Introducción

El cultivo de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) es uno de los más importantes en Ecuador, debido a su contribución a la economía agrícola y a la elevada producción de azúcar (11. García R, Guevara DAS, Poma JPP, Sancho D, Sarabia D, Heredia FJM. Utilización de tres métodos químicos para la conservación de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.), variedad POJ 93, en Pastaza, Ecuador. La Técnica. 2018;(19):61-74. Available from: https://doi.org/10.33936/la_tecnica.v0i19.1308 ). A pesar de ello, la necrosis foliar, una afección común que afecta el rendimiento y la calidad, se ha convertido en una amenaza importante en las últimas décadas (22. Hoang AT, Lam TT, Thi HTP, Nguyen Thi H, Pham HP, Doan Thi L,et al. Identification of Nigrospora sphaerica and Curvularia lunata as causal agents of leaf spot disease in cantaloupe (Cucumis melo L.) in Southern Vietnam. Australas Plant Pathol. 2025;1-10. Available from: https://doi.org/10.1007/s13313-025-01028-3 ). Identificar los patógenos que causan esta enfermedad es esencial para un manejo eficaz del cultivo y una producción sostenible (33. LaO Hechavarria M de la L. Genotipificación y fuentes de resistencia de los agentes causales de virus del mosaico y hoja amarilla de la caña de azúcar. An La Acad Ciencias Cuba [Internet]. 2018;18(1):1-6. Available from: https://revistaccuba.sld.cu/index.php/revacc/article/view/363 ).

Estos hongos fitopatógenos son responsables de diversas enfermedades, por lo que su detección temprana para un manejo oportuno evitaría pérdidas significativas de rendimiento (44. Aliya SSS, Nusaibah SA, Mahyudin MM, Yusop MR. Pathogenicity, enzymatic assays, and differential metabolomics to assess the virulence of fungal pathogens responsible for complex circular leaf spot (CCLS) disease of rubber trees in Malaysia. Physiol Mol Plant Pathol. 2025;136:102582. Available from: https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2025.102582 ). El Centro Ecuatoriano de Investigación en Caña de Azúcar (CINCAE) ha desempeñado un papel fundamental en la mejora de la producción de caña de azúcar (55. Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Ecuador (CINCAE). Manejo de enfermedades [Internet]. 2026. Available from: https://cincae.org/areas-de-investigacion/manejo-de-enfermedades/ ). Sin embargo, su enfoque ha estado más orientado a la agronomía y a la mejora genética, lo que ha generado una brecha significativa en la investigación sobre los microorganismos fitopatógenos que afectan a este cultivo.

Existe información limitada sobre fitopatógenos en las nuevas variedades de cultivo de caña de azúcar, lo que limita el establecimiento de un manejo de control efectivo (66. Arauz EEC, Gaitán YYG, Gómez IES, Estrada SPC. Diagnóstico de enfermedades bacterianas en el cultivo de café (Coffea arabica L.) y sensibilidad in vitro a bactericidas de uso agrícola. La Calera. 2023;23(40). Available from: https://doi.org/10.5377/calera.v23i40.15831 ). La necrosis foliar se manifiesta como muerte localizada o generalizada de la hoja, lo que afecta la fotosíntesis de la planta y puede provocar efectos secundarios como detención del crecimiento, marchitamiento e incluso hasta la muerte de la planta (22. Hoang AT, Lam TT, Thi HTP, Nguyen Thi H, Pham HP, Doan Thi L,et al. Identification of Nigrospora sphaerica and Curvularia lunata as causal agents of leaf spot disease in cantaloupe (Cucumis melo L.) in Southern Vietnam. Australas Plant Pathol. 2025;1-10. Available from: https://doi.org/10.1007/s13313-025-01028-3 ). Un enfoque multidisciplinario que involucre microbiología, fitopatología y biología molecular puede generar una comprensión más profunda de las interacciones entre la caña de azúcar y sus patógenos (77. Jeger M, Beresford R, Bock C, Brown N, Fox A, Newton A, et al. Global challenges facing plant pathology: multidisciplinary approaches to meet the food security and environmental challenges in the mid-twenty-first century. CABI Agric Biosci. 2021;2(1):1-18. Available from: https://doi.org/10.1186/s43170-021-00042-x ).

La diversidad de ecosistemas de Ecuador, combinada con variaciones climáticas y prácticas agrícolas deficientes, crea un entorno favorable para la aparición de nuevas amenazas fitopatológicas (88. Castillo Carrillo CI. Biodiversity in Ecuador and its immense potential for agricultural pest control. In: Agricultural, Forestry and bioindustry biotechnology and biodiscovery. springer; 2020. p. 143-61. Available from: https://doi.org/10.1007/978-3-030-51358-0_9 ). Comprender la dinámica de las enfermedades fúngicas y su impacto en la salud del cultivo es fundamental para desarrollar estrategias de control eficaces (99. Martínez G, Rey JC, Pichardo REP, Manzanilla EE. Marchitez por Fusarium raza tropical 4: Estado actual y presencia en el continente americano. Agron Mesoam [Internet]. 2020;31(1):259-76. Available from: http://dx.doi.org/10.15517/am.v31i1.37925 ). Por lo tanto, es esencial establecer una relación entre los síntomas observados y los patógenos causantes (1010. Guerrero AMC, González M. Micorrizas Autóctonas como Indicadores de Salud y Calidad del Suelo. RECITIUTM [Internet]. 2024;10(2):51-64. Available from: http://201.249.78.46/index.php/recitiutm/article/view/265/pdf ).

Diversas especies fúngicas están asociadas con una variedad de enfermedades que pueden provocar pérdidas en las gramíneas; Aspergillus sp., conocido por su producción de micotoxinas, afecta la calidad de la gramínea y la salud del suelo (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ). En contraste, Curvularia sp., se asocia con enfermedades que causan manchas foliares, reduciendo el rendimiento en maíz y trigo (1212. Khan NA, Asaf S, Ahmad W, Jan R, Bilal S, Khan I, et al. Diversity, lifestyle, genomics, and their functional role of Cochliobolus, Bipolaris, and Curvularia species in environmental remediation and plant growth promotion under biotic and abiotic stressors. J Fungi. 2023;9(2):254. Available from: https://doi.org/10.3390/jof9020254 ). Rhinocladiella sp., también se ha convertido en un patógeno de alto interés debido a su incidencia en cultivos de gramíneas, causando estrés en las plantas y afectando su fisiología (1313. Li L, Zhang X, Tan X, Sun B, Wu B, Yu M, et al. Rhinoclactones AE, resorcylic acid analogs from desert plant endophytic fungus Rhinocladiella similis. Molecules. 2019;24(7):1405. Available from: https://doi.org/10.3390/molecules24071405 ).

Así mismo, Fusarium sp., es un fitopatógeno que ha atraído el interés de la comunidad científica, principalmente por su impacto en cultivos agrícolas, especialmente aquellos de importancia económica como lo es la caña azucarera (1414. Zhong J, Situ J, He C, He J, Kong G, Li H, et al. A virulent milRNA of Fusarium oxysporum f. sp. cubense impairs plant resistance by targeting banana AP2 transcription factor coding gene MaPTI6L. Hortic Res. 2025;12(4):uhae361. Available from: https://doi.org/10.1093/hr/uhae361 ). Este patógeno se asocia con pudrición de raíces, marchitez y amarillamiento de las plantas, conduciendo en última instancia a pérdidas de rendimiento (1515. Badiwe M, Fialho RO, Stevens C, Lombard P-H, van Niekerk J. Fusarium species associated with diseases of Citrus: A comprehensive review. J Fungi. 2025;11(4):263. Available from: https://doi.org/10.3390/jof11040263 ). Investigaciones actuales han mostrado que Fusarium no solo afecta la salud vegetal, sino que también compromete la seguridad alimentaria mediante la producción de sus micotoxinas dañinas (1616. Solórzano-Solórzano JA, Zambrano SMV, Olmedo JBV. Fusarium spp. en el cultivo de maíz: Identificación, distribución geográfica, sintomatología, micotoxinas, ciclo de la enfermedad, control, y desafíos actuales y futuros. Sci Agropecu. 2024;15(4):537-56. Available from: http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2024.040 ). Nigrospora osmanthi es un hongo fitopatógeno que causa pérdidas significativas en cultivos de gramíneas (1717. Yang K, Yang X, Li M, Li D, Huang X, Li C. Occurrence of Nigrospora osmanthi causing leaf spot on Artemisia argyi in China. Crop Prot. 2025;191:107142. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2025.107142 ). Posee la capacidad de adaptarse a diversas condiciones ambientales, lo que presenta desafíos en el control del patógeno (1818. Ugalde-Monge B, Artavia-Carmona R, Hilje-Rodríguez I, Peraza-Padilla W. Identificación morfológica y molecular de potenciales hongos nematófagos en fincas bananeras de la región huetar atlántica de Costa Rica. Agron Costarric. 2024;48(2):111-31. Available from: https://doi.org/10.15517/rac.v48i2.62489 ).

En este contexto, la sostenibilidad del cultivo de caña de azúcar en Ecuador y los medios de vida de los agricultores están en riesgo, lo que subraya la necesidad de priorizar estudios microbiológicos y fitopatológicos orientados a identificar los patógenos que afectan este cultivo y mitigar su impacto. El estudio tuvo como objetivo identificar los agentes fúngicos causales asociados con manchas necróticas en hojas de caña de azúcar de la variedad EC-08.

Materiales y Métodos

Se recolectaron hojas con síntomas de manchas foliares de caña de azúcar del cultivar EC-08 (Figura 1) en la finca “Agrícola Cepeda S.A.”, ubicada en La Puntilla, cantón La Troncal, provincia de Cañar, Ecuador, georreferenciada en las coordenadas (2°26'18.74" S, 79°23'45.54" W), a una altitud de 110 m.s.n.m. La propiedad abarca una superficie de 450 hectáreas y se caracteriza por una topografía completamente plana y suelos franco-limosos. Las muestras de hojas con síntomas de necrosis se tomaron en cuatro parcelas diferentes.

Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias e Ingeniería de la Universidad Estatal de Milagro (UNEMI). La preparación de la muestra vegetal consistió en cortar los tejidos en piezas de 3 cm², lavarlas con jabón líquido neutro y enjuagarlas con agua destilada. A continuación, las muestras se desinfectaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 % durante 2 minutos, se realizaron enjuagues consecutivos en agua estéril y se introdujeron en etanol al 70 % durante 1 minuto. Posteriormente, las muestras se trasladaron a una cámara de seguridad estéril (BIOBASE FH1200), donde se cortaron en fragmentos de 5 mm² a la altura de la vena foliar e inocularon en placas de Petri con agar dextrosa de papa (PDA) a una dosis de 39 g·L⁻¹. Las placas se incubaron a 28 °C durante 10 días para su posterior purificación.

Los micelios fúngicos de los cultivos iniciales se transfirieron a nuevas placas de Petri con PDA, según sus características colorimétricas, para su purificación. Estas se incubaron a la misma temperatura durante 14 días. Este proceso dio como resultado cuatro placas con cepas puras para la identificación del género por caracterización morfológica con la técnica de tinción con azul de lactofenol, para la posterior identificación de la especie por técnicas moleculares.

Tres de los cultivos purificados, codificados como H700, H701 y H769 fueron identificados molecularmente mediante extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN), amplificados por fragmentos espaciador transcrito interno (ITS), secuenciación convencional, ensamblaje de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y búsqueda en bases de datos. El procedimiento se llevó a cabo de la siguiente manera.

La extracción de ADN se realizó mediante métodos convencionales (1919. Vera-Rodríguez JH, Villamar-Aveiga MR, Herrera-Feijoo RJ, Sevilla-Carrasco JD, Moreno D, Gavin-Moyano CS, et al. Detection of Diaporthe sp. in cacao plants (cv. CCN 51) in Guayas Province, Ecuador. Rev Fac Agron Univ Zulia. 2025;42(4). Available from: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v42.n4.III ) con aproximadamente 100 mg de muestra. La integridad y calidad del ADN se evaluaron mediante espectrofotometría de microvolúmen y visualización en gel agarosa de poliacrilamida al 1 %. A una concentración de 20 ng·μL⁻¹, el ADN se diluyó para la amplificación por PCR utilizando los cebadores ITS1/ITS4 (2020. Ćurčić NŽ, Miljanić JA, Bočarov SAS, Vukelić ID, Bodroža SMI. PCR-RFLP method in combination with on-chip electrophoresis as a tool for determining of variability between important species of Aspergillus. Food Feed Res. 2024;51(1):31-9. Available from: https://doi.org/10.5937/ffr0-49318 ). El producto final de la PCR se purificó y secuenció mediante el método de Sanger. Las secuencias obtenidas se limpiaron y ensamblaron con el software bioinformático Geneious (versión 11.1.2). Las secuencias ensambladas se compararon con las de la base de datos GenBank de NCBI para la identificación taxonómica, empleando la herramienta BLAST para encontrar similitudes.

Se realizó un análisis del perfil taxonómico de la región ITS mediante secuenciación masiva de alto rendimiento (metabarcoding) en las muestras purificadas etiquetadas como H631 y H710. Este análisis incluyó la extracción de ADN y el metabarcoding del ITS, como se detalla a continuación:

Aproximadamente 500 mg de cada micelio fúngico aislado de la muestra de tejido foliar afectado, se utilizaron para la extracción de ADN mediante métodos convencionales. La calidad del ADN extraído se evaluó mediante espectrofotometría con NanoDrop. La integridad del ADN se verificó por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1 %. Tras la evaluación de calidad, las secuencias objetivo se amplificaron utilizando cebadores ITS (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA y TCCTCCGCTTATTGATATGC) específicos para hongos. Los productos de PCR resultantes se purificaron, cuantificaron y agruparon para la preparación de la biblioteca. Se realizó control de calidad de las bibliotecas, y aquellas que cumplieron los criterios, se procesaron para su secuenciación en la plataforma Illumina. Las lecturas resultantes se limpiaron, ensamblaron y contabilizaron mediante herramientas bioinformáticas. Se eliminaron las secuencias quiméricas y las secuencias finales se identificaron mediante BLAST, utilizando un umbral de identidad del 97 % frente a la base de datos UNITE de hongos. Los resultados se visualizaron mediante gráficos Krona.

Resultados y Discusión

La Figura 2 muestra la caracterización morfológica de los hongos fitopatógenos aislados en las muestras de tejido necrótico foliar de la caña de azúcar.

La caracterización morfológica de los aislados permitió identificar estructuras importantes en la aproximación al género de los hongos aislados (Curvularia sp. y Aspergillus sp.) comparados con códigos taxonómicos de literatura publicada. Curvularia sp tuvo un crecimiento de textura algodonosa de color oscuro melanizada, presenta hifas tipo dematiácea de color oscura, sus estructuras con forma macroconidias tabicadas, sus conidios son de forma curva en forma de celdas desiguales. Aspergillus sp tuvo un crecimiento con textura granulosa de color blanca, sus hifas hialinas de color más clara con conidióforos con cabeza conidial en forma de vesícula, sus conidios son pequeñas y redondas.

Las características encontradas son concordantes con lo publicado por literatura científica, Curvularia posee un micelio de crecimiento rápido y macroconidias multiseptadas con una célula central prominente y curvada (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ), mientras que, el género Aspergillus presenta una morfología hialina, se caracteriza por la presencia de fialides con forma radial (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ). Estas características fenotípicas permiten realizar una aproximación hacia el agente causal de enfermedades para poder estableces planes de manejo y control en cultivos agrícolas de alto valor económico para los productores.

La caracterización molecular de las cepas fúngicas aisladas mediante el método ITS confirmó la presencia de ADN de alta calidad, apto para el proceso de amplificación (Figura 3).

Se visualizaron bandas de 536 pares de bases para la muestra H700, mientras que 535 pb en la muestra H701 y 529 pb en la muestra H769 corresponden al marcador ITS. A partir de las lecturas obtenidas por secuenciación SANGER se generaron secuencias ensambladas que permitieron determinar la identificación de las especies fúngicas, como se describe en la Tabla 1.

Con la identificación molecular se puede confirmar con precisión cual es el agente causal que afecta a este cultivo en Ecuador. En este estudio se identificaron tres especies fúngicas predominantes mediante el método de código de barras ITS: A. arachidicola, C. petersonii y Rhinocladiella sp. Este método es reconocido por su eficacia en la identificación taxonómica de organismos fúngicos, lo que permite la determinación precisa de las especies implicadas en la patogenicidad (2121. Paloi S, Luangsa-Ard JJ, Mhuantong W, Stadler M, Kobmoo N. Intragenomic variation in nuclear ribosomal markers and its implication in species delimitation, identification and barcoding in fungi. Fungal Biol Rev. 2022;42:1-33. Available from: https://doi.org/10.1016/j.fbr.2022.04.002 ).

La presencia de A. arachidicola es particularmente significativa, ya que este hongo se asocia con la producción de compuestos tóxicos que pueden afectar gravemente la seguridad del cultivo y de los alimentos. Investigaciones publicadas han mostrado que la presencia de este hongo en los cultivos puede provocar pérdidas económicas sustanciales debido a la reducción del rendimiento y la calidad de la caña de azúcar (2222. Moore GG, Mack BM, Beltz SB, Puel O. Genome sequence of an aflatoxigenic pathogen of Argentinian peanut, Aspergillus arachidicola. BMC Genomics. 2018;19(1):189. Available from: https://doi.org/10.1186/s12864-018-4576-2 ). Por tanto, la identificación precisa del patógeno es esencial para implementar estrategias de manejo eficaces.

C. petersonii es conocido como un hongo fitopatógeno que contribuye a la necrosis foliar en cultivares de gramíneas. Se ha demostrado que este hongo puede afectar negativamente la fotosíntesis y, en consecuencia, reducir la producción de biomasa vegetal (2323. Iturrieta-González I, Gené J, Wiederhold N, García D. Three new Curvularia species from clinical and environmental sources. MycoKeys. 2020;68:1. Available from: https://doi.org/10.3897/mycokeys.68.51667 ). Curvularia spp es un género que representa un desafío para la agricultura y subraya la necesidad de monitorear y gestionar las condiciones ambientales que favorecen su proliferación (2424. Tan YP, Crous PW, Shivas RG. Cryptic species of Curvularia in the culture collection of the Queensland Plant Pathology Herbarium. MycoKeys. 2018;(35):1. Available from: https://doi.org/10.3897/mycokeys.35.25665 ).

La presencia de Rhinocladiella sp entre los aislados fúngicos identificados indica una diversidad de organismos potencialmente implicados en la enfermedad. Se ha reportado que puede causar diversas patologías en plantas (2525. Madrid H, Hernandez-Restrepo M, Gené J, Cano J, Guarro J, Silva V. New and interesting chaetothyrialean fungi from Spain. Mycol Prog. 2016;15(10):1179-201. Available from: https://doi.org/10.1007/s11557-016-1239-z , 2626. Crous PW, Wingfield MJ, Schumacher RK, Akulov A, Bulgakov TS, Carnegie AJ, et al. New and interesting fungi. 3. Fungal Syst Evol. 2020;6:157. Available from: https://doi.org/10.3114/fuse.2018.01.08 ). Estos hallazgos resaltan la necesidad de un enfoque integrado para el manejo de enfermedades fúngicas, que incluya vigilancia continua y el uso de métodos de identificación molecular.

La muestra H710 fue sometida a un perfil taxonómico de la región ITS mediante secuenciación masiva de alto rendimiento (Tabla 2).

La concentración y calidad adecuadas del ADN obtenidas de los aislados fúngicos para la preparación de bibliotecas y la posterior secuenciación metagenómica mediante metabarcoding del ITS son evidentes. Los resultados de la búsqueda BLAST para la identificación de hongos a nivel de género y especie se presentan en los gráficos Krona (Figuras 4 y 5) para el Phylum Ascomycota, lo que permite un análisis interactivo de los resultados.

Los resultados indican que la muestra H710, dentro del Phylum Ascomycota, presentó un predominio del 100 % para la especie Fusarium pseudoanthophilum, mientras que la muestra H631 fue 97 % predominante para Nigrospora osmanthi.

Los resultados obtenidos para la muestra H710 resaltan la relevancia de este hongo en el contexto vegetal. F. pseudoanthophilum ha sido reconocido por su capacidad para causar enfermedades en cultivos (podría mencionarse cuales para notar la amplitud de estos o su cercanía con caña de azúcar), lo que subraya la importancia de su identificación para el manejo eficaz de fitopatógenos. Investigaciones han documentado que este hongo puede asociarse con marchitez y enrojecimiento foliar en varias especies vegetales, afectando negativamente la producción agrícola (2727. Amobonye A, Bhagwat P, Ranjith D, Mohanlall V, Pillai S. Characterization, pathogenicity and hydrolytic enzyme profiling of selected Fusarium species and their inhibition by novel coumarins. Arch Microbiol. 2021;203(6):3495-508. Available from: https://doi.org/10.1007/s00203-021-02335-1 ).

N. osmanthi es un hongo fitopatógeno identificado como agente patógeno en diversos cultivos agrícolas (2828. Petrović E, Vrandečić K, Ćosić J, Siber T, Godena S. Antifungal efficacy of essential oils and their predominant components against olive fungal pathogens. Agriculture. 2025;15(3):340. Available from: https://doi.org/10.3390/agriculture15030340 ). Este hongo pertenece al género Nigrospora, que incluye varias especies conocidas por su capacidad de causar daños significativos en plantas (2929. Oskay F, Karataş A. Pinus nigra subsp. pallasiana ve Pinus sylvestris tohumlarında Diplodia sapinea’nın yoğunluğu. Turkish J For. 2021;22(3):218-28. Available from: https://doi.org/10.18182/tjf.799849 ). La identificación y caracterización de N. osmanthi son cruciales para comprender su impacto en la agricultura y desarrollar estrategias de manejo efectivas (1717. Yang K, Yang X, Li M, Li D, Huang X, Li C. Occurrence of Nigrospora osmanthi causing leaf spot on Artemisia argyi in China. Crop Prot. 2025;191:107142. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2025.107142 ).

Estos hallazgos contrastan con el predominio general del Phylum Ascomycota, que incluye muchos de los principales patógenos vegetales. El predominio de Fusarium en este contexto refuerza la necesidad de enfoques específicos de monitoreo y control centrados en este género, especialmente en sistemas agrícolas donde la sanidad vegetal es crítica (3030. Shabeer S, Tahira R, Jamal A. Fusarium spp. mycotoxin production, diseases and their management: An overview. Pakistan J Agric Res. 2021;34(2):278. Available from: https://dx.doi.org/10.17582/journal.pjar/2021/34.2.278.293 ).

Conclusiones

La técnica metabarcoding ITS permitió obtener ADN de alta calidad, lo que facilitó la amplificación y posterior identificación de las especies fúngicas presentes en las muestras analizadas, demostrando la eficacia de las técnicas moleculares para identificar con precisión hongos patógenos.

Las secuencias obtenidas mediante secuenciación Sanger confirmaron la existencia de las especies específicas: A. arachidicola, C. petersonii y Rhinocladiella sp., aportando información relevante sobre la diversidad de hongos patógenos en los tejidos foliares de la variedad EC-08 de caña de azúcar estudiada.

El análisis por secuenciación masiva de las muestras H710 y H631 reveló un predominio del 100 % de F. pseudoanthophilum y del 97 % de N. osmanthi, respectivamente, dentro del Phylum Ascomycota. Por tanto, estas especies serían las responsables de causan necrosis foliar en el cultivo de caña de azúcar.

La información derivada de esta investigación tiene importantes implicaciones para el manejo de los cultivos, ya que la identificación precisa (esto se realiza mediante pruebas de patogenicidad y completar los postulados de Koch), aquí es una mera suposición de los hongos patógenos puede facilitar el desarrollo de estrategias de control eficaces que mejoren la sanidad del cultivo. Sugiriendo evaluar el grado de patogenicidad de estos agentes causales.

Introduction

Sugarcane (Saccharum officinarum L.) cultivation is one of the most important in Ecuador, due to its contribution to the agricultural economy and high sugar production (11. García R, Guevara DAS, Poma JPP, Sancho D, Sarabia D, Heredia FJM. Utilización de tres métodos químicos para la conservación de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.), variedad POJ 93, en Pastaza, Ecuador. La Técnica. 2018;(19):61-74. Available from: https://doi.org/10.33936/la_tecnica.v0i19.1308 ). Despite this, leaf necrosis, a common condition affecting yield and quality, has become a major threat in recent decades (22. Hoang AT, Lam TT, Thi HTP, Nguyen Thi H, Pham HP, Doan Thi L,et al. Identification of Nigrospora sphaerica and Curvularia lunata as causal agents of leaf spot disease in cantaloupe (Cucumis melo L.) in Southern Vietnam. Australas Plant Pathol. 2025;1-10. Available from: https://doi.org/10.1007/s13313-025-01028-3 ). Identifying the pathogens that cause this disease is essential for effective crop management and sustainable production (33. LaO Hechavarria M de la L. Genotipificación y fuentes de resistencia de los agentes causales de virus del mosaico y hoja amarilla de la caña de azúcar. An La Acad Ciencias Cuba [Internet]. 2018;18(1):1-6. Available from: https://revistaccuba.sld.cu/index.php/revacc/article/view/363 ).

These phytopathogenic fungi are responsible for various diseases, so their early detection for timely management would prevent significant yield losses (44. Aliya SSS, Nusaibah SA, Mahyudin MM, Yusop MR. Pathogenicity, enzymatic assays, and differential metabolomics to assess the virulence of fungal pathogens responsible for complex circular leaf spot (CCLS) disease of rubber trees in Malaysia. Physiol Mol Plant Pathol. 2025;136:102582. Available from: https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2025.102582 ). The Ecuadorian Sugarcane Research Center (CINCAE, according its acronyms in Spanish) has played a fundamental role in improving sugarcane production (55. Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Ecuador (CINCAE). Manejo de enfermedades [Internet]. 2026. Available from: https://cincae.org/areas-de-investigacion/manejo-de-enfermedades/ ). However, its focus has been more oriented towards agronomy and genetic improvement, which has created a significant gap in research on phytopathogenic microorganisms affecting this crop.

Limited information exists on phytopathogens in new sugarcane varieties, which limits the establishment of effective control management (66. Arauz EEC, Gaitán YYG, Gómez IES, Estrada SPC. Diagnóstico de enfermedades bacterianas en el cultivo de café (Coffea arabica L.) y sensibilidad in vitro a bactericidas de uso agrícola. La Calera. 2023;23(40). Available from: https://doi.org/10.5377/calera.v23i40.15831 ). Leaf necrosis manifests as localized or generalized leaf death, affecting plant photosynthesis and can lead to secondary effects such as growth arrest, wilting, and even plant death (22. Hoang AT, Lam TT, Thi HTP, Nguyen Thi H, Pham HP, Doan Thi L,et al. Identification of Nigrospora sphaerica and Curvularia lunata as causal agents of leaf spot disease in cantaloupe (Cucumis melo L.) in Southern Vietnam. Australas Plant Pathol. 2025;1-10. Available from: https://doi.org/10.1007/s13313-025-01028-3 ). A multidisciplinary approach involving microbiology, phytopathology, and molecular biology can generate a deeper understanding of the interactions between sugarcane and its pathogens (77. Jeger M, Beresford R, Bock C, Brown N, Fox A, Newton A, et al. Global challenges facing plant pathology: multidisciplinary approaches to meet the food security and environmental challenges in the mid-twenty-first century. CABI Agric Biosci. 2021;2(1):1-18. Available from: https://doi.org/10.1186/s43170-021-00042-x ).

Ecuador's ecosystem diversity, combined with climatic variations and poor agricultural practices, creates a favorable environment for the emergence of new phytopathological threats (88. Castillo Carrillo CI. Biodiversity in Ecuador and its immense potential for agricultural pest control. In: Agricultural, Forestry and bioindustry biotechnology and biodiscovery. springer; 2020. p. 143-61. Available from: https://doi.org/10.1007/978-3-030-51358-0_9 ). Understanding the dynamics of fungal diseases and their impact on crop health is essential for developing effective control strategies (99. Martínez G, Rey JC, Pichardo REP, Manzanilla EE. Marchitez por Fusarium raza tropical 4: Estado actual y presencia en el continente americano. Agron Mesoam [Internet]. 2020;31(1):259-76. Available from: http://dx.doi.org/10.15517/am.v31i1.37925 ). Therefore, establishing a relationship between observed symptoms and the causal pathogens is essential (1010. Guerrero AMC, González M. Micorrizas Autóctonas como Indicadores de Salud y Calidad del Suelo. RECITIUTM [Internet]. 2024;10(2):51-64. Available from: http://201.249.78.46/index.php/recitiutm/article/view/265/pdf ).

Various fungal species are associated with a variety of diseases that can cause losses in grasses; Aspergillus sp., known for its mycotoxin production, affects grass quality and soil health (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ). In contrast, Curvularia sp. is associated with diseases causing leaf spots, reducing yield in corn and wheat (1212. Khan NA, Asaf S, Ahmad W, Jan R, Bilal S, Khan I, et al. Diversity, lifestyle, genomics, and their functional role of Cochliobolus, Bipolaris, and Curvularia species in environmental remediation and plant growth promotion under biotic and abiotic stressors. J Fungi. 2023;9(2):254. Available from: https://doi.org/10.3390/jof9020254 ). Rhinocladiella sp. has also become a pathogen of high interest due to its incidence in grass crops, causing plant stress and affecting their physiology (1313. Li L, Zhang X, Tan X, Sun B, Wu B, Yu M, et al. Rhinoclactones AE, resorcylic acid analogs from desert plant endophytic fungus Rhinocladiella similis. Molecules. 2019;24(7):1405. Available from: https://doi.org/10.3390/molecules24071405 ).

Likewise, Fusarium sp. is a phytopathogen that has attracted the interest of the scientific community, mainly due to its impact on agricultural crops, especially those of economic importance such as sugarcane (1414. Zhong J, Situ J, He C, He J, Kong G, Li H, et al. A virulent milRNA of Fusarium oxysporum f. sp. cubense impairs plant resistance by targeting banana AP2 transcription factor coding gene MaPTI6L. Hortic Res. 2025;12(4):uhae361. Available from: https://doi.org/10.1093/hr/uhae361 ). This pathogen is associated with root rot, wilting, and yellowing of plants, ultimately leading to yield losses (1515. Badiwe M, Fialho RO, Stevens C, Lombard P-H, van Niekerk J. Fusarium species associated with diseases of Citrus: A comprehensive review. J Fungi. 2025;11(4):263. Available from: https://doi.org/10.3390/jof11040263 ). Current research has shown that Fusarium not only affects plant health but also compromises food safety through the production of its harmful mycotoxins (1616. Solórzano-Solórzano JA, Zambrano SMV, Olmedo JBV. Fusarium spp. en el cultivo de maíz: Identificación, distribución geográfica, sintomatología, micotoxinas, ciclo de la enfermedad, control, y desafíos actuales y futuros. Sci Agropecu. 2024;15(4):537-56. Available from: http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2024.040 ). Nigrospora osmanthi is a phytopathogenic fungus causing significant losses in grass crops (1717. Yang K, Yang X, Li M, Li D, Huang X, Li C. Occurrence of Nigrospora osmanthi causing leaf spot on Artemisia argyi in China. Crop Prot. 2025;191:107142. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2025.107142 ). It has the ability to adapt to diverse environmental conditions, which presents challenges for pathogen control (1818. Ugalde-Monge B, Artavia-Carmona R, Hilje-Rodríguez I, Peraza-Padilla W. Identificación morfológica y molecular de potenciales hongos nematófagos en fincas bananeras de la región huetar atlántica de Costa Rica. Agron Costarric. 2024;48(2):111-31. Available from: https://doi.org/10.15517/rac.v48i2.62489 ).

In this context, the sustainability of sugarcane cultivation in Ecuador and the livelihoods of farmers are at risk, underscoring the need to prioritize microbiological and phytopathological studies aimed at identifying the pathogens affecting this crop and mitigating their impact. The study aimed to identify the causal fungal agents associated with necrotic spots on sugarcane leaves of variety EC-08.

Materials and Methods

Sugarcane leaves with symptoms of leaf spots from cultivar EC-08 (Figure 1) were collected at the "Agrícola Cepeda S.A." farm, located in La Puntilla, La Troncal canton, Cañar province, Ecuador, georeferenced at coordinates (2°26'18.74" S, 79°23'45.54" W), at an altitude of 110 m a.s.l. The property covers an area of 450 hectares and is characterized by completely flat topography and silty-loam soils. Leaf samples with necrosis symptoms were taken from four different plots.

The samples were processed at the Microbiology Laboratory of the Faculty of Science and Engineering of the State University of Milagro (UNEMI, according its acronyms in Spanish). Plant sample preparation consisted of cutting the tissues into 3 cm² pieces, washing them with neutral liquid soap, and rinsing them with distilled water. Next, the samples were disinfected with 2 % sodium hypochlorite (NaClO) for 2 minutes, followed by consecutive rinses in sterile water, and then placed in 70 % ethanol for 1 minute. Subsequently, the samples were transferred to a sterile safety cabinet (BIOBASE FH1200), where they were cut into 5 mm² fragments at the leaf vein and inoculated onto Petri dishes containing potato dextrose agar (PDA) at a dose of 39 g·L⁻¹. The plates were incubated at 28 °C for 10 days for subsequent purification.

Fungal mycelia from the initial cultures were transferred to new PDA Petri dishes according to their colorimetric characteristics for purification. These were incubated at the same temperature for 14 days. This process resulted in four plates with pure strains for genus identification through morphological characterization using the lactophenol blue staining technique, followed by species identification using molecular techniques.

Three of the purified cultures, coded H700, H701, and H769, were molecularly identified by DNA extraction, amplification of the internal transcribed spacer (ITS) region, conventional sequencing, assembly of polymerase chain reaction (PCR) products, and database searching. The procedure was carried out as follows:

DNA extraction was performed using conventional methods (1919. Vera-Rodríguez JH, Villamar-Aveiga MR, Herrera-Feijoo RJ, Sevilla-Carrasco JD, Moreno D, Gavin-Moyano CS, et al. Detection of Diaporthe sp. in cacao plants (cv. CCN 51) in Guayas Province, Ecuador. Rev Fac Agron Univ Zulia. 2025;42(4). Available from: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v42.n4.III ) with approximately 100 mg of sample. DNA integrity and quality were assessed by microvolume spectrophotometry and visualization on 1 % agarose polyacrylamide gel. At a concentration of 20 ng·μL⁻¹, the DNA was diluted for PCR amplification using ITS1/ITS4 primers (2020. Ćurčić NŽ, Miljanić JA, Bočarov SAS, Vukelić ID, Bodroža SMI. PCR-RFLP method in combination with on-chip electrophoresis as a tool for determining of variability between important species of Aspergillus. Food Feed Res. 2024;51(1):31-9. Available from: https://doi.org/10.5937/ffr0-49318 ). The final PCR product was purified and sequenced using the Sanger method. The obtained sequences were cleaned and assembled using Geneious bioinformatics software (version 11.1.2). The assembled sequences were compared with the NCBI GenBank database for taxonomic identification using the BLAST tool to find similarities.

A taxonomic profile analysis of the ITS region was performed using high‑throughput massive sequencing (metabarcoding) on purified samples labeled H631 and H710. This analysis included DNA extraction and ITS metabarcoding, as detailed below:

Approximately 500 mg of each fungal mycelium isolated from the affected leaf tissue sample was used for DNA extraction using conventional methods. The quality of the extracted DNA was assessed by spectrophotometry using a NanoDrop. DNA integrity was verified by horizontal electrophoresis on 1 % agarose gel. After quality assessment, the target sequences were amplified using ITS primers (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA and TCCTCCGCTTATTGATATGC) specific for fungi. The resulting PCR products were purified, quantified, and pooled for library preparation. Libraries were quality‑controlled, and those meeting the criteria were processed for sequencing on the Illumina platform. The resulting reads were cleaned, assembled, and counted using bioinformatics tools. Chimeric sequences were removed, and the final sequences were identified using BLAST against the UNITE fungal database with a 97 % identity threshold. The results were visualized using Krona charts.

Results and Discussion

Figure 2 shows the morphological characterization of the phytopathogenic fungi isolated from samples of necrotic leaf tissue of sugarcane.

The morphological characterization of the isolates allowed the identification of important structures for genus‑level approximation of the isolated fungi (Curvularia sp. and Aspergillus sp.) when compared with taxonomic codes from published literature. Curvularia sp. exhibited cottony‑textured, dark melanized growth, with dark dematiaceous hyphae and septate macroconidia‑like structures; its conidia are curved and composed of unequal cells. Aspergillus sp. showed granular, white‑textured growth, with lighter hyaline hyphae, conidiophores bearing vesicle‑shaped conidial heads, and small, round conidia.

These characteristics are consistent with those reported in the scientific literature. Curvularia has fast‑growing mycelium and multiseptate macroconidia with a prominent curved central cell (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ), while the genus Aspergillus presents hyaline morphology characterized by radially arranged phialides (1111. Taniwaki MH, Pitt JI, Magan N. Aspergillus species and mycotoxins: occurrence and importance in major food commodities. Curr Opin Food Sci. 2018;23:38-43. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cofs.2018.05.008 ). These phenotypic features allow an approximation of the causal agents of diseases, facilitating the establishment of management and control plans for agricultural crops of high economic value to farmers.

Molecular characterization of the isolated fungal strains using the ITS method confirmed the presence of high‑quality DNA suitable for the amplification process (Figure 3).

Bands of 536 bp (H700), 535 bp (H701), and 529 bp (H769) were observed for the ITS marker. Assembled sequences from Sanger sequencing reads enabled fungal species identification, as shown in Table 1.

Molecular identification allows precise confirmation of the causal agent affecting this crop in Ecuador. In this study, three predominant fungal species were identified using the ITS barcoding method: A. arachidicola, C. petersonii, and Rhinocladiella sp. This method is recognized for its effectiveness in the taxonomic identification of fungal organisms, enabling accurate determination of the species involved in pathogenicity (2121. Paloi S, Luangsa-Ard JJ, Mhuantong W, Stadler M, Kobmoo N. Intragenomic variation in nuclear ribosomal markers and its implication in species delimitation, identification and barcoding in fungi. Fungal Biol Rev. 2022;42:1-33. Available from: https://doi.org/10.1016/j.fbr.2022.04.002 ).

The presence of A. arachidicola is particularly significant, as this fungus is associated with the production of toxic compounds that can severely affect crop and food safety. Published research has shown that the presence of this fungus in crops can lead to substantial economic losses due to reduced sugarcane yield and quality (2222. Moore GG, Mack BM, Beltz SB, Puel O. Genome sequence of an aflatoxigenic pathogen of Argentinian peanut, Aspergillus arachidicola. BMC Genomics. 2018;19(1):189. Available from: https://doi.org/10.1186/s12864-018-4576-2 ). Therefore, accurate pathogen identification is essential for implementing effective management strategies.

C. petersonii is known as a phytopathogenic fungus that contributes to leaf necrosis in grass cultivars. It has been demonstrated that this fungus can negatively affect photosynthesis and, consequently, reduce plant biomass production (2323. Iturrieta-González I, Gené J, Wiederhold N, García D. Three new Curvularia species from clinical and environmental sources. MycoKeys. 2020;68:1. Available from: https://doi.org/10.3897/mycokeys.68.51667 ). Curvularia spp. represents a challenge for agriculture and underscores the need to monitor and manage the environmental conditions that favor its proliferation (2424. Tan YP, Crous PW, Shivas RG. Cryptic species of Curvularia in the culture collection of the Queensland Plant Pathology Herbarium. MycoKeys. 2018;(35):1. Available from: https://doi.org/10.3897/mycokeys.35.25665 ).

The presence of Rhinocladiella sp. among the identified fungal isolates indicates a diversity of organisms potentially involved in the disease. It has been reported that it can cause various plant pathologies (2525. Madrid H, Hernandez-Restrepo M, Gené J, Cano J, Guarro J, Silva V. New and interesting chaetothyrialean fungi from Spain. Mycol Prog. 2016;15(10):1179-201. Available from: https://doi.org/10.1007/s11557-016-1239-z , 2626. Crous PW, Wingfield MJ, Schumacher RK, Akulov A, Bulgakov TS, Carnegie AJ, et al. New and interesting fungi. 3. Fungal Syst Evol. 2020;6:157. Available from: https://doi.org/10.3114/fuse.2018.01.08 ). These findings highlight the need for an integrated approach to fungal disease management, including continuous surveillance and the use of molecular identification methods.

Sample H710 was subjected to a taxonomic profile analysis of the ITS region using high‑throughput massive sequencing (Table 2).

The adequate concentration and quality of DNA obtained from the fungal isolates for library preparation and subsequent metagenomic sequencing via ITS metabarcoding are evident. The BLAST search results for the identification of fungi at the genus and species level are presented in Krona charts (Figures 4 and 5) for the phylum Ascomycota, allowing an interactive analysis of the results.

The results indicate that sample H710, within the phylum Ascomycota, showed 100 % predominance of the species Fusarium pseudoanthophilum, while sample H631 showed 97 % predominance of Nigrospora osmanthi.

The results obtained for sample H710 highlight the relevance of this fungus in the plant context. F. pseudoanthophilum has been recognized for its ability to cause diseases in crops (specific crops could be mentioned to illustrate the breadth of its impact or its proximity to sugarcane), underscoring the importance of its identification for effective phytopathogen management. Research has documented that this fungus can be associated with wilting and leaf reddening in several plant species, negatively affecting agricultural production (2727. Amobonye A, Bhagwat P, Ranjith D, Mohanlall V, Pillai S. Characterization, pathogenicity and hydrolytic enzyme profiling of selected Fusarium species and their inhibition by novel coumarins. Arch Microbiol. 2021;203(6):3495-508. Available from: https://doi.org/10.1007/s00203-021-02335-1 ).

N. osmanthi is a phytopathogenic fungus identified as a pathogen in various agricultural crops (2828. Petrović E, Vrandečić K, Ćosić J, Siber T, Godena S. Antifungal efficacy of essential oils and their predominant components against olive fungal pathogens. Agriculture. 2025;15(3):340. Available from: https://doi.org/10.3390/agriculture15030340 ). This fungus belongs to the genus Nigrospora, which includes several species known for their ability to cause significant damage to plants (2929. Oskay F, Karataş A. Pinus nigra subsp. pallasiana ve Pinus sylvestris tohumlarında Diplodia sapinea’nın yoğunluğu. Turkish J For. 2021;22(3):218-28. Available from: https://doi.org/10.18182/tjf.799849 ). The identification and characterization of N. osmanthi are crucial for understanding its impact on agriculture and developing effective management strategies (1717. Yang K, Yang X, Li M, Li D, Huang X, Li C. Occurrence of Nigrospora osmanthi causing leaf spot on Artemisia argyi in China. Crop Prot. 2025;191:107142. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2025.107142 ).

These findings contrast with the general predominance of the phylum Ascomycota, which includes many of the major plant pathogens. The predominance of Fusarium in this context reinforces the need for specific monitoring and control approaches focused on this genus, especially in agricultural systems where plant health is critical (3030. Shabeer S, Tahira R, Jamal A. Fusarium spp. mycotoxin production, diseases and their management: An overview. Pakistan J Agric Res. 2021;34(2):278. Available from: https://dx.doi.org/10.17582/journal.pjar/2021/34.2.278.293 ).

These results differ from the general predominance of the phylum Ascomycota, which encompasses many key plant pathogens. The dominance of Fusarium highlights the need for targeted monitoring and control strategies centered on this genus, particularly in agricultural systems where plant health is of critical importance (3030. Shabeer S, Tahira R, Jamal A. Fusarium spp. mycotoxin production, diseases and their management: An overview. Pakistan J Agric Res. 2021;34(2):278. Available from: https://dx.doi.org/10.17582/journal.pjar/2021/34.2.278.293 ).

Conclusions

The ITS metabarcoding technique allowed obtaining high‑quality DNA, which facilitated the amplification and subsequent identification of the fungal species present in the analyzed samples, demonstrating the effectiveness of molecular techniques for accurately identifying pathogenic fungi.

The sequences obtained by Sanger sequencing confirmed the existence of the specific species A. arachidicola, C. petersonii, and Rhinocladiella sp., providing relevant information on the diversity of pathogenic fungi in the leaf tissues of the studied sugarcane variety EC-08.

Massive sequencing analysis of samples H710 and H631 revealed a 100 % predominance of F. pseudoanthophilum and 97 % predominance of N. osmanthi, respectively, within the phylum Ascomycota. Therefore, these species would be responsible for causing leaf necrosis in the sugarcane crop.

The information derived from this research has important implications for crop management. However, precise identification (which requires pathogenicity tests and completion of Koch's postulates), here it is merely an assumption of the pathogenic fungi could facilitate the development of effective control strategies to improve crop health. It is suggested to evaluate the degree of pathogenicity of these causal agents.