Zona de estudio

La fase de campo de la investigación se desarrolló en la finca ganadera "Don Julio", situada en la parroquia rural Pancho Negro, cantón La Troncal, provincia de Cañar, Ecuador. El sitio de muestreo se encuentra georreferenciado en las coordenadas 2°29'34,1"S y 79°27'08,5"W, a una altitud que oscila entre 40 y 200 metros sobre el nivel del mar. La zona presenta un clima tropical, con una temperatura media anual de 30 °C, una precipitación media de 1239 mm y una humedad relativa del 77 %.

La recolección de los especímenes de Rhipicephalus microplus se realizó mediante un muestreo manual directo sobre bovinos mestizos infestados de forma natural. Se seleccionaron un total de 150 garrapatas hembras adultas en estado de ingurgitación, caracterizadas por su máximo grado de repleción y escasa movilidad. La selección se basó en criterios de tamaño, integridad física y ausencia de daños visibles. Los especímenes recolectados fueron cuidadosamente depositados en viales de plástico estériles y transportados en condiciones de refrigeración al laboratorio de la Facultad de Ciencias de la Salud y de la Vida de la Universidad Internacional del Ecuador, sede Guayaquil, para su posterior procesamiento en un lapso no mayor a 24 horas.

Aislamiento y reactivación de cepas fúngicas

Se utilizaron cepas comerciales de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. Para su reactivación y purificación, se empleó el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA), suplementado con cloranfenicol (0,1 g/L) para inhibir la contaminación bacteriana (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/). Se sembraron alícuotas de las cepas en cajas de Petri conteniendo el medio PDA y se incubaron en una estufa a una temperatura controlada de 25 ± 2 °C y un fotoperiodo de 12:12 horas (luz:oscuridad) durante 15 días. Este periodo permitió el desarrollo micelial completo y la esporulación de los hongos. El crecimiento fúngico se monitoreó y midió diariamente durante los primeros tres días utilizando un calibrador vernier para registrar el diámetro de las colonias.

Caracterización morfológica y preparación de suspensiones

La confirmación de la identidad morfológica de las cepas se realizó mediante microcultivo. Se tomaron pequeñas porciones del micelio esporulado con cinta adhesiva transparente, las cuales se montaron sobre un portaobjetos con una gota de azul de lactofenol como colorante de contraste. Las preparaciones se observaron bajo un microscopio óptico con un objetivo de 40x, analizando las características distintivas de las hifas, conidióforos y conidios de cada especie.

Para la preparación de las suspensiones de trabajo, los conidios fueron cosechados de la superficie de los cultivos en PDA mediante un raspado suave con un asa de Digralsky estéril. El material fúngico recolectado se suspendió en una solución de agua destilada estéril con Tween 80 al 0,05 % (v/v) como agente tenso-activo para facilitar la dispersión homogénea de los conidios. La concentración de las suspensiones se determinó mediante conteo en una cámara de Neubauer y se ajustó a una concentración final estandarizada de 1x10⁸ conidios/mL para todos los tratamientos (1313. García, J.A.C. Beauveria Bassiana para control biológico de Rhipicephalus Microplus en ganado bovino. Tesis de pregrado, Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, 2023. Available from: https://rraae.cedia.edu.ec/vufind/Record/ULEAM_8adefd2d2221295ce7a778fa789936eb?sid=3063131,1515. Alarcon, L.E. Efecto de Beauveria Bassiana A21 y Metarhizium Anisopliae A13 sobre Rhipicephalus Microplus En Laboratorio y Campo. 2023. Available from: https://dspace.espoch.edu.ec/items/49269b3c-19bc-4a3f-b66e-d4f3ae812e13).

Bioensayo de sinergismo in vitro

El bioensayo se diseñó siguiendo metodologías de inmersión previamente reportadas para la evaluación de la actividad acaricida de hongos entomopatógenos (1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.). Las 150 garrapatas recolectadas se distribuyeron aleatoriamente en cuatro tratamientos experimentales, cada uno con tres réplicas biológicas independientes, conformadas por 10 garrapatas por réplica, constituyendo un total de 30 garrapatas por tratamiento.

Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:

Las garrapatas fueron sumergidas en sus respectivas suspensiones durante 30 segundos, posteriormente secadas a temperatura ambiente sobre papel absorbente estéril y fueron colocadas individualmente en cajas de Petri de 90 mm de diámetro, con papel filtro humedecido para mantener una humedad relativa superior al 80 %. Las cajas se sellaron con parafilm y se incubaron a 27 ± 1 °C, bajo un fotoperiodo de 12:12 h.

Evaluación de la mortalidad y análisis estadístico

La mortalidad de las garrapatas se evaluó diariamente desde el día 3 hasta el día 13 post-tratamiento. Se consideró una garrapata muerta cuando no presentó respuesta motora al estímulo con un pincel fino y se evidenció el crecimiento micelial característico del hongo entomopatógeno sobre la cutícula (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/).

Los porcentajes de mortalidad acumulada fueron transformados mediante la función arcoseno de la raíz cuadrada para cumplir con los supuestos de normalidad. Posteriormente, los datos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA), seguido de una prueba de comparación de medias de Tukey, considerando un nivel de significancia de p < 0,05. El análisis estadístico se realizó utilizando el software InfoStat versión 2020.

Crecimiento y caracterización de los hongos entomopatógenos

La reactivación de las cepas de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana en medio Agar Papa Dextrosa (PDA) confirmó su viabilidad, pureza y adecuado comportamiento de crecimiento para su uso en bioensayos. En el caso de Metarhizium anisopliae, se observó un crecimiento micelial inicial de coloración blanquecina, que evolucionó progresivamente hacia un tono verde olivo oscuro conforme avanzó el proceso de esporulación. La colonia presentó una textura aterciopelada y compacta, alcanzando un diámetro promedio de 3,5 cm a los tres días de incubación, lo que evidencia una alta capacidad de colonización del medio de cultivo (Figura 1).

La observación microscópica permitió confirmar la identidad morfológica de M. anisopliae, evidenciándose hifas hialinas septadas, con conidióforos ramificados y conidios cilíndricos dispuestos en cadenas densas, características consistentes con las descripciones taxonómicas reportadas para la especie (Figura 2).

Por su parte, Beauveria bassiana mostró un crecimiento micelial algodonoso y pulverulento, manteniendo una coloración blanca homogénea durante todo el periodo de incubación. El desarrollo micelial fue ligeramente más lento en comparación con M. anisopliae, alcanzando un diámetro promedio de colonia de 2,8 cm al tercer día. Estas características macroscópicas confirman un crecimiento estable y adecuado para su aplicación experimental.

La identificación microscópica de B. bassiana evidenció hifas hialinas septadas y conidióforos ensanchados en la base, con un raquis en zigzag donde se disponían conidios globosos, confirmando la identidad de la cepa antes de su uso en los bioensayos (Figura 3).

Efectividad acaricida de los tratamientos sobre Rhipicephalus microplus

El bioensayo in vitro demostró una marcada actividad acaricida de los hongos entomopatógenos evaluados, observándose diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p < 0,05). El grupo control (T4), tratado únicamente con agua destilada estéril y Tween 80 al 0,05 %, no presentó mortalidad durante los 13 días de evaluación, manteniendo las garrapatas movilidad normal y ausencia de signos de micosis. Este resultado confirma que las condiciones experimentales no fueron letales y que la mortalidad registrada en los tratamientos experimentales fue atribuible exclusivamente a la acción de los hongos.

El tratamiento con Beauveria bassiana (T2) mostró un efecto acaricida progresivo, con inicio de mortalidad a partir del cuarto día post-tratamiento. La mortalidad acumulada alcanzó un 33,33 % al día 7 y un valor final de 73,33 % ± 5,77 % al día 13. Los individuos muertos presentaron una colonización micelial blanquecina característica, confirmando la acción patogénica del hongo sobre las garrapatas (Figura 4).

El tratamiento con Metarhizium anisopliae (T1) demostró una virulencia significativamente mayor en comparación con B. bassiana. Las primeras garrapatas muertas se observaron al tercer día. La tasa de mortalidad fue considerablemente más rápida, llegando al 80 % al día 7 y alcanzando el 100 % de mortalidad al día 9. Este resultado es consistente con los hallazgos (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/), quienes también reportaron una alta patogenicidad de cepas de M. anisopliae contra esta misma especie de garrapata. La colonización de los cadáveres fue evidente, con un micelio verde oscuro cubriendo completamente los cuerpos.

De manera destacada, el tratamiento combinado (T3), que empleó una suspensión de ambos hongos, exhibió un potente efecto sinérgico, superando la eficacia de los tratamientos individuales. La mortalidad en este grupo fue la más rápida y contundente, iniciándose al segundo día y alcanzando el 100 % de la población de garrapatas en tan solo 5 días. El análisis estadístico (Tukey, p<0,05) confirmó que la eficacia de la sinergia fue significativamente superior a la de M. anisopliae (T1) y B. bassiana (T2) a partir del tercer día de evaluación. La rápida letalidad sugiere que la combinación de los mecanismos patogénicos de ambos hongos, posiblemente a través de un repertorio enzimático y tóxico más diverso, superó las defensas de la garrapata de manera más eficiente. La colonización post-mortem en este grupo mostró un crecimiento micelial mixto, con áreas blancas y verdes sobre los tegumentos de las garrapatas. El orden de efectividad de los tratamientos fue claramente T3 > T1 > T2 > T4.

Los resultados en este estudio confirman la alta susceptibilidad de Rhipicephalus microplus a la infección por los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana bajo condiciones in vitro, evidenciando diferencias significativas en la velocidad y magnitud de la mortalidad inducida por cada tratamiento. La elevada virulencia observada para M. anisopliae, que alcanzó el 100 % de mortalidad en nueve días, concuerda con reportes previos que destacan la eficiencia de esta especie frente a R. microplus y otras garrapatas de importancia veterinaria (1212. Martínez-García, J.; Abad-Zavaleta, J.; García-Gómez, M.J.; Núñez-Gaona, O. In Vitro evaluation of the acaricidal potential of Beauveria Bassiana DS3.17 on the common tick (Rhipicephalus Microplus) in Oaxaca, México. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias 2023, 14, 644-657. Available from: doi: http://doi.org/10.22319/rmcp.v14i3.6265. ,1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/). Por su parte, B. bassiana mostró una acción más gradual, alcanzando una mortalidad final del 73,33 %, comportamiento consistente con estudios que describen una patogenicidad moderada pero sostenida de esta especie fúngica (1212. Martínez-García, J.; Abad-Zavaleta, J.; García-Gómez, M.J.; Núñez-Gaona, O. In Vitro evaluation of the acaricidal potential of Beauveria Bassiana DS3.17 on the common tick (Rhipicephalus Microplus) in Oaxaca, México. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias 2023, 14, 644-657. Available from: doi: http://doi.org/10.22319/rmcp.v14i3.6265. ,1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.).

El hallazgo más relevante de la presente investigación es la marcada aceleración de la mortalidad observada en el tratamiento sinérgico, en el cual la combinación de M. anisopliae y B. bassiana permitió alcanzar el 100 % de mortalidad en un periodo significativamente menor (cinco días) en comparación con los tratamientos individuales. Este resultado sugiere que la acción conjunta de ambos entomopatógenos no solo incrementa la eficacia acaricida, sino que reduce de manera sustancial el tiempo requerido para el control de la población parasitaria, aspecto de alta relevancia para su aplicación práctica.

El efecto sinérgico observado puede explicarse por la complementariedad de los mecanismos de infección y patogenicidad de ambos hongos. Se ha descrito que M. anisopliae produce un amplio repertorio de enzimas hidrolíticas, como proteasas, quitinasas y lipasas, así como metabolitos secundarios del grupo de las destruxinas, los cuales facilitan una rápida penetración de la cutícula y alteran la homeostasis fisiológica del hospedador [14]. En contraste, B. bassiana se caracteriza por la producción de metabolitos como la beauvericina y por un patrón de colonización que, aunque más lento, compromete de manera progresiva la integridad tisular del artrópodo (1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.). La aplicación simultánea de ambos hongos podría generar una degradación cuticular más eficiente y una sobrecarga tóxica que supere con mayor rapidez las defensas inmunológicas de R. microplus.

Estudios previos han evaluado de manera independiente el uso de M. anisopliae y B. bassiana para el control de R. microplus tanto en condiciones de laboratorio como en ensayos de campo, reportando niveles variables de eficacia (1515. Alarcon, L.E. Efecto de Beauveria Bassiana A21 y Metarhizium Anisopliae A13 sobre Rhipicephalus Microplus En Laboratorio y Campo. 2023. Available from: https://dspace.espoch.edu.ec/items/49269b3c-19bc-4a3f-b66e-d4f3ae812e13). Sin embargo, la mayoría de estos trabajos no aborda de forma directa la evaluación de sinergias entre entomopatógenos, limitándose a comparaciones individuales de cepas o concentraciones. En este sentido, los resultados del presente estudio aportan evidencia experimental que respalda la hipótesis de que la combinación de ambos hongos potencia la actividad acaricida, lo que representa un avance relevante en el desarrollo de estrategias de biocontrol más eficientes.

La ausencia total de mortalidad en el grupo control confirma que las condiciones experimentales no influyeron negativamente en la supervivencia de las garrapatas y que la mortalidad registrada en los tratamientos experimentales se debió exclusivamente a la acción de los hongos entomopatógenos. Este aspecto refuerza la validez interna del bioensayo y la confiabilidad de los resultados obtenidos.

Desde una perspectiva aplicada, la rápida acción observada en el tratamiento sinérgico adquiere especial importancia frente a los problemas actuales de resistencia a acaricidas químicos, ampliamente documentados en poblaciones de R. microplus (19). La formulación de bioacaricidas basados en la combinación de M. anisopliae y B. bassiana podría contribuir a reducir la presión de selección ejercida por los productos químicos convencionales, disminuir la contaminación ambiental y mejorar la sostenibilidad de los sistemas ganaderos. No obstante, es importante considerar que los resultados obtenidos corresponden a condiciones in vitro, por lo que su extrapolación a escenarios de campo debe realizarse con cautela.

En este sentido, futuros estudios deberían enfocarse en la evaluación de esta sinergia bajo condiciones in vivo, considerando variables ambientales, interacción con el hospedador y persistencia del inóculo fúngico, con el fin de validar su eficacia y viabilidad como herramienta de manejo integrado de R. microplus.

Study area

The field phase of the research was carried out at the "Don Julio" cattle farm, located in the rural parish of Pancho Negro, La Troncal canton, Cañar province, Ecuador. The sampling site is georeferenced at coordinates 2°29'34.1"S and 79°27'08.5"W, at an altitude ranging between 40 and 200 meters above sea level. The area has a tropical climate, with an average annual temperature of 30 °C, average annual rainfall of 1239 mm, and relative humidity of 77 %.

The collection of Rhipicephalus microplus specimens was carried out through direct manual sampling on naturally infested crossbred cattle. 150 adult female ticks in the engorgement stage were selected, characterized by their maximum degree of engorgement and low mobility. The selection was based on criteria of size, physical integrity, and absence of visible damage. The collected specimens were carefully placed in sterile plastic vials and were transported under refrigeration conditions to the laboratory of the Faculty of Health and Life Sciences at the Universidad Internacional del Ecuador, Guayaquil campus, for subsequent processing within a period not exceeding 24 hours.

Isolation and reactivation of fungal strains

Commercial strains of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were used. For their reactivation and purification, Potato Dextrose Agar (PDA) culture medium, supplemented with chloramphenicol (0.1 g L) to inhibit bacterial contamination, was employed (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/). Aliquots of the strains were plated on Petri dishes containing PDA medium and incubated in an oven at a controlled temperature of 25 ± 2 °C with a 12:12 hour photoperiod (light:dark) for 15 days. This period allowed complete mycelial development and sporulation of the fungi. Fungal growth was monitored and measured daily during the first three days using a vernier caliper to record colony diameter.

Morphological characterization and preparation of suspensions

Confirmation of the morphological identity of the strains was carried out using a microculture technique. Small portions of the sporulated mycelium were taken with transparent adhesive tape, which were then mounted on a slide with a drop of lactophenol blue as a contrast stain. The preparations were observed under an optical microscope with a 40x objective, analyzing the distinctive characteristics of the hyphae, conidiophores, and conidia of each species.

For the preparation of working suspensions, conidia were harvested from the surface of the PDA cultures by gentle scraping with a sterile Digralsky loop. The collected fungal material was suspended in a sterile distilled water solution with 0.05 % (v/v) Tween 80 as a surfactant agent to facilitate homogeneous dispersion of the conidia. The concentration of the suspensions was determined by counting in a Neubauer chamber and adjusted to a final standardized concentration of 1x10⁸ conidia/mL for all treatments (1313. García, J.A.C. Beauveria Bassiana para control biológico de Rhipicephalus Microplus en ganado bovino. Tesis de pregrado, Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, 2023. Available from: https://rraae.cedia.edu.ec/vufind/Record/ULEAM_8adefd2d2221295ce7a778fa789936eb?sid=3063131,1515. Alarcon, L.E. Efecto de Beauveria Bassiana A21 y Metarhizium Anisopliae A13 sobre Rhipicephalus Microplus En Laboratorio y Campo. 2023. Available from: https://dspace.espoch.edu.ec/items/49269b3c-19bc-4a3f-b66e-d4f3ae812e13).

In vitro synergism bioassay

The bioassay was designed following previously reported immersion methodologies for evaluating the acaricidal activity of entomopathogenic fungi (1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.). The 150 collected ticks were randomly distributed into four experimental treatments, each with three independent biological replicates, composed of 10 ticks per replicate, constituting 30 ticks per treatment.

The evaluated treatments were as follows:

Ticks were immersed in their respective suspensions for 30 seconds, subsequently they were dried at room temperature on sterile absorbent paper, and placed individually in 90 mm diameter Petri dishes with moistened filter paper to maintain relative humidity above 80 %. The dishes were sealed with parafilm and incubated at 27 ± 1 °C, under a 12:12 h photoperiod.

Evaluation of mortality and statistical analysis

Tick mortality was evaluated daily from day 3 to day 13 post-treatment. A tick was considered dead when it showed no motor response to stimulus with a fine brush and characteristic mycelial growth of the entomopathogenic fungus was evident on the cuticle (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/).

Cumulative mortality percentages were transformed using the arcsine square root function to meet normality assumptions. Subsequently, the data were analyzed using analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey's mean comparison test, considering a significance level of p < 0.05. Statistical analysis was performed using InfoStat software version 2020.

Growth and characterization of entomopathogenic fungi

The reactivation of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana strains on Potato Dextrose Agar (PDA) medium confirmed their viability, purity, and adequate growth behavior for use in bioassays. In the case of Metarhizium anisopliae, initial whitish mycelial growth was observed, which progressively evolved towards a dark olive-green color as the sporulation process advanced. The colony presented a velvety and compact texture, reaching an average diameter of 3.5 cm after three days of incubation, evidencing a high capacity for colonization of the culture medium (Figure 1).

Microscopic observation confirmed the morphological identity of M. anisopliae, revealing septate hyaline hyphae, branched conidiophores, and cylindrical conidia arranged in dense chains, characteristics consistent with the taxonomic descriptions reported for the species (Figure 2).

For its part, Beauveria bassiana showed cottony and powdery mycelial growth, maintaining a homogeneous white coloration throughout the incubation period. Mycelial development was slightly slower compared to M. anisopliae , reaching an average colony diameter of 2.8 cm by the third day. These macroscopic characteristics confirm stable growth suitable for experimental application.

Microscopic identification of B. bassiana revealed septate hyaline hyphae and conidiophores widened at the base, with a zigzag rachis where globose conidia were arranged, confirming the identity of the strain before its use in the bioassays (Figure 3).

Acaricidal effectiveness of treatments against Rhipicephalus microplus

The in vitro bioassay demonstrated marked acaricidal activity of the evaluated entomopathogenic fungi, with statistically significant differences observed between treatments (p < 0.05). The control group (T4), treated only with sterile distilled water and 0.05 % Tween 80, showed no mortality during the 13 days of evaluation, with ticks maintaining normal mobility and absence of signs of mycosis. This result confirms that the experimental conditions were not lethal and that the mortality recorded in the experimental treatments was exclusively attributable to the action of the fungi.

The treatment with Beauveria bassiana (T2) showed a progressive acaricidal effect, with mortality onset starting from the fourth day post-treatment. Cumulative mortality reached 33.33 % by day 7 and a final value of 73.33 % ± 5.77 % by day 13. Dead individuals exhibited characteristic whitish mycelial colonization, confirming the pathogenic action of the fungus on the ticks (Figure 4).

The treatment with Metarhizium anisopliae (T1) demonstrated significantly higher virulence compared to B. bassiana. The first dead ticks were observed on the third day. The mortality rate was considerably faster, reaching 80 % by day 7 and achieving 100 % mortality by day 9. This result is consistent with the findings (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/), who also reported high pathogenicity of M. anisopliae strains against this same tick species. Colonization of the cadavers was evident, with dark green mycelium completely covering the bodies.

Remarkably, the combined treatment (T3), which used a suspension of both fungi, exhibited a potent synergistic effect, surpassing the efficacy of the individual treatments. Mortality in this group was the fastest and most decisive, beginning on the second day and reaching 100 % of the tick population in just 5 days. Statistical analysis (Tukey, p<0.05) confirmed that the efficacy of the synergy was significantly superior to that of M. anisopliae (T1) and B. bassiana (T2) from the third day of evaluation. The rapid lethality suggests that the combination of the pathogenic mechanisms of both fungi, possibly through a more diverse enzymatic and toxic repertoire, overcame the tick's defenses more efficiently. Post-mortem colonization in this group showed mixed mycelial growth, with white and green areas on the tick teguments. The order of effectiveness of the treatments was clearly T3 > T1 > T2 > T4.

The results of this study confirm the high susceptibility of Rhipicephalus microplus to infection by the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana under in vitro conditions, evidencing significant differences in the speed and magnitude of mortality induced by each treatment. The high virulence observed for M. anisopliae, which reached 100 % mortality in nine days, agrees with previous reports highlighting the efficiency of this species against R. microplus and other ticks of veterinary importance (1212. Martínez-García, J.; Abad-Zavaleta, J.; García-Gómez, M.J.; Núñez-Gaona, O. In Vitro evaluation of the acaricidal potential of Beauveria Bassiana DS3.17 on the common tick (Rhipicephalus Microplus) in Oaxaca, México. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias 2023, 14, 644-657. Available from: doi: http://doi.org/10.22319/rmcp.v14i3.6265. ,1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/). For its part, B. bassiana showed a more gradual action, reaching a final mortality of 73.33 %, a behavior consistent with studies that describe moderate but sustained pathogenicity of this fungal species (1212. Martínez-García, J.; Abad-Zavaleta, J.; García-Gómez, M.J.; Núñez-Gaona, O. In Vitro evaluation of the acaricidal potential of Beauveria Bassiana DS3.17 on the common tick (Rhipicephalus Microplus) in Oaxaca, México. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias 2023, 14, 644-657. Available from: doi: http://doi.org/10.22319/rmcp.v14i3.6265. ,1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.).

The most relevant finding of the present research is the marked acceleration of mortality observed in the synergistic treatment, in which the combination of M. anisopliae and B. bassiana achieved 100 % mortality in a significantly shorter period (five days) compared to individual treatments. This result suggests that the combined action of both entomopathogens not only increases acaricidal efficacy but also substantially reduces the time required for control of the parasitic population, an aspect of high relevance for its practical application.

The observed synergistic effect can be explained by the complementarity of the infection and pathogenicity mechanisms of both fungi. It has been described that M. anisopliae produces a broad repertoire of hydrolytic enzymes, such as proteases, chitinases, and lipases, as well as secondary metabolites from the destruxin group, which facilitate rapid cuticle penetration and alter the physiological homeostasis of the host (1414. Jiménez-Martínez, E.; López, J.; Ucn, F.; Bravo, G.; Guilén, E.; Gutierrez, R. Potencial acaricida de Beauveria Bassiana y Metarhizium Anisopliae sobre la garrapata bovina Rhipicephalus Microplus En Nicaragua. 2024. Available from: https://repositorio.ucn.edu.ni/id/eprint/51/). In contrast, B. bassiana is characterized by the production of metabolites such as beauvericin and a colonization pattern that, although slower, progressively compromises the arthropod's tissue integrity (1616. Yari Briones, D.I.; Paredes-Valderrama, J.R.; Milla Pino, M.E.; Murga Valderrama, N.L. Efecto del hongo entomopatógeno Beauveria Bassiana en el control de garrapatosis en ganado bovino. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 2021, 32. Available from: doi: http://doi.org/10.15381/rivep.v32i5.19586.). The simultaneous application of both fungi could generate more efficient degradation of the cuticle. In addition, it presented a toxic overload that more quickly overcomes the immune defenses of R. microplus.

Previous studies have independently evaluated the use of M. anisopliae and B. bassiana for the control of R. microplus both under laboratory conditions and in field trials, reporting variable levels of efficacy (1515. Alarcon, L.E. Efecto de Beauveria Bassiana A21 y Metarhizium Anisopliae A13 sobre Rhipicephalus Microplus En Laboratorio y Campo. 2023. Available from: https://dspace.espoch.edu.ec/items/49269b3c-19bc-4a3f-b66e-d4f3ae812e13). However, most of these works do not directly address the evaluation of synergies between entomopathogens, limiting themselves to individual comparisons of strains or concentrations. In this sense, the results of the present study provide experimental evidence supporting the hypothesis that the combination of both fungi enhances acaricidal activity, representing a relevant advance in the development of more efficient biocontrol strategies.

The total absence of mortality in the control group confirms that the experimental conditions did not negatively influence tick survival and that the mortality recorded in the experimental treatments was due exclusively to the action of the entomopathogenic fungi. This aspect reinforces the internal validity of the bioassay and the reliability of the results obtained.

From an applied perspective, the rapid action observed in the synergistic treatment acquires special importance in the face of current problems of resistance to chemical acaricides, widely documented in populations of R. microplus (19). The formulation of bioacaricides based on the combination of M. anisopliae and B. bassiana could contribute to reducing the selection pressure exerted by conventional chemical products, decreasing environmental contamination, and improving the sustainability of livestock systems. However, it is important to consider that the results obtained correspond to in vitro conditions, so their extrapolation to field scenarios should be done with caution.

In this sense, future studies should focus on evaluating this synergy under in vivo conditions, considering environmental variables, interaction with the host, and persistence of the fungal inoculum, in order to validate its efficacy and viability as an integrated management tool for R. microplus.