ctr Cultivos Tropicales cultrop 0258-5936 1819-4087 Ediciones INCA 00006 00006 Artículo original Estabilidad química y actividad biológica del QuitoMax® durante su almacenamiento Mederos-Torres Yuliem 1 * Ramírez-Arrebato Miguel Ángel 2 Falcón-Rodríguez Alejandro 1 Bernabé-Galloway Patricia 3 María-Moreno Ana 1 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) San José de las Lajas Mayabeque CP 32 700 Cuba Unidad Científico Tecnológica de Base "Los Palacios". Km 1½ carretera La Francia, Los Palacios, Pinar del Río, Cuba. CP 22900 Unidad Científico Tecnológica de Base "Los Palacios" Los Palacios Pinar del Río CP 22900 Cuba Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio de Polímeros. Calle Zapata s/n, entre G y Carlitos Aguirre, Vedado, La Habana, Cuba. CP 10400 Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio de Polímeros Vedado La Habana CP 10400 Cuba Autor para correspondencia. yuliem@inca.edu.cu 01 03 2020 Jan-Mar 2020 41 1 e06 11 12 2018 18 02 2020 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

El QuitoMax® es un producto biológicamente activo, biocompatible y biodegrabable a base de quitosano. Tiene la capacidad de estimular el crecimiento y rendimiento vegetal e inducir mecanismos defensivos contra patógenos. Independientemente de su campo de acción, este producto debe ser capaz de mantener sus características químicas durante el almacenamiento. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar las características químicas del QuitoMax® durante el almacenamiento y la actividad biológica en posturas de tomate. Se determinó la conductividad, el pH y la masa de quitosano soluble como características químicas. A las semillas previamente tratadas con QuitoMax® se les evaluó la germinación y las variables morfoagronómicas de las posturas de tomate a los 25 días de sembradas. Como resultados no se evidenciaron cambios significativos en la conductividad, el pH y la masa de quitosano soluble en el periodo evaluado. De igual forma, no se apreciaron diferencias entre el producto conservado y uno recién producido al evaluar la germinación y la altura de la planta. Los resultados obtenidos demuestran que el producto mantiene las características químicas y la actividad biológica a los 270 días de conservación.

Palabras clave: quitina conductividad polímero quitosano
INTRODUCCIÓN

El uso de los bioproductos en la agricultura como alternativa al uso indiscriminado de fertilizantes y pesticidas ha ganado auge en los últimos años. Estos productos son biodegradables, no tóxicos y son capaces de actuar en la fisiología de las plantas promoviendo incrementos en el crecimiento y desarrollo vegetal 1. El quitosano forma parte de estos bioproductos y se obtiene a partir de la quitina que es el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. Es un copolímero compuesto por unidades de 2-acetamido-2-desoxi-D-glucosa y 2-amino-2-desoxi-D-glucosa unidas entre sí por enlaces glicosídicos β (1→4), con un predominio de las últimas. Se obtiene a partir de subproductos de la industria marisquera aunque se puede encontrar en la naturaleza en la pared celular de algunos hongos 2. Desde el punto de vista biológico se ha demostrado que este polímero presenta gran actividad biológica independientemente de su masa molecular 3. A la concentración adecuada es capaz de adelantar la germinación, promover el crecimiento y el desarrollo de las plantas así como inducir mecanismos defensivos y de resistencia contra patógenos 1,4,5. Se ha probado su actividad antibacteriana contra el Pectobacterium carotovorum con el empleo de aceites esenciales de tomillo encapsulados en nanopartículas de quitosano 6. También en forma de películas para el recubrimiento de frutos con el objetivo de alargar la vida útil en postcosecha 7-9.

El quitosano se utiliza ampliamente en el manejo de residuos, el procesamiento de comidas, la nanotecnología, la medicina, la biotecnología y la agricultura. Es un material muy interesante en aplicaciones farmacéuticas por su baja toxicidad, biodegrababilidad y biocompatibilidad 7. Es un policatión natural con actividad antifúngica 10 con capacidad para inducir resistencia al ataque de patógenos 11. La caracterización de este polímero se basa en la determinación de su estructura por distintos métodos como la Microscopia Electrónica de Barrido (SEM), Espectroscopia de Energía Dispersa (EDS), Espectroscopia Infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR) y Potencial Z entre otros 6. También por la determinación de su masa molecular por viscosimetría 12, cromatografía de filtración en gel, y el grado de desacetilación por potenciometría o métodos espectroscópicos 13, así como la cuantificación del contenido de cenizas y la humedad presente en el mismo 14.

Sin embargo, una vez conocidas estas características y realizada la dilución del mismo, la conductividad, el pH y la concentración son parámetros que pueden ser tenidos en cuenta pues brindan información del comportamiento de este polímero en solución. Esto se debe a que la determinación de la conductividad permite predecir cambios en la estructura de este polisacárido en disolución puesto que el quitosano en condiciones acídicas es un polielectrolito cuyo parámetro de carga λ es proporcional a la densidad de carga lineal que depende del pH y el grado de desacetilación 12. El control del pH es importante porque las propiedades del quitosano en disolución están dadas por el alto contenido de los grupos amino primarios (NH3) con un pKa de 6,3. La carga positiva del grupo NH3 a bajos valores de pH convierte al quitosano en un polielectrolito catiónico soluble en agua. Cuando el pH se incrementa por encima de 6,0 la carga positiva del grupo NH3 se pierde y el quitosano se vuelve insoluble. La transición del quitosano de soluble a insoluble ocurre en un rango de pH 6,0-6,5 en el pKa de los grupos aminos primarios que depende estrechamente del grado de desacetilación y del método de N-desacetilación 15,16. La masa de quitosano soluble puede brindar información sobre la concentración de quitosano soluble presente en el producto.

El Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas cuenta con una tecnología para obtener un producto a base de quitosano nombrado QuitoMax®. Este producto ha sido evaluado y extendido en diversos cultivos de importancia económica como la papa (Solanum tuberosum L.), el pepino (Cucumis sativus L.), el pimiento (Capsicum annuum L.), el frijol (Phaseolus vulgaris L.), la soya (Glicine max L.), el maíz (Zea mays L.), el arroz (Oryza sativa L), tabaco (Nicotiana tabacum L.). Los incrementos productivos generados a partir de la aplicación del QuitoMax® han incrementado la demanda de este producto.

El tomate (Solanum lycopersicum L.), es una de las hortalizas que más se produce e industrializa en todo el mundo. En Cuba este cultivo representa el 50 % del área total dedicada a las hortalizas y su producción oscila alrededor de los 750 000 t 1. Los estudios de aplicación del QuitoMax® en tomate revelan un estímulo en las variables de crecimiento y rendimiento de este cultivo 1.

Teniendo en cuenta los antecedentes anteriormente expuestos, el objetivo de este trabajo fue evaluar las características químicas y la actividad biológica de este producto durante su almacenamiento. Dentro de las características químicas a determinar se encuentran la conductividad, el pH y la masa de quitosano soluble; mientras que la actividad biológica será evaluada mediante el efecto en la germinación de las semillas de tomate y la altura de sus posturas.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se desarrolló en el laboratorio de producción de Bioestimulantes y en el cuarto de luces perteneciente al departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas situado en el municipio de San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba.

Se prepararon tres lotes de QuitoMax® a una concentración de 4 g L-1 que contiene benzoato de sodio a 0,5 g L-1 a pH 4,5. El quitosano que se empleó en la producción tiene una masa molecular de 106 KDa y un grado de desacetilación (GD) del 73 % determinado por valoración potenciométrica, un 13 % de humedad y 2,2 % de cenizas. El QuitoMax® se almacenó en frascos de 240 ml a 30 ºC. El periodo de análisis fue de 30, 60, 90, 180 y 270 días.

La conductividad se le determinó a las diluciones de QuitoMax® a 0,5 g L-1 de concentración, con el empleo de un conductímetro CRISON ECMeter 30+ fabricado por Crison Instrumenst SA en los Estados Unidos previamente calibrado con soluciones patrones de 147 μS cm-1, 1413 μS cm-1 y 12,88 ms cm-1a 25 ºC.

El pH se determinó a una disolución de QuitoMax® de 4 g L-1 de concentración, con el empleo de un pHmetro Inolab pH 720 fabricado en Alemania, previamente calibrado con soluciones patrón de pH 4,01 y 7,00.

La masa de quitosano soluble se determinó filtrando previamente el QuitoMax® con una frita número 1, se tomaron 80 ml del producto y se le ajustó el pH a 10 para lograr la precipitación del quitosano presente en la disolución. Se separó el sólido del líquido por filtración con papel de filtro previamente pesado en balanza analítica Sartorius TE214S fabricada en Alemania. El sólido junto al papel de filtro se secó en una estufa Binder ED115 fabricada en Alemania, hasta peso constante. La masa de quitosano soluble se determinó a partir de la siguiente ecuación.

<math> <mrow> <mi>M</mi><mi>Q</mi><mi>S</mi><mo>=</mo><mfrac> <mrow> <mrow><mo>(</mo> <mrow> <mi>p</mi><mi>F</mi><mo>+</mo><mi>m</mi><mi>Q</mi></mrow> <mo>)</mo></mrow><mo>−</mo><mi>p</mi><mi>F</mi></mrow> <mrow> <mn>0</mn><mo>,</mo><mn>265</mn></mrow> </mfrac> <mo>*</mo><mn>100</mn></mrow> </math>

Donde pF es el peso en gramos del papel de filtro, m es el peso en gramos del quitosano precipitado y 0,265 es la masa de quitosano teórica determinada teniendo en cuenta la humedad del quitosano y el contenido de cenizas. La masa de quitosano soluble se expresó en porcentaje (%). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Adicionalmente se realizó la evaluación de la germinación a los 270 días de almacenado el producto. Las semillas se embebieron durante 1 hora en una disolución de QuitoMax® de 1 g L-1 de concentración, posteriormente se secaron y se dispersaron en placas petris a razón de 50 semillas por placa por cada tratamiento incluyendo el control. Como control se tomó el agua destilada, el tratamiento 1 correspondió a un QuitoMax® de reciente producción y el tratamiento 2 es el QuitoMax® conservado del lote 2. Las semillas de pusieron a germinar en una cámara de crecimiento WTW TS606/3-i a 28 ºC y se realizan evaluaciones a las 24, 48, 72 horas.

Posteriormente las semillas pre-germinadas se sembraron en recipientes de 6,6 cm de diámetro y 9,7 cm de altura sobre suelo Ferralítico Rojo Compactado Éutrico, según la Clasificación de los Suelos de Cuba 17. El crecimiento de las posturas transcurrió en el cuarto de luces a una temperatura de 27 °C y 36 % de humedad relativa, con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad. A los 25 días posteriores a la siembra se evalúo la altura de la planta a 15 posturas. La altura de las posturas (cm) se midió con regla graduada, desde el cuello de la raíz hasta la axila de la hoja más joven.

Los datos se procesaron mediante análisis de varianza de clasificación simple ANOVA y las medias se compararon por la Prueba de Tukey (p≤0,05). Para los análisis estadísticos se utilizó paquete estadístico STATGRAPHIC PLUS.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La determinación del pH en los tres lotes mostró que este indicador se mantuvo estable a lo largo del periodo evaluado, entre 4,45-4,57 (Figura 1) consistentes con los valores reportados en el registro del producto de 4,5±0,1. La estabilidad del pH en este rango es necesaria puesto que un incremento elevado podría conllevar a la disminución de la acción del benzoato de sodio como antimicrobiano, teniendo en cuenta que solo es efectivo en condiciones ácidas. Las concentraciones de inhibición de los microorganismos son alrededor de 0,05-0,1 % del ácido no disociado, principalmente en alimentos ácidos (pH menor o igual 4-4,5) 18. Por lo que el pH en el cual se mantiene el producto, garantiza la solubilidad del quitosano y las propiedades antimicrobianas del benzoato de sodio.

Registros del pH en tres lotes de QuitoMax<sup>®</sup> durante 270 días de almacenamiento Las barras sobre los valores medios representan el intervalo de confianza de las medias α =0,5

Por otro lado, el estudio de la conductividad en los tres lotes mantuvo la estabilidad en el periodo de almacenamiento (Figura 2) y las diferencias entre los lotes 1, 2 y 3 son atribuibles al proceso de preparación del producto. La conductividad de este producto está dada por la contribución de todas las especies presentes en el, desde el quitosano, el benzoato de sodio y el hidróxido de sodio empleado para ajustar el pH. Por lo que las variaciones pueden provenir desde la heterogeneidad propia del quitosano hasta las cantidades de hidróxido de sodio empleadas en el ajuste de pH. La estabilidad observada en el transcurso del tiempo, indica que no hubo variación de la solubilidad del quitosano en el periodo de almacenamiento. Las mediciones de conductividad pueden mostrar la evolución de la protonación, con un incremento progresivo producto a la solubilización paulatina del quitosano. Una solubilización completa se obtiene cuando el grado de disociación α ≥ 0,5 y la relación estequiométrica entre el ácido acético y el quitosano <math> <mrow> <mrow><mo>[</mo> <mrow> <mi>A</mi><mi>c</mi><mi>O</mi><mi>H</mi></mrow> <mo>]</mo></mrow><mo>/</mo><mrow><mo>[</mo> <mrow> <mi>C</mi><mi>h</mi><mi>i</mi><mi>t</mi><mo>−</mo><mi>N</mi><msub> <mi>H</mi> <mn>2</mn> </msub> </mrow> <mo>]</mo></mrow></mrow> </math> es 0,6 19. La conductividad como herramienta de análisis, también se ha empleado en el estudio de la formación de complejos polielectrolitos entre el quitosano y la pectina, en los que se aprecia un incremento de esta a medida que se forma el complejo polielectrolito, lo que permite determinar la relación estequiométrica entre estos dos polisacáridos 20.

La poca variabilidad de la conductividad en el tiempo determinada en este estudio, coincide con los estudios de conductividad realizados por otros autores a diferentes concentraciones de quitosano y ácido acético. En estos se refiere que la conductividad en las disoluciones de quitosano no sufre cambios durante su almacenamiento y que las variaciones son consecuencias de errores en la medición 15.

Registros de la conductividad en tres lotes de QuitoMax<sup>®</sup> durante 270 días de almacenamiento Las barras sobre los valores medios representan el intervalo de confianza de las medias α =0,5

Por otro lado, al evaluar la solubilidad del quitosano de manera general se determina el material insoluble presente en disoluciones de ácido acético al 1 % a una temperatura de 25 °C 21. Sin embargo, en este trabajo se evaluó la masa de quitosano soluble presente en el QuitoMax® a 30 °C, como indicador de la concentración de quitosano disuelto en el producto (Figura 3). En general en los tres lotes la masa de quitosano disuelto se encontró por encima del 80 %, no existiendo diferencias entre el mismo lote en los periodos evaluados.

Registros de la masa de quitosano soluble (MQS) en tres lotes de QuitoMax<sup>®</sup> durante 270 días de almacenamiento Las barras sobre los valores medios representan el intervalo de confianza de las medias α =0,5

En cuanto a la actividad biológica, al evaluar la germinación en semillas de tomate de cultivar “Amalia” tratadas con el producto se pudo observar que a los 270 días de conservación no hubo diferencias significativas p < 0,05 entre el producto conservado y el fresco y si con el control (Figura 4). Pasadas las 72 horas no se muestran diferencias significativas entre ninguno de los tratamientos. En general a los 270 días de conservación se observó un efecto positivo en la germinación a las 48 horas. Este incremento en la germinación puede deberse a que el quitosano tiene excelentes propiedades formadoras de películas, lo que facilita la formación de una película semipermeable en la superficie de la semilla y ayuda a mantener la humedad y promover la germinación 22. Aunque el mecanismo mediante el cual el quitosano ejerce un efecto en la germinación aún es desconocido, se ha reportado el efecto positivo en semillas de maíz (23) y trigo 22.

Efecto del QuitoMax<sup>®</sup> fresco (T1) y conservado (T2) en la germinación de semillas de Tomate Letras iguales no difieren estadísticamente según la Prueba de Rangos Múltiples de Tukey HSD

La evaluación de la altura de la postura a los 25 días de germinadas no mostró diferencias significativas entre el producto conservado y el fresco, pero si con el control (Figura 5). Este comportamiento fue similar al observado en la germinación a las 48 horas. Si bien el mecanismo por el cual el quitosano promueve el crecimiento de las posturas tampoco ha sido publicado, los efectos positivos en el crecimiento y desarrollo de diversos cultivos ha sido ampliamente documentado en arroz 24, tomate 1, papa 5, soya 3 entre otros.

Efecto del QuitoMax<sup>®</sup> fresco (T1) y conservado (T2) en la altura de las posturas Letras iguales no difieren estadísticamente según la Prueba de Rangos Múltiples de Tukey HSD

La estimulación del crecimiento y el desarrollo de las plantas por parte del quitosano ha sido asociado a procesos fisiológicos. Uno de estos procesos es evitar la pérdida de agua por vía de la transpiración mediante el cierre estomático de las plantas, lo que está relacionado con un efecto estimulante del crecimiento de estas, producto al efecto antitranspirante del quitosano 25. A su vez, resultados encontrados en el cultivo del frijol, han señalado que uno de los aspectos a través de los cuales el quitosano influye en la reducción de la transpiración, es mediante el incremento de los niveles de ácido abscísico (ABA) en las hojas tratadas, el cual activa el cierre parcial de los estomas 26

En este trabajo las posturas a los 25 días de germinadas no alcanzaron el tamaño óptimo requerido para el trasplante entre 15-18 cm 27. Sin embargo, estos resultados son similares a investigaciones realizadas utilizando la concentración de 1 g L-1 y la imbibición por 4 horas, puesto que las posturas a los 24 días de germinadas difieren del control, pero sus alturas no sobrepasan los 9 cm. De igual forma coincide con otros trabajos que al evaluar el efecto de este producto a esta misma concentración (1 g L-1) y por imbibición de semillas de tomate del cultivar “Mara” a cielo abierto sobre canteros, logran incrementos por encima del control desde los 10 días de germinadas las plantas. Sin embargo, difiere de la altura reportada por estos investigadores cuando informan que las posturas están listas para el trasplante a los 15 días de germinadas las plantas 1. Este trabajo también difiere con otros que emplean tiempos de imbibición de cuatro y ocho horas a diferentes concentraciones de quitosano (0,1-2000 mg L-1). En estas investigaciones las posturas a los 27 días de sembradas no evidenciaron cambios significativos en la altura de las plantas en ninguna de las concentraciones evaluadas respecto al control, pero si en la masa seca de la raíz a la menor concentración de 0,1 mg L-1 (28.

Teniendo en cuenta que estos son los primeros resultados de la estabilidad química del QuitoMax® en el tiempo y la actividad biológica de este, se sugiere extender la estabilidad química hasta el año de conservación y evaluar otras variables morfoagronómicas que puedan aportar información sobre la actividad biológica del QuitoMax® conservado en posturas de tomate u otros cultivos de interés económico.

El empleo de los bioestimulantes en la agricultura en contraposición al uso indiscriminado de fertilizantes químicos y pesticidas es de vital importancia porque contribuyen a disminuir la carga contaminante de los suelos al mismo tiempo que incrementan el rendimiento y el desarrollo de los cultivos. El QuitoMax® y los derivados de los quitosanos constituyen una vía eficaz y promisoria que debe ser tenida en cuenta en pos del desarrollo de la agricultura de nuestro país.

CONCLUSIONES

Los análisis químicos realizados a los tres lotes del producto QuitoMax® no demuestran cambios en la conductividad, el pH y la masa de quitosano soluble del producto durante la conservación.

El producto QuitoMax® presenta actividad biológica a los 270 días.

El producto conservado promueve adelantos en la germinación e incrementos en la altura de las plantas de tomate.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo el uso del QuitoMax puede ser extendido hasta los 270 días.

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Martínez L Castro I Díaz L Núñez M Influencia del tratamiento a semillas con quitosana en el crecimiento de plantas de tomate Solanum lycopersicum L Cultivos Tropicales 2007 28 4 79 82 Original Article Chemical stability and biological activity of QuitoMax® during storage Mederos-Torres Yuliem 1 * Ramírez-Arrebato Miguel Ángel 2 Falcón-Rodríguez Alejandro 1 Bernabé-Galloway Patricia 3 María-Moreno Ana 1 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700 Unidad Científico Tecnológica de Base "Los Palacios". Km 1½ carretera La Francia, Los Palacios, Pinar del Río, Cuba. CP 22900 Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio de Polímeros. Calle Zapata s/n, entre G y Carlitos Aguirre, Vedado, La Habana, Cuba. CP 10400 Author for correspondence. yuliem@inca.edu.cu ABSTRACT

QuitoMax® is a biologically active, biocompatible and biodegradable product based on chitosan. It has the ability to stimulate plant growth, yield and induce defensive mechanisms against pathogens. Regardless of its field of action, this product must be able to maintain its chemical characteristics during storage. The objectives of this work were to evaluate the chemical characteristics of QuitoMax® during storage and biological activity in tomato seedlings. The conductivity, pH and mass of soluble chitosan were determined as chemical characteristics. Seeds previously treated with QuitoMax® were evaluated for germination and morphoagronomic variables of tomato postures 25 days after planting. As results, there were no significant changes in conductivity, pH and mass of soluble chitosan in the period evaluated. Likewise, no differences were between the conserved product found and one newly produced when evaluating the germination and plants height. The results obtained show that the product maintains the chemical characteristics and biological activity at 270 days of conservation.

Key Word: chitin conductivity polymer chitosan
INTRODUCTION

The use of bioproducts in agriculture as an alternative to the indiscriminate use of fertilizers and pesticides has gained popularity in recent years. These products are biodegradable, non-toxic and are capable of acting on the physiology of plants promoting increases in plant growth and development 1. Chitosan is part of these bioproducts and is obtained from chitin, which is the second most abundant polymer in nature after cellulose. It is a copolymer composed of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose and 2-amino-2-deoxy-D-glucose units linked together by β (1→4) glycosidic bonds, with a predominance of the latter. It is obtained from by-products from the shellfish industry although it can be found in nature in the cell wall of some fungi 2. From a biological point of view, this polymer has been shown to have great biological activity regardless of its molecular mass 3. At the proper concentration, it is capable of advancing germination, promoting plant growth and development, as well as inducing defensive and resistance mechanisms against pathogens 1,4,5. Its antibacterial activity against Pectobacterium carotovorum has been with the use of thyme essential oils proven encapsulated in chitosan nanoparticles 6. Also in the form of films for the coating of fruits with the aim of extending the shelf life in post-harvest 7-9.

Chitosan is widely used in waste management, food processing, nanotechnology, medicine, biotechnology, and agriculture. It is a very interesting material in pharmaceutical applications due to its low toxicity, biodegravability and biocompatibility 7. It is a natural polycation with antifungal activity 10 with the capacity to induce resistance to pathogen attack 11. The characterization of this polymer is based on the determination of its structure by different methods such as Scanning Electron Microscopy (SEM), Energy Dispersed Spectroscopy (EDS), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Z Potential among others 6. Also by determining its molecular mass by viscosimetry 12, gel filtration chromatography, and the degree of deacetylation by potentiometry or spectroscopic methods 13, as well as the quantification of the ash content and the humidity present in it 14.

However, once these characteristics are known and its dilution has been carried out, conductivity, pH and concentration are parameters that can be taken into account since they provide information on the behavior of this polymer in solution. This is due to the fact that the conductivity determination allows predicting changes in the structure of this polysaccharide in solution since the chitosan in acidic conditions is a polyelectrolyte whose charge parameter λ is proportional to the linear charge density that depends on the pH and the degree of deacetylation 12. The control of the pH is important because the properties of the chitosan in solution are given by the high content of the primary amino groups (NH3) with a pKa of 6.3. The positive charge of the NH3 group at low pH values converts chitosan into a water soluble cationic polyelectrolyte. When the pH increases above 6.0 the positive charge of the NH3 group is lost and the chitosan becomes insoluble. The transition of chitosan from soluble to insoluble occurs in a pH range 6.0-6.5 in the pKa of the primary amino groups, which depends closely on the degree of deacetylation and the N-deacetylation method 15,16. The mass of soluble chitosan can provide information on the concentration of soluble chitosan present in the product.

The National Institute of Agricultural Sciences has a technology to obtain a chitosan-based product named QuitoMax®. This product has been evaluated and extended in various crops of economic importance such as potatoes (Solanum tuberosum L.), cucumbers (Cucumis sativus L.), peppers (Capsicum annuum L.), beans (Phaseolus vulgaris L.), soybeans (Glicine max L.), corn (Zea mays L.), rice (Oryza sativa L), and tobacco (Nicotiana tabacum L.). The productive increases generated from the application of QuitoMax® have increased the demand for this product.

The tomato (Solanum lycopersicum L.), is one of the vegetables that is most produced and industrialized worldwide. In Cuba, this crop represents 50 % of the total area dedicated to vegetables and its production ranges around 750,000 t 1. The studies of application of the QuitoMax® in tomato reveal a stimulus in the growth and yield variables of this crop 1.

Taking into account the previously exposed background, the objective of this work was to evaluate the chemical characteristics and the biological activity of this product during its storage. Among the chemical characteristics to be determined are the conductivity, the pH and the mass of soluble chitosan; while the biological activity will be evaluated through the effect on the germination of tomato seeds and the height of their positions.

MATERIALS AND METHODS

The research was carried out in the Biostimulants production laboratory and in the light room belonging to the Department of Plant Physiology and Biochemistry of the National Institute of Agricultural Sciences. It is located in San José de las Lajas municipality, Mayabeque province, Cuba.

Three batches of QuitoMax® were prepared at a concentration of 4 g L-1 containing sodium benzoate at 0.5 g L-1 at pH 4.5. The chitosan used in production has a molecular mass of 106 KDa and a degree of deacetylation (GD) of 73 % determined by potentiometric titration, 13 % humidity and 2.2 % ash. QuitoMax® was stored in 240 ml bottles at 30 ºC. The analysis period was 30, 60, 90, 180 and 270 days.

The conductivity was determined at the dilutions of QuitoMax® at 0.5 g L-1 concentration, with the use of a CRISON ECMeter 30+ conductivity meter manufactured by Crison Instrumenst SA in the United States previously calibrated with standard solutions of 147 μS cm -1, 1413 μS cm-1 and 12.88 ms cm-1 a 25 ºC.

The pH was determined with a QuitoMax® solution of 4g L-1 concentration, using an Inolab pH 720 pH meter made in Germany, previously calibrated with pH 4.01 and 7.00 standard solutions.

The mass of soluble chitosan was determined by previously filtering the QuitoMax® with a number 1 frit, 80ml of the product were taken and the pH was adjusted to 10 to achieve the precipitation of the chitosan present in the solution. The solid was separated from the liquid by filtration with pre-weighed filter paper on a Sartorius TE214S analytical balance made in Germany. The solid next to the filter paper was dried in a Binder ED115 stove made in Germany, until constant weight. The mass of soluble chitosan was determined from the following equation..

<math> <mrow> <mi>M</mi><mi>Q</mi><mi>S</mi><mo>=</mo><mfrac> <mrow> <mrow><mo>(</mo> <mrow> <mi>p</mi><mi>F</mi><mo>+</mo><mi>m</mi><mi>Q</mi></mrow> <mo>)</mo></mrow><mo>−</mo><mi>p</mi><mi>F</mi></mrow> <mrow> <mn>0</mn><mo>,</mo><mn>265</mn></mrow> </mfrac> <mo>*</mo><mn>100</mn></mrow> </math>

Where pF is the weight in grams of the filter paper, m is the weight in grams of the precipitated chitosan and 0.265 is the theoretical mass of chitosan-determined taking into account the humidity of the chitosan and the ash content. The mass of soluble chitosan was expressed as a percentage (%). All determinations were made in triplicate.

Additionally, the germination evaluation was carried out 270 days after the product was stored. The seeds were soaked for 1 hour in a QuitoMax® solution of 1 g L-1 concentration, and then they were dried and dispersed in Petris plates at a rate of 50 seeds per plate for each treatment including the control. The distilled water was taken as control, treatment 1 corresponded to a recently produced QuitoMax® and treatment 2 is the preserved QuitoMax® from lot 2. The seeds were germinated in a growth chamber WTW TS606/3-ia 28 ºC and evaluations are made at 24, 48, 72 hours.

Subsequently, the pre-germinated seeds were sown in containers of 6.6 cm in diameter and 9.7 cm in height on Ferralitic Red Compacted Eutric soil, according to the Cuban Soil Classification 17. Posture growth took place in the light room at a temperature of 27 ºC and 36 % relative humidity, with a photoperiod of 16 light hours and 8 hours of darkness. At 25 days after planting, the height of the plant was evaluated at 15 positions. The height of the postures (cm) was measured with a graduated ruler, from the root neck to the axilla of the youngest leaf.

The data were processed by means of analysis of variance of simple ANOVA classification and the means were compared by the Tukey test (p≤0.05). For statistical analyzes, the STATGRAPHIC PLUS statistical package was used.

RESULTS AND DISCUSSION

The determination of the pH in the three batches showed that this indicator remained stable throughout the evaluated period, between 4.45-4.57 (Figure 1), consistent with the values reported in the product record of 4.5 ± 0,1. The stability of the pH in this range is necessary since a high increase could lead to a decrease in the action of sodium benzoate as an antimicrobial, taking into account that it is only effective in acidic conditions. The inhibition concentrations of the microorganisms are around 0.05-0.1 % of the undissociated acid, mainly in acidic foods (pH less than or equal to 4-4.5) 18. So the pH at which the product is kept guarantees the solubility of chitosan and the antimicrobial properties of sodium benzoate.

pH records in three batches of QuitoMax<sup>®</sup> during 270 days of storage The bars on the mean values represent the confidence interval of the means α = 0.5

On the other hand, the conductivity study in the three batches maintained stability in the storage period (Figure 2) and the differences between batches 1, 2 and 3 are attributable to the product preparation process. The conductivity of this product is given by the contribution of all the species present in it, from chitosan, sodium benzoate and sodium hydroxide used to adjust the pH. Therefore, variations can come from the heterogeneity of the chitosan to the amounts of sodium hydroxide used in the pH adjustment. The stability observed over time indicates that there was no variation in the solubility of chitosan in the storage period. Conductivity measurements can show the evolution of protonation, with a progressive increase due to the gradual solubilization of chitosan. Complete solubilization is obtained when the degree of dissociation α ≥ 0.5 and the stoichiometric relationship between acetic acid and chitosan <math> <mrow> <mrow><mrow> <mrow><mo>[</mo> <mrow> <mi>A</mi><mi>c</mi><mi>O</mi><mi>H</mi></mrow> <mo>]</mo></mrow></mrow><mo>/</mo><mrow> <mrow><mo>[</mo> <mrow> <mi>C</mi><mi>h</mi><mi>i</mi><mi>t</mi><mo>−</mo><mi>N</mi><msub> <mi>H</mi> <mn>2</mn> </msub> </mrow> <mo>]</mo></mrow></mrow></mrow> </mrow> </math> is 0.6 19. Conductivity as an analysis tool has also been used in the study of the formation of polyelectrolyte complexes between chitosan and pectin, in which an increase in it is observed as the polyelectrolyte complex is formed, which allows determining the stoichiometric relationship between these two polysaccharides 20.

The little variability of conductivity over time determined in this study coincides with conductivity studies carried out by other authors at different concentrations of chitosan and acetic acid. In these, it is referred that the conductivity in the chitosan solutions does not undergo changes during its storage and that the variations are consequences of measurement errors 15.

Conductivity records in three batches of QuitoMax<sup>®</sup> during 270 days of storage The bars on the mean values represent the confidence interval of the means α = 0.5

On the other hand, when evaluating the solubility of chitosan in general, the insoluble material present in 1 % acetic acid solutions is determined at a temperature of 25 ºC 21. However, in this work the mass of soluble chitosan present in the QuitoMax® at 30 ºC was evaluated, as an indicator of the concentration of chitosan dissolved in the product (Figure 3). In general, in the three batches the mass of dissolved chitosan was found to be over 80 %, with no differences between the same batches in the evaluated periods.

Records of the mass of soluble chitosan (MQS) in three batches of QuitoMax<sup>®</sup> during 270 days of storage The bars on the mean values represent the confidence interval of the means α = 0.5

As for the biological activity, when evaluating the germination in tomato seeds of cultivar "Amalia" treated with the product, it was observed that after 270 days of conservation there were no significant differences p <0.05 between the preserved product and the fresh and if with the control (Figure 4). After 72 hours, there were no significant differences between any of the treatments. In general, after 270 days of conservation, a positive effect on germination was observed at 48 hours. This increase in germination may be because chitosan has excellent film-forming properties, which facilitates the formation of a semi-permeable film on the surface of the seed and helps to maintain moisture and promote germination 22. Although the mechanism by which chitosan exerts an effect on germination is still unknown, a positive effect has been reported in corn 23 and wheat 22 seeds.

Las barras sobre los valores medios representan el intervalo de confianza de las medias α =0,5.

Effect of fresh QuitoMax<sup>®</sup> (T1) and preserved (T2) on tomato seed germination Equal letters do not differ statistically according to the Tukey HSD Multiple Range Test

The evaluation of the height of the laying at 25 days after sprouting did not show significant differences between the preserved product and the fresh one, but with the control (Figure 5). This behavior was similar to that observed in germination at 48 hours. Although the mechanism by which chitosan promotes posture growth has also not been published, the positive effects on growth and development of various crops have been widely documented in rice 24, tomato 1, potato 5, soy 3 among others.

Effect of fresh (T1) and preserved (T2) QuitoMax<sup>®</sup> on posture height Equal letters do not differ statistically according to the Tukey HSD Multiple Range Test

The stimulation of plant growth and development by chitosan has been associated with physiological processes. One of these processes is to avoid the loss of water through transpiration through the stomatal closure of plants, which is related to a stimulating effect of plant growth, due to the antiperspirant effect of chitosan 25). In turn, results found in bean cultivation have indicated that one of the aspects through which chitosan influences the reduction of transpiration is by increasing the levels of abscisic acid (ABA) in the leaves treated, which activates the partial closure of the stomata 26.

In this work, postures 25 days after germination did not reach the optimal size required for transplantation from15-18 cm 27. However, these results are similar to investigations carried out using the concentration of 1 g L-1 and imbibition for 4 hours, since the postures 24 days after germination differ from the control, but their heights do not exceed 9 cm 2. In the same way, it coincides with other works that when evaluating the effect of this product at this same concentration (1 g L-1) and by imbibition of tomato seeds of the cultivar "Mara" in the open air on stonemasons, achieve increases above the control from the 10 days of germinated the plants. However, it differs from the height reported by these researchers when they report that the positions are ready for transplanting 15 days after the plants have germinated 1. This work also differs from others that employ imbibition times of four and eight hours at different concentrations of chitosan (0.1-2000 mg L-1). In these investigations, the postures at 27 days of sowing did not show significant changes in the height of the plants in any of the concentrations evaluated with respect to the control, but in the dry mass of the root at the lowest concentration of 0.1 mg L -1 (28.

Taking into account that these are the first results of the chemical stability of QuitoMax® over time and its biological activity, it is suggested to extend the chemical stability until the year of conservation and to evaluate other morphoagronomic variables that may provide information on biological activity of the QuitoMax® preserved in tomato or other crops of economic interest.

The use of biostimulants in agriculture as opposed to the indiscriminate use of chemical fertilizers and pesticides is of vital importance because they contribute to decrease the polluting load of soils at the same time that they increase the yield and development of crops. QuitoMax® and chitosan derivatives are an efficient and promising route that must be taken into account in pursuit of the development of agriculture in our country.

CONCLUSIONS

The chemical analyzes carried out on the three batches of the QuitoMax® product did not demonstrate changes in the conductivity, pH and mass of soluble chitosan of the product during storage.

The QuitoMax® product shows biological activity after 270 days. The preserved product promotes advances in germination and increases in the height of tomato plants.

Taking into account the results obtained in this work, the use of the QuitoMax® can be extended up to 270 days.

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