernández-Villegas J. Incidencia de la escoba de bruja (Crinipellis perniciosa) sobre el rendimiento de dos agroecosistemas de cacao con diferentes condiciones de manejo. Bioagro [Internet]. 2016;28(1):59-64. Available from: https://ve.scielo.org/scielo.php?pid=S1316-33612016000100008&script=sci_arttext ). Esto subraya la necesidad urgente de desarrollar nuevas herramientas de manejo.

El estudio tuvo como objetivo investigar el efecto antagónico in vitro de Trichoderma asperellum frente a Moniliophthora perniciosa. Los resultados de esta investigación contribuirán al conocimiento sobre las interacciones biológicas, ofreciendo una base científica para el desarrollo de estrategias de control biológico más eficientes y amigables con el medio ambiente, beneficiando a los productores y al ecosistema cacaotero.

Materiales y Métodos

La toma de muestras para el aislamiento de los agentes fúngicos se llevó a cabo en el mes de septiembre del 2024, en la finca “Hermanos Quito” de la parroquia Lorenzo Garaicoa del cantón Simón Bolívar, provincia del Guayas-Ecuador, mientras que el procesamiento de las muestras se realizó en el laboratorio de microbiología de la Universidad Agraria del Ecuador.

Para el aislamiento de T. asperellum se aplicó la metodología propuesta por Vera (77. Vera J, Sarango Y, Villamar M, Ortiz J, Sevilla-Carrasco J, Duarte J LL. Effect of herbicides on the growth of beneficial microorganisms in rhizospheric soil. Rev Fac Agron [Internet]. 2025;42(2):e254222. Available from: https://www.produccioncientificaluz.org/index.php/agronomia/article/view/43831 ) utilizando trampas de arroz y sembrar en medio PDA por sus características colorimétricas al género Trichoderma. Mientras que para M. perniciosa se tomó una rama de cacao con síntoma de la enfermedad, fue lavada con jabón neutro y agua destilada, se cortó la rama transversalmente hasta tener 5 pedazos de ≈3 cm, luego se sumergieron las fracciones en hipoclorito de sodio al 1% durante 2 minutos con enjuagues de agua estéril, finalmente dentro de la cabina de seguridad se sumergieron en etanol al 70 % durante 20 segundos, se realizó un corte longitudinal a los fragmentos eliminando la corteza y tomando fracciones del cambium vascular de la rama de ≈5 mm, los mismos que fueron sembrados sobre medio de cultivo PDA en la parte central de la placa e incubadas a 28 ºC durante 14 días, para pasar a la fase de purificación.

La identificación molecular de los hongos se llevó a cabo mediante una serie de pasos estandarizados. Inicialmente, se procedió a la extracción de ADN a partir de 100 mg de cada muestra fúngica. Posteriormente, la integridad y pureza del ADN extraído se verificaron mediante espectrofotometría de microvolúmenes y electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El ADN fue luego ajustado a una concentración de 20 ng/µL^-1 para su amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) utilizando los cebadores ITS1/ITS4 (2121. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc a Guid to methods Appl [Internet]. 1990;18(1):315-22. Available from: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1 ); y BtuB: Bt2a/Bt2b (2222. Glass NL, Donaldson GC. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl Environ Microbiol [Internet]. 1995;61(4):1323-30. Available from: https://doi.org/10.1128/aem.61.4.1323-1330.1995 ). Los productos de PCR resultantes se purificaron antes de la secuenciación por el método de Sanger. Finalmente, las secuencias obtenidas fueron depuradas informáticamente y comparadas con la base de datos de nucleótidos del GenBank (NCBI) para la identificación taxonómica del hongo.

Para determinar la dinámica de crecimiento de M. perniciosa, se diseñó un experimento comparativo. Un grupo control M. perniciosa representó la ausencia de competencia, mientras que el otro tratamiento incorporo la presencia de microorganismos con reconocida actividad antagonista M. perniciosa & T. asperellum. Este estudio se realizó en placas de Petri de 90 mm, utilizando medio PDA como sustrato para la inoculación simultánea y estéril del hongo patógeno y su correspondiente antagonista. El progreso del micelio de M. perniciosa fue registrado diariamente en milímetros (mm) durante 7 días. Los datos de crecimiento recopilados sirvieron para calcular las velocidades de crecimiento específicas de cada entidad y la influencia de los agentes antagonistas en la disminución del crecimiento del patógeno.

La metodología aplicada para el procesamiento de los datos obtenidos en el experimento (Tabla 1) consistió en un modelamiento matemático predictivo utilizando el sistema de ecuaciones diferenciales de Lotka-Volterra para competencia interespecífica. Se definieron los parámetros clave del modelo para ambas especies (M. perniciosa y T. asperellum), incluyendo la población inicial, la tasa de crecimiento intrínseca, la capacidad de carga del ambiente y los coeficientes que cuantifican la interacción competitiva mutua entre los dos hongos (Tabla 2).

A partir de los datos experimentales se estimaron los parámetros para la tasa de crecimiento Intrínseca (r), capacidad de carga (K) y Coeficiente de Competencia (α) mediante métodos estadísticos y numéricos, buscando el conjunto de parámetros que mejor explica las dinámicas de población observadas.

Estos valores son los que se aplicaron en las fórmulas del modelo de Lotka-Volterra para realizar las simulaciones de crecimiento. Las fórmulas generales del modelo de Lotka-Volterra para competencia utilizadas para generar los datos de la gráfica consistieron en dos ecuaciones diferenciales:

Para la Especie 1 (M. perniciosa, que llamaremos N1):

Para la Especie 2 (T. asperellum, que llamaremos N2):

Donde:

$N_1$ : Población de M. perniciosa en el tiempo t.

$N_2$ : Población de T. asperellum en el tiempo t.

$\frac{d{N}_1}{dt}$ : Tasa de cambio de la población de M. perniciosa con respecto al tiempo.

$\frac{d{N}_2}{dt}$ : Tasa de cambio de la población de T. asperellum con respecto al tiempo.

$r_1$ : Tasa de crecimiento intrínseca de M. perniciosa (0.5).

$r_2$ : Tasa de crecimiento intrínseca de T. asperellum (0.8).

$K_1$ : Capacidad de carga de M. perniciosa (10000).

$K_2$ : Capacidad de carga de T. asperellum (15000).

${\alpha }_{12}$ : Coeficiente de competencia que representa el efecto de T. asperellum ( $N_2$ ) sobre M. perniciosa ( $N_1$ ) (0.7).

${\alpha }_{21}$ : Coeficiente de competencia que representa el efecto de M. perniciosa ( $N_1$ ) sobre T. asperellum ( $N_2$ ) (0.2).

Con estos parámetros, se procedió a la integración numérica de las ecuaciones diferenciales que describen la dinámica poblacional del antagonismo durante el período de evaluación, lo que permitió obtener la evolución de las poblaciones de M. perniciosa y T. asperellum a lo largo del tiempo. Finalmente, los resultados de la simulación se representaron visualmente mediante una gráfica, que ilustra las curvas de crecimiento de ambas especies bajo las condiciones de competencia definidas por el modelo.

Resultados

Discusión

Este resultado sugiere una alta especificidad y calidad de la secuencia obtenida. T. asperellum es un hongo ampliamente reconocido por su potencial como agente de biocontrol contra diversas enfermedades de plantas (2323. Guigón-López C, Guerrero-Prieto V, Vargas-Albores F, Carvajal-Millán E, Ávila-Quezada GD, Bravo-Luna L, et al. Identificación molecular de cepas nativas de Trichoderma spp. su tasa de crecimiento in vitro y antagonismo contra hongos fitopatógenos. Rev Mex Fitopatol [Internet]. 2010;28(2):87-96. Available from: https://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S0185-33092010000200002&script=sci_arttext ), mientras que M. perniciosa es el agente causal de la enfermedad conocida como "escoba de bruja" en el cacao, una de las enfermedades más devastadoras para este cultivo (1515. Tirado-Gallego PA, Lopera-Álvarez A, Ríos-Osorio LA. Estrategias de control de Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa en Theobroma cacao L.: revisión sistemática. Cienc y Tecnol Agropecu [Internet]. 2016;17(3):417-30. Available from: http://dx.doi.org/10.21930/rcta.vol17_num3_art:517 ).

Estos hallazgos in vitro son prometedores para el desarrollo de estrategias sostenibles de control biológico contra M. perniciosa, una enfermedad devastadora que causa pérdidas significativas en la producción de cacao a nivel mundial (2424. Mondego JMC, Carazzolle MF, Costa GGL, Formighieri EF, Parizzi LP, Rincones J, et al. A genome survey of Moniliophthora perniciosa gives new insights into Witches’ Broom Disease of cacao. BMC Genomics [Internet]. 2008;9:1-25. Available from: https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-548 ). No obstante, es crucial que estos resultados sean validados en condiciones de campo para confirmar la eficacia de T. asperellum en un entorno más complejo y variable, donde factores ambientales como la temperatura, la humedad y la interacción con otros microorganismos pueden influir en la dinámica del antagonismo (1111. Duarte-Leal Y, Lamz-Piedra A, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de aislamientos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a Sclerotium rolfsii Sacc. Rev protección Veg [Internet]. 2017;32(3):0. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522017000300003&script=sci_arttext ).

Esta dinámica es un reflejo directo de los parámetros intrínsecos de crecimiento (r) y de competencia (α) asignados en el modelo. La simulación demuestra el potencial del modelo de Lotka-Volterra para predecir y entender las interacciones ecológicas entre especies, un concepto bien establecido en la ecología de poblaciones (2525. Cano MA. Interacción de microorganismos benéficos en plantas: Micorrizas, Trichoderma spp. y Pseudomonas spp. Una revisión. Rev UDCA Actual Divulg Científica [Internet]. 2011;14(2):15-31. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0123-42262011000200003&script=sci_arttext ).

Los ensayos de antagonismo in vitro demostraron inequívocamente que T. asperellum ejerce una potente actividad inhibitoria sobre el crecimiento de M. perniciosa. La simulación de la dinámica poblacional mediante el modelo de Lotka-Volterra corrobora el fuerte potencial antagónico de T. asperellum. El modelo predice que, incluso partiendo de una menor densidad inicial, T. asperellum supera significativamente la población de M. perniciosa en un corto período de tiempo (7 días), lo que respalda su capacidad para desplazar y controlar al patógeno en un sistema competitivo.

Conclusiones

El estudio confirmó la identidad molecular de los aislados fúngicos utilizados: Trichoderma asperellum (H801) y Moniliophthora perniciosa (H802), mediante la amplificación y secuenciación de los genes BtuB e ITS, respectivamente, obteniendo un alto porcentaje de identidad con secuencias de referencia en bases de datos.

En conjunto, estos resultados moleculares, in vitro y de modelado, proporcionan una base sólida para considerar a T. asperellum como un prometedor agente de biocontrol para la enfermedad de la "escoba de bruja" del cacao, aunque su validación en condiciones de campo es esencial para confirmar su eficacia en entornos reales.

Introduction

Modern agriculture faces constant challenges due to fungal diseases affecting crops, causing significant economic losses and threatening global food security (11. Vera-Rodríguez JH, Duarte-Cuesta JM, del Rocío Villamar-Aveiga M, Sevilla-Carrasco JD, Ortiz-Mata JD, Gavin-Moyano CS, et al. Morphological characterization, molecular identification, and phylogenetic analysis of Lasiodiplodia theobromae associated with CCN-51 cacao plants in Ecuador. Sci Agropecu [Internet]. 2025 Aug 8 [cited 2025 Sep 8];16(4):513-9. Available from: https://doi.org/10.17268/sci.agropecu.2025.039 ). Among these diseases, witches’ broom caused by the fungus Moniliophthora perniciosa (formerly Crinipellis perniciosa) represents one of the main threats to cacao (Theobroma cacao L.) cultivation in various producing regions worldwide, including Ecuador (22. Peralta SLP, Herrera CW, Castro B del RG. Estimación de pérdidas económicas en Cacao causado por Escoba de Bruja (Crinipellis Perniciosa) y Monilia (Monilia Roreri) en pequeños productores. Rev la Univ del Zulia [Internet]. 2024;15(42):179-92. Available from: https://doi.org/10.46925//rdluz.42.10 ). This pathogen is responsible for the deformation of shoots, floral cushions, and fruits, severely impacting cacao yield and quality (33. Sánchez MAL, Aguayo AAA, Campoverde AG. El Análisis comparativo sobre la incidencia de las tres principales enfermedades en el cacao CCN-51, en el cantón La Troncal, provincia del Cañar, Ecuador. Rev Científica Ciencias Nat y Ambient [Internet]. 2018;12(1). Available from: https://doi.org/10.53591/cna.v12i1.271 ).

The management of fungal diseases in traditional agriculture has largely depended on the use of synthetic fungicides (44. Villa-Martínez A, Pérez-Leal R, Morales-Morales HA, Basurto-Sotelo M, Soto-Parra JM, Martínez-Escudero E. Situación actual en el control de Fusarium spp. y evaluación de la actividad antifúngica de extractos vegetales. Acta agronómica [Internet]. 2015;64(2):194-205. Available from: https://doi.org/10.15446/acag.v64n2.43358 ). Although these substances provide effective short-term control, their indiscriminate application raises concerns about negative effects on the environment, human health, and the emergence of resistant pathogen strains (55. Bobadilla CCC, Ruíz JRC. Efecto antifúngico del aceite esencial de Origanum vulgare sobre el crecimiento micelial de Rhizoctonia solani. Sagasteguiana [Internet]. 2015;3(1):79-86. Available from: https://revistas.unitru.edu.pe/index.php/REVSAGAS/article/view/2011 ). This issue has driven the search for more sustainable and ecological alternatives for disease control, with biological control emerging as one of the most promising strategies (66. Jeres-Caguana GA, Montaño-Roldan VL, Ordoñez-Zuñiga NL, Vera-Rodriguez JH, Lucas-Vidal LR. Efecto biorremediador de la espirulina y Trichoderma spp. en suelo contaminado con plomo (Pb). Multidiscip Collab J [Internet]. 2025;3(2):1-12. Available from: https://doi.org/10.70881/mcj/v3/n2/48 ).

In this context, the use of beneficial microorganisms as biological control agents has gained great relevance (77. Vera J, Sarango Y, Villamar M, Ortiz J, Sevilla-Carrasco J, Duarte J LL. Effect of herbicides on the growth of beneficial microorganisms in rhizospheric soil. Rev Fac Agron [Internet]. 2025;42(2):e254222. Available from: https://www.produccioncientificaluz.org/index.php/agronomia/article/view/43831 ). The genus Trichoderma stands out as one of the most studied and applied groups of fungi in agriculture due to its versatility and multiple antagonistic mechanisms of action against phytopathogens (88. Parraguirre-Lezama C, Romero-Arenas O, Cruz Coronel A, Mauricio-Gutiérrez A, Contreras-Paredes CA, Rivera Tapia A. Toxicidad de fungicidas de contacto en cuatro especies de Trichoderma, un enfoque de compatibilidad in vitro. Rev Mex Fitopatol [Internet]. 2025;43(1). Available from: https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2402-7 ). Several Trichoderma species are recognized for their ability to promote plant growth, enhance nutrient uptake, and, most importantly, suppress disease development (99. Rios-Catota DV, Álvarez-Sánchez AR, Vera-Rodríguez JH. Biosíntesis de nanopartículas de plata mediante Trichoderma asperellum y su impacto en el crecimiento vegetativo del maíz (Zea mays L.). Multidiscip Collab J [Internet]. 2025;3(2):148-58. Available from: https://doi.org/10.70881/mcj/v3/n2/57 ).

Within the genus Trichoderma, the species Trichoderma asperellum has proven particularly effective in controlling a wide range of fungal pathogens (1010. Cruz A, Rivero D, Echevarría A, Rodríguez AT. Manejo de hongos fitopatógenos en Oryza sativa con la aplicación de Trichoderma asperellum. Cultiv Trop [Internet]. 2022;43(4):1-5. Available from: https://cu-id.com/2050/v43n4e01 ). Its antagonistic mechanisms include mycoparasitism, where the beneficial fungus directly attacks the pathogen (1111. Duarte-Leal Y, Lamz-Piedra A, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de aislamientos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a Sclerotium rolfsii Sacc. Rev protección Veg [Internet]. 2017;32(3):0. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522017000300003&script=sci_arttext ); competition for nutrients and space, where it outcompetes the pathogen in substrate colonization (1212. Martínez B, Infante D, Reyes Y. Trichoderma spp. y su función en el control de plagas en los cultivos. Rev Protección Veg [Internet]. 2013;28(1):1-11. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=s1010-27522013000100001&script=sci_arttext ); production of antifungal compounds such as secondary metabolites and lytic enzymes (1313. Mesa-Vanegas AM, Marin A, Calle-Osorno J. Metabolitos secundarios en Trichoderma spp. y sus aplicaciones biotecnológicas agrícolas. Actual biológicas [Internet]. 2019;41(111):32-44. Available from: https://doi.org/10.17533/udea.acbi.v41n111a02 ); and induction of systemic resistance in the host plant (1414. Camacho-Luna V, Flores-Moctezuma HE, Rodríguez-Monroy M, Montes-Belmont R, Sepúlveda-Jiménez G. Inducción de la respuesta de defensa de plantas de cebolla en la interacción con Trichoderma asperellum y Alternaria porri. Rev Mex ciencias agrícolas [Internet]. 2021;12(4):685-98. Available from: https://doi.org/10.29312/remexca.v12i4.2683 ).

Cacao witches’ broom, caused by Moniliophthora perniciosa, is a highly complex disease due to the genetic variability of the pathogen and its particular life cycle, which involves different stages in the cacao plant (1515. Tirado-Gallego PA, Lopera-Álvarez A, Ríos-Osorio LA. Estrategias de control de Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa en Theobroma cacao L.: revisión sistemática. Cienc y Tecnol Agropecu [Internet]. 2016;17(3):417-30. Available from: http://dx.doi.org/10.21930/rcta.vol17_num3_art:517 ). The fungus infects meristematic tissues, causing abnormal proliferation of shoots and branches that eventually dry and die, forming the characteristic “brooms” (1616. Lopes MA, Gomes DS, Koblitz MGB, Pirovani CP, de Mattos Cascardo JC, Góes-Neto A, et al. Use of response surface methodology to examine chitinase regulation in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa. Mycol Res [Internet]. 2008;112(3):399-406. Available from: https://doi.org/10.1016/j.mycres.2007.10.017 ). When fruits are affected, they become mummified and lose their commercial value (1717. Garcia O, Macedo JAN, Tibúrcio R, Zaparoli G, Rincones J, Bittencourt LMC, et al. Characterization of necrosis and ethylene-inducing proteins (NEP) in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom in Theobroma cacao. Mycol Res [Internet]. 2007;111(4):443-55. Available from: https://doi.org/10.1016/j.mycres.2007.01.017 ).

Despite research efforts, effective and sustainable control of M. perniciosa remains a challenge (1818. Rivera-Fernández RD, Valarezo-Beltron O, Macías LV, Chavarría-Párraga JE, Cedeño ÁMG. Efecto de la poda fitosanitaria sobre la enfermedad escoba de bruja en el cultivo de cacao. Intropica Rev del Inst Investig Trop [Internet]. 2014;9(1):129-36. Available from: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=5111585 ). Current strategies often combine cultural practices, such as sanitary pruning, with fungicide application (1919. Almestar-Montenegro J, Leiva-Espinoza S, Borjas-Ventura R, Valderrama-Palacios D, León-Rojas F, Castro-Cepero V, et al. Efecto de la poda y la remoción de frutos sobre las enfermedades de la mazorca de cacao en Copallín, Amazonas, Perú. Idesia (Arica) [Internet]. 2024;42(4):69-77. Available from: http://dx.doi.org/10.4067/s0718-34292024000400069 ). However, these measures are not always sufficient to mitigate the impact of the disease, particularly in areas with high inoculum pressure (2020. Hernández-Villegas J. Incidencia de la escoba de bruja (Crinipellis perniciosa) sobre el rendimiento de dos agroecosistemas de cacao con diferentes condiciones de manejo. Bioagro [Internet]. 2016;28(1):59-64. Available from: https://ve.scielo.org/scielo.php?pid=S1316-33612016000100008&script=sci_arttext ). This underscores the urgent need to develop new management tools.

The aim of this study was to investigate the in vitro antagonistic effect of Trichoderma asperellum against Moniliophthora perniciosa. The results of this research will contribute to knowledge on biological interactions, providing a scientific basis for the development of more efficient and environmentally friendly biological control strategies, benefiting both producers and the cacao agroecosystem.

Materials and Methods

Sample Collection and Fungal Isolation Sampling for the isolation of fungal agents was conducted in September 2024 at the “Hermanos Quito” farm, located in the Lorenzo Garaicoa parish of Simón Bolívar canton, Guayas province, Ecuador. Sample processing was carried out at the Microbiology Laboratory of the Agrarian University of Ecuador.

For the isolation of T. asperellum, the methodology proposed by Vera (77. Vera J, Sarango Y, Villamar M, Ortiz J, Sevilla-Carrasco J, Duarte J LL. Effect of herbicides on the growth of beneficial microorganisms in rhizospheric soil. Rev Fac Agron [Internet]. 2025;42(2):e254222. Available from: https://www.produccioncientificaluz.org/index.php/agronomia/article/view/43831 ) was applied, using rice traps and subsequent inoculation on PDA medium, based on the colorimetric characteristics typical of the genus Trichoderma. For M. perniciosa, a cacao branch showing disease symptoms was collected, washed with neutral soap and distilled water, cut transversely into five fragments of ≈3 cm, and immersed in 1 % sodium hypochlorite for 2 minutes followed by sterile water rinses. Finally, under a biosafety cabinet, fragments were immersed in 70 % ethanol for 20 seconds, longitudinally sectioned to remove the bark, and ≈5 mm fractions of vascular cambium were placed centrally on PDA plates and incubated at 28 °C for 14 days before purification.

Molecular identification was performed through standardized procedures. DNA was extracted from 100 mg of each fungal sample. The integrity and purity of the extracted DNA were verified using microvolume spectrophotometry and 1 % agarose gel electrophoresis. DNA concentration was adjusted to 20 ng/µL for amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction) using primers ITS1/ITS4 (2121. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc a Guid to methods Appl [Internet]. 1990;18(1):315-22. Available from: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1 ) and BtuB: Bt2a/Bt2b (2222. Glass NL, Donaldson GC. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl Environ Microbiol [Internet]. 1995;61(4):1323-30. Available from: https://doi.org/10.1128/aem.61.4.1323-1330.1995 ). PCR products were purified prior to sequencing by the Sanger method. Sequences obtained were bioinformatically processed and compared against the GenBank (NCBI) nucleotide database for taxonomic identification.

To determine the growth dynamics of M. perniciosa, a comparative experiment was designed. The control group (M. perniciosa) represented the absence of competition, while the treatment group incorporated the presence of microorganisms with recognized antagonistic activity (M. perniciosa & T. asperellum). The study was conducted in 90 mm Petri dishes using PDA medium as substrate for simultaneous sterile inoculation of the pathogen and its antagonist. The progress of M. perniciosa mycelium was recorded daily in millimeters (mm) over 7 days. Growth data were used to calculate specific growth rates for each organism and to assess the influence of antagonistic agents on pathogen growth reduction.

The methodology applied for data processing (Table 1) consisted of predictive mathematical modeling using the Lotka-Volterra system of differential equations for interspecific competition. Key parameters of the model were defined for both species (M. perniciosa and T. asperellum), including initial population size, intrinsic growth rate, environmental carrying capacity, and coefficients quantifying mutual competitive interactions between the two fungi (Table 2).

Based on the experimental data, the parameters for the intrinsic growth rate (r), carrying capacity (K), and competition coefficient (α) were estimated using statistical and numerical methods, seeking the set of parameters that best explains the observed population dynamics.

These values were applied in the Lotka-Volterra model equations to perform the growth simulations. The general Lotka-Volterra competition model used to generate the graph data consisted of two differential equations:

For Species 1 (M. perniciosa, denoted as N1):

For Species 2 (T. asperellum, denoted as N2):

Where:

$N_1$ : Population of M. perniciosa at time t.

$N_2$ : Population of T. asperellum at time t.

$\frac{d{N}_1}{dt}$ : Rate of change of the M. perniciosa population with respect to time.

$\frac{d{N}_2}{dt}$ : Rate of change of the T. asperellum population with respect to time.

$r_1$ : Intrinsic growth rate of M. perniciosa (0.5).

$r_2$ : Intrinsic growth rate of T. asperellum (0.8).

$K_1$ : Carrying capacity of M. perniciosa (10000).

$K_2$ : Carrying capacity of T. asperellum (15000).

${\alpha }_{12}$ : Competition coefficient representing the effect of T. asperellum (N2) on M. perniciosa ( $N_1$ ) (0.7).

${\alpha }_{21}$ : Competition coefficient representing the effect of M. perniciosa (N1) on T. asperellum (N2) (0.2).

With these parameters, numerical integration of the differential equations describing the population dynamics of antagonism was performed during the evaluation period, allowing the evolution of the populations of M. perniciosa and T. asperellum over time to be obtained. Finally, the simulation results were visually represented through a graph illustrating the growth curves of both species under the competitive conditions defined by the model

Results

Discussion

This result suggests a high specificity and quality of the sequence obtained. T. asperellum is a fungus widely recognized for its potential as a biocontrol agent against various plant diseases (2323. Guigón-López C, Guerrero-Prieto V, Vargas-Albores F, Carvajal-Millán E, Ávila-Quezada GD, Bravo-Luna L, et al. Identificación molecular de cepas nativas de Trichoderma spp. su tasa de crecimiento in vitro y antagonismo contra hongos fitopatógenos. Rev Mex Fitopatol [Internet]. 2010;28(2):87-96. Available from: https://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S0185-33092010000200002&script=sci_arttext ), whereas M. perniciosa is the causal agent of the disease known as “Witches’ Broom” in cacao, one of the most devastating diseases affecting this crop (1515. Tirado-Gallego PA, Lopera-Álvarez A, Ríos-Osorio LA. Estrategias de control de Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa en Theobroma cacao L.: revisión sistemática. Cienc y Tecnol Agropecu [Internet]. 2016;17(3):417-30. Available from: http://dx.doi.org/10.21930/rcta.vol17_num3_art:517 ).

These in vitro findings are promising for the development of sustainable biological control strategies against M. perniciosa, a devastating disease that causes significant losses in cacao production worldwide (2424. Mondego JMC, Carazzolle MF, Costa GGL, Formighieri EF, Parizzi LP, Rincones J, et al. A genome survey of Moniliophthora perniciosa gives new insights into Witches’ Broom Disease of cacao. BMC Genomics [Internet]. 2008;9:1-25. Available from: https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-548 ). Nevertheless, it is crucial that these results be validated under field conditions to confirm the efficacy of T. asperellum in a more complex and variable environment, where environmental factors such as temperature, humidity, and interactions with other microorganisms may influence the dynamics of antagonism (1111. Duarte-Leal Y, Lamz-Piedra A, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de aislamientos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a Sclerotium rolfsii Sacc. Rev protección Veg [Internet]. 2017;32(3):0. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522017000300003&script=sci_arttext ).

This dynamic is a direct reflection of the intrinsic growth (r) and competition (α) parameters assigned in the model. The simulation demonstrates the potential of the Lotka-Volterra model to predict and understand ecological interactions between species, a well‑established concept in population ecology (2525. Cano MA. Interacción de microorganismos benéficos en plantas: Micorrizas, Trichoderma spp. y Pseudomonas spp. Una revisión. Rev UDCA Actual Divulg Científica [Internet]. 2011;14(2):15-31. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0123-42262011000200003&script=sci_arttext ).

The in vitro antagonism assays unequivocally demonstrated that T. asperellum exerts a strong inhibitory activity on the growth of M. perniciosa. The simulation of population dynamics using the Lotka-Volterra model corroborates the strong antagonistic potential of T. asperellum. The model predicts that, even starting from a lower initial density, T. asperellum significantly surpasses the population of M. perniciosa within a short period (7 days), supporting its capacity to displace and control the pathogen in a competitive system.

Conclusion

The study confirmed the molecular identity of the fungal isolates used: Trichoderma asperellum (H801) and Moniliophthora perniciosa (H802), through amplification and sequencing of the BtuB and ITS genes, respectively, obtaining a high percentage of identity with reference sequences in databases. Taken together, these molecular, in vitro, and modeling results provide a solid basis for considering T. asperellum as a promising biocontrol agent for cacao Witches’ Broom disease, although validation under field conditions is essential to confirm its effectiveness in real environments.